Nghiên cứu xác định động vật thủy sinh chủ yếu mang virus gây bệnh đốm trắng ở tôm nuôi nước lợ tại một số tỉnh miền bắc

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRƯƠNG THỊ MỸ HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘNG VẬT THỦY SINH CHỦ YẾU MANG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM NUÔI NƯỚC LỢ TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 64 01 08 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phan Thị Vân PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn, thông tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Trương Thị Mỹ Hạnh Trương Thị Mỹ Hạnh i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo tạo điều kiện hướng dẫn tơi vấn đề có liên quan đến học tập, nghiên cứu từ ngày đầu nhập học, trình học tập, thực đề tài hồn thành luận án Qua đây, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể cán Lãnh đạo Trung tâm Quan trắc Môi trường Bệnh thủy sản miền Bắc, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I thầy cô giáo thuộc môn Vi sinh vật truyền nhiễm, khoa Thú Y, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến hai giáo viên hướng dẫn, người ln động viên, khích lệ lúc có góp ý phản biện khoa học sâu sắc giúp tơi hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin giành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình bên cạnh, động viên lo lắng cơng việc gia đình để tơi n tâm nghiên cứu học tập hoàn thành luận án Một lần xin cảm ơn tất ủng hộ cho luận án này! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Trương Thị Mỹ Hạnh ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận án xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Nghề nuôi tôm nước lợ Việt Nam 2.1.1 Một số đặc điểm chung nghề nuôi tôm nước 2.1.2 Hiện trạng nuôi tôm Quảng Ninh, Nam Định Nghệ An 2.2 Bệnh đốm trắng tôm nuôi nước lợ 11 2.2.1 Tác nhân gây bệnh 12 2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 16 2.2.3 Phương thức lan truyền bệnh đốm trắng 18 2.2.4 Yếu tố nguy dẫn đến tôm nhiễm bệnh virus đốm trắng 19 2.3 Sinh vật mang virus đốm trắng gây bệnh cho tôm nuôi 20 2.3.1 Nghiên cứu sinh vật mang WSSV gây bệnh đốm trắng cho tôm giới 21 2.3.2 Nghiên cứu sinh vật mang WSSV gây bệnh đốm trắng cho tôm Việt Nam 32 Phần Phương pháp nghiên cứu 35 3.1 Địa điểm nghiên cứu 35 3.2 Thời gian nghiên cứu 35 3.3 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 35 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 35 iii 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 35 3.3 Nội dung nghiên cứu 38 3.4 Phương pháp nghiên cứu 39 3.4.1 Phương pháp điều tra .40 3.4.2 Phương pháp thu, bảo quản định danh loài động vật thủy sinh 40 3.4.3 Phương pháp phân tích mẫu động vật thủy sinh sinh học phân tử 41 3.4.4 Phương pháp tách chiết ADN 41 3.4.5 Phương pháp tách chiết ARN 43 3.4.6 Tổng hợp cDNA 44 3.4.7 Khuyếch đại ADN 45 3.4.8 Chu trình nhiệt PCR 45 3.4.9 Tinh ADN 45 3.4.10 Định lượng nồng độ WSSV kỹ thuật Real time PCR .46 3.5 Gây nhiễm xác định khả mang WSSV động vật thủy sinh 46 3.5.1 Gây nhiễm WSSV lên động vật thủy sinh hình thức tiêm 47 3.5.2 Gây nhiễm WSSV lên động vật thủy sinh hình thức ngâm 48 3.6 Gây nhiễm xác định khả lan truyền WSSV từ động vật thủy sinh sang tôm chân trắng môi trường nuôi 48 3.7 Phân tích xử lý số liệu 50 Phần Kết thảo luận 52 4.1 Điều tra trạng vùng nuôi, đánh giá yếu tố nguy bệnh đốm trắng tôm Quảng Ninh, Nam Định Nghệ An 52 4.1.1 Thông tin chung trạng quản lý bệnh đốm trắng tôm nuôi điểm nghiên cứu 53 4.1.2 Xác định yếu tố nguy bệnh đốm trắng tôm chân trắng nuôi điểm nghiên cứu 65 4.2 Nghiên cứu xác định động vật thủy sinh chủ yếu mang WSSV Nghệ An, Nam Định Quảng Ninh 75 4.2.1 Động vật thuỷ sinh nhiễm WSSV thu điều kiện tự nhiên .75 4.2.2 Động vật thủy sinh chủ yếu mang WSSV điều kiện thí nghiệm 82 4.3 Khả lan truyền WSSV từ động vật thủy sinh sang tôm thẻ chân trắng môi trường nuôi 92 iv 4.3.1 Khả lây truyền WSSV từ cáy đỏ sang tôm chân trắng 92 4.3.2 Khả lan truyền WSSV từ tôm sang tôm chân trắng 96 4.3.3 Khả lan truyền WSSV từ tôm gai sang tôm chân trắng 102 Phần Kết luận kiến nghị 107 5.1 Kết luận 107 5.2 Đề xuất 108 Danh mục cơng trình cơng bố có liên quan đến luận án 109 Tài liệu tham khảo 110 Phụ lục 128 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ AHPND Acute hepatopancreatic necrosis disease ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay GXCC Giáp xác chân chèo HHMBV Hypodermal and haematopoietic necrosis baculovirus IHHVN Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus ISH In situ hybridization NNE Nòng nọc ếch PCR Polymerase Chain Reaction PmNOB II Penaeus monodon non-occluded baculovirus II SEMBV Systemic ectodermal and mesodermal baculoviral TCT Tôm chân trắng TEM Transmission electron microscopy WPD White patch disease WSBV White spot baculovirus WSD White spot disease WSSV White spot syndrome virus WSVI White spot viral infection XK Xuất YHV Yellow head virus vi DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Kim ngạch xuất mặt hàng thủy sản qua năm 2014-2017 2.2 Dịch bệnh đốm trắng tôm nuôi nước lợ qua năm 2014-2017 2.3 Tên gọi bệnh đốm trắng tôm virus gây theo thời gian 13 2.4 Danh sách lồi tơm mang virus đốm trắng 22 2.5 Danh sách loài cua mang virus đốm trắng 25 2.6 Danh sách loài thực vật nhiễm virus đốm trắng 28 2.7 Danh sách loài động vật phù du mang virus đốm trắng 29 2.8 Danh sách lồi trùng mang WSSV tự nhiên 31 3.1 Các loài sinh vật thu vùng nghiên cứu 36 3.2 Cặp mồi sử dụng nghiên cứu 37 3.3 Thành phần phản ứng để khuyếch đại ADN 37 3.4 Danh mục kít sử dụng nghiên cứu 38 3.5 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 44 3.6 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 44 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 44 3.8 Chu trình nhiệt giai đoạn trình PCR 45 3.9 Thành phần phản ứng Real time PCR 46 3.10 Yếu tố phân tích mơ tả xác định nguy tiềm 51 4.1 Diện tích ni tơm hộ ni Nghệ An, Nam Định Quảng Ninh 53 4.2 Mực nước trì ao ni tơm 57 4.3 Số lần cấp nước vào ao ni q trình nuôi 57 4.4 Thời điểm thả giống tôm năm 58 4.5 Nguồn tôm giống thả nuôi hộ vùng nghiên cứu 62 4.6 Mật độ thả tôm giống hộ nuôi 63 4.7 Cỡ tôm giống thả 64 4.8 Hoạt động giảm sốc cho tôm giống thả 65 4.9 Mối quan hệ hoạt động lấy nước vào ao nuôi tôm với bệnh đốm trắng xuất ao nuôi 66 4.10 Quan hệ diện tích ni tôm mực nước ao nuôi với bệnh đốm trắng tôm xuất ao nuôi 68 vii 4.11 Quan hệ vùng nuôi xuất bệnh WSSV hoạt động kiểm tra môi trường thường xuyên với bệnh đốm trắng tôm 69 4.12 Mối quan hệ cỡ tôm giống, hoạt động thả tôm xuất sinh vật khác ao nuôi tôm với tôm bị bệnh đốm trắng 70 4.13 Thành phần loài sinh vật xuất vùng nuôi tôm 72 4.14 Kết phân tích virus động vật thủy sinh 75 4.15 Tên loài động vật thuộc nhóm giáp xác thu Nam Định 77 4.16 Nồng độ WSSV sử dụng thí nghiệm gây nhiễm 83 4.17 Kết phân tích virus sau gây nhiễm nhân tạo WSSV lên cáy đỏ 86 4.18 Kết xác định thời gian virus nhân lên tế bào động vật thủy sinh thí nghiệm gây nhiễm 89 4.19 Kết phân tích WSSV cáy đỏ tơm thẻ thí nghiệm xác định khả lan truyền WSSV 93 4.20 Kết phân tích WSSV tơm tơm thẻ thí nghiệm xác định khả lan truyền WSSV 97 4.21 Kết phân tích WSSV tơm gai tơm thẻ thí nghiệm xác định khả lan truyền WSSV 102 viii WSSV-infected Marsupenaeus japonicus juveniles and adults Aquaculture 305 pp 133-137 173 Zhang C, Li F and J Xiang (2015a) Effect of temperature on the standard metabolic rates of juvenile and adult Exopalaemon carinicauda Chinese J Oceanol Limnol 33 pp 381-388 174 Zhang JS, S.L Dong, X.L Tian, Y.W Dong, X.Y Liu and D.C Yan (2006) Studies on the rotifer (Brachionus urceus Linnaeus, 1758) as a vector in white spot syndrome virus (WSSV) transmission Aquaculture 261 pp 1181-1185 175 Zhang XZ, X.Q Cheng, Y.X Yu, H Shen and X.H Wan (2015b) Analysis of ITS1 sequences and genetic relationships between populations of ridgetail white prawn, Exopalaemon carinicauda, in the East China Sea Genet Mol Res 14 pp 12316-12322 176 Zhao C, H Fu, S Sun, H Qiao, W Zhang, S Jin, S Jiang, Y Xiong and Y Gong (2017) Experimental inoculation of oriental river prawn Macrobrachium nipponense with white spot syndrome virus (WSSV) Dis Aquat Organ 126 pp: 45-52 177 Zhu Y, Q Ding and F Yang (2007) Characterization of a homologous-regionbinding protein from white spot syndrome virus by phage display Virus Res 125 pp 145-152 127 PHỤ LỤC 1.1 Phiếu điều tra THÔNG TIN CHUNG Họ tên chủ hộ: Số điện thoại ………………………………………………………………………… Địa chỉ: Thôn: Xã Huyện: THƠNG TIN VỀ AO NI Số ao ni: (ao) Tổng diện tích ni: (m2) Hình thức ni: Thâm canh Bán thâm canh Khác Mực nước ao nuôi (m) Nguồn nước cấp Trực tiếp từ kênh cấp Xử lý nước trước nuôi: Qua ao xử lý Có Khơng Hóa chất cách xử lý Thời gian thả nuôi: Vụ 1: từ tháng .đến tháng Vụ 2: từ tháng .đến tháng Nếu nuôi vụ lý sao? Mật độ thả: (con/m2) Cỡ giống thả: Lồi tơm thả nuôi: 10 Con giống: 128 Nguồn giống: Trước thả ni có kiểm dịch khơng? Có Khơng (Nếu có ghi rõ kiểm tra đâu, loại bệnh gì?) 11 Trước thả giống có xử lý khơng? Nếu có: Phương thức xử lý nào? 12 Các loại thuốc, hóa chất sử dụng q trình ni?, mục đích sử dụng thuốc 13 Loại thức ăn cho tôm ăn 11 Trong trình ni có thay nước khơng? 12 Số lần thay vụ 13 Lượng nước thay lần Có sử dụng lưới lọc khơng? 14 Trong q trình ni thường bắt gặp lồi sinh vật ngồi tơm ni chính? Kể tên: 15 Mương cấp có sinh vật hoang dã diện? Kể tên THƠNG TIN VỀ DỊCH BỆNH 16 Hộ ni có tơm bị chết WSSV khơng? Có Khơng 17 Thời gian chết kéo dài? 18 Giai đoạn tôm chết (thả ? ngày) ………………………………………… ……………………………………………………………………………………… 129 ……………………………………………………………………………………… 19 Dấu hiệu tơm có tượng chết WSSV (mô tả): 20 Khi tôm nhiễm WSSV, tỷ lệ chết thường bao nhiêu? 21 Trước thời gian tôm chết thời tiết có khác thường? Các yếu tố mơi trường nhiệt độ nước, pH, S‰, khí độc, khí hậu ? 22 Khi tơm bắt đầu có tượng chết ơng (bà) có sử dụng thuốc để trị bệnh không? Hiệu quả? 23 Theo ơng (bà) tượng tơm chết WSSV có lây lan hộ khơng? Có Khơng Khơng biết 24 Khi tơm bị chết, lồi giáp xác khác ao (cua, cịng, tơm đất ) có bị chết khơng Có Khơng Khơng biết 25 Theo ơng (bà) WSSV nguyên nhân gây tượng tôm chết hàng loạt? Có Khơng 26 Sau kể từ tơm nhiễm WSSV, gia đình ni thả lại tơm? tháng 130 tháng vụ khác 27 Nhận định chủ quan, nguồn gốc tôm nhiễm WSSV từ đâu? 28, Bệnh WSSV xảy năm gần đây, có xảy ao ni gia đình, tích dấu (x), ghi rõ tháng mấy? 2014 2015 2016 Tên bệnh Vụ Vụ Vụ Vụ Vụ Vụ WSSV Ngày tháng .năm Người vấn 131 1.2 Hình ảnh danh mục sinh vật mang virus đốm trắng cơng bố giới DANH MỤC LỒI TƠM MANG VIRUS ĐỐM TRẮNG Farfantepenaeus aztecus Fenneropenaeus merguiensis Farfantepenaeus duorarum Fenneropenaeus penicillatus Fenneropenaeus indicus Litopenaeus stylirostris Metapenaeus dobsonii Marsupenaeus japonicas Litopenaeus setiferus Metapenaeus monoceros Metapenaeus ensis Metapenaeus brevicornis Penaeus penicillatus Penaeus semisulcatus Penaeus chinensis Penaeus duorarum Penaeus merguiensis Penaeus schmitti 132 Penaeus setiferus Penaeus aztecus Parapenaeopsis stylifera Solenocera indica Trachypenaeus curvirostris Alpheus sp Alpheus lobidens Alpheus brevicristatus Callianassa sp Macrobrachium rosenbergii Palaemon adspersus X Exopalaemon orientalis X Macrobrachium idella Macrobrachium lamerrae Exopalaemon carinicauda Panulirus homarus Panulirus longipes Panulirus ornatus Panulirus penicillatus Panulirus polyphagus Panulirus versicolor 133 Scyllarus arctus Astacus astacus Astacus leptodactylus Cherax destructor Cherax quadricarinatus Pacifastacus leniusculus Procambarus clarkii Orconectes limosus Orconectes punctimanus X Acetes sp Metapenaeus elegans Aristeus sp Metapenaeus affinis Heterocarpus sp Palaemon styliferus X Penaeus canaliculatus Solenocera crassicornis Seranopsis longipes Solenocera choprai Trachypenaeus curvirostris Squilla mantis 134 Farfantepenaeus Farfantepenaeus brasiliensis Macrobranchium nipponense paulensis 135 DANH MỤC LOÀI CUA NHIỄM VIRUS ĐỐM TRẮNG Atergatis integerrimus Calappa philarigus Uca arcuata Callinectes sapidus Callinectes arcuatus Cancer pagurus Carcinus maenas Charybdis annulata Charybdis feriatus Charybdis granulata Charybdis japonica Charybdis lucifera Charybdis natator Charybdis cruciata Charybdis hoplites Charybdis riversandersoni Charybdis cruciate Charybdis feriatus 136 X X Charybdis granulata Charybdis natatus Demania splendida Doclea hybrida Lio puber Gelasimus marionis nitidus Grapsus albolineatus Halimede ochtodes Helice tridens Liagore rubronaculata Liocarcinus depurator Liocarcinus puber X Lithodes maja Macrophthalmus sulcatus Matuta miersi Matura planipes Menippe rumphii Metapograpsus messor 137 Paradorippe granulate X X Paratelphusa hydrodomous Paratelphusa pulvinata X Phylira syndactyla Parthenope prensor Podophthalmus vigil Portunus pelagicus Portunus sanguinolentus Pseudograpsus intermedius Scylla serrata Scylla olivacea X Sesarma oceanica X Scylla paramamosain Somanniathelpusa tranquebaricca Uca pugilator 138 Thalamite danae DANH MỤC LOÀI THỰC VẬT PHÙ DU NHIỄM VIRUS ĐỐM TRẮNG Alexandrium tamarense Platymonas subcordiformis Isochrysis galbana Alexandrium minutum Heterosigma akashiwo Skeletonema costatum Isochrysis zhanjiangensis Scrippsiella trochoidea Chlorella sp Dunaliella salina 139 DANH MỤC LOÀI ĐỘNG VẬT PHÙ DU NHIỄM VIRUS ĐỐM TRẮNG Branchiopoda cladocera Branchiopoda Artemia franciscana Chaetognata Acartia clause Nitocra sp Brachionus urceu Brachionus plicatilis X Schmackeria dubia 140 DANH MỤC LỒI CƠN TRÙNG, GIUN NHIỀU TƠ VÀ NHUYỄN THỂ NHIỄM VIRUS ĐỐM TRẮNG Coleoptera Ephydridae Notonecta X Ranatra Dragon nymph Dendronereis spp Crassostrea gigas Perinereis sp X Marphysa gravelyi 141 ... đốm trắng gây bệnh cho tôm nuôi nước lợ số tỉnh miền Bắc 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Xác định yếu tố nguy gây bệnh đốm trắng virus cho tôm nuôi nước lợ vùng nghiên cứu Xác định loài động vật thủy sinh. .. vật mang virus đốm trắng gây bệnh cho tôm nuôi 20 2.3.1 Nghiên cứu sinh vật mang WSSV gây bệnh đốm trắng cho tôm giới 21 2.3.2 Nghiên cứu sinh vật mang WSSV gây bệnh đốm trắng cho tôm Việt... virus gây bệnh đốm trắng tôm nuôi nước lợ số tỉnh miền Bắc Việt Nam 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục tiêu chung Xác định số loài động vật thủy sinh chủ yếu có khả mang lan truyền virus