- Sinh viên biết phương pháp pha loãng, xác định một số chỉ tiêu trong đánh giá chất lượng tinh trùng vật nuôi. Đối tượng:[r]
(1)THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT Bộ môn CNSH Động vật-Khoa Công nghệ sinh học
BÀI 01
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHA CHẾ, BẢO QUẢN
MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG VÀ CÁCH SỬ DỤNG MỘT SỐ TRANG THIẾT BỊ CHỦ YẾU TẠI PHỊNG THÍ NGHIỆM CNSH ĐỘNG VẬT
Mục đích thực tập:
- Sinh viên biết cách tổ chức, bố trí khu vực chức phịng thí nghiệm CNSHĐV
- Sinh viên hiểu rõ thực hiện thao tác sử dụng trang thiết bị, dụng cụ thường dùng phịng thí nghiệm
- Sinh viên biết cách tra cứu, chuẩn bị pha chế mợt số hóa chất dùng nuôi cấy tế bào động vật
1 Nội dung:
1.1 Pha chế, bảo quản sử dụng số mơi trường thơng dụng phịng thí nghiệm CNSH động vật
1.1.1 Mơi trường, hóa chất, vật tư thông dụng - Môi trường PBS
- Môi trường DMEM - Môi trường TCM199 - Môi trường M12 - Môi trường M16 - Fetal Bovine Serum - Peniciline-Streptomycine - DMSO, Glycerol
- BSA, Hyaluronidase - Trypsin-EDTA
- Millipore
- Buồng đếm hồng cầu (Neubauer, Thoma) - Flask nuôi tế bào
- Đĩa thao tác nuôi tế bào loại
1.1.2 Pha ch môi trờng PBS vi thành phần nh sau (dïng pha lÝt): Hãa chÊt Khèi lưỵng (gram)
NaCl
Na pyruvate 0,036
KCl 0,2
Na2HPO4 1,15
KH2PO4 0,2
Glucose
MgCl2.6H2O 0,1
CaCl2.2H2O 0,1
(2)Bovine Serum Albumin 2-4 1.2 Sử dụng số trang thiết bị chủ yếu
1.2.1 Các khu vực chức phịng thí nghiệm - Khu vực xử lý mẫu
- Khu vực tiền khử trùng
- Khu vực thao tác nuôi cấy tế bào - Khu vực bảo quản tế bào
- Khu vực phụ trợ (cất giữ quần áo, vật tư, hóa chất…) 1.2.2 Trang thiết bị cách vận hành:
- Tủ hút an toàn sinh học cấp II - Kính hiển vi soi
- Bàn ấm để mẫu - Đồng hồ bấm giây
- Máy hút môi trường cầm tay - Tủ nuôi điều chỉnh CO2 - Bình chứa CO2 lỏng - Kính hiển vi phản pha - Bình Nitơ
- Cân phân tích, cân kỹ thuật - Máy đo pH
- Máy khuấy từ có gia nhiệt - Máy ly tâm thường
- Máy ly tâm lạnh - Bể rửa siêu âm - Máy vortex
- Máy làm ấm ống nghiệm - Máy bơm hút mini chân không - Tủ nuôi xách tay
- Kính hiển vi quang học
- Bàn ấm kính hiển vi soi - Kính hiển vi vi thao tác
- Tủ khử trùng có đèn cực tím - Tủ sấy
- Máy xung điện BTX - Máy cắt kim
- Máy mài kim - Máy cất nước - Máy khử ion nước - Máy PCR
- Máy Realtime PCR - Máy soi gel
BÀI 02
(3)Mục đích thực tập:
- Sinh viên hút trứng từ buồng trứng (lợn, bò, dê, trâu…), quan sát, thao tác đánh giá chất lượng trứng kính hiển vi soi Nikon SMZ1000
Đối tượng: - Buồng trứng (lợn, bò, dê, trâu…) thu vật bị chết, vận chuyển phịng thí nghiệm Các trứng bên nang chọc hút sử dụng bơm tiêm loại 5ml
2.1 Thu nhận trứng từ buồng trứng vật nuôi 2.1.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất
- Kính hiển vi soi Nikon SMZ1000 - Pipetman loại 1ml, 200ul
- Đĩa nhựa NUNC to (02 cái) - Đĩa nhựa NUNC bé (06 cái) - Bơm tiêm loại 5ml (01 cái) - Găng tay (01 cái)
- Môi trường PBS bổ sung kháng sinh, 10% FBS 2.1.2 Phương pháp tiến hành
Bước 1:
- Hút 20 ml môi trường PBS cho vào đĩa NUNC to số 01 pipetman loại 1ml Bước 2:
- Hút 02 ml môi trường PBS từ đĩa NUNC to 01 nói vào bơm tiêm Bước 3:
- Tay đeo găng cầm buồng trứng, nhẹ nhàng vừa chọc vừa hút nang bề mặt buồng trứng (lặp lại vài lần đến hút hết tất nang)
Bước 4:
- Tháo kim tiêm, bơm cẩn thận mơi trường có trứng, dịch nang, loại tế bào… từ bơm tiêm vào đĩa NUNC to số 01
Bước 5:
- Lặp lại bước vài lần đến hút hết tất nang bề mặt buồng trứng 2.2 Thao tác với trứng động vật bậc cao
Bước 6:
- Chuẩn bị đĩa 06 đĩa NUNC nhỏ (đánh số từ 01 đến 06, số tương ứng 01 sinh viên), đĩa nạp 03 ml mơi trường PBS (có bổ sung kháng sinh, 10% FBS)
- Soi tìm trứng (đĩa NUNC to 01) kính hiển vi soi NIKON SMZ1000 theo ngun tắc hình chữ “chi”
- Hút tồn bợ trứng có đĩa NUNC to 01 sử dụng pipetman loại 200ul, chuyển vào đĩa môi trường NUNC nhỏ số 01 (sinh viên làm chung bước này)
Bước 07:
- Từ đĩa NUNC nhỏ 01, sinh viên số 01 chuyển tồn bợ trứng sang đĩa NUNC nhỏ 02
- Từ đĩa NUNC nhỏ 02, sinh viên số 02 chuyển tồn bợ trứng sang đĩa NUNC nhỏ 03
- Tương tự với sinh viên khác
(4)hợp trạng thái nguyên sinh chất Bước 09:
- Nhóm sinh viên hội ý, ghi báo cáo kết
- Giáo viên hướng dẫn thực tập kiểm tra kết quả: sai khác < 20% so với kết giáo viên nhóm sinh viên đánh giá đạt u cầu, > 20% khơng đạt u cầu (phải thực hành lại vào buổi khác)
BÀI 03
(5)Mục đích thực tập:
- Sinh viên biết tìm thơng tin chọn lọc phương pháp, dụng cụ, vật tư, hóa chất để nhân nuôi in vitro tế bào động vật (www.invitrogen.com)
- Sinh viên quan sát, thu nhận, thao tác, đếm tế bào nhân nuôi, bảo quản lạnh tế bào granulose, cumulus sử dụng buồng đếm hồng cầu
Đối tượng:
- Trang web: www.invitrogen.com
- Tế bào granulose, cumulus động vật
3.1 Thu thập, đánh giá số lượng chất lượng tế bào 3.1.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất
- Tủ hút an tồn sinh học cấp II
- Kính hiển vi quang học NIKON E200 - Kính hiển vi phản pha NIKON TS100 - Đèn cồn, bật lửa
- Tủ nuôi điều chỉnh CO2 - Máy ly tâm
- Pipetman loại 1ml, 200ul - Đĩa nhựa NUNC to (01 cái) - Đĩa nhựa NUNC bé (02 cái) - Đĩa nhựa lỗ NUNC (01 cái)
- Ống ly tâm có nắp đậy loại 15ml (06 cái)
- Môi trường PBS bổ sung kháng sinh, 10% FBS - Môi trường DMEM bổ sung kháng sinh, 10% FBS - Trypsin-EDTA
- Hyaluronidase
- Dầu khoáng (Mineral Oil) - Dimethyl Sulfoxide (DMSO) - Kháng sinh Penni/Strep - Fetal Bovine Serum 3.1.2 Phương pháp tiến hành
Bước 1:
- Dùng pipetman loại ml hút dung dịch tế bào đĩa NUNC lớn 01 thực hành số 02, chia vào 02 ống ly tâm loại 15 ml (đã có sẵn 03ml PBS, 10%FBS kháng sinh), đậy nắp Cân đặt đối xứng 02 ống vào máy ly tâm
Bước 2:
- Ly tâm 1200 rpm/5 phút Bước 3:
3a - Hút bỏ môi trường bên mợt cách cẩn thận từ xuống, cịn khoảng 0,5 ml dừng lại
3b - Thêm mơi trường PBS (đã có bổ sung kháng sinh 10% FBS) vào ống ly tâm đến vạch 5ml, hút trộn mẫu
Bước 4:
(6)- Lấy 50 ul mẫu dung dịch có tế bào từ bước 3a, cho lên đĩa NUNC nhỏ, đặt lên kính hiển vi phản pha NIKON TS100 để quan sát
- Thêm 05ul Trypsin-EDTA/05ul Hyaluronidase để phân tách tế bào (02-03 phút/370C) (nếu cần)
Bước 6:
- Dùng môi trường PBS để pha loãng đếm số lượng tế bào sử dụng buồng đếm Thoma, kính hiển vi quang học NIKON E200 (chia 02 lượng tế bào có: ½ ni in vitro (bước 7-9), ½ bảo quản lạnh (bước 10-12))
3.2 Nhân nuôi in vitro tế bào tủ nuôi Bước 7:
- Chuẩn bị dung dịch 05 ml DMEM có tế bào với nồng độ 1x106 cho vào lỗ đĩa
nuôi 04 giếng NUNC, phủ dầu khoáng (0,5 ml/ giếng) Bước 8:
- Đậy nắp cho đĩa nuôi 04 giếng NUNC vào tủ nuôi đã điều chỉnh 37OC, 5%CO
Bước 9:
- Đánh giá khả sống tế bào vào ngày soi kính hiển vi phản pha NIKON TS100
3.3 Bảo quản lạnh tế bào Bước 10:
- Chuẩn bị dung dịch 02 ml DMEM có bổ sung 10% DMSO, 10% FBS Bước 11:
- Cho tế bào vào dung dịch DMEM nói Bước 12:
- Hạ nhiệt độ (+40C 30 phút, -200C 30 phút) bảo quản lạnh tế bào ơ
-1960C Giải đông 370C-01 phút, kiểm tra chất lượng tế bào
BÀI 04
(7)- Sinh viên biết phương pháp pha loãng, xác định một số tiêu đánh giá chất lượng tinh trùng vật nuôi
Đối tượng:
- Tinh trùng lợn, bò
4.1 Chuẩn bị buồng đếm mẫu tinh trùng
4.1.1 Tính tốn nồng độ tế bào cách sử dụng buồng đếm: C: Nồng độ tế bào ban đầu (số lượng tế bào/ml)
N: Số lượng tế bào đếm 05 ô lớn H: Hệ số pha loãng (giả sử 20 lần)
Buồng đếm Thoma, Neubauer có ba thơng số sau: - Mợt ô lớn gồm 16 ô nhỏ
- Độ sâu ô nhỏ lớn: 0,1mm
- Diện tích mặt đáy mợt nhỏ: 1/400 mm2
C = ?
- Sau hợi ý, nhóm sinh viên điền kết sau dấu ? báo cho giáo viên hướng dẫn thực tập kết
- Giáo viên hướng dẫn tiếp nhận kết 4.2 Xác định số lượng tinh trùng
- Bất hoạt tinh trùng dung dịch NaCl 10%
- Cho 07 ul mẫu lên buồng đếm đã gắn lamen tiêu chuẩn
- Xác định vị trí đếm kính hiển vi Nikon, vật kính từ nhỏ đến lớn (từ 04 đến 40)
- Vi chỉnh kính hiển vi để nhìn rõ tinh trùng buồng đếm
- Đếm số lượng tinh trùng 05 ô lớn (lặp lại 03 lần cho mẫu tinh trùng) tính trung bình
4.3 Xác định tinh trùng kỳ hình
- Tinh trùng kỳ hình: tinh trùng có hình dạng khác thường so với tinh trùng bình thường khơng có khả thụ thai
(8) (www.invitrogen.com)