Nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn từ chủng cường độc

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỖ THỊ LIÊN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘC GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN TỪ CHỦNG CƯỜNG ĐỘC Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Trần Anh Đào NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Thị Liên i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập hồn thành luận văn tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ quý báu quý thầy cô, anh chị bạn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa thú y, thầy cô giáo Học Viện Nông Nghiệp Việt nam chia sẻ tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trường Nhân dịp hoàn thành luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc tới Thầy, Cô giáo Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Trần Anh Đào môn Bệnh Lý, Khoa Thú y – Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam, người tận tình hướng dẫn suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Đồng thời bày tỏ biết ơn đến Thầy, Cô môn Bệnh Lý, khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, anh chị phịng thí nghiệm trung tâm tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp tốt Xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Thị Liên ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Lịch sử tình hình dịch bệnh PRRS lợn 2.1.1 Tình hình dịch PRRS giới 2.1.2 Tình hình dịch PRRS Việt Nam 2.2 Hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản (PRRS) 2.2.1 Căn bệnh 2.2.2 Đặc điểm dịch tễ học 13 2.2.3 Triệu chứng 16 2.2.4 Bệnh tích 18 2.2.5 Chẩn đoán 19 2.2.6 Biện pháp phòng điều trị 21 2.3 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào nghiên cứu virus học 23 2.3.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 23 2.3.2 Điều kiện nuôi cấy 24 2.3.3 Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào 25 2.3.4 Khả tiếp truyền virus PRRS dòng tế bào MARC-145 25 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 27 3.1 Địa điểm nghiên cứu 27 3.2 Thời gian nghiên cứu 27 3.3 Vật liệu nghiên cứu 27 iii 3.3.1 Nguyên liệu 27 3.3.2 Động vật thí nghiệm 27 3.3.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 27 3.4 Nội dung nghiên cứu 27 3.5 Phương pháp nghiên cứu 28 3.5.1 Phương pháp tiếp truyền virus tế bào MARC-145 28 3.5.2 Giám định virus PRRS phương pháp RT-PCR 31 3.5.3 Bố trí thí nghiệm 35 3.5.4 Xác định hàm lượng kháng thể có máu 37 3.5.5 Phương pháp khám lâm sàng 38 3.5.6 Phương pháp đo tiêu huyết học 38 3.5.7 Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể 38 3.5.8 Phương pháp làm tiêu bệnh lý 39 3.5.9 Phương pháp xử lý số liệu 40 Phần Kết thảo luận 41 4.1 Kết đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-08 qua đời cấy chuyển 41 4.1.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào CPE chủng virus cường độc KTY-PRRS-08 qua đời cấy chuyển 41 4.1.2 Kết xác định hiệu giá virus qua đời cấy chuyển 43 4.1.3 Kết xác định đường cong nhân lên môi trường tế bào 44 4.2 Kết đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-08 qua đời cấy chuyển 47 4.2.1 Kết so sánh tương đồng nucleotide gen ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu đời cấy chuyển khác 47 4.2.2 Kết giải trình tự amino acid 52 4.3 Kết tính kháng nguyên chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường marc-145 đời 90 56 4.4 Kết nghiên cứu độc lực chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường marc-145 đời 90 58 4.4.1 Kết theo dõi thân nhiệt lợn trước sau gây nhiễm virus 58 4.4.2 Kết theo dõi tần số hô hấp lợn trước sau gây nhiễm virus 60 iv 4.4.3 Kết theo dõi triệu chứng lợn sau gây nhiễm virus 62 4.4.4 Kết theo dõi số tiêu huyết học lợn sau gây nhiễm virus 62 4.4.5 Kết biến đổi bệnh lý đại thể lợn thí nghiệm 64 4.4.6 Kết biến đổi bệnh lý vi thể lợn thí nghiệm 65 Phần Kết luận kiến nghị 66 5.1 Kết luận 66 5.2 Kiến nghị 67 Tài liệu tham khảo 68 Phụ lục 73 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng việt Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DPI Day Post Inoculated DWP Deep-well-plate ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay H.E Hematoxylin & Eosin IPMA Immuno – Peroxidase Monolayer Assay LDHV Lactic dehydrogennase virus NXB Nhà xuất OIE Tổ chức thú y giới PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome RNA Virus RT – PCR Ribonucleic Acid TPB Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction TCID50 Tryptose Phosphate Broth TMB Tissue Culture Infective fifty percent Dose 3,3’,5,5’-Tetrammethylbenzidine vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Protein cấu trúc PRRSV Bảng 2.2 Sức đề kháng PRRSV 12 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng RT-PCR 31 Bảng 3.2 Các bước thực phản ứng RT-PCR 32 Bảng 3.3 Bảng bố trí thí ngiệm 36 Bảng 4.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào (CPE) môi trường tế bào MARC-145 42 Bảng 4.2 Kết giám định bệnh tích tế bào RT-PCR 42 Bảng 4.3 Kết xác định hiệu giá virus qua đời cấy chuyển 43 Bảng 4.4 Vị trí sai khác nucleotide chủng KTY-PRRS-08 sau đời cấy chuyển khác tế bào MARC-145 50 Bảng 4.5 So sánh tương đồng nucleotide đoạn gene ORF5 chủng KTY-PRRS08 đời cấy chuyển 51 Bảng 4.6 Vị trí sai khác amino acid chủng KTY-PRRS-08 đời cấy chuyển tế bào MARC-145 54 Bảng 4.7 So sánh tương đồng amino acid đoạn gene ORF5 chủng KTYPRRS-08 đời cấy chuyển 55 Bảng 4.8 Kết xét nghiệm kháng thể kháng PRRSV lợn trước gây nhiễm chủng virus KTY-PRRS-08 56 Bảng 4.9 Kết xét nghiệm kháng thể sau gây nhiễm chủng virus KTYPRRS-08 cấy chuyển môi trường MARC-145 đời 90 57 Bảng 4.10 Kết theo dõi thân nhiệt lợn trước sau gây nhiễm virus 59 Bảng 4.11 Kết theo dõi tần số hô hấp lợn trước sau gây nhiễm virus 61 Bảng 4.12 Kết theo dõi triệu chứng lợn sau gây nhiễm virus 62 Bảng 4.13 Kết theo dõi số tiêu huyết học lợn sau gây nhiễm virus .63 Bảng 4.14 Bệnh tích đại thể số khí quan lợn thí nghiệm 64 Bảng 4.15 Bệnh tích vi thể số khí quan lợn thí nghiệm 65 Bảng 4.16 Bệnh tích vi thể số khí quan lợn lơ đối chứng 65 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ tình hình dịch bệnh PRRS độc lực cao châu Á từ năm 2006 đến năm 2010 Hình 2.2 Hình thái virus PRRS .7 Hình 2.3 Cấu trúc gen PRRSV Hình 2.4 Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào 14 Hình 4.1 Đường biểu diễn nhân lên phát triển chủng virus KTYPRRS-08-P#10 44 Hình 4.2 Đường biểu diễn nhân lên phát triển chủng virus KTYPRRS-08-P#30 45 Hình 4.3 Đường biểu diễn nhân lên phát triển chủng virus KTYPRRS-08-P#90 45 Hình 4.4 So sánh trình tự nucleotide gene ORF5 chủng virus KTYPRRS-08 qua đời cấy chuyển 49 Hình 4.5 So sánh trình tự amino acid gene ORF5 chủng virus KTYPRRS-08 qua đời cấy chuyển 53 Hình 4.6 Biểu đồ diễn biến hàm lượng kháng thể kháng chủng virus KTYPRRS-08-P#90 máu lợn thí nghiệm 58 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thị Liên Tên Luận văn: Nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn từ chủng cường Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn từ chủng cường độc phân lập Việt Nam phục vụ công tác chế tạo vacxin phịng Hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản lợn Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tiếp truyền virus tế bào MARC-145, phương pháp chiết tách ARN, phương pháp RT-PCR phương pháp giải trình tự gen, phương pháp đọc kết giải trình tự gen, phương pháp ELISA, phương pháp khám lâm sàng, phương pháp đo tiêu huyết học, phương pháp xử lý số liệu Kết kết luận Đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển Chủng KTY-PRRS-08 bắt đầu gây bệnh tích tế bào vào thời điểm 12 bệnh tích đạt 100% vào thời điểm 60 sau gây nhiễm đời tiếp truyền đời tiếp truyền thứ 30 Từ đời tiếp truyền 40 đến 90, thời điểm bắt đầu xuất bệnh tích tế bào sớm thời điểm bệnh tích đạt 100% rút ngắn xuống cịn 48 Chủng virus KTY-PRRS-08 có hiệu giá tương đối cao, ổn định qua đời cấy chuyển, hiệu giá virus cao xác định đời 50 với giá trị 8,12 ± 0,87 x 107 Quy luật nhân lên chủng virus KTY-PRRS-08 có thay đổi đời từ đời 30 Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển Đã xác định trình tự nucleotide đoạn ORF5 chủng KTY-PRRS-08 đời cấy chuyển Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 chủng virus KTY-PRRS-08 có kích thước 603bp mã hố cho 200 amino acid protein kháng nguyên GP5 Trình tự nucleotide axit amin đoạn gen ORF5 chủng nghiên cứu qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 tương đối ổn định, ix Bảng 4.11 Kết theo dõi tần số hô hấp lợn trước sau gây nhiễm virus LôTN Lô ĐC n=3 n=3 X ± mx X ± mx 19,4 ± 0,2 17,5 ± 0,3 19,5 ± 0,3 15,6 ± 0,1 18,6 ± 0,1 18,4 ± 0,2 17,4 ± 0,2 18,5 ± 0,3 19,4 ± 0,2 19,5 ± 0,3 19,5 ± 0,3 15,6 ± 0,1 18,6 ± 0,1 19,4 ± 0,2 20,4 ± 0,2 15,4 ± 0,2 24,4 ± 0,2 14,5 ± 0,3 25,4 ± 0,2 19,6 ± 0,1 19,5 ± 0,3 16,4 ± 0,2 19,6 ± 0,1 19,5 ± 0,3 16,4 ± 0,2 19,6 ± 0,1 15,4 ± 0,2 19,4 ± 0,2 19,4 ± 0,2 15,5 ± 0,3 18,5 ± 0,3 18,4 ± 0,5 10 19,5 ± 0,3 16,5 ± 0,5 11 16,4 ± 0,2 19,5 ± 0,3 12 19,4 ± 0,2 18,5 ± 0,3 13 14,5 ± 0,3 17,5 ± 0,3 14 15,6 ± 0,1 19,5 ± 0,2 15 19,4 ± 0,2 18,5 ± 0,3 16 16,4 ± 0,2 19,2 ± 0,3 17 17,5 ± 0,3 16,5 ± 0,3 18 16,6 ± 0,1 16,5 ± 0,3 19 18,4 ± 0,2 19,5 ± 0,3 20 19,5 ± 0,1 16,5 ± 0,3 21 16,4 ± 0,1 18,5 ± 0,3 Thời gian theo dõi ( ngày) Trước gây nhiễm virus Sau gây nhiễm virus 61 4.4.3 Kết theo dõi triệu chứng lợn sau gây nhiễm virus Các triệu chứng lâm sàng ln có ý nghĩa vơ quan trọng góp phần tích cực cơng tác chẩn đốn nghiên cứu lĩnh vực thú y Trước gây nhiễm virus tiến hành theo dõi triệu chứng lâm sàng lợn Kết cho thấy trước lợn gây nhiễm virus khơng có triệu chứng lâm sàng bệnh như: sốt, giảm ăn, bỏ ăn, táo bón, chảy nước mũi, tiêu chảy, thở khó … Kết theo dõi triệu chứng lâm sàng lợn thí nghiệm sau gây nhiễm virus động vật trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Kết theo dõi triệu chứng lợn sau gây nhiễm virus Triệu chứng lâm sàng Sốt Giảm ăn, bỏ ăn Phát ban Mí mắt sưng Ho, khó thở Tím tái Chảy nước mũi Tiêu chảy Táo bón TN1 + - - - - - - - - TN2 + - - - - - - - - TN3 + - - - - - - - - ĐC1 - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - ĐC3 - - - - - - - - - STT Lô TN Lô ĐC Ghi chú: (-) Không biểu (+) Biểu Qua bảng 4.12 cho thấy lợn thí nghiệm sau gây nhiễm virus sốt nhẹ lợn đối chứng khơng có biểu sốt Các triệu chứng lâm sàng khác như: bỏ ăn hay giảm ăn, ho, khó thở, mí mắt sưng, tím tai, cháy nước mũi, táo bón, ỉa chảy, không biểu lô đối chứng lơ thí nghiệm 4.4.4 Kết theo dõi số tiêu huyết học lợn sau gây nhiễm virus Trong thể, máu cung cấp chất dinh dưỡng, dưỡng khí cho tổ chức tế bào, đưa chất thải đến quan tiết Nó mối liên hệ bên 62 tỏ chức quan thể Máu cịn có chức bảo vệ thể Khi thể bị bệnh có chất lạ xâm nhập vào thể tính chất, thành phần máu có thay đổi tương ứng đặc hiệu mà dựa vào để chẩn đốn bệnh Bảng 4.13 Kết theo dõi số tiêu huyết học lợn sau gây nhiễm virus Thời gian Chỉ tiêu SLHC (triệu/µl) (n=3) 110,05±0,85 113,2±0,24 7,56±0,52 7,5±0,5 53,2±0,22 53,08±0,18 BCAT (%) 5,48±0,17 5,6±0,37 BCAK (%) 0,58±0,54 0,48±0,34 BCDNL (%) 6,22±0,94 6,3±0,34 34,52±0,74 34,54±0,44 6,21±0,42 6,18±0,43 115,35±0,15 112,2±0,4 11,07±0,2 7,4±0,4 55,22±0,21 53,22±0,41 BCAT (%) 5,46±0,17 5,46±0,7 BCAK (%) 0,62±0,54 0,6±0,44 6,2±0,94 6,3±0,14 32,5±0,74 34,42±0,24 Trước gây BCĐNTT (%) Tế bào Lympho (%) SLHC (triệu/µl) Hàm lượng Hb (g/l) SLBC (nghìn/µl) nhiễm (n=3) 6,15±0,4 SLBC (nghìn/µl) Sau gây Lơ ĐC 6,01±0,14 Hàm lượng Hb (g/l) nhiễm Lô TN BCĐNTT (%) BCDNL (%) Tế bào Lympho (%) Trong số nhiều tiêu sinh lý máu tiến hành kiểm tra số tiêu quan trọng, bao gồm: số lượng hồng cầu, hàm lượng Hb, bạch cầu toan, bạch cầu kiềm, bạch cầu đơn nhân lớn, số lượng bạch cầu, bạch cầu đa nhân trung tính, tế bào lympho 63 Kết bảng 4.13 cho thấy, số tiêu sinh lý máu như: số lượng hồng cầu, hàm lượng Hb, bạch cầu toan, bạch cầu kiềm, bạch cầu đơn nhân lớn lợn lơ đối chứng thí nghiệm trước sau gây nhiễm virus khơng có biến đổi nhiều, dao động xung quanh số sinh lý bình thường Tuy nhiên, số lượng bạch cầu, bạch cầu đa nhân trung tính, tế bào lympho lại có thay đổi đáng kể lợn thí nghiệm sau gây nhiễm virus KTY-PRRS-08 so với lợn đối chứng số lượng bạch cầu tăng từ 7,56±0,52 nghìn/µl tới 11,07±0,2 nghìn/µl, bạch cầu đa nhân trung tính tăng 53,2% tới 55,22%, tế bào lympho 34,52% giảm xuống 32,5% Điều lợn gây nhiễm virus, thể tự huy động bảo vệ thể để chống lại tác nhân lạ xâm nhập vào thể Trong có tượng thực bào, mà vai trò lớn bạch cầu đa nhân 4.4.5 Kết biến đổi bệnh lý đại thể lợn thí nghiệm Đối với lợn thí nghiệm thời gian theo dõi tiến hành mổ khám quan sát biến đổi bệnh lý đại thể Kết thể bảng 4.14 Bảng 4.14 Bệnh tích đại thể số khí quan lợn thí nghiệm STT Số có biểu Bệnh tích KTY-PRRS-08 Lơ đối chứng Viêm màng phổi 0/3 0/3 Phổi xuất huyết 0/3 0/3 Phổi đặc căng phồng 0/3 0/3 Hạch phổi có bệnh tích 0/3 0/3 Ruột non xuất huyết 0/3 0/3 Ruột già xuất huyết 0/3 0/3 Thận xuất huyết 0/3 0/3 Tổn thương gan 0/3 0/3 Tổn thương tim 0/3 0/3 10 Tổn thương lách 0/3 0/3 11 Tổn thương hạch amidan 0/3 0/3 12 Tổn thương não 0/3 0/3 64 Kết quan sát bệnh tích đại thể lơ thí nghiệm gây nhiễm với chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường MARC-145 đời 90 khơng quan sát thấy có bệnh tích đại thể quan giống với lô đối chứng 4.4.6 Kết biến đổi bệnh lý vi thể lợn thí nghiệm Với lợn thí nghiệm, sau mổ khám quan sát biến đổi đại thể, tiến hành lấy mẫu quan: phổi, lách, hạch lâm ba, thận, ruột ngâm bảo quản formalin 10% sau làm tiêu vi thể, nhuộm đọc kính hiển vi thu kết bệnh tích vi thể lơ thí nghiệm lơ đối chứng trình bày bảng 4.15 4.16 Bảng 4.15 Bệnh tích vi thể số khí quan lợn thí nghiệm Phổi Hạch phổi Hạch amidan Gan lách Thận tim Sung huyết 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Xuất huyết 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Thâm nhiễm tế bào 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Thoái hoá tế bào 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Huyết khối lòng mạch 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Tăng sinh tế bào 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Tăng sinh nang lympho 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Bệnh tích Hạch Ruột ruột Bảng 4.16 Bệnh tích vi thể số khí quan lợn lơ đối chứng Bệnh tích Phổi Hạch Hạch phổi amidan Gan Lách Thận Tim Hạch Ruột ruột Sung huyết 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Xuất huyết 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Thâm nhiễm tế bào 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Thoái hoá tế bào 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Huyết khối lòng mạch 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Tăng sinh tế bào 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Tăng sinh nang lympho 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Kết quan sát bệnh tích vi thể lơ đối chứng khơng quan sát thấy có bệnh tích vi thể quan giống với lô đối chứng 65 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết thu nghiên cứu chúng tơi có số kết luận sau: Đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển Chủng KTY-PRRS-08 bắt đầu gây bệnh tích tế bào vào thời điểm 12 bệnh tích đạt 100% vào thời điểm 60 sau gây nhiễm đời tiếp truyền đời tiếp truyền thứ 30 Từ đời tiếp truyền 40 đến 90, thời điểm bắt đầu xuất bệnh tích tế bào sớm thời điểm bệnh tích đạt 100% rút ngắn xuống cịn 48 Chủng virus KTY-PRRS-08 có hiệu giá tương đối cao, ổn định qua đời cấy chuyển, hiệu giá virus cao xác định đời 50 với giá trị 8,12 ± 0,87 x 107 Quy luật nhân lên chủng virus KTY-PRRS-08 có thay đổi đời từ đời 30 Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển Đã xác định trình tự nucleotide đoạn ORF5 chủng KTY-PRRS08 đời cấy chuyển Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 chủng virus KTY-PRRS-08 có kích thước 603bp mã hố cho 200 amino acid protein kháng nguyên GP5 Kết phân tích trình tự nucleotide amino acid cho thấy chủng virus KTY-PRRS-08 có ổn định di truyền kháng nguyên sau 90 đời cấy chuyển với mức độ tương đồng cao từ 98,67% đến 100% nucleotide từ 97% đến 100% amino acid Tính kháng nguyên chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường MARC-145 đời 90 Sau 10 ngày gây nhiễm có hàm lượng kháng thể máu lợn thí nghiệm gây nhiễm virus chủng KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường MARC-145 đời 90 66 Thử độc lực chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường MARC-145 đời 90 Chủng virus cường độc KTY-PRRS-08 nhược độc sau 90 đời cấy chuyển 5.2 KIẾN NGHỊ Bệnh PRRS bệnh phổ biến, gây nhiều thiệt hại to lớn cho người chăn nuôi Hiện chưa có thuốc chữa trị mang lại hiệu bên cạnh chưa có nhiều chủng vacxin phịng bệnh hồn tồn đề tài theo dõi ngày trở nên cấp thiết hết Tuy nhiên điều kiện không cho phép nên nghiên cứu chủng virus KTY-PRRS-08 Để nghiên cứu hoàn thiện đưa kiến nghị: Tiếp tục thu thập thêm mẫu nghi bệnh từ thực địa để tìm thêm chủng virus phục vụ cho sản xuất vacxin vô hoạt Tiếp tục nghiên cứu để giải trình tự gen đoạn gen cịn lại virus PRRS tiến tới giải trình tự toàn hệ gen virus phát biến chủng để chế tạo vacin có hiệu phòng bệnh cao Tiếp tục nghiên cứu thêm biểu lâm sàng, tiêu huyết học hàm lượng kháng thể lợn tiêm thử nghiệm chủng virus KTY-PRRS08 qua đời cấy chuyển để có tranh hoàn thiện chủng virus thử nghiệm 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bùi Quang Anh Nguyễn Văn Long (2007) Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp (lợn tai xanh) tình hình Việt nam Diễn đàn khuyến nông công nghệ, Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn, tháng 8/2007 Cục Thú Y (2007) Báo cáo hội thảo khoa học phịng chống hội chứng Rối loạn hơ hấp sinh sản lợn, ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội Hoàng Văn Năm (2001) Hội chứng sinh sản hô hấp lợn (bài dịch tổng hợp) Tạp chí khoa học thú y Số 1/2002 Tr 74- 87 Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2009) Giáo trình Miễn dịch học thú y, Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh Đỗ Ngọc Thuý (2012) Giáo trình Bệnh Truyền Nhiễm Thú Y, Nhà xuất Đại Học Nông Nghiệp Nguyễn Hữu Nam Nguyễn Thị Lan (2007) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp-sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Ngọc Hải Võ Khánh Hưng (2012) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp-sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, Đại học Nông Nghiệp hà Nội Nguyễn Văn Thanh (2007) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS), Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội Phạm Xuân Bảo (2013) Đánh giá hiệu sử dụng vacxin nhược độc đơng khơ chủng JXA1-R thể độc lực cao phịng, chống hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn tỉnh Quảng Nam Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 10 Tiêu Quang An Nguyễn Hữu Nam (2011) Một số đặc điểm bệnh lý đại thể vi thể lợn bị Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) Tạp chí khoa học Thú y, Tập XVIII, số 6-2011, trang 24-30 11 Tô Long Thành, Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Khoa học kỹ 68 thuật Thú Y tập XIV, số 3/2007, Tr.81-88 12 William Tchristianson Han Soo Joo (2001) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) Tạp chí KHKT Thú y, (tập VIII) số - 2001, tr 74 – 86 Tiếng Anh: 13 Ansari, I H., Kwon, B., Osorio, F A & Pattnaik, A K (2006) Influence of Nlinked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies J Virol 80, 3994-4004 14 Ausvetplan (2004) Disease stratery porcine reproductive and respỉatory syndrome 15 Benfield DA and Nelson (1992) Characterrization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus, South Dakota; South Dakota State University, NPPC Final Report 1705 16 Bierk M.S., Dee, K.Rossow, J.Collins, S.Otake and T.Monitor (2011) Transmission of PRRS virus from persistently infected sows tocontact controls, Can.J.Vet.Res 65(4) 261-266 17 Botner A, B Strandbygaard, K, J Sorensen, P Have, K G Madsen, S Madsen and S Alexandersen (1997) Appearance of acute PRRS- like symptom in sow herds after vacinasion with a modified live vaccine, Vet Rec 141:497- 499 18 Bush J.A and W.N Wintrobe (1995) Blood volume Studisesn in nomal and Anemic swine, Am.J.Physilo pp, 181-192 19 Coles (2004) Veterinary clinical pathology, Third edition, Part 16, Microbiology 20 Collins J.E., D.A Benfield, W.T Christianson, L Harris, J.C Hennings, D.P Shaw and S.M Goyal (1992) Isolation of swine intertility and expiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North American and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs, J.vet Diagn Invest 4, 117-126 21 Dea S., C A Gagnon, H Mardassi, B Pirzadeh and D Rogan (2000) Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates Arch Virol 145, 659-688 69 22 Gao Z.Q., X Guo and H.C Yang (2004) Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus Archives of virolory 149, 1341-1351 23 Gilbert S.A and R Larochelle (1996) Typing of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome viruses by a Multiplex PCR Assay, Journal or Clinical Microiology, 264-267 24 Grebennikova T.V., A.V Syroeshkin, M.I Musienko, A.D Zaberezhny and T.I Aliper (2005) Changes of microelement content in Marc-145 cells before and after infection with virulent and attenuated strains of PRRS virus 2005 International PRRS Symposium Westport Conference Center, St Louis, Missouri December 2-3, 2005 25 Han-kook C., C Choi, J Kim and C Chae (2002) Detection and differentiation of North American and European genotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by multiplex reverse transcription-nested PCR, p59 26 Han J and Y Wang (2006) Complete genome analanysis of RFLP 184 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Virus research 122, 175183 27 Kappes M A and K S Faaberg (2015) PRRSV structure, replication and recombination: Origin of phenotype and genotype diversity Virology 479-480, 475-486 28 Keffaber K.K (1989) Presented at the American Swine Practioner 29 Kim H.S., J Kwang, H.S Joo and M.L Frey (1993) Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homegenneus subpopulation of MA-104 cell line Arch Virol., 133:477-483 30 Leng X., Li Z., Xia M., He Y and Wu H (2012) Evaluation of the Efficacy of an Attenuated Live Vaccine against Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Young Pigs Clinical and Vaccine Immunology 19 (8): 1199–1206 31 Meng, X.J., P S Paul, P G Halbur and I Morozov (1995) Sequence comparison of open reading frames to of low and high virulence United States isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus J Gen 70 Virol 76:3181-3188 32 Murtaught M.P and M.R Elam (1995) Comparation of the structure protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus, Archives of Virology, 1451-1460 33 Nelsen C.J and GenBank (1998) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Resp PRRS MLV, complete genome, May 15 34 Nodejil G and M Nielen (2003) A review of Porcine Rproductive and Respiratory syndrome virus in Dutch breeding herd, population dynamics and clinical relevance 35 Ostrowski M., J A Galeota, A M Jar, K B Platt, F A Osorio and O J Lopez (2002) Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain J Virol 76, 42414250 36 Prieto C and J.M Castro (2000) Pathogennesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRS) in gestating sows, Vet.Res, số31:56-57 37 Rossow K.D (1998) Porcine reproductive and respiratory syndrome, Vet, Pathol, 1-20 38 Terpstra C., G Wensvoort and J.M.A Pol (1991) Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad virus: Koch’s postulates fulfilled, The Veterinary Quarterly, vol 13, No.3, pp 131 – 136, Jul 39 Wang X., M Eaton, M Mayer, H Li, D He, E Nelson and H J Christopher (2007) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus productively infects monocyte-derived dendritic cells and compromise their antigene-presenting ability, Arch Virol (2007) số 152:289-303 40 Wensvoort G., C Terpstra, J M Pol, E A ter Laak, E P M Bloemraad, de Kluyver, C Kragten, L van Buiten, A den Besten and F.Wagenaar (1991) Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelýtad virus, Vet Q, số 13:121-30 41 Yin G., L Gao, X Shu, G Yang, S Guo and W Li (2012) Genetic diversity of the ORF5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in southwest China from 2007 to 2009 PLoS One 7, e33756 71 42 Yoon K.J and G Stevenson (1999) Porcine reproductive and respiratory syndrome, Trends in emerging viral infection of swine, số Iowa State Press p347354 43 Yu X., Z Zhou, Z Cao, J Wu, Z Zhang, B Xu, C Wang, D Hu, X Deng, W Han, X Gu, S Zhang, X Li, X Wang and K Tian (2015) Assessment of the Safety and Efficacy of an Attenuated Live Vaccine Based on Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Clin Vaccine Immunol 22(5): 493-502 44 Zimmerman J.J., K.J Yoon, R.W Willis and S.L Swenson (1997) General overview of PRRSv: a perspective from the united states, veterinary microbiology 55:187-196 72 PHỤ LỤC 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi Hình ảnh gây nhiễm virus chủng KTY-PRRS-08 môi trường tế bào MARC-145 73 Kính hiển vi soi ngược Máy PCR Ni cấy tế bào 74 Bảng ký hiệu amino acid Tên amino acid Tên viết tắt Ký hiệu G Glycine Gly Alanine Ala A Valine Val V Leucine Leu L Isoleucine Ile I Methionine Met M Phenylalanine Phe F Tryptophan Trp W Proline Pro P Serine Ser S Threonine Thr T Cysteine Cys C Tyrosine Tyr Y Asparagine Asn B Glutamine Gln Q Aspartic acid Asp D Glutamic acid Glu E Lysine Lys K Arginine Arg R Histidine His H 75 ... nghiên cứu Tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn từ chủng cường độc phân lập Việt Nam phục vụ công tác chế tạo vacxin phịng Hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản lợn Phương... hấp sinh sản lợn từ chủng cường độc? ?? 1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn từ chủng cường độc phân lập Việt Nam phục vụ công tác chế tạo vacxin... nhược độc từ chủng cường độc phân lập từ thực địa điều cần thiết Xuất phát từ thực tế chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh