Nghiên cứu các đặc tính sinh học của một số loài cây quý hiếm có nguy cơ bị tiêu diệt ở việt nam làm cơ sở cho công tác bảo tồn 2000 2001

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT s LỒI CÂY QUỶ HIẾM CĨ NGUY Cơ BỊ TIÊU DIỆT VIỆT NAM LÀM c s CHO CÔNG TÁC BẢO TỔN (2000-2001 ) MÃ SỐ: QT - 00 - 21 CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI : PGS.TSKH NGUYỄN NGHĨA THÌN CÁN BƠ PHỐI HOP: GS.TS NGUYỄN BÁ GS.TS VŨ VẨN VỤ PGS.TS NGUYỄN VẢN MUI 0Ĩ Ị o o u o Tên để tài: NGHIÊN c ứ u CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LỒI CÂY QUÝ HIÊM CÓ NGUY c BỊ TIÊU DIỆT ỏ VIỆT NAM LÀM C SỞ CHO CÔNG TÁC BẢO TỒN (2000-2001) MÃ SỐ: QT - 00 - 21 Chủ trì để tái: PGS.TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn T e l /F a x : - - 8 , E m ail! nnthin@bio-hu.ac.vn Các cán phôi hợp: - GS.TS Nguyễn Bá - GS.TS Vu Văn Vụ " PGS.TS.Nguyễn Văn Mùi Mục tiêu nội dung nghiên cứu: - Mục tiêu xây dụng đề tài nhằm tập hợp nhà khoa học thuộc íĩnh vực khác Khoa giải đối tượng nghiên cứu - Bước đầu đánh giá đặc tính sinh học: hình thái học, sinh thái học, khả tái sinh số lồi q làm sở cho cơng tác bảo tổn Các kết đạt được: + Mô tả đặc điểm hình thái học lồi q lựa chọn: Bách xanh - Cơiucedrus macrolepis, Pơ mu - Fokienia hodginsii, Sa mu dầu - Cunninghamia konishii Bản báo cáo cho thấy giá trị loài cho tinh dầu gỗ quý + Đánh giá tính chất sinh thái phân bố lồi Đó lồi sót lại, thích nghi với điều kiện lạnh với nhiệt độ trung bình 15° c , với lương mưa từ 1200 mm trở lên chúng phân bố chủ yếu 1000 m so với mặt biển + Đã theo dõi khả tái sinh loài cho thấy Bách xanh lồi khó tái sinh hạt lồi cịn lại tái sinh hạt + Hiên trang nguyên nhân thu hep khu phân bố: Do nguồn gốc lồi sót lại nên điều kiện không phù hợp làm cho khả phát triển Hơn giá trị gỗ dầu nên chúng đối tương săn lùng người dân bọn lâm tặc Đó nguyên nhân làm thu hẹp khu phân bố + Khả nhân giơng nhân vơ tính: Vì khả tái sinh hat Bách xanh khả thu hạt khó viêc nghiên cứu khả tái sinh hom cấp thiết Theo kết thu tài liệu nghiên cứu trước cho thấy - loài có khả tái sinh hom tốt với thuốc AIB nồng độ 1-1,5% chiều dài rễ lớn sau 2-4 tháng Kết cho ta sở để bảo tồn chúng nhân giống vơ tính Tinh hình kinh phí để tài: + Kinh phí đề tài cấp: 10 triệu + Kinh phí chi theo dự tốn: 10 triệu CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI PGS.TSKH NGUYÊN NGHĨA THÌN .1 Project Title: No: QT-00-21 Study on biological characteristics o f some endagenred species fo r conservation o f genetic resources in Vietnam T itle H e a d e r: Ass Prof Dr Sc Nguyen Nghia Thin - Position: Head ol' Departm ent of Bolany, Vietnam National University Hanoi Tel/Fax: 8582178, - Collaborating Scientists: Prof Dr Nguyen Ba Prof Dr Vu Van Vu Ass Prof Dr Nguyen Van Mu ị Subject!ves of Project 3.1 Subjectives 3.1 G r o u p in g dif ferent scientists in Fac ult y o f Biology to s ys te ma tic all y research a scientific topic 3.2 A s s e s s m e n t o f biological char act ers lor en d a n g e r e d plant species: m o rp h o l o g ic a l, ecological, cap ability o f na turally rege neration, cau s c s OÍ' n a rr o w e d areas and 3.2 R esults obtained: - De sc rib in g m o rp ho lo gi ca l features o f studied species: B c h x a n h Calocedrus macrolepis, Pơ mu - Fokienia hodginsii, Sa mu dầu Cunninghamia konishii The report also shows value ct these species - A s s e s s m e n t o f eco log ic al features and distribution o f these Species They arc relic species, ad ap h li n e with the te mp era tu re OỈ 15' c an n u al l y rain I fall m o r e 1200 m m , so they arc o n ly found ove r 100 m all - Q h s e r h i n ụ a capability o f na turally re ge n e ti o n id]- these spccics: had lor ( 'í/locưilnis niưcrepis hut tiootl lor the remains - C au s e s ol na rr o w e d areas lor studied spccics: 1/ Present co n d il i^ n s noi support iheir d e ve lo pm en t; / T h e y arc o bj c cl for cullinu and ;is \ a l u c of ụood tim be r and a ro m a ti c c sse nci al oil - A ssessm ent on capality of regeneration by vegetative reproduction: The regenerative capatity by seed is low for Calocedrus macrolepis and relative high for Cunninghamia komshii Fokienia hodgmsii The regenerative capality by cutting are good for all species in solution AỈB at 1-1,5% and the longwith of root is the longest after 2-4 months XÁC NHẬN CỦA BAN CHỎ NHIỆM KHOA CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI PGS.TSKH NGUYỄN NGHĨA THÌN PGS.TS TRỊNH ĐĨNH ĐẠT ÂN CỦA TRƯỜNG MỤC LỤC I Đặt vấn đ ề II Điểu kiện tự nhiên III Đối tượng, mục tiêu, nội dung nghiên c ứ u IV Phương pháp luận phương pháp nghiên cứu V Kết nghiên cứu 1- Bách xanh - Calocedrus m acrolepis 1.1 Giới thiệu chung 1.2 Đặc điểm hình thái học 1.3 Đặc điểm sinh thái phân bố 1.4 Đặc điểm tái sinh 1.5 Hiện trạng nguyên nhân thu hẹp khu phân bố 1.6 Nhân giống Bách xanh hom 2- Pd mu - Fokienia hodginsii 2.1 Giới thiệu chung 2.2 Đặc điểm hình thái học 2.3 Đạc điểm sinh thái vắ phân bố 2.4 Đặc điểm tái sinh 2.5 Hiện trạng nguyên nhân thu hẹp khu phân bố 2.6 Nhân giống Pơ mu hom 3- Sa mu dầu - Cunninghamia konishii 3.1 Giới thiệu chung 3.2 Đặc điểm hình thái học 3.3 Đặc điểm sinh thái phân bố 3.4 Đặc điểm tái sinh 3.5 Hiện trạng nguyên nhân thu hẹp diện tích 3.6 Hướng phát triển bảo tổn VI Phương phápphân loại học phân tử VI Kết luận Tài liệu tham khảo Phụ lục Hợp đồng nghiên cứu khoa học Báo cáo kết nghiên cứu năm 2000 Cơng trình cơng bố 1 11 16 25 33 34 36 ĐẶC Đ IỂM SINH HỌC CỦA M Ộ T s ố LO ÀI CÂY Q UÝ H IẾM CÓ NG UY C BỊ TIÊU D Ệ T Ở V IỆT NAM CẦN BẢO VỆ I- ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam trung tâm đa dạng sinh học giới, Việt Nam coi mảnh đất bị lãng qn nơi tổn nhiều lồi lạ chưa dược mơ tả việc đánh giá tính đa dạng sinh học nghiên cứu biện pháp bảo tổn chúng cần thiết Ngoài biện pháp chung bảo vê sinh thái bàng việc xây dựng Vườn Quốc gia Khu bảo tồn, việc bảo vê loài đặc biệt loài nguy cấp cần đặt lên hàng đầu Chình để góp phần bảo tồn lồi nguy cấp lồi lại có giá trị kinh tế cao mà gọi lồi q lại địi hỏi cấp bách Đó lý chúng tơi thành lập đề tài nghiên cứu Mục tiêu đề tài hệ thống hố tài liệu có từ trước tới lồi nghiên cứu bổ sung dấu hiệu cần thiết phục vụ cho công tác bảo tổn II-ĐIỀU KIỆN Tự NHIÊN Nước Việt Nam nằm Đơng nam bán đảo Đơng Dương, có phần đất liền rộng khoảng 330.000 km2, với bờ biển dài khoảng 3.200 km, phần nội thuỷ lãnh hải gần với bờ biển rộng khoảng 22.600 km Nước Việt nam có đường biên giới đất liền giáp với nước láng giềng dài khoảng 4.630 km, có 1.463 km với Trung Quốc, 2.067 km với Lào 1.100 km với Campuchia Ba phần tư diện tích nước đồi núi, với đỉnh núi cao Phansipan 3.143 m phía Tây Bắc Nơi dãy núi cao hình thành kéo dài dãy núi Himalaya Do phạm vi rộng vĩ độ độ cao mà khí hậu Việt Nam không đồng Mạc dù nước nằm gọn nội vùng nhiệt đới, khí hậu lại thay đổi từ vùng nhiệt đới ẩm vùng thấp phía Nam đến điều kiện ơn hồ ỏ vùng núi cao phía Bắc, từ vùng có mùa mưa ẩm cao Thừa Thiên-Huế đến vùng có mùa khô khắc nghiệt Tây Nguyên hay vùng cạn kiệt Khánh Hồ Nhiệt độ trung bình hàng năm độ cao ngang mặt biển vào khoảng 27°c phíaNam giảm dần xuống cịn 21°c phía Bắc Tương tự nhiệt độ hàng năm giảm khoảng 0.5°c lên cao lOOm giảm lên cao Thế Việt Nam 30% diện tích có độ cao 500m, nơi cao, thực tế có điêu kiện nhiệt đới chí có điều kiên ơn đới Tồn quốc nhìn chung tương đối ẩm Hầu hết vùng có cân nước dương (lượng mưa hàng năm cao lượng mưa bốc hơi) Hầu hết vùng đất nước lượng mưa khoảng 2.000 mm/nãm, có vùng Nghê An đến Thừa Thiên có lượng mưa đạt đến 3.000 mm/năm độ ẩm lớn Tuy nhiên lượng mưa phân phối không năm mà tập Irung vào mùa mưatừ tháng đến tháng 10 trừ vùng Thừa Thiên - Huế từ tháng đến tháng 12 Ba chế độ gió mùa chủ yếu tác động đến khí hậu Việt Nam Trong thực tế Việt Nam giao điểm ba luồng gió mùa Gió thổi từ Đơng Bắc lạnh khơ, đổi có mưa phùn nhẹ, gió mùa tác động đến miền Bắc Phía Nam từ vĩ độ 16, gió Tây chiếm ưu suốt tháng mùa đơng với khí hậu nhiệt đới ẩm nhiều Gió nam gió Đơng Nam gió Tây phần phía Nam Việt nam thổi từ biển tháng mùa hè mang theo nhiều nước, tạo thời tiết nội nhiệt đới nước Trong mùa nóng đơi bão hình thành vùng biển Đông xâm nhập vào vùng bờ biển miền Tung miền Bắc gây thiệt hại đáng kể Tần số xuất hiên loại gió mùa tăng cường năm gần hậu thay đổi khí hậu việc chặt phá rừng năm vừa qua Một vùng có khí hậu ngoại lệ, vùng núi cao thuộc tỉnh Lào Cai, Yên Bái Nơi nhiều đỉnh núi có độ cao 3.000m, gió thổi mạnh xạ mặt trời lớn, lượng mưa không đáng kể, điểu kiện bán ẩm chiếm ưu thảm thực vật bị cằn cỗi chịu khơ hạn Vùng có nhiêu lồi đặc hữu Do phạm vi rộng vĩ độ tính đa dạng củ địa hình, cảnh quan từ vùng ngập nước, đến núi đá vôi, đỉnh núi cao, cao nguyên rộng lớn với gió mùa mà nước Việt Nam có thiên nhiên phong phú có tính đa dạng sinh học cao Mặc dù có tổn thất quan trọng diện tích rừng thời kỳ kéo dài nhiều kỷ, hệ thực vật rừng Việt Nam vẩn phong phú chủng loại Theo dự đốn nhà thực vật học số lồi lên đến 15.000 lồi, có khoảng 3.200 loài dược nhân dân dùng làm nguồn lương thực, thực phẩm, làm Ihuốc chữa bệnh, thức ăn cho gia súc, lấy gỗ, tinh dầu nhiều nguyên vật liệu khác Chắc hộ thực vật Việt Nam cịn nhiều lồi mà chưa biết cơng dụng Cũng có nhiều lồi có tiềm nàng nguồn cung cấp sản vậí quan trọng cho dược liệu chẳng hạn Hơn hệ thực vật Việt Nam có mức độ đặc hữu cao Tuy hệ thực vật Việt Nam khơng có họ đặc hữu có khoảng 1% số chi đặc hữu (nhu chi Oligoceras) số loài đặc hữu chiếm đến khoảng 20% số loài, tập trung bốn khu vực chính: Khu vực núi cao Hồng Liên Sơn miển Bắc, khu vực núi cao Ngọc Linh miền Trung, cao nguyên Lâm viên phía Nam khu vực rừng ẩm phần Bắc trung Nhiều loài đặc hữu địa phương gập vùng hẹp với số cá thể thấp Các lồi thường khu rừng dây thường bị chia cắt thành mảnh nhỏ hay bị khai thác cách mạnh mẽ Bên cạnh đạc điểm cấu trúc, kiểu rừng nhiệt đới ẩm thường khơng có lồi chiếm ưu rõ rệt, nên số lượng cá thể loài thường hạn chế bị khai thác, khai thác khơng hợp lý chúng chóng bị kiệt q Đó tình trạng số loài gố quý Gõ đỏ, Gụ mật, Đinh, nhiều loài làm thuốc Hoàng liên chân gà, Ba kích chí có nhiềulồi trở nên hay có nguy bị tiêu diệt Hoàng đàn, cẩm lai, Pơ mu.Đặc biệt hệ động vật Việt Nam tình trạng nguy cấp, việc bn bán trái phép hồnh hành khắp nơi để xuất chủ yếu sang Trung Quốc Các loài Hổ, Báo, Gấu, Trăn, Cá sấu, Trút, Rắn độc III- ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU, NỘI DƯNG NGHIÊN c ứ u 3.1 Đ ố l TƯƠNG NGHIÊN CỨU: Theo sách đỏ Việt Nam phần thực vật đẫ hệ thực vật Việt Nam có 365 loài quý cần ưu tiên bảo vệ thuộc 265 chi, 123 họ, ngành thực vật chúng tập trung chủ yếu ngành: Dương xỉ, Hạt trần Hạt kín với 335 lồi, 246 chi 105 họ Với số lượng loài lớn khơng thể ỉúc tiến hành nghiên cứu tất mà phải lựa chọn số loài quan trọng cần ưu tiên trước Để lựa chọn, trước hết cần đưa số tiêu chuẩn sau để có cãn cứ: • Cãn tính nguy cấp lồi • Cãn khả ứng dụng kết đưa • Căn ngân sách tài trợ Từ chúnii tơi lựa chọn lồi sau để nghiên cứu: Bách xanh Calơcedrrus macrolepis, Pơ Mu - Fokienia hodginsii Sa mu dầu - Cunninghamia konishii 3.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỂ TÀI LÀ: nghiên cứu số đặc tính sinh học lồi lựa chọn hình thái học, sinh thái phân bố, khả nãng tái sinh, trạng nguyên nhân thu hẹp diện tích khu phân bố, nhân giống vơ tính hom nhằm cung cấp thơng tin quan trọng giúp cho công tác bảo tồn 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Để tiến hành đề tài thực hiên thu thập nghiên cứu theo nội dung sau đây: Vị trí phân loại giá trị đối tượng nghiên cứu Đặc điểm hình thái Đặc điểm sinh thái phân bố Khả tái sinh Hiện trạng nguyên nhân thu hẹp diện tích khu phân bố Khả nãng nhân giống vơ tính hom IV PHƯƠNG PHÁP LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 4.1 Phương pháp luận: Hệ thơng hố tư liệu có từ trước tới nay: để tiết kiệm thời gian kinh phí, nhấl diều kiện kinh phí hạn chế hiên nay, ngồi đóng góp nhóm nghiên cứu việc tận dụng có phê phán thành tựu có việc làm bắt buộc việc chắt lọc số liệu hệ thống hố lại công việc làm không phần quan trọng Nghiên cứu bổ sung tư liệu cần thiết cho mục tiều đề tài đặt ra\ Mỗi đề tài có mục tiêu riêng khơng thể tận dụng số liêu có mà cần tiến hành nghiên cứu bổ sung tư liệu Tất nhiên để tiến hành nghiên cứu thực địi hỏi phải có thời gian, lúc từ đề tài chấp nhận đốn có kinh phí quý nên thí nghiêm mới bước đầu Phần lớn nghiên cứu nhóm chủ yếu số liệu nghiên cứu trước 4.2, Phương pháp nghiên cứu: Thu thập tài liệu: Các tư liệu thu thập thu thập từ thư viện Viện Điều tra Quy hoach rừng, Bộ Nông Nghiệp PTNT, từ Viên Khoa học Lâm 2) R F L P (Restriction Fragm ent Length Polym orphism ) kỹ thuật sử dụng cac enzim căt hạn chế để cắt ADN tai vị đăc hiêu tao thành đoạn nhỏ có độ dài khác Sau chạy điện di gel agaroz lai Southern blots ta có thê xác định sư khác chiều dài đoan ADN Khi hai nhiều cá thể so sánh với m ột m ẫu dị RFLP thấy có khác độ dài đoạn cắt Sự khác sản phẩm ADN trình này gọi Đa hình Các đoạn có khả nãng di truyền sử dụng dấu phân tử RFLP sử dụng dấu phân tử người, sau sử dụng lập đồ phân tử ngô, cà chua, lúa v.v 3) SSR (Simple Sequence Repeats) hay gọi Tiểu vệ tinh đoạn ADN ngắn có m ột số lượng đoạn nucleotide lặp lại Các chuỗi lặp lại thường có m ột đên sáu nucleotide SSR sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền động vật thực vật 4) A F L P (Am plified Fragm ent Length Polymorphism) kỹ thuật phối hợp R FLP PCR Kỹ thuật dùng PCR để nhân chọn lọc đoạn cắt giới hạn đa hình xác định khác độ dài đoạn cắt giới hạn nhân AFLP sử đụng để lập đồ phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền Các phương pháp phân loại phân tử góp phần giải vấn đề sau : 1) Nghiên cứu cấu trúc chủng quần ví dụ: biến đổi theo vùng địa lý; 2) Nhận biết ranh giới loài; 3) Đánh giá phát sinh chủng loại Đối với m ục đích nghiên cứu, cần chọn lựa phương pháp phù hợp Hiệu kỹ thuật phân tử mục đích nghiên cứu trình bày bảng Thông thường, để giải nhiều vấn đề đặt đối tượng động vật, người ta phân tích đoạn DNA ti thể gene nhân, kết hợp nhóm gene Cịn thực vật phân loại phân tử dựa gene nhân lục lạp Có thể nêu ví dụ điển hình sau nghiên cứu theo hướng 26 Bảng Khả nâng ứng dụng kỹ thuật phân loại học phán tử (Hillis et al, 1996) Vấn để nghiên cứu Isozym Lai p/t vị trí p/t p/t AD enzyme đoạn trình tự N giới hạn ADN ADN Tiến hoá gene M - M -,M,- + Cấp phân loại phụ quẩn thể + - + M,+,- + Sự biến đổi theo vùng địa lý + - + M ,+,M + Ranh giới loài + - + +,M ,- + Phát sinh chủng loại (0-5T năm) + M + + Phát sinh chủng loại (5-50T năm) + + + + Phát sinh chủng loại (5-500T năm) M M M + - - + Phát sinh chủng loại (500-3500 T năm) Chú thích: ị-) Phươiig p h p không pliù liợp, (IVI) Phuơngpháp phù hợp phần; (+) Phương pliáp phủ hợp có liiệu quả; (a) Phán tích duạn DNA bao gồm kỹ tliuật theo íliứ tự sau RADP, D N A tiểu vệ tinli (M icrosaleỉỉiles) điểm c lii D N A da locus (multilocus DN A fingerprinting) Sao la (Pseudoryx nghetinhensis) lồi thuộc họ Bị (Bovidac), phát Việt Nam năm 1992 Hassanin Douzery (1999) nghiên cứu mối quan hệ họ hàng m ặt tiến hoá Sao la với lồi khác họ Bị dựa phân tích trình tự đầy đủ gene ti thể gene cytochrome b (1143bp), gene 12S-1-RNA (956bp) gene nhân aromatase cytochrom e P-450 (199bp), lactoferrin (338bp) Soltis cộng (1999) nghiên cứu mối quan hệ chủng loại loài họ thực vật H ạt kín dựa phân tích trình tự 18S-rRNA (gene nhân) trình tự gene lbcL (ribulose-1,5 bisphosphate carboxylase, large subunit) lục lạp M ột phương pháp nghiên cứu mức độ khác loài, dang loài đa dạng cá thê m ột loài sử dụng kỹ thuật RADP-PCR dựa nguyên tắc phản ứng chuỗi trùng hợp- PCR (Polym esae Chain Reaction) Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR cho phép nhân in vitro đoạn ADN đặc hiệu theo ý m uốn cách sử dụng ADN polym eraz 27 ohgonucleotit tổng hợp nhân tạo Nhờ mà có đủ lượng ADN cần thiết để tiến hành thí nghiệm ADN Sơ đồ kỹ thuật PCR : Tách chiết AND phâm RAPD- PCR 6.2 -> -> Chạy RAPD-PCR -> Điện di sản Phân tích kết thu C ác chu kỳ p h ản ứng P C R : Cũng chép ADN in vivo, phản ứng PCR gồm ba giai đoạn chính: - Giai đoạn biến tính: xử lí nhiệt để tách sợi ADN kép thành sợi đơn - Gắn mồi: ADN mồi bắt cặp bổ xung với sợi ADN khuôn - Giai đoạn tổng hợp: Các dNTP lắp ráp để tạo thành sợi ADN Tất giai đoạn trình chép ADN xảy tế bào xúc lác enzym, cịn q trình tổng hợp ADN kỹ thuật PCR phải sử dụng nhiệt độ Ihích hựp Thời gian chu kì phản ứng - Giai đoạn biến tính: 95°c thời gian từ 1-5 phút - Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ giai đoạn dao động lớn phụ Ihuộc vào độ dài mồi, từ 30°c -60°c thời gian 20 giây đến phút - Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 68°C-72°C, thời gian dao đông thuộc vào chiều dài đoạn ADN cần nhân lên, thường 20 giây giai đoạn nhỏ 500 nucleotit 40 giây với giai đoạtnhor 1200 nucleotit Số chu kỳ lặp lại trình tiến hành phản ứng PCR thường dao động từ 25- 45, với số chu kì có đủ sản phẩm PCR để quan sát m thường ánh sáng đèn tử ngoại, Nếu số kỳ lớn dễ tạo băng ADN không đặc trưng, lượng trạc chép thành chu kì sau nhiều, m lượng ADN polym eraz không đủ Đ iều làm trình tổng hợp m ột số phân tử bị ngất quãng, m ột số băng có Irọng lương gần tạo nên m ột băng phụ, băng ADN không đặc trưng Sau n chu trình phản ứng số sợi ADN tổng hợp là: 2nx , n số chu kỳ, X số sợi ADN khn ban đầu Nếu tính riêng sợi ADN m ong m uốn (nghĩa hoàn toàn) sau n chu kì có: (2n -2n)X 28 6.3 Các thành phần phản ứng PCR 6.3.1 A D N pholym erase: ADN polym erase enzym xúc tác cho trình tổng hợp chuồi AND, giúp cho trình lắp nucleotit A, T, G, c vào chuỗi AND Khác với ARN polymeraz, ADN polymeraz khơng có khả khởi đầu q trình tổng hợp ADN, q trình ln xảy theo chiều từ đầu 5' đến đầu 3' Vì trình tổng hợp ADN ln địi hỏi phải cung cấp đoạn ngắn ADN ARN (đoạn mồi) Đoạn mồi cung cấp đầu 3' có nhóm O H tự để bốn loại deoxynucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) gắn tiếp vào theo nguyên tắc bổ xung sở sợi AND khuôn Phản ứng tổng hợp ADN xúc tác ADN polymerase: dNTP + (dM NP)n -> (dNM M P)I1+1 +PP, Để cho phản ứng PCR tiến hành cách tự động nhà khoa học tìm enzym chịu nhiệt độ cao Taq polymeraz Với loại enzym người ta cần cho m ột lần Irước tiến hành chạy PCR Vì kỹ thuật PCR đưực tiến hành hoàn toàn tự động sau trộn hỗn hợp phản ứng Taq polym eraz có hoạt tính exonucleaz 5'-3\ khơng có hoạt lính exonucleaz 3'-5' Tuỳ theo hãng có thổ có loại Taq ADN polym eraz với trọng lượng phân tử khác (ƯSB-94 kD, Promega- 85 kD, Boehringer- 95 kD ) tính chất tương tự Taq ADN polym eraz tự nhiên Taq ADN polym eraz có hoạt tính mạnh nhiệt độ 75-80°C, tốc độ xúc tác tổng hợp 130-300 nucleotit/giây Nhiệt độ giảm tốc độ giảm theo: 70°C-60 nucleotit/giây; 55°C-24 nucleotit/giây; 57°C-1,5 nucleotit/giây; 22°C-0,25 nucleotit/giây Hơn nhiệt độ lên 90°c hoạt tính enzym bị giảm theo thời gian: 50% hoạt tính emzym bi giảm 92,5°c sau 130 phút; 95°c sau 40 phút; 97,7°c sau 5-6 phút Ion M g++ gây ảnh hưởng đến hoạt tính Taq ADN polymeraz 2mM M gCl2 0,7- 0,8m M dNTP lãng cường hoạt tính Taq polymeraz tới tối đa 6.3.2 D eoxynucleotit triphotphat (dNTPs) Là thành phần tham gia tạo nên sợi ADN mới, Sự không cân bàng bốn loại deoxynueleotit triphotphat làm giảm hoạt tính Taq ADN Polym eraz Nồng độ tối ưu deoxynucleotit tripholphat cho phản ứng 29 PCR phụ thuộc vào chiều dài đoạn ADN cần nhân, số chu kì phản ứng PCR, Nồng độ M g++ Nồng độ tối ưu khoảng từ 100 đến 200fiM Ngoai deoxynucleotit triphotphat dùng dạng đồng phân, có cấu trúc tương tự cho phản ứng PCR : [a - P 32]dNTPs, [a -35S]dATP, [a -35S]dTP, đNTPs, dƯTP, Biotin-11dưT P, B iotin-16-dUTP, Biotin-21-dUTP, Digoxigenin-11-dưTP, 7-đeasedGTP 6.3.3 A D N mồi Thường có chiều dài từ 14-40 nucleotid với lượng G c 40-75%, trình tự ADN mồi phải theo nguyên tắc bổ sung với ADN khuôn Nhiệt độ để mồi gắn vào sợi ADN khn từ 39-65°C Nhiệt độ gắn mồi thích hợp tính theo sơ cơng thức sau : • Tm = 81,5 + 16,6 (log10[J+]) = 0,41 (% G+C)-(600/1) - 0,63(% FA ) (Sambrook - 1986) Với [J+J nồng độ cation chiều dài đoạn mồi FA dạng amit • Tp - 22 = 16,6 (Ln) (Wu cộng - 1991) Với Tp nhiệt độ gắn ADN mồi (±2-5°C) Ln đoạn mồi Ln = (số G C) - (số A T) * Tm = 2°c * (A +T) + 4°c* (C + G) (Thein - 1986) Với ATC số nucleotit mồi Trong thực tế nhiệt độ mồi gắn thích hợp thường cao hưn so với tính tốn lý thuyết từ 3-12°C M ột số nguyên tắc cần ý lựa chọn ADN mồi - ADN mồi cấu trúc bậc hai - ADN mồi cần tránh không cân GC A/T - Đẩu 3' ADN mồi cần tránh bắt cặp tạo móc - G iàu nucleotit G c 6.3.4 Dung dịch đệm cho Taq A D N polymeraz Thành phần sau : lOOmM Tris - HCI với pH = 25°c, 500 m M K Cl, 0,01 % gelatin, 15m M M gCl, 6.3.5 A D N khuôn 30 Co thể SỢI ADN kép, sợi ADN đơn hoăc ARN tách chiết từ đối tượng cần nghiên cứu 6.3.6 M gCl2 Nồng độ M gCl, dùng cho phản ứng PCR 0,5 - mM 1,5 mM nồng độ tối ưu dùng với 200|J.M dNTP phản ứng PCR Nồng độ MgCU thấp làm giảm khả tổng hợp AND Nồng độ MgCl2 có ba tác dụng : Tạo phức chất với dTTP, giúp kết hợp dNTP với emzym ADN polym erase tốt Tăng cường hoạt tính enzym ADN polymerase Tăng cường nhiệt độ bám ADN mồi 6.4 Tiến hành phản ứng PCR : Mỗi phản ứng PCR tiến hành tổng thể tích 50jJ, bao gồm chất trộn theo thứ tự số lượng sau (các thao tác phải tiến hành điều kiện lạnh để đảm bảo chất giữ nguyên hoạt tính tiến hành trong điều kiện vô trùng để tránh bị nhiễm ADN khuôn khác nhau): 34 JLJ.1 H-,0, ụl dNTPs, jul đệm cho AND Taq polymeaz, ^1 mồi OPA 10 20m M , 0,5 jul ADN khuôn, 0,5 ịxl Taq Polymeraz (2 Uniự|_il) Ly tâm - giây Cho vào m áy chạy PCR theo chế độ phù hợp Chu kì nhiệt Bước 1: 95°c - phút Bước 2: 95°c Bước 3: 95°c Bước 4: 72°c - 1 phút phút 30 giây phút (lặp lại 35 lần từ bước 2) Bước 5: 72°c - 10 phút Bước 6: 4°c 6.5 Điện di A D N sau phản ứng PCR: + C huẩn bị gel để điện di - Cân 0,8 g bột agaroza, hòa tan 100 ml dung dịch đệm TAE (1 lần) - Đun sôi tan hết, để đun£ dịch agaroza nguội đến k h o ả n g 31 °c đổ vào khn có cài lược để tạo giếng nhỏ Độ dày gen tuỳ thuộc m ục đích sử dụng Để thạch đơng ổn định hoàn toàn 30 p h ú t + Tiến hành điện di - R út lược khỏi khuôn đổ gel, đặt khay gel vào bể điện di, đổ đệm TAE lần tới ngập m ặt gel - Tra m ẫu điện di: M ẫu trộn đểu với 2ụ\ đệm lót mẫu đặc lần TAE để tổng thể tích hỗn hợp 10 (0.1 Tra hỗn hợp ADN vào giếng, chạy điện di dòng điện chiều với hiệu điện 60V Sau điện di, gel agaroza nhuộm với ethidium bromit, rửa gel nước cất, băng ADN đưực xem đèn tử ngoại chụp ảnh 1- Pơ mu, 2- Bách xanh, 3- Sa mu dầu H ình 1: ảnh điện di sản phám RAPD-PCR loài với moi OPA 10 Đường chạy 1: ADN tách từ Pơ mu Đường chay 2: ADN lách từ Bách xanh Đường chạy 3: ADN tách từ Sa mu dầu Từ ảnh điện di ADN thu được, chúng lơi sư đồ hố băng ADN sau: + có băng, _ khơng xuất băng, then thứ tự có trọng lượng phân tử giảm dần 32 Bảng 2: Sơ đồ băng ADN từ ảnh điện di loài với mồi OPAIO Pơ mu Bách xanh Thứ tư + + + + + + + + 10 + + 11 Từ bảng ta thấy số lượng băng ADN Sa mu dầu + + + + + + + + xuất loài khác ta dùng mồi OPA 10 Điều cho thấy có sai khác di truyền loài nghiên cứu, nhiên sai khác thê chúng tơi cịn tiếp tục nghiên cứu cơng trình Từ kết chúng tơi muốn khẳng định sử dụng phương pháp RAPD PCR, phương pháp sinh học đại đê phân loại loài cách xác VII- KẾT LUẬN Ba lồi lồi sót lại có giá trị sử dụng cao Cả lồi có tinh dầu thơm Ba loài phân bố độ cao 1000 m so với m ặt biển, thích nghi với nhiệt độ trung bình 15° c lượng mưa hàng nãm 1200mm M ùa loài thường tập trung vào m ùa lạnh từ tháng 8-11 Cả loài nghiên cứu tập trung chủ yếu vùng Nam Trung Quốc Bắc Đ ông Dương K tái sinh hạt Bách xanh sau Sa mu dầu tái sinh m ạnh gặp Pơ mu K nhân giống hom tối sử dụng dung dich AIB 11 5% thời gian đưa trồng trọt sau 2-4 tháng kể từ xử lý.ư Về m ặt sinh học phân tử phân tích lồi nghiên cứu giưa chúng có khác biệt rõ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ■ Chu Văn Dũng, 2000 - Triển vọng bảo tồn phát triển Sa mu dầu Việt nam Hội thảo K hoa học bảo tồn phát triển Sa mu dầu Nghệ An, Vinh tháng 11-2000: 4-6 Đinh Văn Đề, 2000 - v ề Sa m u dầu núi Pù Hạt, huyện Q uế Phong tỉnh Nghệ An Hội thảo K hoa học bảo tồn phát triển Sa m u dầu Nghệ An, Vinh tháng 11-2000: 15-17 Hoàng Hoa Quế, 2000 - Tư liệu Sa mộc Hội thảo Khoa học bảo tồn phát triển Sa m u dầu Nghệ An, Vinh tháng 11-2000: 18 IUCN, 1998 - The list of threatened trees, W old Conservation Press Lê Đình Khả, Đồn Thị Bích, 1997 - Nhân giống Bách xanh hom, t/c Lâm nghiệp, 3: 5-6 Lê Đình Khả, Nguyễn Đình Hải, 1997 - Nhân giống Pưmu hom, t/c Lâm nghiệp, 7: 13-14 Ngô Trực Nhã, 2000 - Cây Sa mu dầu cẩn nghiên cứu, bảo vệ phái triển Việt Nam, Hội thảo Khoa học bảo tổn phát triển Sa mu dầu Nghệ An, Vinh tháng 11-2000: 12-13 Nguyễn Duy Chuyên, Lý Thọ, 1995- Đặc trưng lâm học trạng tài nguyên rừng Pơ m u tỉnh Lâm Đồng, Cơng trình KHKT Điều tra quy hoạch rừng, 1991-1995: 48-54 N guyễn N gọc Chính, Chu Văn Dũng, 1977 - Cần bảo vệ khẩn cấp khu lửng Sa m u cổ Nghệ An, t/c Lâm Nghiệp, 7: 22-23 10.N guyễn Ngọc Chính, 2000 - Cần bảo vệ quần thể Sa m u dầu Việt nam Hội thảo K hoa hục bảo tồn phát triển Sa mu dầu Nghệ An, Vinh tháng 11-2000: 9-12 11.N guyễn Tiến H iệp et G.E Vidal, 1996 - Gym nosperm ae, Irong Flore du C am podge, Du Laos e du Vietnam, 28 M uséum National d'histoire nature lie, Paris 12.Phạm Hoàng Hộ, 1999 - Cây cỏ Việt Nam, 1, NXB Trẻ thành phố Hồ C hí M inh 34 13.Phan K ế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp, 1999- Cunningham ia konishii Hayata m ọc hoang dại Việt nam hay không tên khoa học Sa m ộc dầu gi?, Đ a dạng sinh học Bắc Trường Sơn (lần thứ 2), NXB ĐHQG Hà Nội, 61-63 14.Phùng Tửu Bồi, 2000 - Cây Sa m u dầu triển vọng chương trình trồng triệu rừng Hội thảo K hoa học bảo tồn phát triển Sa mu dầu Nghệ An, Vinh tháng 11-2000: 13-14 15.Phùng Tửu Bôi Cs 1991- Bước đầu điều tra đề xuất phương hướng bảo vệ phát triển rừng Pơ mu Việt nam, Cơng Irình KHKT Điều tra quy hoạch rừng, 1991-1995: 43-47 ló.Phùng Tửu Bơi Thân Văn Cảnh, 1993- Kết nghiên cứu tái sinh Pơ mu tỉnh Trung tâm nguyên liệu giấy sợi 17.Trần Ngũ Phương, 1970 - Bước đầu nghiên cứu rừng miền Bắc Việt nam, NXB K H K T - KT, Hà Nội 18 Vũ Văn Dũng, 1992- Cây Pơ mu, Tin KHKT KT lâm nghiệp, 3-1992: 10-12 19.Vũ Văn Dũng tập thể, 1996 - Forestry of Vietnam, Agr Publ House, NXB N ông nghiệp 35 HỘI KHOA HỌC KỸ THUẬT LẢM NGHIỆP VIỆT NAM TỈNH HỘI NGHỆ• AN * HỘI TH Ả O KIIOA HỌC Về bảo tồn pliát triển Sanui dầu Nghệ An Worksop on flic conservation and Development of Cunninghamia Konisliii Haynta Ngliean Province Lần thứ * * * TÀI TRỢ CHO HỘI THẢO: - Ngân hàng giới (The World Bank - Dự án lâm nghiệp xã hội bảo tồn thiên nhiên Nghệ All (ALA - VIE - 94/24) CVívsa mu dẩn Pừ Hoạt, đường kính 3,2tn, cao 60m Vinh - Tháng II - 2000 ộmậl độ Sa Mư chiếm ưu Ihế, lầ biện pháp lổ! nhấl để nhanh chóng phục hơl lạl rừng Sa Mu Nghệ An t ' Giđng trông rừng: Trong chương trinh 661 cán bố lrf ngt/ón kinh phí đá trổng mộf sđ diện ffch rimg phủ hợp (cỏ Ihể trổng nghlẻn cứu thí nghiệm) số vùng điểm Kỷ Sơn, Quế Phong Từ xAy rtựng quỉ Irlnh gieo ươm, Irổng rừng để phục vụ cho kế hoạch dài hạn phục hói rừng Sa Mu SA MỘC DẨU - MẠV LUNG I INH IIAY MẠY I.ANG LỀNH CUNNINGHAIỊỊIIA m iS H II HAYAĨA NGUỔN GẸN QUÝ CỦA NGHỆ, AN CẦN D ợ c NGHIÊN CỬU, KHAI THÁC VÀ BẢO TỔN N n n Y F N M í ỉ llỈ A ỈỈIÌN ỉ h ii lim ỢihH ÍỊ/II III) Nội 4- Một vàl để xuất: 1- Cắn nhanh chóng thánh lập Ban quản lỷ ồể !hưc Ihỉ dự án đáu tư xậy dựng khu rừng đặc dụng pi 11li long Pu Hoạt để thực chương trinh bảo vệ rừng lại khu rừng BT Ỉ M 2- Tiến hành điéu Ira đánh giá tinh Irạng phfln bố loài Sa Mu dắu Nghệ An, lập Irung đỉềti Im ưu liên thực cảc khu BTTN, vùng Tưdng Dương vâ Ký Sơn, riêng khu B ĩ TN Pù rinạl nán điểu ỉra kỹ để phái nhftng cá Ihể Sa Mu cớ đường kính lớn rlể phục vụ cíng lác nghiên rim khoa học, tham quan du lịch ófi xitấl biên pháp quản lý, báo vệ lâu Hái 3- Tiếp tục nghiên cứu v£ phán loại, sinh thái, hlnh Ihành cáu (rúc linh hỉnh lái sinh lự nhiên, dặc ríiểin sinh học lồi Sa Mu dán để có pháp báo vệ phái Iriển chúng Ironq tương lai H al Irán lẳ mỏl nqành dặn biệl Ih'irV hn Put rnor fnv(ưli:|í o;in í|ifíir CM3 hệ lliựr vật v/iộlMain Ở R Ml".VII pllrll f't’Vi 'i HIM l-ì Việl Nam số r.á thổ cùa chiinn \A CưniruihnmiR Innrnolnla 'T I- 'i ngânh náy khống nhiổu nhimg số loài (Lanill.) Honk l.oAi n^ỵ 'Iinr ptiíì [li^n cửa nốđáng đirơc lưu V ỈA lính Iiỉtinii lỉnh Miión IAv Main v;> Mnm chất độc đáo ngiión gen ci’n ĩrniK) Ounr (Ị Viột Mnm rhỉ f]áfi rriộỉ 4- Tiếp lục kêu goi !Ai trợ quốc Nhiều lồi có lính ctiấl rìặr hfn Jbnn rlin lệ tổ chức Chính phù phi đốn rhỉ lổn tronq vài khtI Chỉnh plnì cho kill! B TTN cùa lỉnh, nhn nơi xa xôi, hiểm Irở nliir dư án lập Irung vàn \fiện nânạ cao nguổn lực, sở vậ! chất cho khu Thông dẹt - Pinus krnmpfii ĩhồng bảo lón Pù Huống, Pù Hoạt, xAy (lựng Pà Lạt - p.dnlntnnỳs VA rhnr r.tiắn dự án vùng đệm để hỗ Irợ nhân r.òn nhiéli lồi nỉióm nho dến (tịn cài thiện bước nAng cao nry chưa biết đốn Ví dụ trôn đĩnh dời sống vậl chất tinh (hán, chuyển nui đá vôi Cao Bancj fin r.n B Inài I lạt dổl lập quán khai llrâc rừng sancj bào vệ rửng gìn gift lài nguyên (hiên , trán khác LoAi Sn mộc Háu Ctinivnqlwmia Kanishii Hayala vờn nhiẻn flf'i I 'lln rniil), Iny fjn Inv r |li I n^i II" f phái Pii I luốnq, Quy cti.'iu, r>AVr^f| ^^11 n.'iv fill nyti hiốl ! (Ilf-Ill r't Nghê An Irong nliírnq sổ dó P;ii [ nnn Ma Ham lình Hừn PhAn r'f 5- Cẩn Ihực cỏng Inc luyên Iruyén bảo vệ rừng, báo vệ tài nguyên Ihiên nhiên, báo vệ lồi Sa Mu dấu cho íổng báo dftn tộc miổn núi, đặc liệi vùng có Sa Mu rlể người tàn lự giác tham gia hào vẻ rửng./ T) loíii l_ỉn mộr - Snfi;i lỉnh I Anr ni rÁn tỉnli plii^ 1'nr nhir l.ạnq Srni, f ’nn Pnnq, IIA (ịinnq líi Mơn flấu - Cwwinlwtiiin bnnklìii Hnynla rlirợc phq| liiộrt lán