Nghiên cứu proteinaz được tiết ra từ các vi khuẩn gây bệnh côn trùng trong phức hệ cộng sinh tuyến trùng vi khuẩn

ĐAI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HOC T ự NHIÊN NGHIÊN CỨU PROTEINAZ Được TIẾT RA TỪ CÁC VI KHUẨN GẦY BỆNH CÔN TRÙNG TRONG PHỨC HỆ CỘNG SINH TUYẾN TRỪNG-VI KHUAN MÃ SỐ: QT - - 15 CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: TS Trịnh Hổng Thái đ a i h ọ c QUOC GIA HÀ N ỏ r TRUNG TÂM D ĩ / thô ng Ỹ Z s CÁC CÁN BỘ THAM GIA: ThS Phan Thị Hà CN Lưong ThuỲ Dương T r ị n h T h ị T h a n h H n g HA NỘI - 2004 Tin thư v iệ n CAM ON c I m u V It'll XI li chan i l i j i i l i ( a m tin I n l i t ( i n i / n ( I n c f)ji h o c ( 2HOC XI11 l l ủ X n t , H o n k ì m a h ụ c - C ò n l i ' J i c ỉ ) l l ( J ( i l I , x H u n ( i t i i i i i i c i i ! r n i ) ụ i Ihn K l i O i l h o c l ự n l i i c n I ỈUII C h ú n h i ệ m K h o a Si / i l ì h ọ c , r i i ò n x K l i o a h ọ c - C ô i i i ỉ I i h ệ v ù r i ỉ ò n Ị i l ủ i vụ l rườiiỵ D I1K IITN ilã AVI duyệt vù cunạ cáp kinh phí d i ' t h ự c h i ậ i (ít' lủ i Ch lì IIX lơi xin chã II !hủ nil cùm (in Till II i> lâm 67;//” iiíịIìc smli hoc, DllQdllN Tritníi tủm Sinh học phún íử Ý Cơn lị iHịliệ lữ hào dã lạo íliứu kiợn cá/ì ỉíìicĩ rỡ traiiy ihicl bị cũni’ ý úp dỡ VC (iìuycn lìióiì clc clí' lủi ill ực Ini'll vó kcí q C u ố i CÙIIỈ>, c h ú n g l ó i ctlnỵ x i I I c a m tin T S i \ ' ^ n y c i i > \ \ o c C h u , r i ì ị i ì í ị T i t y ì ì i r ù n ỵ V i ệ n S i n h t l ì ú i v ' L ùi n g u y ê n Sinh vật nhiệt lình 177 cuiìíị cấp mủn vật sử dụn^ IroniỊ n g h iê n cửu cm TRÌ ĐỂ I VI TS T r ị n h H ó n g Th MỤC LỤC Báo cáo túm lắt Abstract Háo c;í>I1;J phui " Iinn co chứa 25 11112 Bromothvmol Blue \a 40 illi; rriplk-iụltetra/^lium ( lil'M’hlc I ' -i i m ộ t k h u n lạc, c y vào mỏi trườno dinh Hirfino , ' g • Va ương khơng có agar Nuôi cáy đưov thực >rẹn m y lắc ồn nhiệt 220 vơng/phú, 3 ' hì ^ ™ ^ ' í pro" ' , w ™ n* w * ™ « S kl.u vuc I * J h “ * » * chí- Ngưực lai p r a a n a z hu.ic thu I an ? i , A ^ PMSĩ * ^ m ặ h cdc cnzyn, „:,y l l l I p „ h, dịch ngoại bào chứa proteinaz có thành phàn khác K Ế T LUẬN Hoạt độ proteinaz dịch ngoại bào vi khuẩn p lu m in e s c e n t Ip manh pi 2Enzym dịch ngoại bào rát bén nhiệt, sau phút ú 60"C hoat dơ proieina/ chi cịn khoảng khoảng 50% !\oạt độ ban đầu Enzym bị ưc chẽ mạnh ù với ion IIg :\ sau dó đèn C i r \ N i:+, Zn2’ \'à C o2' Ngươc lai ion Mn *, Ca Fe * làm tăng hoạt độ cn/ym ^ Các enzym dịch ngoại bào vi khuẩn p.hm únesccns Hp chu yếu thuộc nhóm p ro tein az xêrin nhom proteinaz kim loại Đ iện di gel polyacrylamit cho phép nhận iháy hai hãng proteinaz bị ức chế P M S F E D T A TÀI LIÊU THAM KHẢO Forst S., Dowds B., Boemare N., Stackebrandt E A n n a R e v M ic r o b io l N„51 (19 97), pp 47- 72 Hartley B.S., 1960 An/Ill Rev Biochem., V.29, N„60, pp 45-72, Heussen c and Dowdle E.B., Anal Biochem., V.102 (1980) pp 196-202 Pham Thi Tran Chau and H enryk Urbanek Acta Microbiologvcal polonica V (2 3), N„1 (1 ) pp 21-25 Trịnh Hổng Thái, Nguyền Hoài Hà, Phạm Thị Trân Châu Tạp chi Sinh hoc, V.21 (l b) (1999) pp 173179 Trinh Hong Thai, Boigegrain R A., Brehelin M., ,1 Genetics and A p plications S pecicaì Issue: Biotechnology (2001), pp 10- 17 Trịnh Hổng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Lương Thuỳ Dương, Phan Thị Hà Tạp chi dì truyền học ứng dụng, Hà N ội 2002 Tr 1- Trịnh Hồng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Phan Thị Hà T p chí di truyền học ứng dung, Hà Nội 2002.Tr 6- 12 Trịnh Hổng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Lương Thuỳ Dươnơ, Phan Thị Hà T p chí khoa học (đ a n g in) 10 Vivas E I and Goodrich-Blair H Journal o f Bacteriology, V 183, N J (2001) pp 4687- 4693 S u m m ary C H A R A C T E R I Z A T I O N O F E X T R A C E L L U L A R P R O T E IN A S E S F R O M B A C T E R IA PHOTO RHABDUS LU M IN ESCEN S HP Trinh Thi Thanh Huong, Trinh Hons Thai College of Science, Vietnam National University Hanoi Photorhabcius htm iiicscens Up are bacteria symbiotic with entomopitthogenic namatode of H etc ro rh a b d u is b a e te n o p h o HP88 Extracellular proteinases of /■’ III m i It,'SITUS Up v vre characterized: the pH optim um was pH 8.0 The enzyme was not stable at 60'C: alicr incubaiin.i; ihc enzyme 'c in minutes, its activity remained ^ The proteinases were sironelv inhibited b\ E D I A (>80% inhibition) and PMSF (>20% inh ibition) A m ons 12 tested metal ions ( M i r C Y \ Fc,; Cd*:, Ba*\ M g \ Pb C o ’2, Zn’:, N i ° Cu’: and Hg*: ) the ions of M n‘; Ca’; F c': incrcaicd activiiv of the proteinase, the ions of Hg*:, Cu‘:, \ Tr :, Co’\ Pb': inhibited aciivitv of the proteina^es especially, the ion o f H g ’: strongly inhibited proteinascs (> rr inhibition) T h r e e area s o f p r o t e i n a s e a c ti v it y w e r e in d en tified b y e le c t r o p h o r e s i s in a c e la t in -c o n ia in in i: polyacrylamide activity gel: bands of I with relative motility (Rm) of 0- bands of II with Rill ol 0.29- 0.34, and band of III with R m of 0.46 EDTA strongly inhibited ihc proteinascs of I and PM SI- strongly inhibited protcinases of I and II The protcinascs o f I, which were inhibited by IÌDTA restored their activity in incubating with metal ions o f N i’2, M n’2, M g '3 and Ca'2 The proteinase activity of III was increased by ions of Ni Mn’: and Mg*2 On the basis o f inhibitor studies and restoration of their activity by some metal ion1', ihe proteinases of I behaved like serine mctalloproteinase Đia c h i liên h e Trịnh Hổng Thái, Khoa Sinh học, Trường Đại hoc Khoa học lư nhiên, Đại liọc Quốc gia Hà N ội, 334 N guyen Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội E-mail: thaith(5)vnu.edu.vn hoâc thaithvnu(Ã)yahoo.com Tel.: 084-04-8582798 TĨ M TẮT CÁC CƠNG TRÌNH NCKH CỨA CA NHÀN (Bài báo, báo cáo Hội nghị khoa hoc) N G À N H : SIN H HOC T rịn h H Thái, Trinh Thị Thanh Hương, Lương Thuỳ Dương Phan Thí H à, (2002) Xenorhabcỉus sp CA: Một số tính chất proteinaz naoại bìu từ vi k h u ẩn cộng sinh với tuyến trùng Tap chí Di truycn & ứng đun (C h u y ên san CNSH), tr 1-5 T óm tát: Pproteinaz ngoại bào vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng {Xenorhabdus SỊ CA ) x ác định tính chất: pH thích hợp 8,0 Các proteinaz bén nhiệt hoạt tính cị n ] 5% sau ủ 60nc 10 phút Trong số ion kim loại thử (Ca2+, M g 2+, M n 2+, C u 2+, F c 2+, C o2+, Z n 2+, H g 2+), proteinaz bị ức ch ế mạnh hời Hg2+, sau đ ó đến Z n 2+, C o 2+ C u 2+; ngược lại, C a2+ M g :+ làm tăng hoạt độ proteinaz Pro tcinaz hi ức c h ế m ạnh bới ED TA PMSF Một số bâng proteinaz dã dược xác định bằn g điện di gel p olyacrylam ide có SDS có chất 0,1% gelatin Mòt băng en zym bị ức c h ế PM SF, băng lại bị ức che bới PM SF ức chỏ’ rrú-í phần E D T A , đặc biệt, có bang bị ức c h ế ED TA PMSF X e u o rh a h d u s sp c \ : characterization of ex tracellular Proteinases from en to m o p ath o g c n ic bactcria G cnctics and A pplications (B iotechnology N um ber 2002) Summary: I; \ l n c c ỉ l u l a i ' nrolcinasos sccictcd c h a nc l cr i Ax l T h ei r pH o p t i m u m remained about a c t i\ i t \ hadena haw h c e w a s s T h e p m l c m a s e s w e r e l ess s t abl e: t ur , U\ s f/ a l t e r m a i b a i m i l at 6( ) "( ’ 111 10 m i n u t e s AmoiiL! s call-in- Iisicil ( C r f M 1,:' M u ’ * C i r ’ l v ' -' hv 1-1 by c n t o m o p a i h o y c n i c t h e n bv Z i r Co'-' Co'' 7.\r‘ I lu ' ) i hc p m k ' i i u v - ' -li' ' 11L'I\ mh; ni u \ l a mi C u ' ■: on I he c o n t r a r y C.I ' -uni M l ’ iiilmmm' ' ! i!k-i! by H g , then by Z n 2\ C o 2+ and C u2+- on the c o n t r a r v r I w - ■_ 'Lne contrary Ca and M g: increased thcir activity P ro leinases were strongly inhibited by EDTA and PM SF Some b a n d s 01 Iho proteinases w ere i d e n tif ie d in p o ly a c ry la m id e g e ls by in co rp o ratin g 0.1% gelatin in to sodium d o d ecy l su lfate (SDS)-polyacrylam ide gel O ne band was inhibited by PMSF the other band w as inhibited by PM SF and partly by ED TA especially, was inhibited by both E D T A and PMSF ã m jjo r h a n d Trịnh H ổ n g T hái, Trịnh Thị Thanh Hương Phan Thị Hà (2002) N °hiên cứu m ọt so tinh chat cua proteinaz ngoại bào từ vi khuẩn cộng sinh với tuyên trùn° (.Xenorhabcỉits sp XS4) Tạp chí Di truyền & ứng dung (Chuycn san CNSH), tr - 12 Tóm tắt: Các pro teinaz ngoại bào vi khuẩn cộng sinh với tuyên trùng (Xeiioihabíhis sp XS4) tinh phần qua sắc ký trao đổi ion D E A E Sephadex ÃO Hoạt tính p rotein az đ ã tìm thây phân đoan kh ô n g hấp phụ trẽn cột sác ký P roteinaz củ a dịch nuôi cấy sau ly tâm phấn kh ông hấp phu CỘI sác ký ngh iẽ n cứu tính chất: pH thích hợp proteinaz 8,0 Trên cư sờ nghiên cứu với ch ất ức c h ế đặc hiệu, proteina/ bị ức c h ế bới EDTA o- phenanthroline phân loại thuộc nh óm proteinaz kim loại Các p ro leina/ bền nhiệt: Sau ủ 60"C 20 phút, hoạt độ enzy m chí cịn 50% so với ban dấu Trong sô ion kim loai thử (C a~ \ M g 2+, M n 2+ F e: \ C o2+, C u 2+, Z r r + Mg2*) protcinaz bị ức chê m ạn h bứi H s :+ (ức chê >9 0% ), sau đơn C u 2+ Z i r + (ức chê 7080%)- trái lại ion C a :+, M g :+ M n 2+đã làm tũrm hoạt dỏ enzym : Điộn di trôn gel polyacrylam id phân biệt khu vực có hoạt tính protcma/., chu yêu proteina/ di chuyến chàm Vai 1rò p ro tc m a / q nh gãy họ-nil trù n ” cQim đ ã tiược ihád luận C h a raclcri/.atioiì ol' e x ira v llu L ir protcinascs (X cno.halxlus sp XS4) G cnclics and Applieaiions < Sunimar\: lii-m ciiioiiìop ath o^oiiK Numhu I\I,UTI,I , f " rr secre,ed by ' " ' “ " O t o g e n i c bacteria have hoc, p“ Ĩ p! * y a n i° " ex ch a n g e chrom atoSraPhJ' D E A E Sephadcx A-59 Z activity was found in the un ad sorben fractions o f chrom atography column Proteinases of culture supernatant and unadsorbent fractions J Z have been characterized p H o p tim u m o f proteinases was On the basis of inhibitor studies, the protem ases w hich w ere inhibited by EDTA and o-phenanthroline were classified as m etalloproteinases The proteinases were less stable: their activity remained about after in c u b atin g at 60"C in 20 minutes A m ong cations tested < G r \ M g * Fe , Co , Cu +, Z n m, M »> , H g 2*), the proteinases were strongly inhibited by H »!* % inhibition), then b y C u 2* and Z n * (70-80% inhibition): on the contrary O r * M»-* and Mn increased activity o f the proteinases Proteinase activity was identified in polyacrylam ide g els by incorporating 0.1% gelatin in to sodium dodecyl sult’ate (SDS)polyacrylam ide gel polyacrylam ide gels Four zones of proteinase in which there were som e activity were v isu alized ' in proteinase bands, mainly slow migrating p ro teinase bands The role o f these proteinases in entom opathogenecity of nem atode-bacterium c o m p lex es was discussed Trịnh H n g T hái, T rịnh Thị Thanh Hương, Lương T hu ỳ Dương, Phan Thị Hà, (2004) T h n h phần proteinaz ngoại bào vi k h u ẩn cộng sinh với tuyên trùng (X en o rh a b d u s sp CA) Tạp chí kh oa học, Đ H Q G H N (đang in) T óm tắt: Pro teinaz ngoại bào vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng (X enorhabdus sản phẩm C A ) bị ức chê m an h bới ED TA PMSF T hành phần proteinaz dươc phân tích bàng điện di gel polyacrylam d có SDS có chất gclatụi 0,1 ty Hoai tính proteinaz dược nhận thày khu vực (I, II, III) với độ di động diện di tưưng ứng b ằn° (0-0.08), (0 09-0 ,2 ) ( > , 1) Hoạt tính proieina/ cua khu vực II kì manh nhâl c h ú n ° bi ức chõ bói F.DTA PMSF Ti'ái lại hcii chai ức chõ lai khnii'j ức chè p ro te in a / cua khu vực Tuy nhiên ProteiiKi/ cua khu vực III bị úc chõ manh bới P M SF nlurnu cŨHii bị ức chẽ mõi phan bơi 1:D I A O í c ion C r + B 1:+ M ° : * M n : ' P b : ' íl.ì l a m l ũng hoa i I.li> p r o k - i n a / cLK1 khu vực III nhiên ánh hường cua ion N r \ c \ r K-: ' c II■ < 1.11 ra! VCU U m - V ion C n \ Ba: \ M s r \ M n : ' LỈU anh hướng cĩcn Imivj OM1 I V ' Lhi mh hướng đến bang 31 T ron g sổ ion kim loại dược nghién cứu chúng to, chi,, ùm tháy ion n có ảnh hường đen bang protcinaz thuộc khu vực II Các prolcm a/ nàv phân loại th uộ c nh ó m proteinaz kim loại-xerin C o m p o sitio n o f extracellular proteinase produced by entom opathosenic bacteria {Xenoj h a b d u s sp ca) J o f Science Natural Sciences (in press) Summary: X e n o rh a b d u s sp CA, an entom opathogenic bacterium associated with the Steinernem a ca rp o c a p sa e Xenorhabclits sp.C A was was isolated strongly in V ietnam inhibited Extracellular by ED TA and proteinase of PMSF Proteinase composition was analyzed by using a sodium dodecyl sulfate polyacrylamidc gel electrophoresis incorporating 0.1% gelatin Proteinase activity was identified in areas (I, II, II) with relative motility of (0-0,08), (0,09-0,20) (0,25-0.31) respectively P roteinase activity of II was the strongest, the proteinases were inhibited by EDTA and PM SF In contrary, they did't inhibite the proteinases of Ỉ However, the proteinase,s of III w ere strongly inhibited by PM SF and partly inhibited by EDTA Ions o f C a 2+ Ba2+, M g 2+, M n 2+, Pb2+ increased the proteinase activity of III, however the effect o f N r +, C d 2\ F e2+, C u2+, C o 2+ was very weak It is interested that ions of C a 2+ Ba2+, M g 2+, M n 2+ influenced on the band o f 0.25, and Pb2+ influenced only on the band o f 0.31 U nexpectively, we did't find any m etal ions which effected on the protcinascs o f II The proteinascs were classified as serine m ctalloproteinase T rịnh Thị T h an h H ương, Trịnh H ồng Thái, (2004) N ghiên cứu số tính chất c í n proteina? n°oiú bào từ vi khuan P liotoiliíibihix litnitucsc eus Hp Tap ch I kho a học, Đ H Q C rH N (đang in) Tóm lát: n „ l< ;l,a l h is /ôằôãô,ãô.ãôằ Iku-nn-hMỡlis b.l.nrph.-ru Hp i;> VI khuán cong s in h I l l ’s,s r n/ yi ì i kh in; IV n v „i II,yen M I C : s a u u « trim s ) « 60"C [ r o n g p h ú l h o i l i n h c n / v m chi 0.11 S K - C a v | m l , b, ức , h c m a n h M I O T A ( ức c h : l l i m SO ' I I PMSI Hi , , h c 1,.M - w ; I T r o n g ■hũ ( M „ - \ c v \ I V CÀ1 : ■Ba'-\ Mg-; I'H " o , - M n,: c a I.Ill- luo'iil: h'Ui mill c n / \ n i Cite inn H'J 1' Z n ' N, i : i „n k n n l „ , i « *