T p h ho h HQGHN: ho h T nhi n v C ng ngh T p 33 S 2S (2017) 53-59 Nghiên ứu ho n thi n quy trình hẩn đoán di truyền trướ huyển ph i b nh teo tủy kỹ thu t minisequen ing Nguyễn Thị Th nh Ng 1,* Trần Văn ho 1, Nguyễn Thị Hồng Vân2 Ng Trường Gi ng1 Học viện Quân Y, 160 Phùng Hưng, Hà Nội, Việt Nam Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nh n ng y 16 tháng năm 2017 Chỉnh sử ng y 20 tháng năm 2017; Chấp nh n đăng ng y 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: B nh teo tủy l b nh thần kinh bị đồng hợp exon gen SMNt tr n nhiễm sắ thể s Trẻ bị b nh teo tủy thường hết sớm lứ tuổi h Vì v y mụ ti u ủ nghi n ứu l ho n thi n quy trình phát hi n đột biến đồng hợp exon gen SMNt gây b nh teo tủy trướ huyển ph i kỹ thu t minisequen ing Nghi n ứu đượ tiến h nh tr n 30 mẫu tế b o ph i sinh thiết từ ph i dư 04 ặp m ng gen ó nguy n v ng sinh on khỏe m nh Nhân to n bộ gen tr n 30 mẫu tế b o ph i sinh thiết từ ph i dư s u nhân exon gen SMNt phát hi n đột biến gây b nh teo tủy kỹ thu t minisequen ing để huẩn hó quy trình hẩn đốn di truyền trướ huyển ph i b nh teo tủy Ứng dụng quy trình với gi đình th m gi nghi n ứu kết 02 ặp th nh ng với trẻ khỏe m nh r đời Chúng t i ho n thi n v ứng dụng th nh ng kỹ thu t minisequen ing hẩn đoán di truyền trướ huyển ph i b nh teo tủy Từ khóa: Teo tủy gen SMN SMA PCR-RFLP Đặt vấn đề giới l 1/10.000 trẻ đẻ s ng v tỷ l người m ng gen b nh d o động từ 1/40-1/60 [1] Nguyên nhân gây b nh SMA l đột biến gen SMNt (surviv l monitor neurone) tr n nhiễm sắ thể s Gen SMN b o gồm exon mã hó ho phân tử protein SMN d i 294 id Gen SMN ó h i s o gi ng nh u l gen SMNt (SMN1) v gen SMN (SMN2) Trong 95% b nh nhân bị b nh teo tủy đồng hợp exon gen SMNt Do để hẩn đốn gen b nh SMA thường phân t h s ó mặt h y vắng mặt exon gen SMNt Có s phương pháp B nh teo tủy (Spinal Muscular Atrophy – SMA) l b nh thần kinh đặ trưng s thoái hoá tuần tiến ủ tế b o sừng trướ tuỷ s ng dẫn đến yếu đ i xứng g hi trương l v phản x gân xương bị giảm hoặ Tỷ l b nh SMA tr n to n _ Tá giả li n h T.: 84-1689186638 Email: thanhngabongbong81@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4560 53 54 N.T.T Nga nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, phát hi n đột biến gen gây b nh SMA song vi sử dụng phương pháp phù hợp n o l quan tr ng hẩn đoán di truyền trướ huyển ph i ó đặ điểm v khó khăn với hẩn đoán tr n b nh phẩm th ng thường Một đặ điểm phân tử qu n tr ng l exon gen SMNt exon gen SMN hỉ nh u ặp nu leotid vị tr 214 n n nhân exon gen SMNt nhân lu n ả exon gen SMN Vì v y ặp nu leotid nh u exon đượ sử dụng để phân bi t gen SMNt với SMNc hẩn đoán SMA [1] Th tế trẻ mắ b nh SMA r đời thường dẫn tới tử vong sớm Do vi hẩn đốn di truyền trướ huyển ph i (preimplantation genetic diagnosis- PGD) b nh SMA với gi đình tiểu sử ó người mắ b nh SMA nhằm h n r ph i l nh để huyển v o tử ung mẹ từ sinh r em bé khỏe m nh l ần thiết v ó ý nghĩ qu n tr ng ể th hi n đượ điều bướ đầu húng t i tiến h nh nghi n ứu đề t i: “Nghi n ứu ho n thi n quy trình hẩn đốn di truyền trướ huyển ph i b nh teo tủy kỹ thu t minisequen ing ” Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đ i tượng 30 mẫu tế b o ph i sinh thiết từ mẫu ph i dư; gi đình gồm b mẹ m ng gen on bị b nh teo tủy (con bị b nh teo tủy Vi n Nhi Trung ương hẩn đốn đồng hợp exon gen SMNt) có nguy n v ng làm PGD 2.2 Hóa chất, thiết bị Hó hất nhân to n gen theo kit GenomePlex® single cell whole genome mplifi tion (Sigm ) Hó hất tinh s h: SAP EXO1 Hó hất n di: Hidi-formamid; GeneScan-120 LIZ Hó hất ho PCR: hỗn hợp phản ứng PCR enzym DNA Polymer se 2S (2017) 53-59 mồi minisequensing SN Pshot Multiplex Kit Thiết bị: máy ly tâm văng buồng th o tá PCR máy PCR ABI 9700 h t ủ hó hất máy n di t động 3130xl Geneti n lyzer h th ng n di tr n gel 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Các bước phát đột biến đồng hợp exon gen MNt gây bệnh teo tủy mẫu tế bào phôi sinh thiết từ phôi dư Tiến h nh nhân to n bộ gen (Whole Genome Amplification- WGA) từ mẫu tế b o ph i sinh thiết theo bướ hướng dẫn ủ k t GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplifi tion; lấy sản phẩm s u tiến h nh nhân to n bộ gen l m mẫu để th hi n kỹ thu t minisequen ing phát hi n đột biến đồng hợp exon gen SMNt gây b nh teo tủy với bướ : + Nhân exon gen SMNt với trình t mồi thiết kế theo Fiorentino F V s [2] có ải bi n: F-5’- agactatcaacttaatttctgatca-3’ R-5’- caccttccttctttttgattttgt-3’ + h thướ sản phẩm nhân: 189bp + Th nh phần phản ứng PCR ho exon SMNt: m ster mix 12.5 µl; mồi 0.5 µl; nướ đề ion 7µl; mẫu 5µl + Chu trình nhi t phản ứng PCR: 960C phút; [940C 45 giây, 550C 30 giây, 720C phút] x 35 hu kỳ; 720C 10 phút Phản ứng Minisequen ing đượ tiến h nh: Sản phẩm nhân exon gen SMNt đượ tinh s h enzym SAP v EXO1 h y minisequensing theo quy trình ủ kit ABI PRISM SNaPshot Multiplex với 0,2 μM mồi minisequencing: + Trình t mồi minisequen ing: 5’- ccttttattttccttacagggttt-3’ Hỗn hợp phản ứng đượ h y tr n máy PCR 9700 với hu trình nhi t s u: [960C N.T.T Nga nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, 10 giây, 500C 10 giây, 600C 30 giây] x 25 hu kỳ; 720C phút Sản phẩm thu đượ th m v o đơn vị enzym SAP ủ theo hu trình nhi t: 370C v 750C 15 phút Sản phẩm minisequen ing đượ n di huỳnh qu ng tr n máy 3130xl Genetic analyzer 45 phút, phân t h phần mềm GeneM pper ID v 3.2 ánh giá kết phát hi n đột biến d v o s lượng m u sắ v độ lớn ủ đỉnh thu đượ tr n n di huỳnh qu ng Ở vị tr nucleotid 214 exon SMNt C, cịn exon SMN l T Vì v y với kỹ thu t minisequen ing người kh ng bị b nh teo tủy xuất hi n h i đỉnh: m u đen tương ứng nu leotit C ủ exon SMNt v m u đỏ tương ứng nu leotit T ủ exon SMN hoặ hỉ xuất hi n đỉnh m u đen tương ứng nu leotit C ủ exon gen SMNt (vì hỉ exon gen SMNt gây b nh teo tủy) người bị b nh teo tủy đồng hợp exon SMNt hỉ xuất hi n đỉnh m u đỏ tương ứng nu leotit T ủ exon gen SMN 2.3.2 Các bước ứng dụng quy trình chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi bệnh teo tủy cho gia đình Cá bướ phát hi n đột biến đồng hợp exon gen SMNt gây b nh teo tủy từ mẫu máu to n phần ủ b mẹ: Thu mẫu máu to n phần ủ gi đình b nh nhân th m gi nghi n ứu tá h ADN theo k t F vorPrepTM Genomic DNA Mini ủ hãng F vorgen S u tiến h nh kỹ thu t minisequen ing bướ th hi n tr n tế b o ph i để phát hi n đột biến B n nh vi nhân gen phát hi n đột biến vi đánh giá nhiễm ADN ngo i l i ủ mẫu tế b o ph i sinh thiết đượ ũng qu n tr ng b nh teo tủy l b nh di truyền lặn n n trình sinh thiết ph i hoặ th o tá kỹ thu t kh ng t t ó thể bị nhiễm ADN ngo i l i n n hẩn đoán ph i b nh th nh ph i thường dẫn đến huyển nhầm ph i b nh Do nghi n ứu húng t i nhân polymorphic 2S (2017) 53-59 55 m rker D5S1977 D5S629 D5S641 h n r lo i polymorphi m rker dị hợp b mẹ để đánh giá nhiễm ADN ngo i l i, lẽ húng ó t nh đ hình v đặ trưng ho thể o n n ó thể dễ d ng phát hi n đượ tế b o ph i sinh thiết đượ ó di truyền từ b v mẹ h y kh ng - Cá bướ phát hi n đột biến đồng hợp exon gen SMNt gây b nh teo tủy từ mẫu tế b o ph i sinh thiết ủ gi đình: Ni phơi ngày hoặ tiến h nh sinh thiết tế b o; S u nhân to n bộ gen từ mẫu tế b o ph i sinh thiết theo bướ hướng dẫn ủ k t GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplifi tion; Lấy sản phẩm s u tiến h nh nhân to n bộ gen l m mẫu để th hi n h i bướ s u: + Th hi n kỹ thu t minisequen ing phát hi n đột biến đồng hợp exon gen SMNt gây b nh teo tủy + Nhân polymorphi m rker h n (đã biết dị hợp b mẹ) để đánh giá khả nhiễm ADN ngo i l i ủ tế b o ph i sinh thiết Kết nghiên cứu 3.1 Kết phát đột biến đồng hợp exon gen MNt gây bệnh teo tủy mẫu tế bào phôi sinh thiết từ phôi dư 3.1.1 Kết nhân toàn bộ gen mẫu tế bào phôi sinh thiết từ phôi dư Chúng t i tiến h nh nhân to n bộ gen từ 30 mẫu tế b o ph i sinh thiết i n di kiểm tr sản phẩm nhân gel g rose 2% kết thể hi n tr n hình v bảng ết n di gel g rose 2% ho thấy ả mẫu Ph i (P1 P2 P3 P4 P5) ó sản phẩm nhân to n bộ gen với k h thướ khoảng 100bp-1.500bp Tiến h nh tương t với mẫu tế b o ph i òn l i thu đượ kết thể hi n bảng 56 N.T.T Nga nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, 2S (2017) 53-59 Bảng ết nhân to n bộ gen từ tế b o ph i ết Có sản phẩm nhân WGA h ng ó sản phẩm nhân WGA S lượng tế b o ph i 30 29 100% 96,67% 3,33% Tỷ l Như v y kỹ thu t nhân to n bộ gen từ tế b o ph i th nh ng với sản phẩm ADN thu đượ ó k h thướ d o động khoảng 100bp – 1.500bp với hi u phản ứng o (96.67%) đủ điều ki n để th hi n bướ th nghi m Hình ết n di gel g rose 2% sản phẩm nhân to n gen từ tế b o ph i: P1: Phôi 1; P2: Phôi 2; P3: Phôi 3; P4: Phôi 4; P5: Phôi 3.1.2 Kết nhân exon gen MNt từ sản phẩm nhân toàn bộ gen mẫu tế bào phôi sinh thiết từ phôi dư Lấy sản phẩm nhân to n bộ gen ủ tế b o ph i l m mẫu tiến h nh nhân exon gen SMN kỹ thu t minisequen ing kết thể hi n bảng Bảng ết nhân exon gen SMNt từ sản phẩm nhân to n bộ gen tr n tế b o ph i sinh thiết từ ph i dư Gen SMNt S mẫu tiến h nh Exon 29 S mẫu ó sản phẩm PCR ủ exon 29 Th ng k bảng ho thấy th hi n kỹ thu t minisequen ing nhân gen phát hi n đột biến tr n 29 mẫu tế b o ph i sinh thiết từ ph i dư ó sản phẩm nhân exon gen SMNt điều n y ho n to n phù hợp với th tế tất ả mẫu tế b o phôi sinh thiết từ ph i dư bình thường Hi u phản ứng nhân exon gen SMNt phát hi n đột biến nghi n ứu o v ũng gần tương đương với s tá giả tr n giới Dreesen J C cs [3] (100%), Daniels G cs [4] (91%), Moutou C cs [5] (92,9%), Fiorentino F cs [2] (93,8%), Girardet A cs [6] (88 2) Như v y ó thể nói húng t i S mẫu kh ng ó sản phẩm PCR ủ exon Hi u phản ứng PCR 100% th nh ng vi ho n thi n kỹ thu t minisequen ing hẩn đoán di truyền trướ huyển ph i b nh teo tủy tr n ph i thụ tinh ng nghi m 3.2 Kết ứng dụng quy trình PGD cho gia đình 3.2.1 Kết phát đột biến gen MNt từ máu toàn phần b , mẹ - ết phát hi n đột biến đồng hợp exon gen SMNt gây b nh teo tủy kỹ thu t minisequen ing ủ gi đình SMA18 thể hi n tr n hình N.T.T Nga nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, 2S (2017) 53-59 57 Như v y B B18 ó sản phẩm nhân D5S641 dị hợp với h i len v mẹ M18 ó sản phẩm nhân D5S641 dị hợp với h i len v Do v y h n D5S641 để đánh giá nhiễm ADN ngo i l i ủ mẫu ph i sinh thiết đ i với gi đình SMA18 3.2.2 Kết tiến hành tế bào phơi sinh thiết Hình ết n di huỳnh qu ng sản phẩm nhân exon gen SMNt kỹ thu t minisequen ing từ máu to n phần gi đình SMA18: B18: b b nh nhân SMA18; M18: mẹ b nh nhân SMA18; C18: b nh nhân bị b nh teo tủy s 18 Cả b b nh nhân 18 (B18) v mẹ b nh nhân 18 (M18) xuất hi n h i đỉnh tương ứng với exon gen SMNt v exon gen SMN điều n y ho n to n hợp lý th tế h l người bình thường B nh nhân (C18) hỉ ó đỉnh tương ứng exon gen SMN nghĩ l C18 bị đồng hợp exon gen SMNt ( ết n y phù hợp với kết lu n hẩn đoán gen gây b nh teo tủy trướ ủ Vi n nhi Trung ương) - ết h n polymorphi m rker dị hợp với b mẹ gi đình SMA18: Nhân polymorphic marker D5S629, D5S641, D5S1997 từ máu to n phần ủ gi đình SMA18 ết B18 v M18 ó sản phẩm nhân D5S641 dị hợp thể hi n hình Hình ết nhân D5S641 ủ gi đình SMA18: B18: B b nh nhân 18; M18: Mẹ b nh nhân 18 ết nhân gen phát hi n đột biến đồng hợp exon gen SMNt gây b nh teo tủy Gia đình SMA18 sinh thiết đượ mẫu tế b o ph i Tiến h nh nhân to n bộ gen theo k t GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification S u tiến h nh nhân gen phát hi n đột biến đồng hợp exon gen SMNt kỹ thu t minisequen ing kết thể hi n hình Hình ết phát hi n đột biến gen SMNt gây b nh teo tủy từ mẫu tế b o ph i sinh thiết ủ gi đình SMA18 dùng kỹ thu t minisequen ing: P1: Phôi 1; P2: Phôi 2; P3: Phôi 3; P4: Phơi 4.Sau tiến h nh hẩn đốn PGD b nh SMA kỹ thu t miniseque ing đ i với gi đình SMA18 ho thấy phơi sinh thiết đượ hỉ ó ph i (P4) xuất hi n h i đỉnh tương ứng với exon gen SMNt v exon gen SMN n n l ph i bình thường ph i ịn l i (Ph i 1- P1; phôi 2- P2; phôi 3- P3) hỉ ó đỉnh tương ứng exon gen SMN n n l ph i bị b nh teo tủy 58 N.T.T Nga nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, - ánh giá nhiễm ADN ngo i l i ủ mẫu tế b o ph i sinh thiết 2S (2017) 53-59 Nhân D5S641 từ mẫu tế b o ph i sinh thiết ủ gi đình SMA18 kết thể hi n hình Hình ết nhân D5S641 ủ gi đình 18 B18: B 18 dị hợp với h i len v 2; M18: Mẹ 18 dị hợp với h i alen 4; P1: Phôi 1; P2: Phôi 2; P3: Phôi 3; P4: Phôi Như v y ả ph i ó s di truyền nh n len tương ứng từ b v mẹ nghĩ l tất ả mẫu ph i sinh thiết kh ng bị nhiễm ADN ngo i l i Do l h n phơi kh ng bị b nh Bảng ết hẩn đoán di truyền trướ teo tủy kh ng nhiễm ADN ngo i l i để huyển ph i Với bướ tiến h nh tương t với gi đình ịn l i thu đượ kết th ng k bảng huyển ph i ủ gi đình th m gi nghi n ứu STT S tế b o ph i sinh thiết đượ Phôi bình thường S tế b o ph i huyển SMA1 SMA2 Ph i kh ng phát triển SMA18 1 SMA19 2 Kết luận khuyến nghị 4.1 Kết lu n ã ho n thi n đượ quy trình hẩn đốn di truyền trướ huyển ph i b nh teo tủy kỹ thu t minisequen ing Bướ đầu áp dụng th nh ng quy trình hẩn đốn di truyền trướ huyển ph i ết Sinh em bé khỏe m nh Sinh em bé khỏe m nh ng theo dõi b nh teo tủy kỹ thu t minisequencing ho 04 gi đình: ó em bé khỏe m nh r đời ặp đ ng theo dõi từ l m giảm gánh nặng ho gi đình v xã hội góp phần tăng hất lượng dân s 4.2 Khuyến nghị Tiếp tụ áp dụng quy trình hẩn đốn di truyền trướ huyển ph i b nh teo tủy N.T.T Nga nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, kỹ thu t minisequen ing ho ặp vợ hồng m ng gen ó nguy n v ng hủ động sinh on khỏe m nh hảo sát th m polymorphi m rker nằm gần gen SMNt để h n r lo i ó tỷ l dị hợp o người Vi t n m từ l m tăng hi u đánh giá nhiễm ADN ngo i l i [3] [4] Tài liệu tham khảo [5] [1] Burglen L., Lefebvre S., Clermont O., et al, Structure and organization of the human survival motor neurone (SMN) gene, Genomics, 32 (1996), 497-482 [2] Fiorentino F et al (2003) The minisequencing method: an alternative strategy for preimplantation genetic diagnosis of single [6] 2S (2017) 53-59 59 gene disorders Mol.Hum Reprod., Vol 9, No pp 399 – 410 Dreesen J.C., Bras M., Die- Smulders C et al, Preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy Mol.Hum Reprod., Vol (1998), No.9 pp 881-885.3 Daniels G., Rachel Pettigrew, Alan Thornhill et al, Six unaffected livebirths following preimplatation diagnosis for spinal muscular atrophy Mol.Hum Reprod., Vol.7 (2001), No.10 pp.995-1000.4 Moutou C et al, Duplex PCR for preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy, Prenatal diagnosis, 23 (2003), 685-689.5 Girardet A et al, Efficient strategies for preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy, Fertility and Sterility, Vol.90 (2008), No.2 Study on Protocol Improvement for Spinal Muscular Atrophy Preimplantation Genetic Diagnosis by Using the Minisequencing Technique Nguyen Thi Thanh Nga1, Tran Van Khoa1, Nguyen Thi Hong Van2, Ngo Truong Giang1 Vietnam Military Medical University, 160 Phung Hung, Hanoi, Vietnam Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam Abstract: Spinal muscular atrophy (SMA) is a severe neurodegenerative autosomal recessive disorder Most of patients are caused by the homozygous absence of exon of the telomeric copy of the SMN gene (SMNt) on chromosome Children with SMA often died prematurely at school age Therefore, the aim of the study was to improve protocol for spinal muscular atrophy preimplantation genetic diagnosis by using the minisequencing technique The study was conducted on 30 embryonic cell templates byopsied plus embryos, and four couples were treated using this method Five unaffected embryos were transferred which resulted in two clinical pregnancy We have successfully applied the technique of minisequencing for the Preimplantation Genetic Diagnosis of spinal muscular atrophy Keywords: Spinal muscular atrophy, SMN gene, Preimplantation Genetic Diagnosis, minisequencing ... applied the technique of minisequencing for the Preimplantation Genetic Diagnosis of spinal muscular atrophy Keywords: Spinal muscular atrophy, SMN gene, Preimplantation Genetic Diagnosis, minisequencing. .. strategies for preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy, Fertility and Sterility, Vol.90 (2008), No.2 Study on Protocol Improvement for Spinal Muscular Atrophy Preimplantation Genetic. .. on chromosome Children with SMA often died prematurely at school age Therefore, the aim of the study was to improve protocol for spinal muscular atrophy preimplantation genetic diagnosis by using