Alterations of the MT ATP8 gene and 9 bp deletion in vietnamese patients with breast cancer

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 38-47 Biến đổi gen MT-ATP8 ty thể đoạn bp bệnh nhân ung thư vú Việt Nam Nguyễn Thị Tú Linh, Nguyễn Thị Thảo, Đỗ Thị Dung, Trịnh Hồng Thái* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 16 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Gen MT-ATP8 ty thể mã hóa cho tiểu đơn vị protein A6L thuộc kênh proton phức hệ tổng hợp ATP Biến đổi gen MT-ATP8 ảnh hưởng tới cấu trúc chức enzyme ATP synthase, từ gây bệnh Trong nghiên cứu này, biến đổi gen MT-ATP8 xác định mẫu mô bệnh nhân ung thư vú mẫu máu người bình thường sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự trực tiếp PCR-RFLP, sau phân tích đánh giá phương pháp tin sinh học thống kê sinh học Kết PCR giải trình tự trực tiếp xác định biến đổi gen MT-ATP8 35 mẫu mô u bệnh nhân ung thư vú 26 mẫu máu người bình thường, có biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin phân tử protein tương ứng C8414T C8417T Biến đổi C8417T sàng lọc tiếp PCR-RFLP biến đổi gặp với tần suất 0,98% (1/102 mẫu mô) bệnh nhân ung thư vú Biến đổi làm thay đổi axít amin leucine thành phenylalanine (L18F) thuộc vị trí bảo thủ A6L dự đốn có nhiều khả làm thay đổi cấu trúc chức phân tử protein Bên cạnh đó, đoạn bp tìm thấy vùng khơng mã hóa ADN ty thể có tần suất 26,5% (27/102 trường hợp) bệnh nhân 27% (7/26 trường hợp) mẫu đối chứng Như vậy, kết cho thấy đột biến C8417T vị trí bảo thủ gen MT-ATP8 thuộc loại gặp lần xác định thấy nhóm bệnh nhân ung thư vú Việt Nam Từ khóa: ADN ty thể, MT-ATP8, Ung thư vú Mở đầu hô hấp ty thể (phức hệ I - V), ARN ribosome 22 ARN vận chuyển [1] Ty thể giữ vai trò quan trọng chết theo chương trình (apoptosis) tế bào, biến đổi gen ty thể cho có liên quan với q trình tạo u tế bào ung thư cần sử dụng nhiều lượng để sinh trưởng tăng sinh điều kiện hạn chế [2] Trong phức hệ hô hấp ty thể, phức hệ V phức hệ tổng hợp ATP Nó bao gồm Ty thể coi “nhà máy lượng” tế bào tạo 90% lượng ATP cho hoạt động tế bào Để đảm nhận chức này, ty thể có hệ gen riêng với 37 gen mã hóa cho 13 protein phức hệ _ Tác giả liên hệ ĐT.: 84-243-8582798 Email: thaith@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4713 38 N.T.T Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 38-47 kênh proton nằm màng ty thể (F0) thành phần xúc tác (F1) nằm chất Trong số tiểu đơn vị F0, tiểu đơn vị α A6L mã hóa gen MT-ATP6 MT-ATP8 ty thể [3] Đột biến trình tự mã hóa cho tiểu đơn vị phức hệ tổng hợp ATP ảnh hưởng tới cấu trúc chức enzyme ATP synthase [4] Gen MT-ATP8 (còn gọi với tên khác ATP8 hay ATPase8) có kích thước 207 bp, nằm từ vị trí 8366 đến 8572 sợi nặng ADN ty thể mã hóa cho tiểu đơn vị A6L Gen mã hóa cho phân tử protein thuộc vùng có chức quan trọng phức hệ tổng hợp ATP, nhiên vai trò biến đổi gen MT-ATP8 ung thư chưa quan tâm nghiên cứu đầy đủ Do đó, nghiên cứu thực nhằm đánh giá biến đổi gen MT-ATP8 ty thể tìm hiểu mối liên quan biến đổi với đặc điểm bệnh học ung thư vútrên nhóm đối tượng bệnh nhân người Việt Nam Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu Mẫu nghiên cứu bao gồm mẫu mô ung thư biểu mô ống tuyến vú (được lấy vị trí khối u, gọi mô u) 102 bệnh nhân ung thư vú phẫu thuật triệt có vét hạch chẩn đốn xác định mô bệnh học Khoa Giải phẫu bệnh – Tế bào, Bệnh viện K thời gian từ tháng 12/2012 đến tháng 12/2013 mẫu máu 26 người cho máu bình thường Khoa Sàng lọc máu, Viện Huyết học Truyền máu Trung ương cung cấp Các mẫu bệnh phẩm lấy vào vùng không bị hoại tử loại trừ trường hợp ung thư di từ nơi khác đến Danh sách số đặc điểm bệnh học bao gồm độ tuổi, kích thước khối u, số hạch, kích thước hạch, giai đoạn TNM (u nguyên phát - hạch vùng - di xa) mức độ biệt hóa khối u cung cấp kèm theo mẫu bệnh phẩm Nghiên cứu thực theo quy định hành đạo đức nghiên cứu y học việc thu thập mẫu máu mô 39 bệnh nhân Các dẫn liệu thu được giữ bí mật, phục vụ cho mục đích nghiên cứu, khơng sử dụng cho mục đích khác 2.2 Phương pháp Tách chiết ADN tổng số PCR giải trình tự trực tiếp: ADN tổng số tách chiết từ mẫu mô mẫu máu sử dụng QIAamp DNA Mini Kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình nhà sản xuất Nồng độ ADN tổng số xác định máy quang phổ NanoDrop 2000c (Thermoscientific, Mỹ) Các cặp mồi đặc hiệu cho đoạn ADN quan tâm thiết kế sử dụng chương trình Primer-BLAST với trình tự ADN ty thể tham khảo từ sở liệu NCBI (mã số NC_012920.1) (Bảng 1) Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn ADN có kích thước 1148 bp sử dụng để giải trình tự bao gồm: 6,25 µl Maxima Hot Start PCR Master Mix 2X; 0,25 µl mồi (0,2 µM); khn ADN (với nồng độ từ - 2,5 ng/µl) H2O tổng thể tích 12,5 µl Hỗn hợp phản ứng chạy máy GenAmp® PCR System 9700 với chu trình nhiệt sau: 95°C: phút, 35 chu kỳ (95°C: 30 giây; 56°C: 30 giây; 72°C: 75 giây); 72°C: phút, sau giữ 4°C Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,5%, tinh ExoSAP-IT (Affymetrix, Mỹ) giải trình tự (Cơng ty 1st Base, Malaysia) Dự đốn khả gây bệnh biến đổi dựa thay đổi trình tự axít amin: Tác động biến đổi gen làm thay đổi trình tự axít amin đến cấu trúc chức phân tử protein dự đoán chương trình PolyPhen-2[5] Sàng lọc biến đổi C8417T sử dụng phương pháp PCR-RFLP: Đoạn gen MT-ATP8 mang biến đổi C8417T (được dự đốn có vai trị quan trọng đến phân tử protein) tiến hành nhân sử dụng cặp mồi 8417 (Bảng 1) với thành phần phản ứng bao gồm: 6,25 µl Maxima Hot Start PCR Master Mix 2X; 0,25 µl mồi (0,2 µM); khn ADN (với nồng độ từ - 2,5 ng/µl) H2O tổng thể tích 12,5 µl Chu trình N.T.T Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 38-47 40 nhiệt sử dụng với cặp mồi 8417 thiết lập sau: 95°C: phút, 35 chu kỳ (95°C: 30 giây; 52°C: 30 giây; 72°C: 30 giây); 72°C: phút, sau giữ 4°C Sản phẩm PCR có kích thước 255 bp xử lý với enzyme giới hạn DdeI (Thermo Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm cắt enzyme giới hạn điện di kiểm tra gel polyacrylamide 8% Bảng Trình tự cặp mồi enzyme giới hạn sử dụng xác định biến đổi gen MT-ATP8 Mục đích Giải trình tự Sàng lọc biến đổi C8417T Tên mồi ATP8 8417 Kích thước sản phẩm (vị trí) 1148 bp (8197-9344) 255 bp (8185-8439) Trình tự mồi xi (5’ – 3’) cagtttcatg cccatcgt tggagcaaa ccacagtta c Trình tự mồi ngược (5’ – 3’) Enzyme sử dụng Sản phẩm cắt Không Có biến biến đổi đổi gcctagtatgaggag cgtta - - - tgggtgatgaggaat agtctaa DdeI 5’C↓TNAG 3’ 125 bp, 108 bp, 22 bp 125 bp, 130 bp Các phần mềm tin sinh học phân tích thống kê: Các mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR thiết kế chương trình Primer BLAST (NCBI) Trình tự gen ty thể so sánh, phân tích với trình tự tham chiếu ADN ty thể công bố sở liệu NCBI (NC_012920.1) phần mềm tin sinh học chuyên dụng BioEdit v7.0, BLAST ClustalX Xác định sản phẩm cắt enzyme giới hạn chương trình Watcut So sánh thống kê thực kiểm định 2 kiểm định Fisher (Fisher’s exact test) để phân tích mối liên quan biến đổi với đặc điểm bệnh học ung thư vú Kết 3.1 Giải trình tự gen MT-ATP8 ty thể phân tích dạng biến đổi Trong nghiên cứu này, đoạn ADN chứa gen MT-ATP8 có kích thước 1148 bp nhân sử dụng để giải trình tự trực tiếp nhằm xác định dạng biến đổi Kết giải trình tự trực tiếp 35 mẫu mơ u bệnh nhân ung thư vú 26 mẫu máu đối chứng phát thấy biến đổi gen MT-ATP8 C8410T, C8414T, C8417T, A8440G T8473C (Hình 1) Hình Các biến đổi gen MT-ATP8 xác định thơng qua giải trình tự trực tiếp N.T.T Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 38-47 Trong biến đổi có biến đổi C8414T, A8440G T8473C thấy xuất đồng thời mẫu mô bệnh nhân mẫu máu đối chứng Các biến đổi gen MT-ATP8 mẫu mô máu có tần suất thấp, xuất 2/35 bệnh nhân (chiếm 5,7%) 2/26 đối 41 chứng (chiếm 7,7%) (Bảng 2) Tất biến đổi trạng thái đồng tế bào chất (homoplasmy) báo cáo sở liệu Mitomap Đáng ý, có 2/5 biến đổi (chiếm 40%), C8414T C8417T, làm thay đổi trình tự axít amin phân tử protein (Bảng 2) Bảng Thống kê biến đổi gen MT-ATP8 mẫu mô u bệnh nhân ung thư vú mẫu máu bình thường xác định giải trình tự trực tiếp TT Vị trí Biến đổi Thay đổi axít amin 8410 8414 8417 8440 8473 C>T C>T C>T A>G T>C P15P L17F L18F Q25Q P36P Tần suất Mẫu mô 1/35 1/35 1/35 1/35 Mẫu máu 1/26 1/26 1/26 Công bố + Longevity + + + Chú thích: (+): Đã công bố MITOMAP 3.2 Tác động biến đổi gen làm thay đổi trình tự axít amin Mặc dù biến đổi C8414T báo cáo trước bệnh ung thư vú [6], nhiên nghiên cứu này, biến đổi C8414T phát thấy mẫu mô bệnh nhân mẫu máu người bình thường Do đó, chúng tơi lựa chọn phân tích biến đổi C8417T, biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin phân tử protein, thấy xuất mẫu mô bệnh nhân không thấy mẫu máu đối chứng để tiến hành phân tích Vai trò biến đổi C8417T (L18F) đến cấu trúc chức phân tử protein A6L dự đốn sử dụng chương trình PolyPhen2 Theo đó, biến đổi nằm vị trí bảo thủ dự đốn có nhiều khả ảnh hưởng đến phân tử protein (PolyPhen-2 score: 0,994) Tiếp theo, thực sàng lọc biến đổi mẫu nghiên cứu 3.3 Tần suất biến đổi C8417T mẫu nghiên cứu Để phân tích biến đổi C8417T mẫu nghiên cứu, đoạn ADN có kích thước 255 bp có chứa vị trí biến đổi 8417 nhân (Giếng 1, 3, 5, Hình 2) sàng lọc mẫu nghiên cứu sử dụng enzyme DdeI (Thermo Scientific, Mỹ) có vị trí nhận biết C^TNAG Theo tính tốn, khơng có biến đổi (8417C) enzyme giới hạn cắt sản phẩm PCR có kích thước 255 bp thành đoạn ADN tương ứng 125 bp, 108 bp 22 bp Trên gel polyacrylamide 8%, dạng xác định nhờ vào băng 125 bp 108 bp (Giếng 4, Hình 2) Ngược lại, có biến đổi (8417T) enzyme giới hạn cắt sản phẩm PCR có kích thước 255 bp thành đoạn ADN tương ứng 130 bp 125 bp Trên gel polyacrylamide 8%, dạng 8417T xác định nhờ vào băng có kích thước ~ 130 bp Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 8417 sản phẩm cắt xác định biến đổi C8417T enzyme DdeI gel polyacrylamide 8% M: Thang chuẩn ADN 100 bp Giếng 1, 3, 5: sản phẩm PCR mẫu mô u bệnh nhân (#30698, #33114, #33157) Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm cắt enzyme DdeI mẫu mô u bệnh nhân (#30698, #33114, #33157) Giếng 7: Đối chứng âm (H2O) 42 N.T.T Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 38-47 Kết sàng lọc 102 mẫu mô bệnh nhân ung thư vú cho thấy có 1/102 mẫu (chiếm 0,98%) có biến đổi C8417T 101/102 mẫu bệnh khơng có biến đổi vị trí 8417 (chiếm 99,02%) Kết sàng lọc 26 mẫu máu đối chứng cho thấy tất mẫu máu đối chứng khơng có biến đổi C8417T 3.4 Mất đoạn bp thuộc vùng khơng mã hóa ADN ty thể mẫu nghiên cứu Kết điện di sản phẩm cắt enzyme DdeI cho thấy ngồi băng ADN có kích thước ~ 125 bp 108 bp theo tính tốn ban đầu, số mẫu có xuất thêm băng ADN có kích thước lạ khác Các mẫu tinh tiến hành giải trình tự trực tiếp nhằm xác định biến đổi Kết giải trình tự cho thấy mẫu có xuất đoạn nhỏ có kích thước bp, có trình tự CCCCCTCTA, nằm vị trí 8272 - 8280 vùng khơng mã hóa ADN ty thể (giữa gen MT-CO2 MT-TK) (Hình 3) Mất đoạn bp làm cho sản phẩm cắt có kích thước 125 bp trở thành sản phẩm có kích thước 116 bp (Giếng 6, Hình 2) A B Hình Kết giải trình tự xác định đoạn bp (8272 - 8280) A: Khơng có đoạn bp B: Có đoạn bp Kết sàng lọc mẫu nghiên cứu phát thấy 27/102 trường hợp có đoạn bp mơ u bệnh nhân ung thư vú (chiếm 26,5%) 7/26 trường hợp có đoạn bp (chiếm 27%) máu đối chứng Phân tích tần suất xuất đoạn bp theo đặc điểm bệnh học ung thư vú cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê theo mức độ biệt hóa (rõ, vừa kém) khối u, kích thước hạch (N0 so với N1-2), số hạch (< 10 hạch ≥ 10 hạch) giai đoạn T (T1-2 T3-4) (p > 0,05) Tuy nhiên, đoạn lại thấy cao có ý nghĩa thống kê độ tuổi ≥ 50 (21/62 trường hợp, chiếm 33,9%) so với độ tuổi < 50 (6/32 trường hợp, chiếm 18,8%) (dữ liệu khơng báo cáo) Bàn luận Vai trị ADN ty thể liên quan với trình phát sinh ung thư báo cáo sớm từ năm 1920 Otto Warburg phát thấy tế bào ung thư cần sử dụng nhiều lượng ATP cho tăng sinh nhanh chóng thơng qua tổng hợp đường đường phân (glycosis) nhiều hơn, thay sử dụng phosphoryl hóa oxy hóa (OXPHOS) ty thể [7] Điều cho thấy chức OXPHOS ADN ty thể bị biến đổi tế bào ung thư [8] Gen MT-ATP8 mã hóa cho tiểu đơn vị A6L phức hệ ATP synthase, enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp ATP tế bào, biến đổi gen MT-ATP8 ảnh hưởng đến chức tổng hợp ATP gây bệnh [9] Ví dụ đột biến G8529A nằm vùng gối lên gen MT-ATP6 MT-ATP8 ADN ty thể báo cáo trước Mặc dù đột biến không làm thay đổi trình tự axít amin phân tử protein α gen MT-ATP6 mã hóa lại tạo ba kết thúc sớm vùng bảo thủ gen MT-ATP8 (W55X) Do đó, biến đổi dẫn đến việc lắp ráp khơng xác làm giảm hoạt tính holoenzyme phức hệ V [10] Một đột biến khác, T8528C, cho đột N.T.T Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 38-47 biến gây bệnh dẫn đến thay axít amin tryptophan (có tính kỵ nước, bảo thủ cao) thành arginine (có tính kiềm cao) thuộc tiểu đơn vị A6L gen MT-ATP8 mã hóa thay đổi mã ba mở đầu dịch mã gen MT-ATP6 làm thay methionine thành threonine tiểu đơn vị α phức hệ V Do đó, biến đổi ảnh hưởng đến tiểu đơn vị phức hệ V ty thể [11] Biến đổi gen MT-ATP8 báo cáo số loại ung thư C8414T (L17F), A8459G (N32D) C8472T (P36L) ung thư buồng trứng [12], [13], C8468T C8472T (P36L) ung thư tuyến giáp [1],[15], C8395T C8515T ung thư tuyến cận giáp [16] (Bảng 3)… Trong nghiên cứu này, đa số biến đổi gen MTATP8 xuất với tần suất thấp không làm thay đổi trình tự axít amin phân tử protein Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, liệu ban đầu biến đổi gen MT-ATP8 thu khác biệt nhóm bệnh nhân khác Chintha cộng (cs) (2013) sàng lọc biến đổi gen OXPHOS 180 mẫu bao gồm mẫu mô mẫu máu bệnh nhân ung thư vú, mẫu mô u mô lành liền kề bệnh nhân mắc u vú lành tính u nang, nhiên không phát biến đổi thuộc gen MT-ATP8 [17] Kết tương tự với nghiên cứu Tan cs năm 2002 [18] Tipirisetti cs (2013) phát thấy biến đổi T8426C (F21L) xảy vị trí bảo thủ phân tử protein dự đốn đột biến có hại chương trình PolyPhen-2 [19] Nghiên cứu gần Grzybowska-Szatkowska cs (2014) phát thấy 05 biến đổi gen MT-ATP8 10/50 cặp mẫu mô u mô liền kề bệnh nhân ung thư vú, bao gồm: biến đổi đa hình G8557A đột biến C8429A, A8439C, T8448C G8519A Đa số biến đổi dạng đồng tế bào chất (trừ C8429A) gây thay đổi axít amin phân tử protein Trong số đó, biến đổi A8439C chưa báo cáo trước cho có ảnh hưởng đến chức MT-ATP8 [4] Tương tự, Ghaffarpour cs (2014) phân tích 49 cặp mẫu mơ u mô liền kề bệnh 43 nhân ung thư vú phát thấy biến đổi gen MT-ATP8 4/49 trường hợp (chiếm 8,16%) Trừ biến đổi T8542C G8557A, biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin A8384G (T7A), T8567C (S68P) G8572A (G69S) cho có tác động đến phân tử protein [20] Nghiên cứu 30 bệnh nhân ung thư vú người Mizoram, Ấn Độ nhóm đối chứng, Thapa cs (2016) tìm thấy đột biến C8414T (L17F) gen MTATP8 mẫu nghiên cứu Đột biến nằm vị trí bảo thủ làm thay đổi trình tự axít amin từ leucine thành phenylalanine, dự đốn có ảnh hưởng đến phân tử MTATP8 Trong nghiên cứu chúng tôi, biến đổi gen MT-ATP8 sàng lọc giải trình tự trực tiếp 35 mẫu mơ bệnh nhân ung thư vú 26 mẫu máu đối chứng Tần suất biến đổi thấp gen MT-ATP8 tương đồng với kết nghiên cứu trước Kết xác định biến đổi, có biến đổi thấy xuất mẫu mô bệnh nhân (C8410T C8417T), biến đổi xuất nhóm đối chứng (A8440G) biến đổi xuất đồng thời mẫu mô bệnh nhân mẫu máu đối chứng (C8414T T8473C) Trừ biến đổi C8414T, biến đổi lại chưa thấy công bố trước nghiên cứu đối tượng bệnh nhân ung thư vú [6] Đặc biệt, có 2/5 biến đổi (C8414T C8417T) làm thay đổi trình tự axít amin từ leucine thành phenylalanine vị trí bảo thủ phân tử protein A6L dự đốn có tác động đến phân tử protein tương ứng Trong đó, biến đổi C8417T phát thấy 1/102 mẫu mô bệnh nhân ung thư vú mà khơng thấy có nhóm đối chứng, biến đổi có mối liên quan đến bệnh Trong nghiên cứu trước PeruccaLostanlen cs (2000), biến đổi đồng tế bào chất A8381G (T6A) nằm vị trí bảo thủ cao gen MT-ATP8 tìm thấy mẫu mơ bệnh nhân khơng xuất nhóm đối chứng Biến đổi cho ảnh hưởng đến độ ổn định hoạt động phức hệ tổng hợp ATP, dẫn đến giảm sản xuất ATP gây bệnh [21] Tương 44 N.T.T Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 38-47 tự, Mkaouar-Rebai cs (2010) phát thấy biến đổi A8411G (M16V) vị trí bảo thủ gen MT-ATP8 xuất mẫu bệnh khơng xuất nhóm đối chứng Biến đổi gây rối loạn chức tổng hợp ATP có tác động đến phân tử MT-ATP8 liên quan đến bệnh [9] Bảng Một số biến đổi gen MT-ATP8 báo cáo loại ung thư TT Loại ung thư Vị trí Biến đổi Ung thư buồng trứng Ung thư tuyến giáp Ung thư tuyến cận giáp Ung thư vú 8392 8410 8414 8459 8472 8473 8468 8472 8395 8515 8384 8414 8426 8542 8557 8567 8572 G→A C→T C→T A→G C→T T→C C→T C→T C→T C→T A→G C→T T→C T→C G→A T→C G→A Trong nghiên cứu này, biến đổi gen MT-ATP8, kết phân tích PCR-RFLP cịn phát thấy 27/102 trường hợp bệnh nhân (chiếm 26,5%) có đoạn bp vùng khơng mã hóa ADN ty thể Mất đoạn bp làm trình tự lặp CCCCCTCTA vùng gen MT-CO2 MT-TK đa hình ADN ty thể nghiên cứu nhiều báo cáo có liên quan đến số dạng ung thư ung thư biểu mô tế bào gan, ung thư biểu mô tế bào thận, ung thư buồng trứng [22][24][13]… Jin cs (2012) phát thấy tần suất đoạn bp có khác biệt nhóm bệnh nhân ung thư biểu mơ tế bào gan nhóm đối chứng, đoạn bp có khả làm tăng nguy mắc ung thư với OR = 1,48; 95% CI: 1,03-2,14; p = 0,027 [23] Tương tự, theo nghiên cứu Ren cs (2015), đoạn bp có tần suất cao nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan (304/390 trường hợp) tần suất thấp nhóm đối chứng (86/431 trường hợp) Mất đoạn Thay đổi axít amin Khơng Khơng L17F N32D P36L Không Không P36L Không Không T7A L17F F21L Không Không S68P G69S Tài liệu [13] [12] [13] [13] [12] [13] [15] [14] [16] [16] [20] [6] [19] [20] [20] [20] [20] cho phổ biến quần thể Châu Á gây thay đổi nhiệt động học phân tử tARNLys có vai trị quan trọng phát sinh bệnh [24] Trong nghiên cứu Bai cs (2014), đoạn bp cho có mối liên quan với phát triển bệnh ung thư biểu mô tế bào thận tiến hành phân tích đa biến (OR = 1,599; 95% CI: 1,365-1,872; p < 0,001) Do đó, đoạn sử dụng thị tiên lượng độc lập bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào thận Bên cạnh đó, phân tích mối liên quan với đặc điểm bệnh học bệnh, kết cho thấy có mối liên quan độ tuổi, kích thước khối u đặc điểm mơ học với thời gian sống sót bệnh nhân Cụ thể, bệnh nhân có đoạn bp có thời gian sống sót thấp so với người khơng có đoạn (p < 0,001) Lý giải cho điều này, nhóm tác giả cho đoạn bp có khả làm thay đổi biểu gen vùng xi dịng ngược dịng, có số gen N.T.T Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 38-47 đóng vai trị quan trọng chuỗi hô hấp ty thể MT-ATP8, MT-ATP6, MT-CO3 (cytochrome oxidase III) MT-CYB (cytochrome b) Biểu bất thường gen làm thay đổi chức phosphoryl hóa oxy hóa mức độ stress oxi hóa tế bào [22] Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, theo hiểu biết chúng tơi, chưa có nghiên cứu tập trung phân tích đoạn bp vùng khơng mã hóa gen MT-CO2 MT-TK Do đó, nghiên cứu cung cấp liệu ban đầu tần suất biến đổi nhóm bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam Theo đó, đoạn bp phát thấy 26,5% bệnh nhân mắc ung thư vú (27/102 trường hợp) 27% nhóm đối chứng (7/26 trường hợp) Tuy nhiên khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê tần suất đoạn nhóm bệnh nhân so với đối chứng Mặc dù vậy, phân tích theo đặc điểm bệnh học cho thấy đoạn bp cao có ý nghĩa thống kê độ tuổi ≥ 50 (21/62 trường hợp, chiếm 33,9%) so với độ tuổi < 50 (6/32 trường hợp, chiếm 18,8%) Điều giải thích đoạn tích lũy theo thời gian mơ sau nguyên phân với tỉ lệ khác [25] Do đó, đoạn bp cho khơng có mối liên quan với nhóm bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam Kết luận Như vậy, phương pháp PCR - giải trình tự trực tiếp kết hợp với PCR-RFLP xác định biến đổi gen MT-ATP8 35 mẫu mô u bệnh nhân ung thư vú 26 mẫu máu người bình thường Trong đó, đột biến C8417T vị trí bảo thủ gen MT-ATP8 biến đổi gặp (tần suất 0,98%, 1/102 mẫu) lần xác định thấy nhóm bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam Bên cạnh đó, đoạn bp vùng khơng mã hóa ADN ty thể có tần suất 26,5% mẫu mô 27% mẫu máu cho khơng có mối liên quan với nhóm bệnh nhân 45 Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Đại học Quốc gia Hà Nội đề tài mã số QG.16.14 Tài liệu tham khảo [1] Petros JA, Baumann AK, Ruiz-Pesini E, Amin MB, Sun CQ, Hall J, Lim S, Issa MM, Flanders WD, Hosseini SH, Marshall FF, Wallace DC, mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer, Proc Natl Acad Sci U S A (2005), 102(3):719-24 [2] Wang X, The expanding role of mitochondria in apoptosis, Genes Dev (2001), 15(22):2922-33 [3] Jonckheere AI, Smeitink JA, Rodenburg RJ, Mitochondrial ATP synthase: architecture, function and pathology, J Inherit Metab Dis (2012), 35(2):211-25 [4] Grzybowska-Szatkowska L, Slaska B, Rzymowska J, Brzozowska A, Florianczyk B, Novel mitochondrial mutations in the ATP6 and ATP8 genes in patients with breast cancer, Mol Med Rep (2014), 10(4):1772-8 [5] Adzhubei IA, Schmidt S, Peshkin L, Ramensky VE, Gerasimova A, Bork P, Kondrashov AS, Sunyaev SR, A method and server for predicting damaging missense mutations, Nat Methods (2010), 7(4):248-9 [6] Thapa S, Lalrohlui F, Ghatak S, Zohmingthanga J, Lallawmzuali D, Pautu JL, Senthil Kumar N, Mitochondrial complex I and V gene polymorphisms associated with breast cancer in mizo-mongloid population, Breast Cancer (2016), 23(4):607-16 [7] Warburg O, On the origin of cancer cells, Science (1956), 123:309-14 [8] Dumas JF, Rousse D, Servais S, Mitochondria and cancer, Cellular Bioenergetics in Health and Diseases: New Perspectives in Mitochondrial Biology (2012), 115-47 [9] Mkaouar-Rebai E, Kammoun F, Chamkha I, Kammoun N, Hsairi I, Triki C, Fakhfakh F, A de novo mutation in the adenosine triphosphatase (ATPase) gene in a patient with mitochondrial disorder, J Child Neurol (2010), 25(6):770-5 [10] Jonckheere AI, Hogeveen M, Nijtmans LG et al., A novel mitochondrial ATP8 gene mutation in a patient with apical hypertrophic cardiomyopathy and neuropathy, J Med Genet (2008), 45:129-33 46 N.T.T Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 38-47 [11] Ware SM, El-Hassan N, Kahler SG et al., Infantile cardiomyopathy caused by a mutation in the overlapping region of mitochondrial ATPase and genes, J Med Genet (2009), 46:308-14 [12] Liu VW, Shi HH, Cheung AN, Chiu PM, Leung TW, Nagley P, Wong LC, Ngan HY, High incidence of somatic mitochondrial DNA mutations in human ovarian carcinomas, Cancer Res (2001), 61(16):5998-6001 [13] Zhuo G, Feng G, Leng J, et al., A 9-bp deletion homoplasmy in women with polycystic ovary syndrome revealed by mitochondrial genomemutation screen, Biochem Genet (2010), 48:157163 [14] Abu-Amero KK, Alzahrani AS, Zou M, Shi Y, Association of mitochondrial DNA transversion mutations with familial medullary thyroid carcinoma/multiple endocrine neoplasia type syndrome, Oncogene (2006), 25:677-84 [15] Bonora E, Porcelli AM, Gasparre G, et al., Defective oxidative phosphorylation in thyroid oncocytic carcinoma is associated with pathogenic mitochondrial DNA mutations affecting complexes I and III, Cancer Res (2006), 66:608796 [16] Costa-Guda J, Tokura T, Roth SI, Arnold A, Mitochondrial DNA mutations in oxyphilic and chief cell parathyroid adenomas, BMC Endocr Disord (2007); 7:8 [17] Chintha R, Kaipa PR, Sekhar N, Hasan Q, Mitochondria and tumors: A new perspective, Indian J Cancer (2013), 50(3) [18] Tan DJ, Bai RK, Wong LJ, Comprehensive scanning of somatic mitochondrial DNA mutations in breast cancer, Cancer Res (2002), 62(4):972-6 [19] Tipirisetti NR, Lakshmi RK, Govatati S, Govatati S, Vuree S, Singh L, Raghunadha Rao D, [20] [21] [22] [23] [24] [25] Bhanoori M, Vishnupriya S, Mitochondrial genome variations in advanced stage breast cancer: a case-control study, Mitochondrion (2013), 13(4):372-8 Ghaffarpour M, Mahdian R, Fereidooni F, Kamalidehghan B, Moazami N, Houshmand M, The mitochondrial ATPase6 gene is more susceptible to mutation than the ATPase8 gene in breast cancer patients, Cancer Cell Int (2014), 14(1):21 Perucca-Lostanlen D, Narbonne H, Hernandez JB, et al., Mitochondrial DNA variations in patients with maternally inherited diabetes and deafness syndrome, Biochem Biophys Res Commun (2000), 277(3):771-5 Bai Y, Guo Z, Xu J, Zhang J, Cui L, Zhang H, Zhang S, The 9-bp deletion at position 8272 in region V of mitochondrial DNA is associated with renal cell carcinoma outcome, Mitochondrial DNA A DNA Mapp Seq Anal (2014), 27(3):19735 Jin Y, Yu Q, Zhou D, Chen L, Huang X, Xu G, Huang J, Gao X, Gao Y, Shen L, The mitochondrial DNA 9-bp deletion polymorphism is a risk factor for hepatocellular carcinoma in the Chinese population, Genet Test Mol Biomarkers (2012), 16(5):330-4 Ren W, Li Y, Li R, Feng H, Wu S, Mao Y, Huang L, Mitochondrial intergenic COII/tRNA(Lys) 9bp deletion, a biomarker for hepatocellular carcinoma? Mitochondrial DNA A DNA Mapp Seq Anal (2015), 27(4):2520-2 Cortopassi GA, Shibata D, Soong NW, Arnheim N, A pattern of accumulation of a somatic deletion of mitochondrial DNA in aging human tissues, Proc Natl Acad Sci U S A (1992), 89(16):7370-4 N.T.T Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 38-47 47 Alterations of the MT-ATP8 Gene and 9-bp Deletion in Vietnamese Patients with Breast Cancer Nguyen Thi Tu Linh, Nguyen Thi Thao, Do Thi Dung, Trinh Hong Thai VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam Abstract: The MT-ATP8 gene encodes for A6L protein subunit belonging to the proton channel of the ATP synthase MT-ATP8 gene’s mutations can affect the structure and function of the ATP synthase, which may cause diseases In this study, alterations of MT-ATP8 gene were investigated in tumor tissues of patients with breast cancer and control blood samples using PCR combined with direct sequencing and PCR-RFLP methods, data were analyzed using bioinformatics tools and statistical methods Sequencing results revealed variants of MT-ATP8 gene on 35 breast tumor tissues and 26 blood samples of controls, of which two mutations C8414T and C8417T altered the amino acid sequence of the resulting protein The C8417T was further screened by PCR-RFLP and was found in 0,98% (1/102) of breast tumor samples This change lead to substitution of lecine to phenylalanine (L18F) in a highly conserved position of A6L and was predicted as probably damaging to the structure and function of the protein Additionally, a bp deletion was also observed in a noncoding region of mtDNA in 26,5% (27/102) of breast cancer patients and 27% (7/26) of controls Thus, these results showed that C8417T variant in the conserved position of MT-ATP8 gene was rare and first identified in a group of breast cancer patients in Vietnam Keywords: Breast cancer, mitochondrial DNA, MT-ATP8  ... 38-47 47 Alterations of the MT- ATP8 Gene and 9- bp Deletion in Vietnamese Patients with Breast Cancer Nguyen Thi Tu Linh, Nguyen Thi Thao, Do Thi Dung, Trinh Hong Thai VNU University of Science,... diseases In this study, alterations of MT- ATP8 gene were investigated in tumor tissues of patients with breast cancer and control blood samples using PCR combined with direct sequencing and PCR-RFLP... observed in a noncoding region of mtDNA in 26,5% (27/102) of breast cancer patients and 27% (7/26) of controls Thus, these results showed that C8417T variant in the conserved position of MT- ATP8 gene