VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 36, No (2020) 75-83 Original Article Jak-Stat Signaling Pathway Related Gene Expressions and Blood Biochemical indicators in Acute Promyelocytic Leukemia Bui Kieu Trang1, Nguyen Thi Xuan1,2,* Institute of Genome Research, Vietnam Academy of Science and Technology, A17 Building, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Graduate University of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology, A28 Building, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay , Hanoi, Vietnam Received 12 December 2019 Revised 25 February 2020; Accepted 20 March 2020 Abstract: Acute promyelocytic leukemia (APL) is a type of acute leukemia, which has the highest death rate among blood cancers and caused by a specific (15; 17) chromosomal translocation, resulting in a fusion gene PML/RARα Klotho gene plays a role in preventing aging, inflammation and cancer CTLA4, PD1 and LAG3 are immunosuppressive receptors located on surface of T cells and considered as a negative regulation of immune response These genes regulate immune cell activity through several signalling moleculars such as STATs and NF-κB In this study, to additionally determine the difference between APL and other leukemia, we performed experiments to measure mRNA expression of above genes by using realtime-PCR Results showed that mRNA levels of KL, CTLA4, PD1 and LAG3 genes were lower, while expressions of STAT1, STAT3, STAT5 and STAT6 genes were significantly higher in APL patients than healthy controls In addition, IκB-α gene expression was unaltered on APL cells The results of this study would partially contribute to an understanding of the differences in JAK-STAT signaling associated gene expressions between APL and other leukemia groups This is important to apply for effective chemotherapy for each type of leukemia Keywords: Acute promyelocytic leukemia, klotho, CTLA4, IκB-α, LAG3, PD1, STAT.* * Corresponding author E-mail address: xuannt@igr.ac.vn https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4197 75 VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 36, No (2020) 75-83 Biểu số gen liên quan đến tín hiệu Jak-Stat số sinh hóa máu bệnh bạch cầu tiền tủy bào Bùi Kiều Trang1, Nguyễn Thị Xuân1,2,* Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Nhà A17, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Nhà A28, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 12 tháng 12 năm 2019 Chỉnh sửa ngày 25 tháng 02 năm 2020; Chấp nhận đăng ngày 20 tháng năm 2020 Tóm tắt: Bạch cầu cấp dạng tiền tủy bào (APL) loại bệnh bạch cầu cấp tính gây tử vong cao số bệnh ung thư máu gây hoạt động chuyển vị nhiễm sắc thể 15 17 tạo tổ hợp gen PML/RAR-α Gen klotho (KL) có vai trị ngăn chặn lão hóa, phản ứng viêm ung thư CTLA4, PD1 LAG3 thụ thể kiểm soát miễn dịch nằm bề mặt tế bào T có vai trị điều hịa ngược phản ứng miễn dịch Các gen điều hòa hoạt động tế bào miễn dịch thơng qua số tín hiệu phân tử STAT NF-κB Trong nghiên cứu này, để củng cố thêm khác biệt bệnh APL với bệnh bạch cầu khác, tiến hành đo mức độ biểu mRNA gen kỹ thuật realtime-PCR Kết nhận cho thấy mức độ biểu mRNA gen KL, CTLA4, PD1 LAG3 thấp hơn, nhóm gen STAT1, STAT3, STAT5 STAT6 có mức độ biểu cao rõ rệt bệnh nhân APL so với người khỏe mạnh Ngoài ra, biểu gen IκB-α không thay đổi tế bào APL Kết nghiên cứu đóng góp phần hiểu biết khác biệt biểu gen liên quan đến tín hiệu JAK-STAT bệnh APL với nhóm bệnh bạch cầu khác Điều có ý nghĩa quan trọng ứng dụng liệu pháp hóa trị hiệu cho loại bệnh bạch cầu Từ khóa: Bạch cầu tiền tủy bào, klotho, CTLA4, IκB-α, LAG3, PD1, STAT phân nhóm bệnh bạch cầu cấp tính dịng tủy (AML) gây chuyển vị nhiễm sắc thể 15 17 tạo hợp gen PML RAR-α ký hiệu t (15; 17) (q22; q21) [1, 2] Các tiền tủy bào cần thời gian ngắn bình thường để tăng sinh số lượng tủy xương bệnh nhân [2] Bệnh chiếm khoảng 15 - 20% số bệnh AML Đặt vấn đề* Bệnh bạch cầu cấp tính dạng tiền tủy bào (acute promyelocytic leukemia-APL) * Tác giả liên hệ Địa email: xuannt@igr.ac.vn https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4197 76 B.K Trang, N.T Xuan / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 36, No (2020) 75-83 gần 100% tử vong sớm rối loạn đơng máu khơng có biện pháp điều trị đặc hiệu [2] Có nhiều nghiên cứu đa hình biểu gen có chức điều hòa hoạt động hệ miễn dịch bệnh nhân ung thư Một gen nghiên cứu rộng rãi gen klotho [3] Gen có vai trị quan trọng ngăn chặn lão hóa, phản ứng viêm ung thư Chuột đột biến gen KL dẫn đến chức gen bi bất hoạt, gây tượng lão hóa sớm từ chuột sinh chết sau khoảng 2-3 tháng tích tụ nhiều canxi khớp xương, mạch máu bệnh tim mạch tự miễn dịch [3] Quá trình lão hóa liên quan đến gián đoạn q trình tạo máu gây thiếu máu, hình thành khối u ác tính phát triển thành bệnh bạch cầu [4, 5] Gen KL không biểu tế bào ung thư bạch cầu tủy mạn tính [6] Một số nghiên cứu khác mối tương quan biểu gen KL với hoạt động sinh lý kênh ion kênh Ca2+ tế bào miễn dịch, từ ứng dụng tăng cường miễn dịch chống lại bệnh thơng qua việc cung cấp thêm ngun tố khống phù hợp kết hợp với điều trị gen đích [4, 5] Ngồi gen KL, số gen có vai trị kiểm soát hệ miễn dịch gồm CTLA4, PD1 LAG3 tập trung nghiên cứu ứng dụng điều trị ung thư liệu pháp gen đích sử dụng loại kháng thể thuốc ức chế biểu CTLA4, PD1 LAG3 thụ thể kiểm soát miễn dịch nằm bề mặt tế bào T có vai trị điều hịa ngược phản ứng miễn dịch [7-9] CTLA4 điều hòa hoạt động tế bào T thơng qua ức chế tín hiệu phân tử CD28-CD80/CD86 [7] PD1 điều hòa hoạt động tế bào T chủ yếu vùng ngoại vi [8] LAG3 tìm thấy tế bào T điều hòa nhiều loại ung thư [9] Ở người, LAG3 biểu đồng thời với PD1 gây trạng thái kiệt sức cho tế bào T Protein LAG3 liên kết với phân tử MHC-II làm giảm khả miễn dịch chống ung thư cách ức chế tiết IFN-γ tế bào T [10, 11] LAG3 biểu cao bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu lympho mạn không đáp ứng điều trị [12] 77 Song song với nghiên cứu biểu gen chức năng, khảo sát gen tín hiệu tham gia kiểm soát chức sinh lý tế bào trọng Có nhiều nghiên cứu nhóm gen STAT điều hòa phản ứng miễn dịch thể người bệnh tiết cytokine, tăng sinh, biệt hóa, di cư chết apoptosis tế bào Sự biểu bất thường tín hiệu STAT dẫn tới phát triển bệnh bạch cầu [1, 13, 14] Kích hoạt protein STAT đặc biệt STAT3 STAT5 liên quan đến chuyển đổi hình thái chức tế bào ung thư [15] Ngoài gen STAT, biểu gen IB-α chứng minh đóng vai trị quan trọng loại ung thư máu khác [16] Gen có chức ức chế yếu tố phiên mã NFB giáng hóa IB-α gây hoạt hóa NF-B tế bào [17] Các nghiên cứu biểu gen bệnh nhân APL người Việt Nam chưa trọng Trong nghiên cứu này, tiến hành tách chiết RNA tổng số từ mẫu máu xác định mức độ biểu biện số gen KL, CTLA4, PD1, LAG3, STAT1, STAT3, STAT5, STAT6 IκB-α bệnh nhân APL phục vụ cho cơng tác chẩn đốn điều trị bệnh hiệu Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Tại Bệnh Viện Huyết học Truyền máu Trung ương Bệnh viện Quân Y 103, Hà Nội, Việt Nam, mẫu máu ngoại vi thu thập từ 13 bệnh nhân chưa điều trị chẩn đoán mắc bệnh APL Các bệnh nhân thăm khám lâm sàng, làm xét nghiệm cận lâm sàng giải phẫu bệnh để chẩn đoán xác định loại bệnh Nhóm đối chứng gồm 10 người khỏe mạnh, khơng có cá nhân dùng thuốc bị bệnh cấp tính hay mãn tĩnh khác Tất bệnh nhân tình nguyện viên ký văn đồng ý tham gia nghiên cứu Các quy trình thí nghiệm việc chăm sóc cá nhân thực theo luật pháp Việt Nam phê duyệt Hội Đồng Y Đức 78 B.K Trang, N.T Xuan / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 36, No (2020) 75-83 Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam 2.2 Phương pháp nghiên cứu Tách chiết RNA tổng số phân tích mức độ biểu gen kỹ thuật Realtime-PCR Tổng lượng RNA tách chiết Trizol theo hướng dẫn hãng Invitrogen cDNA tổng hợp từ RNA tổng số theo quy trình sau: lấy 1µg RNA tổng số pha lỗng vào nước cất DEPC thành 12,5µl Sau đó, thêm µl oligo-dT primer (500µg/ml, Invitrogen) ủ nhiệt độ 70oC phút Cho thêm vào ống đựng mẫu 2µl 10x reaction buffer (Biolabs), µl dNTP mix (dATP,dCTP, dGTP, dTTP, 10 mM loại), 0,5µl chất ức chế Rnase (Roche), 0,1 µl enzyme phiên mã ngược M-MuLV (Biolabs) 2,9 µl nước cất DEPC Trộn mẫu sau ủ 42oC tiếng Để dừng phản ứng tổng hợp cDNA, mẫu ủ 94oC phút dự trữ -80oC Mẫu cDNA phân tích mức độ biểu gen CTL-4, PD-1, LAG-3, KL, STAT-1, STAT-3, STAT-5, STAT-6, IκB-α GAPDH Các primer sử dụng bao gồm: CTLA-4: 5’GTCCGGGTGACAGTGCTTCG-3’ (forward) 5’-CCAGGTAGTATGGCGGTGGG-3’ (reverse); PD-1: 5’TGCAGCTTCTCCAACACATC-3’ (forward) 5’-CACGCTCATGTGGAAGTCAC-3’ (reverse); LAG-3: 5’CCTCACTGTTCTGGGTCTGG-3’ (forward) 5’-GGATATGGCAGGTGTAGGTC-3’ (reverse); klotho: 5’ CTAAGCCAGGACAAGATG (forward), 5’ TCAGGTCGGTAAACTGAG (reverse); STAT-1: 5’CCCTTCTGGCTTTGGATTGAA-3’ (forward) 5’-CTTCCCGGGAGCTCTCACTGA-3’ (reverse); STAT-3: 5’-GGA GGA GTT GCA GCA AAA AG-3’ (forward) 5’-TGT GTT TGT GCC CAG AAT GT-3’ (reverse); STAT5: 5’-CAGACCAAGTTTGCAGCCAC-3’ (forward) 5’CACAGCACTTTGTCAGGCAC-3’ (reverse); STAT-6: 5’GCCCACTCACTCCAGAGGACCT-3’ (forward) 5’GGTGTTGGGGAAAGTCGACAT-3’ (reverse); IκB-α: 5’GCAAAATCCTGACCTGGTGT-3’ (forward) 5’-GCTCGTCCTCTGTGAACTCC-3’ (reverse) GAPDH: 5’GGAGCGAGATCCCTCCAAA-3’ (forward) and 5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT-3’ (reverse) Phản ứng quantitative PCR chứa 20 µl tổng thể tích gồm µl cDNA, 2.4 µl MgCl2 (3 µM), µl 02 loại primer (0.5 µM loại), µl cDNA Master SybrGreen I mix (Roche Molecular Biochemicals) 12.6 µl nước DEPC Đoạn cDNA khuyếch đại 95ºC 10 giây, 62ºC 10 giây, and 72ºC 16 giây, số vòng nhắc lại 40 vòng Phương pháp RT-PCR định lượng cho SHP-1 SHP-2 thực hệ thống LightCycler System (Roche Diagnostics) Tỷ lệ biểu tương quan gen nghiên cứu gen GAPDH đối chứng tính mẫu theo phương pháp ngưỡng chu trình 2.3 Phương pháp xử lý số liệu Kết thí nghiệm trung bình cộng giá trị xử lý phương pháp ANOVA Các nghiên cứu lặp lại lần Sự khác biệt mẫu đối chứng mẫu bệnh nhân có ý nghĩa thống kê số p value < 0.05 Kết thảo luận Chỉ số xét nghiệm sinh hóa máu bệnh nhân APL Kết xét nghiệm sinh hóa máu tỷ lệ BN APL có số glucose, axid uric, protein toàn phần, globulin, ferritin, AST, ALT lactate dehydrogenase (LDH) cao người khỏe mạnh tương ứng 15.4%,15.4%, 46.1%, 46.1%, 38.5%, 30.8%, 38.5% 23.1% (Bảng 1) Nồng độ số sinh học tăng cao mức độ ảnh hưởng cao bệnh đến tổn thương quan thận, gan số quan khác Nồng độ LDH tăng cao dẫn đến tăng nồng độ lactat máu tổn thương B.K Trang, N.T Xuan / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 36, No (2020) 75-83 mơ Ngồi ra, số hóa sinh khác bilirubin định lượng sắt huyết có số BN có số cao bình thường Bảng Tỷ lệ BN APL có số xét nghiệm sinh hóa máu cao bình thường STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Chỉ số bệnh Ure Glucose Creatinin Axid uric Bilirubin toàn phần Protein toàn phần Albumin Globulin số A/G Ferritin Calci ion hóa AST (GOT) ALT (GPT) LDH Canxi toàn phần Định lượng sắt huyết Na+ K+ Cl- Bệnh nhân (n) 0/13 2/13 0/13 2/13 1/13 6/13 0/13 6/13 0/13 5/13 0/13 4/13 5/13 3/13 0/13 1/13 0/13 0/13 0/13 Bệnh nhân (%) 0.0 15.4 0.0 15.4 7.7 46.1 0.0 46.1 0.0 38.5 0.0 30.8 38.5 23.1 0.0 7.7 0.0 0.0 0.0 79 Mức độ biểu gen KL, CTLA4, PD1 LAG3 Nhóm gen kiểm sốt miễn dịch CTLA4, PD1 LAG3 biểu cao tế bào T, đặc biệt tế bào T điều hịa có vai trị tăng cường hệ miễn dịch đối kháng, biểu cao gen thuận lợi cho tăng sinh tế bào ung thư [7-9] Tuy nhiên, bệnh nhân APL, chúng tơi khơng tìm thấy khác biệt biểu chúng chí biểu gen CTLA4 LAG3 cịn giảm so với người khỏe (Hình 1) Mức độ biểu mRNA cao CTLA4 chứng minh có liên quan đến thời gian điều trị giai đoạn khởi phát dài bệnh bạch cầu lympho mạn tính tế bào B [18] có tiên lượng so với người có biểu thấp [19, 20] Mức độ biểu gen PD1 bệnh nhân bạch cầu lympho mạn tính chứng minh cao so với người khỏe mạnh [21] Theo nghiên cứu Long L cộng sự, gen LAG3 có mức độ biểu cao bệnh nhân mắc bệnh máu [22] Tuy nhiên, biểu gen LAG3 cao bệnh nhân ung thư có hồi phục tốt so với bệnh nhân khác [23] Kết mức độ biểu gen CTLA4, PD1 LAG3 bệnh nhân APL nghiên cứu phản ánh biểu hệ miễn dịch bệnh nhân APL liên quan đến hoạt động miễn dịch đối kháng Hình Biểu mRNA gen KL, CTLA4, PD1 LAG3 bệnh nhân APL (cột màu đen) mẫu đối chứng (cột màu trắng) 80 B.K Trang, N.T Xuan / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 36, No (2020) 75-83 Ngược lại với 03 gen kiểm soát miễn dịch trên, gen KL chứng minh tham gia ngăn chặn q trình lão hóa, phản ứng viêm tăng sinh tế bào ung thư Biểu gen giảm xuống nguyên nhân gây nhiều loại bệnh ung thư [4, 5] Tương tự, nghiên cứu chúng tơi gen KL có mức độ biểu giảm xuống bệnh nhân APL (Hình 1) Một nghiên cứu gần rằng, biểu gen KL giảm ảnh hưởng đến tăng nồng độ 1,25Dihydroxyvitamin D3 (D3) máu, dẫn đến tượng khớp xương bị vơi hóa sớm, bệnh lão hóa tim mạch hệ miễn dịch bất hoạt [3] Tế bào ung thư APL tiếp xúc với D3 có biểu hoạt hóa tăng lên dẫn đến tăng sinh nhiều so với tế bào không xử lý [24] Chính vậy, biểu giảm gen KL liên quan phần đến tăng sinh tế bào APL Trong nghiên cứu này, bệnh nhân APL có biểu gen STAT tăng rõ rệt so với người khỏe mạnh kết có ý nghĩa thống kê, biểu gen IκB-α không thay đổi tế bào APL Tổng số 04 gen STAT1, STAT3, STAT5 STAT6 tăng bệnh nhân APL phản ánh rằng, gen STAT đặc biệt quan trọng điều hịa q trình gây bệnh APL Nghiên cứu nghiên cứu tăng biểu tổng thể 04 gen, chứng tỏ việc sử dụng thuốc ức chế tyrosine phosphatase điều trị bệnh APL hoàn toàn phù hợp Các nghiên cứu khác bệnh nhân ung thư máu phân tích biểu nhóm gen STAT, nhiên chưa có nghiên cứu biểu tăng lên 04 gen bệnh ung thư Biểu STAT1 tăng cao bệnh bạch cầu bao gồm bệnh APL biết đến nhiều nghiên cứu [1, 25] Sự kích hoạt tín hiệu STAT3 STAT5 bệnh u lympho bệnh bạch cầu [26, 27] Mức độ biểu gen STAT6 mức tìm thấy số bệnh ung thư máu [28] tương quan thuận với tăng khả xâm lấn di tế bào ung thư [29] Biểu gen STAT6 tăng cao bệnh nhân APL nghiên cứu phản ánh tình trạng nặng bệnh Ngồi gen tín hiệu STAT, gen IκB-α khảo sát nghiên cứu này, nhiên biểu gen không thay đổi tế bào ung thư APL Khác với bệnh APL, biểu gen IκB-α giảm rõ rệt số bệnh bạch cầu khác [16, 30] Điều rằng, mức độ biểu gen IκB-α nhóm bệnh nhân APL khác biệt so với nhóm bệnh bạch cầu cịn lại Xác định khác biệt biểu gen tín hiệu có ý nghĩa quan trọng việc điều chỉnh loại thuốc sử dụng cho liệu pháp hóa trị phù hợp với loại bệnh Hình Sản phẩm realtime-PCR gen STAT1, STAT3, STAT5, STAT6 IκB-α mẫu bệnh nhân APL (cột màu đen) mẫu đối chứng (cột màu trắng) * p