VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 31-36 Original Article Inhibitory Effect of the Leaf of Psidium guajava Grown in Vietnam on α-Glucosidase and Protein Tyrosine Phosphatase 1B in vitro Le Thi Thu Huong, Dang Kim Thu, Tran Trong Nghia, Bui Thanh Tung* VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Received 04 April 2019 Revised 20 April 2019; Accepted 21 June 2019 Abstract: Type diabetes is a fairly common chronic disease α-glucosidase and protein tyrosine phosphatase, as enzymes, play an important role in type diabetes This study evaluates the inhibitory effect of the two enzymes in vitro of ethanol extract and fractions of Vietnam Psidium guajava’s leaves The leaves were collected, dried and extracted with 96% ethanol and successively fractionated with n-hexane, ethyl acetate and butanol solvents The results show that the EtOH extract, n-nexan, EtOAc and BuOH fractions had high α-glucosidase inhibitory effect with IC50 values of 2.20; 2.53; 2.24 and 2.16 µg/mL, respectively In addition, EtOAc and BuOH fractions also show strong inhibitory PTP1B effect with IC50 at 120.22 g/mL and 97.72 g/mL, respectively The study results show that Psidium guajava leaves are a potential source of material to inhibit αglucosidase and PTP1B in the treatment of diabetes Keywords: Psidium guajava, α-glucosidase, protein tyrosine phosphatase 1B, diabetes, extraction Corresponding author Email address: tungasia82@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4161 31 VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 31-36 Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidase enzym PTP1B in vitro ổi (Psidium guajava) trồng Việt Nam Lê Thị Thu Hường, Đặng Kim Thu, Trần Trọng Nghĩa, Bùi Thanh Tùng* Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 04 tháng năm 2019 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2019; Chấp nhận đăng ngày 21 tháng năm 2019 Tóm tắt: Đái tháo đường type bệnh mạn tính phổ biến Hai enzym αglucosidase protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) có vai trị quan trọng bệnh đái tháo đường type Nghiên cứu thực nhằm đánh giá tác dụng ức chế hai enzym in vitro cao chiết ethanol phân đoạn dịch chiết ổi trồng Việt Nam Lá thu hái, sấy khô chiết etanol 96% tiến hành phân đoạn với dung môi nhexane, ethyl acetate butanol Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết toàn phần EtOH, phân đoạn n-nexan, phân đoạn EtOAc phân đoạn BuOH có tác dụng ức chế α-glucosidase cao với giá trị IC50 2,20; 2,53; 2,24 2,16 µg/mL Ngồi ra, phân đoạn EtOAc BuOH thể tác dụng ức chế enzym PTP1B với IC50 120,22 g/mL 97,72 g/mL Kết nghiên cứu cho thấy ổi nguồn nguyên liệu có tác dụng ức chế α-glucosidase enzym PTP1B có khả hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường Từ khóa: Ổi; enzym α-glucosidase; enzym protein tyrosin phosphatase 1B; đái tháo đường; cao chiết Đặt vấn đề mắt, thần kinh Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới, năm 2015 tồn giới có 415 triệu người (trong độ tuổi 20-79) bị bệnh ĐTĐ, tương đương 11 người có người bị ĐTĐ, đến năm 2040 số 642 triệu, tương đương 10 người có người bị ĐTĐ Bên cạnh đó, với việc tăng sử dụng thực phẩm khơng thích hợp, không hoạt động thể lực trẻ em, bệnh ĐTĐ type có xu hướng tăng trẻ Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh rối loạn chuyển hóa khơng đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết khiếm khuyết tiết insulin, tác động insulin, hai Tăng glucose mạn tính thời gian dài gây nên rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương nhiều quan khác nhau, đặc biệt tim mạch máu, thận, Tác giả liên hệ Địa email: tungasia82@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4161 32 L.T.T Huong et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 31-36 em, trở thành vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận, cắt cụt chi Nhưng điều đáng khả quan, có tới 70% trường hợp ĐTĐ type dự phòng làm chậm xuất bệnh tuân thủ lối sống lành mạnh, dinh dưỡng hợp lý tăng cường luyện tập thể lực [1] Enzym α-glucosidase thuộc nhóm hydrolase, có chức enzyme xúc tác cho việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid chất để giải phóng α-D-glucose Bằng cách ức chế hoạt động enzyme α-glucosidase, làm giảm thủy phân carbohydrat làm chậm thẩm thấu glucose vào máu [2] Trong tế bào, tyrosine phosphorylation q trình cộng thêm nhóm phosphate (PO4) vào phân tử protein Q trình diễn tự động thơng qua thụ thể insulin màng tế bào xúc tác enzym phosphotidylinositol-3 kinase, sau hệ chuyển đến glucose nhờ enzyme kinase B Quá trình điều hòa ngược enzym tysorin phosphate B Như vây, enzyme quan trọng việc phát sinh bệnh tiểu đường kháng insulin [3] Cây ổi (Psidium guajava Linn) thuộc khí hậu nhiệt đới, trồng rộng rãi Việt Nam để lấy Tất phận cây, bao gồm quả, lá, thân rễ dùng để điều trị nhiều bệnh đau dày, rối loạn đường hô hấp, tiêu hóa, có tác dụng chống co thắt, chống viêm, giảm ho, chống tiêu chảy, kiểm soát huyết áp, béo phì, tiểu đường ung thư [4] Thành phần hoạt tính sinh học ổi bao gồm tinh dầu, flavonoids, carotenoids, polyphenols pentacyclic triterpenoids, esters, aldehydes [5] Trong nghiên cứu này, đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase enzym PTP1B dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết ổi Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu Lá ổi thu hái Gia Thượng, Long Biên, Hà Nội; Ethanol 96%; Ethyl acetat 33 (EtOAc); n-Hexan; Butanol (BuOH); cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản); Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức); Pipet, bình định mức, cối xứ, giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc Hóa chất: enzyme Yeast α-glucosidase; pnitrophenyl-α-D-glucopyranosidase (pDNG); 4Nitrophenol (Sigma) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Lá ổi tươi rửa sạch, sấy khô 75-80°C, nghiền nhỏ Lá khô (1 kg) chiết với Ethanol 96% (3 L x lần) phương pháp ngấm kiệt Dịch chiết lọc gộp lại, cô dịch chiết máy quay chân khơng thu cao Ethanol tồn phần (350g) Lấy 30g cao toàn phần phân tán trong350 mL nước cất chiết phân đoạn với n-hexan, EtOAc, BuOH (mỗi dung môi lần, lần 350mL) 2.3 Đánh giá tác dụng ức chế enzyme αglucosidase Hoạt tính ức chế enzyme α glucosidase thực theo phương pháp mô tả trước [6] Cụ thể sau: Chất thử hòa tan DMSO pha loãng đệm phosphate 10 mM (pH 6.8) 50 l đưa vào giếng khay 96 giếng để có nồng độ 256 g/ml, 64 g/ml; 16 g/ml; g/ml; 20 µl α- glucosidase (0,5U/ml) 130 µl đệm phosphate 100 mM (pH 6.8) thêm vào giếng, trộn ủ 37oC 15 phút Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) đưa tiếp vào giếng thí nghiệm ủ tiếp 37oC 60 phút Đĩa thí nghiệm có mẫu thử, đệm phosphate pNPG sử dụng làm đối chứng trắng (blank) Giếng thí nghiệm có DMSO 10%, đệm phosphate, enzym pNPG sử dụng làm đối chứng Thí nghiệm lặp lại lần để đảm bảo xác Dừng thí nghiệm cách thêm vào 80 µl Na2CO3 0,2M đo OD bước sóng 405nm máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad) 34 L.T.T Huong et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 31-36 Khả ức chế enzyme α- glucosidase mẫu thử xác định theo công thức sau: % ức chế = 100% - (Amẫu thử/ A đối chứng *100) Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank Amẫu thử = ODmẫu thử - OD blank mauthu 2.4 Đánh giá tác dụng ức chế enzyme PTP1B Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym PTP1B tiến hành theo phương pháp mơ tả trước đây, có thay đổi cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm [7] Cơ chất p-nitrophenyl phosphate (pNPP) sử dụng thí nghiệm Dung dịch đệm gồm có mM dithiothreitol (DTT), 0.1 M NaCl, mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 50 mM citrate (pH 6.0) Thí nghiệm tiến hành cách thêm 10 L dung dịch mẫu thử vào 20 L dung dịch enzym PTP1B (1 g/ml), trộn với 40 L pNPP mM 130 L dung dịch đệm đĩa 96 giếng Ủ 37oC vịng 30 phút, sau thêm 10 L NaOH 1M để dừng phản ứng Đo lượng p-nitrophenol sinh cách đo độ hấp thụ quang bước sóng 405 nm Tất thí nghiệm lặp lại lần Axit ursolic sử dụng làm chứng dương Phần trăm ức chế hoạt độ enzym PTP1B (% I) tính theo cơng thức: Ac – At %I= x 100 Ac − Ao Trong đó: I% phần trăm hoạt tính PTP1B bị ức chế Ac : độ hấp thu mẫu chứng (khơng chứa 10 µL dung dịch thử) At : độ hấp thu mẫu thử Ao : độ hấp thu mẫu trắng 2.5 Xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu xử lý thống kê sử dụng phần mềm SigmaPlot 10 (Systat Software Inc, Mỹ) Số liệu biểu diễn dạng X ± SD Kết nghiên cứu 3.1 Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase Bảng tóm tắt giá trị IC50 cao chiết toàn phần, phân đoạn dịch chiết Acarbose Tác dụng ức chế α-glucosidase phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết tổng EtOH, phân đoạn nnexan, phân đoạn EtOAc phân đoạn BuOH có tác dụng ức chế α-glucosidase cao với giá trị IC50 2,20; 2,53; 2,24 2,16 µg/mL; so với chứng dương Acarbose có IC50 139,52 µg/mL Bảng Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase cao chiết toàn phần, phân đoạn dịch chiết ổi Acarbose STT Mẫu EtOH n-Hexan EtOAc BuOH Chất đối chứng Acarbose % ức chế nồng độ (µg/ml) 128 32 98,73 97,56 96,69 45,13 90,84 90,11 81,58 42,09 96,08 95,19 94,40 44,21 99,86 98,05 97,42 46,17 Giá trị IC50 (g/ml) 2,20 2,53 2,24 2,16 139,52 Bảng Tác dụng ức chế enzym PTP1B cao chiết toàn phần, phân đoạn dịch chiết ổi axit ursolic Axit ursolic IC50(µg/mL) EtOH n-hexan EtOAc n-BuOH 134,89 204,17 120,22 97,72 19,75 L.T.T Huong et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 31-36 3.2 Tác dụng ức chế enzyme PTP1B Tác dụng ức chế enzyme PTP1B dịch chiết toàn phần, phân đoạn dịch chiết axit ursolic thể bảng hình Tác dụng ức chế PTP1B phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ Phân đoạn dịch chiết EtOAc BuOH cho thấy có khả ức chế cao với IC50 120,23 97,72 µg/mL so với chứng dương axit ursolic 19,75 µg/mL Phân đoạn n-hexan có tác dụng ức chế enzym PTP 1B thấp với IC50 204,17 µg/mL A 120 % Ức chế 100 80 60 EtOH n-Hexane EtOAc BuOH 40 20 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 Log (Nồng độ) (μg/mL) B 120 % Ức chế 100 80 60 40 Axit ursolic 20 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 Log (Nồng độ) (μg/mL) Hình Đồ thị biểu diễn khả ức chế tác dụng enzym PTP1B phân đoạn dịch chiết từ ổi (A) axit ursolic (B) Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết tính dựa vào đồ thị Bàn luận Enzyme α-glusidase enzyme nằm màng đường ruột, tham gia vàb bước cuối q trình tiêu hóa, Enzyme xúc tác cho 35 trình phân hủy đường disaccaride sucrose hay maltose thành nomosaccharide glucose Do đó, chất ức chế α-glusidase có vai tị quan trọng điều trị bệnh tiểu đường Acarbose, voglibose, miglitol chất ức chế αglusidase sử dụng l Đái tháo đường type có liên quan tới đề kháng insulin dự đoán suy giảm tín hiệu từ thụ thể insulin Các nghiên cứu cho thấy PTP1B enzyme điều hòa ngược tín hiệu insulin quan trọng Để kết thúc tín hiệu, insulin cần khử phospho phân tử IRβ phân tử sau Enzyme PTP1B tăng hoạt động biểu làm tăng trình khử phospho hóa Irβ làm giảm tín hiệu insulin, kháng insulin Vì vậy, lý thuyết, PTP1B giảm hoạt động làm tăng độ nhạy insulin Các hợp chất ức chế PTP1B có tiềm điều trị bệnh đái tháo đường type béo phì Các hợp chất ổi gồm có: morin flavonoid, morin-3-Olyxosyde, morin-3-O-arabinoside, quercetin, quercetin-3-O-arabinoside, glycosides, alkaloids, saponins tritecpenoid [5] Nhiều nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết ổi giới công bố Nghiên cứu Haseena Banu cộng cho thấy dùng theo đường uống cao chiết ổi với liều 300 mg/kg thể trọng có tác dụng hạ đường huyết chuột bị gây tiểu đường streptozotocin [8] Kết cụ thể nhóm nghiên cứu cho thấy cao chiết ổi có tác dụng hạ glucose máu, nồng độ HbA1c làm tăng đáng kể lượng insulin huyết tương, cải thiện hoạt tính enzym chuyển hóa carbohydrate hexokinase, pyruvate kinase Một nghiên cứu khác cho thấy cao chiết nước ổi (250 mg/kg) cho thấy tác dụng hạ đường huyết đáng kể mơ hình chuột bị tiểu đường hợp chất alloxan gây [9] Nếu tiêm màng bụng dịch chiết ổi (10 mg/kg) có khả ức chế tác dụng protein tyrosine phosphatase 1B chuột bị tiểu đường bị loại gen Lepr(db)/Lepr(db) [10] Mặt khác, dịch chiết nước ổi cho thấy khả ức chế mạnh hoạt tính enzym alphaglucosidase, enzyme quan trọng trình hấp thu glucose, niêm mạc ruột non 36 L.T.T Huong et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 31-36 chuột bị tiểu đường [11] Nghiên cứu long-term chuột cho uống cao chiết nước ethanol ổi làm tăng nồng độ insulin huyết tương vận chuyển glucose vào quan dự trữ gan, làm tăng hoạt tính enzym hexokinase, phosphofructokinase and glucose-6phosphate dehydrogenase chuột bị tiểu đường [12] Kết nghiên cứu cho thấy chế tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường ổi thông qua tác dụng ức chế enzym glucosidase enzym Protein Tyrosin Phosphatase 1B Kết luận Nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase PTP1B phân đoạn dịch chiết ổi Các cao chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết ổi có tác dụng ức chế α-glucosidase cao Ngoài ra, hai phân đoạn EtOAc BuOH thể tác dụng ức chế enzym protein tyrosine phosphatase 1B mạnh với IC50 120,22 g/mL 97,72 g/mL Kết có ý nghĩa việc định hướng nghiên cứu sâu thành phần hóa học có dịch chiết ổi đặc biệt phân đoạn EtOAc, BuOH nhằm phát hợp chất có tác dụng điều trị đái tháo đường type Lời cảm ơn Đề tài tài trợ Khoa Y Dược, Đại Học Quốc Gia Hà Nội, mã số đề tài CS.18.07 Tài liệu tham khảo [1] A Chaudhury, C Duvoor, R Dendi, V Sena, S Kraleti, A Chada, et al Clinical review of antidiabetic drugs: Implications for type diabetes mellitus management, Frontiers in endocrinology (2017) [2] F.A Van de Laar, P.L Lucassen, R.P Akkermans, E H Van de Lisdonk, G.E Rutten,C Van, Alpha - glucosidase inhibitors for type diabetes mellitus The Cochrane Library (2005) [3] J Montalibet, B.P Kennedy Therapeutic strategies for targeting PTP1B in diabetes Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies 2(2) (2005) 129 [4] S.M Barbalho, Farinazzi-Machado, R De Alvares Goulart, A.C.S Brunnati, A Otoboni, B Ottoboni Psidium guajava (Guava): A plant of multipurpose medicinal applications, Med Aromat Plants 1(104) (2012) 2167 [5] R.M.P Gutiérrez, S Mitchell, Solis R V Psidium guajava: a review of its traditional uses, phytochemistry and pharmacology Journal of ethnopharmacology 117(1) (2008) [6] B T Tùng, Đ.K Thu, P.T Hải, N.T Hải Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase phân đoạn dịch chiết Lựu (Punica granatum Linn), Tạp chí Y Dược cổ truyền Việt Nam 5(18) (2018) 59 [7] P.H Nguyen, J.L Yang, M.N Uddin, S.L Park, S.I Lim, D.W Jung, et al Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) inhibitors from Morinda citrifolia (Noni) and their insulin mimetic activity, Journal of natural products 76(11) (2013) 2080 [8] H.B.H Khan, D Rajendran, M.R Bai, Sorimuthu S Protective effect of Psidium guajava leaf extract on altered carbohydrate metabolism in streptozotocin-induced diabetic rats, Journal of dietary supplements 10(4) (2013) 335 [9] H Mukhtar, S Ansari, M Ali, T Naved, Z Bhat Effect of water extract of Psidium guajava leaves on alloxan-induced diabetic rats Die PharmazieAn International Journal of Pharmaceutical Sciences 59(9) (2004) 734 [10] W K Oh, C H Lee, M S Lee, E Y Bae, C B Sohn, H Oh, et al Antidiabetic effects of extracts from Psidium guajava, Journal of ethnopharmacology 96(3) (2005) 411 [11] B Wang, H Liu, J Hong, H Li, C Huang, Effect of Psidium guajava leaf extract on alphaglucosidase activity in small intestine of diabetic mouse Sichuan da xue xue bao Yi xue ban, Journal of Sichuan University Medical science edition 38(2) (2007) 298 [12] S C Shen, F C Cheng, N J Wu Effect of guava (Psidium guajava Linn.) leaf soluble solids on glucose metabolism in type diabetic rats, Phytotherapy Research 22(11) (2008) 1458 ... Park, S.I Lim, D.W Jung, et al Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) inhibitors from Morinda citrifolia (Noni) and their insulin mimetic activity, Journal of natural products 76(11) (2013) 2080... Antidiabetic effects of extracts from Psidium guajava, Journal of ethnopharmacology 96(3) (2005) 411 [11] B Wang, H Liu, J Hong, H Li, C Huang, Effect of Psidium guajava leaf extract on alphaglucosidase... α- glucosidase enzym PTP1B có khả hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường Từ khóa: Ổi; enzym α- glucosidase; enzym protein tyrosin phosphatase 1B; đái tháo đường; cao chiết Đặt vấn đề mắt, thần kinh Theo