Extraction of triterpenoids from ganoderma lucidum by ultrasound assisted extraction method and testing bioactivities of extract

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -o0o - NGUYỄN THỊ LINH TRÍCH LY HỢP CHẤT TRITERPENOID TỪ NẤM LINH CHI ĐỎ VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY CĨ HỖ TRỢ SIÊU ÂM VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO TRÍCH (Extraction of triterpenoids from Ganoderma lucidum by ultrasound-assisted extraction method and testing bioactivities of extract) Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC Mã số: 60520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 09 năm 2020 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Minh Nam PGS TS Nguyễn Hữu Hiếu Cán chấm nhận xét 1: TS Huỳnh Ngọc Oanh Cán chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM, ngày 16 tháng 09 năm 2020 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: GS.TS Đống Thị Anh Đào - Chủ tịch TS Huỳnh Ngọc Oanh - Ủy viên phản biện TS Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long - Ủy viên phản biện TS Nguyễn Quốc Thắng - Ủy viên TS Nguyễn Văn Dũng - Thư ký Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Thị Linh MSHV: 1770451 Ngày, tháng, năm sinh: 27/10/1994 Nơi sinh: Hải Dương Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 60520301 I TÊN ĐỀ TÀI Tên tiếng Việt: Trích ly hợp chất triterpenoid từ nấm linh chi đỏ Việt Nam phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích Tên tiếng Anh: Extraction of triterpenoids from Ganoderma lucidum by ultrasoundassisted extraction method and testing bioactivities of extract II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 2.1 Tổng quan: Nấm Linh chi, triterpenoid, hoạt tính nấm Linh chi, phương pháp trích ly hỗ trợ siêu âm, phương pháp định lượng triterpenoid, phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố, kháng ung thư, kháng khuẩn cao trích, quy hoạch thực nghiệm 2.2 Thực nghiệm  Trích ly flavonoid từ nấm Linh chi phương pháp hỗ trợ siêu âm  Khảo sát ảnh hưởng điều kiện đến hàm lượng triterpenoid bao gồm: Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, công suất siêu âm, nhiệt độ thời gian  Khảo sát ảnh hưởng đồng thời bốn điều kiện tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, công suất siêu âm, nhiệt độ thời gian đến hàm lượng triterpenoid quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp CCD  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá, kháng ung thư kháng khuẩn cao trích III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/2020 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 09/2020 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS HOÀNG MINH NAM PGS TS NGUYỄN HỮU HIẾU TP HCM, ngày 12 tháng 10 năm 2020 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Trưởng PTN TĐ ĐHQG TP.HCM CNHH & DK TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tác giả xin trân trọng cảm ơn đến người thân gia đình quan tâm, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả suốt thời gian thực luận văn Tác giả xin chân thành cảm ơn thầy TS Hoàng Minh Nam thầy PGS TS Nguyễn Hữu Hiếu tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả suốt trình học tập thực luận văn Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến học viên, nghiên cứu viên bạn sinh viên Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG TP.HCM Cơng nghệ Hóa học & Dầu khí (CEPP Lab), Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM hỗ trợ tác giả suốt trình học tập nghiên cứu Tác giả Nguyễn Thị Linh iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong luận văn này, hợp chất triterpenoid trích ly từ nấm Linh chi đỏ phương pháp sử dụng dung mơi etanol có hỗ trợ siêu âm Hàm lượng triterpenoid cao trích xác định phương pháp quang phổ hấp thu phân tử (UV–Vis) Ảnh hưởng điều kiện trích ly tỷ lệ dung môi: nguyên liệu, công suất siêu âm, nhiệt độ thời gian đến hàm lượng triterpenoid khảo sát phương pháp luân phiên biến để chọn khoảng tác động Sau đó, tiến hành khảo sát đồng thời bốn điều kiện tỷ lệ dung môi: nguyên liệu, công suất siêu âm, nhiệt độ thời gian phương pháp phối hợp có tâm (CCD) Số liệu xử lý phần mềm Design Expert 11.0 để tìm điều kiện trích ly cho hàm lượng triterpenoid cao Đồng thời phương pháp trích ly nước nóng, dung mơi etanol khơng có hỗ trợ siêu âm Soxhlet thực để đối chứng Cao trích điều kiện tối ưu khảo sát hoạt tính sinh học thơng qua khả kháng oxy hóa sử dụng phương pháp bắt gốc tự 1,1–diphenyl–1–picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'–azino–bis(3–ethylbenzthiazoline–6–sulphonic axit (ABTS) gốc tự hydroxyl với chất đối chứng dương axit ascorbic; khả gây độc tế bào ung thư sử dụng phương pháp 3–[4,5–dimetylthiazol–2-yl] –2,5–diphenyltetrazol brom (MTT) dòng tế bào ung thư ung thư biểu mô, ung thư gan, ung thư phổi ung thư vú iv ABSTRACT In this thesis, active triterpenoid is extracted from Ganoderma lucidum by using ultrasonic-assisted extraction Crude extracted triterpenoid content was determined by molecular absorption spectroscopy (UV-Vis) The effects of each extraction conditions such as solvent: material ratio, ultrasonic power, temperature, and time on triterpenoid content were investigated by single - factor method to choose the impact range Then, simultaneously surveyed these four conditions such as solvent : material ratio, ultrasonic power, temperature and time by Central Composite design (CCD) Data were processed by Design Expert 11.0 software to find the extraction conditions for the highest triterpenoid content At the same time, hot water, ethanol and Soxhlet extractions were performed for control samples Crude extract at optimize conditions was investigated for biological activity through oxidation resistance using the 1.1-diphenyl – – picrylhydrazyl (DPPH), 2,2' – azino – bis free radical capture method (3 – ethylbenzthiazoline – – sulphonic acid (ABTS) and hydroxyl free radical with ascorbic acid as positive control; carcinogenicity using 3– [4,5 – dimethylthiazol – 2-yl] ] –2,5 – diphenyltetrazole bromine (MTT) method for carcinoma, liver, lung, and breast cancer cell lines v LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu thực cá nhân tác giả thực hướng dẫn hai thầy TS Hồng Minh Nam PGS TS Nguyễn Hữu Hiếu, Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG TP HCM Cơng nghệ Hóa học Dầu khí (CEPP Lab), Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP HCM Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, chưa công bố cơng trình khác trước Mọi giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Tác giả Nguyễn Thị Linh vi MỤC LỤC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan nấm Linh chi Phân loại khoa học khu vực phân bố Mô tả thực vật Phân bố, sinh thái Thành phần hoá học 1.1.4.1 Polysaccharide 1.1.4.2 Adenosine 1.1.4.3 Pectit, protein 1.1.4.4 Nhóm phenolic 1.1.4.5 Saponin Hoạt tính sinh học triterpenoid Kháng oxy hoá Kháng ung thư Kháng khuẩn 11 1.2.3.1 Sơ lược vi khuẩn 11 1.2.3.2 Cơ chế kháng khuẩn triterpenoid 13 Một số hoạt tính khác 14 Các phương pháp trích ly hoạt chất nấm Linh chi 14 Phương pháp trích ly truyền thống 15 Phương pháp trích ly đại 15 1.3.2.1 Hỗ trợ vi sóng 15 1.3.2.2 Enzym 16 1.3.2.3 Lưu chất siêu tới hạn 17 1.3.2.4 Phương pháp siêu âm 18 Phân tích hàm lượng hợp chất cao trích quang phổ hấp thu nguyên từ 20 Tình hình nghiên cứu 21 Ngoài nước 21 Trong nước 22 Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung phương pháp nghiên cứu 22 vii Tính cấp thiết 22 Mục tiêu nghiên cứu 23 Nội dung 23 Phương pháp nghiên cứu 23 1.6.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu 23 1.6.4.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng triterpenoid 23 1.6.4.3 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố đến hàm lượng triterpenoid 23 1.6.4.4 Định lượng phương pháp phân tích định lượng triterpenoid 25 1.6.4.5 Phân tích thành phần cao chiết phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier 26 1.6.4.6 Phân tích bề mặt vật liệu kính điện tử quét 27 1.6.4.7 Phân tích nhiệt trọng lượng 27 1.6.4.8 Thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích 28 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 34 Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị địa điểm thực 34 Nguyên liệu 34 Hoá chất 34 Thiết bị 35 Địa điểm thực luận văn 36 Thí nghiệm 36 Xác định độ ẩm nguyên liệu 36 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố trích ly 36 2.2.2.1 Quy trình trích ly triterpenoid 36 2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng triterpenoid 37 2.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố đến hàm lượng triterpenoid 40 2.2.2.4 Định lượng triterpenoid 42 Thí nghiệm so sánh đối chứng 42 Phân tích đặc tính hố lý cao trích 43 Thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích 43 2.2.5.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố 43 2.2.5.2 Thử nghiệm khả gây độc tế bào 44 viii 2.2.5.3 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 45 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46 Độ ẩm nguyên liệu 46 Ảnh hưởng điều kiện trích ly đến hàm luợng triterpenoid 46 Ảnh hưởng điều kiện 46 3.2.1.1 Tỷ lệ dung môi: nguyên liệu 46 3.2.1.2 Ảnh hưởng công suất siêu âm 47 3.2.1.3 Nhiệt độ 47 3.2.1.4 Thời gian 48 Ảnh hưởng đồng thời yếu tố 50 Kiểm chứng mô hình 59 Phân tích thành phần cao chiết 61 Cấu trúc bề mặt nguyên liệu trước sau trích ly 63 Độ bền nhiệt cao chiết 64 Hoạt tính sinh học cao trích 65 Hoạt tính kháng oxy hố 65 3.3.1.1 Khả bắt gốc tự DPPH 65 3.3.1.2 Khả bắt gốc tự ABTS 66 3.3.1.3 Khả bắt gốc tự hydroxyl 68 Hoạt tính kháng ung thư 69 Hoạt tính kháng khuẩn 70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ix Hình PL 2.2.2: Kết phân tích ANOVA Phụ lục 3: Số liệu đường chuẩn triterpenoid Bảng PL 3.1 Kết độ hấp thu axit ursolic Nồng độ (mg/mL) Độ hấp thu 0,02 0,6249 0,03 0,85129 0,04 1,20471 0,05 1,45787 0,06 1,87958 Phụ lục 4: Số liệu phân tích thành phần cao trích PL4.1 Phổ FTIR Hình PL 4.1 Phổ FTIR axit ursolic Hình PL 4.2 Phổ FTIR cao chiết Hình PL 4.2 Phổ FTIR nấm thơ PL4.2 Ảnh SEM nấm Linh chi trước sau trích ly Hình PL 4.4 Ảnh SEM nấm Linh chi trước trích ly Hình PL 4.5 Ảnh SEM nấm Linh chi sau trích ly PL2.5 Phổ TGA cao chiết Phụ lục 3: Số liệu thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích PL3.1: Số liệu thử nghiệm khả bắt gốc tự DPPH PL3.1.1 Số liệu khả bắt gốc tự DPPH axit ascorbic Độ hấp thu Nồng độ (µg/mL) A1 A2 A3 50 0,097 0,099 0,097 93,95 25 0,797 0,811 0,793 50,30 12,5 1,171 1,191 1,164 27,02 6,25 1,363 1,387 1,355 15,01 3,13 1,469 1,496 1,461 8,38 1,56 1,535 1,562 1,526 4,31 Phần trăm bắt gốc tự DPPH PL3.1.1 Số liệu khả bắt gốc tự DPPH cao chiết Độ hấp thu Nồng độ (µg/mL) A1 A2 A3 600 0,158 0,161 0,156 90,11 500 0,413 0,415 0,404 74,22 400 0,668 0,679 0,664 58,34 200 1,129 1,149 1,123 29,58 100 1,480 1,506 1,471 7,74 Phần trăm bắt gốc tự DPPH PL3.1: Số liệu thử nghiệm khả bắt gốc tự ABTS PL3.1.1 Số liệu khả bắt gốc tự ABTS axit ascorbic Độ hấp thu Nồng độ (µg/mL) A1 A2 A3 0,110 0,113 0,101 78,37954 3,5 0,140 0,144 0,128 72,43656 0,171 0,176 0,157 66,36034 2,5 0,193 0,198 0,177 62,07309 Phần trăm bắt gốc tự ABTS 0,230 0,236 0,211 54,80944 1,5 0,245 0,252 0,225 51,84285 0,283 0,291 0,259 44,43225 0,5 0,305 0,313 0,279 40,18615 PL3.1.1 Số liệu khả bắt gốc tự ABTS cao chiết Độ hấp thu Nồng độ (µg/mL) A1 A2 A3 1000 0,011 0,011 0,010 97,35 500 0,130 0,135 0,118 69,97 300 0,173 0,178 0,156 60,31 250 0,195 0,202 0,176 55,12 200 0,215 0,222 0,193 50,72 150 0,231 0,239 0,208 46,87 100 0,241 0,248 0,217 44,73 50 0,254 0,262 0,228 41,73 25 0,269 0,278 0,243 38,06 Phần trăm bắt gốc tự ABTS PL3.1: Số liệu thử nghiệm khả bắt gốc tự hydroxyl PL3.1.1 Số liệu khả bắt gốc tự hydroxyl axit ascorbic Độ hấp thu Nồng độ (µg/mL) A1 A2 A3 Phần trăm bắt gốc tự hydroxyl 700 0,542 0,523 0,501 67,24 400 0,440 0,425 0,407 54,60 300 0,407 0,393 0,376 50,55 200 0,355 0,343 0,329 44,07 100 0,326 0,314 0,301 40,34 50 0,300 0,290 0,279 37,31 PL3.1.1 Số liệu khả bắt gốc tự hydroxyl axit ascorbic Độ hấp thu Nồng độ (µg/mL) A1 A2 A3 Phần trăm bắt gốc tự hydroxyl 2816 0,451 0,435 0,417 55,99 2464 0,421 0,406 0,390 52,25 1760 0,367 0,354 0,339 45,55 1408 0,326 0,315 0,303 40,51 1056 0,283 0,273 0,262 35,15 704 0,245 0,237 0,226 30,47 PL3.1: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư PL3.1: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn Hình PL 3.1 Ảnh đường kính vịng kháng khuẩn cao chiết vi khuẩn E coli Hình PL 3.1 Ảnh đường kính vịng kháng khuẩn cao chiết vi khuẩn S aureus Ghi chú: (-) đối chứng âm DMSO 10 % (+) đối chứng dương ampicillin 0,01 % (M) Mẫu cao chiết PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: NGUYỄN THỊ LINH Ngày, tháng, năm sinh: 27/10/1994 Nơi sinh: Hải Dương Địa liên lạc: 1/6, Đường số 6, Hiệp Bình Chánh, Quận Thủ Đức, Tp.HCM Số điện thoại: 0908 522 745 Email: nguyenlinhot@gmail.com QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO  9/2013-06/2016: Kỹ thuật hóa học, Khoa Cơng nghệ Hóa học, Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM  9/2017-nay: Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC  2016-2018: Packaging Development Engineer, Technical Dept., Kao Vietnam  2018-04/2020: Material Engineer, QA Dept., Tetra Pak Binh Duong  4/2020-nay: Packaging Supervisor, P&T Dept., Perfetti Van Melle Vietnam ... tính sinh học cao trích Tên tiếng Anh: Extraction of triterpenoids from Ganoderma lucidum by ultrasoundassisted extraction method and testing bioactivities of extract II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 2.1... triterpenoid is extracted from Ganoderma lucidum by using ultrasonic-assisted extraction Crude extracted triterpenoid content was determined by molecular absorption spectroscopy (UV-Vis) The effects of each... material ratio, ultrasonic power, temperature and time by Central Composite design (CCD) Data were processed by Design Expert 11.0 software to find the extraction conditions for the highest triterpenoid