Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố bền nhiệt shiga type 2 của Escherichia coli

Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố bền nhiệt shiga type 2 của Escherichia coli Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố bền nhiệt shiga type 2 của Escherichia coli Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố bền nhiệt shiga type 2 của Escherichia coli luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TÔ LAN ANH TÔ LAN ANH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ BỀN NHIỆT SHIGA TYPE CỦA Escherichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC CNSH2017-A Hà Nội – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TÔ LAN ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ BỀN NHIỆT SHIGA TYPE CỦA Escherichia coli Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS Nguyễn Văn Hoàng TS Lê Quang Hòa Hà Nội – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Học viên: Tô Lan Anh Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn 1: TS Nguyễn Văn Hồng Đơn vị: Viện Cơng nghệ mới/ Viện Khoa học Công nghệ quân Người hướng dẫn 2: TS Lê Quang Hịa Đơn vị: Viện Cơng nghệ Sinh học & Công nghệ thực phẩm/ĐHBKHN Tên luận văn:“Nghiên cứu chế tạo que thử phát nhanh độc tố bền nhiệt Shiga type Escherichia coli” Nội dung cam đoan: Tơi xin cam đoan, suốt q trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, hướng dẫn bảo tận tình giáo viên hướng dẫn, tơi tiến hành nghiên cứu luận văn cách trung thực, toàn nội dung báo cáo luận văn trực tiếp thực Tất nghiên cứu không chép từ báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách tác giả Học viên Tô Lan Anh LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hồng, Viện Cơng nghệ mới/Viện Khoa học Công nghệ quân TS Lê Quang Hịa, Viện Cơng nghệ sinh học Cơng nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình, hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn Trong thời gian thực luận văn Phịng Cơng nghệ sinh học-Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học Công nghệ quân sự, nhận quan tâm giúp đỡ, bảo tận tình chun mơn, kĩ thuật động viên chân thành anh, chị cán phịng Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Nhân dịp tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm Viện cơng nghệ sinh học công nghệ thực phẩm, bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ tơi q trình thí nghiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thủ trưởng Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học Công nghệ quân Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm-Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi giúp hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Luận văn nhận hỗ trợ kinh phí từ Đề tài Nghiên cứu KH-CN Viện KH-CN quân “Nghiên cứu chế tạo kit phát nhanh số độc tố bền nhiệt vi khuẩn Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae Escherichia coli gây ngộ độc thực phẩm nước uống” Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Tô Lan Anh MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 11 1.1 Vi khuẩn E coli sinh độc tố Shiga (STEC) 11 1.1.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn STEC 11 1.1.2 Tình hình ngộ độc vi khuẩn STEC 12 1.2 Độc tố Shiga (Stx) .13 1.2.1 Phân loại độc tố Stx 13 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc độc tố Stx 15 1.2.3 Hoạt tính sinh học chế gây độc độc tố Stx 16 1.3 Các phương pháp phát độc tố stx2 19 1.3.1 Phương pháp sinh học phân tử 19 1.3.2 Phương pháp miễn dịch 19 1.3.3 Que thử phát nhanh theo nguyên lý sắc ký miễn dịch 20 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.2 Nguyên vật liệu hóa chất, thiết bị 32 2.3 Phương pháp nghiên cứu 32 2.3.1 Lựa chọn kháng thể phù hợp cho trình chế tạo que thử 32 2.3.2 Tạo dung dịch hạt vàng nano 33 2.3.3 Cộng hợp hạt vàng với kháng thể phát 34 2.3.5 Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose 35 2.3.6 Xây dựng quy trình chế tạo que thử phát nhanh độc tố Stx2 36 2.3.7 Xác định ngưỡng phát thời gian phát que thử 36 2.3.8 Xác định độ đặc hiệu que thử 36 2.3.9 Xác định độ nhạy que thử 37 2.3.10 Đánh giá khả hoạt động que thử pH nhiệt độ …….37 2.3.11 Đánh giá khả phát độc tố que thử thực phẩm …………… 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Lựa chọn kháng thể phù hợp cho trình chế tạo que thử .38 3.2 Tạo dung dịch hạt vàng nano 40 3.3 Cộng hợp hạt vàng với KT phát cố định màng cộng hợp .42 3.4 Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose 44 3.5 Quy trình chế tạo que thử sắc ký miễn dịch phát độc tố Stx2 48 3.6 Xác định ngưỡng phát hiện, thời gian phát que thử 52 3.7 Xác định độ đặc hiệu que thử với độc tố khác .53 3.8 Xác định độ nhạy que thử .55 3.9 Đánh giá khả hoạt động que thử điều kiện pH nhiệt độ khác 55 3.10 Đánh giá khả phát độc tố que thử số thực phẩm 57 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết lựa chọn kháng thể phát kháng thể bắt giữ dựa phản ứng ELISA với độc tố Stx2 cố định giếng 38 Bảng 3.2 Kích thước hạt vàng nano tương ứng với bước sóng hấp thụ cực đại dung dịch (Sigma) .41 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ độ ẩm đến cố định kháng thể bắt giữ 45 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tốc độ phun nồng độ kháng thể phun đến trình cố định kháng thể bắt giữ lên màng cellulose 46 Bảng 3.5 Kết đánh giá ngưỡng phát que thử phát Stx2 mẫu Stx2 tinh khiết 53 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ đặc hiệu que thử 54 Bảng 3.7 Đánh giá khả phát Stx2 tinh khiết nhiễm chủ động que thử số thực phẩm nguy .57 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn STEC 11 Hình 1.2 Phân loại độc tố Stx 15 Hình 1.3 Cấu trúc Shiga toxin 16 Hình 1.4 Cấu trúc thụ thể Gb3 17 Hình 1.5 Cấu trúc độc tố Stx liên kết với thụ thể Gb3 mơ hình ball-and-stick 17 Hình 1.7 Cấu tạo que thử theo nguyên lý sắc ký miễn dịch 20 Hình 1.8 Phân loại que thử theo nguyên lý sắc ký miễn dịch 23 Hình 1.10 Quá trình tạo hạt nano vàng từ khử dung dịch HauCl4 NaCtr 26 Hình 1.12 Các liên kết hạt vàng nano với kháng thể 27 Hình 1.13 Kháng thể cộng hợp trực tiếp với hạt vàng nano nhờ EDC/NHS 28 Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm đánh giá phản ứng kháng nguyên kháng thể…… 33 Hình 2.2 Cấu trúc lưỡng cực nitrocellulose kháng thể 36 Hình 2.3 Thiết bị Linomat .36 Hình 3.1 Phản ứng ELISA……………………………………………………… 38 Hình 3.2 Kết đánh giá kháng thể lựa chọn để chế tạo que thử Stx2 39 Hình 3.3 Kết đặc tính hóa dịch huyền phù nano vàng tổng hợp theo phương pháp sinh trưởng hạt 40 Hình 3.4 Biểu đồ phân tích kích thước hạt vàng tổng hợp theo phương pháp tăng trưởng hạt 41 Hình 3.5 Khả giải phóng hạt vàng khỏi màng cộng hợp sử dụng saccarose đệm pha kháng thể cộng hợp với nồng độ khác .42 Hình 3.6 Cường độ màu que thử sử dụng saccarose đệm pha kháng thể cộng hợp với nồng độ khác 43 Hình 3.7 Kết thử nghiệm khả phát độc tố Stx2 que thử 44 Hình 3.8 Tối ưu liều lượng in kháng thể vạch kiểm chứng 47 Hình 3.9 Tối ưu liều lượng in kháng thể vạch thử nghiệm 48 Hình 3.10 Que thử phát nhanh độc tố Stx2 50 Hình 3.12 Quy trình chế tạo que thử phát nhanh độc tố Stx2 51 Hình 3.12 Đánh giá ngưỡng phát que thử phát Stx2 tính khiết 52 Hình 3.13 Hình ảnh đánh giá độ đặc hiệu que thử Stx2 nước 53 Hình 3.14 Kết thử nghiệm phản ứng chéo que thử Stx2 với độc tố khác 54 Hình 3.15 Hình ảnh đánh giá độ đặc hiệu que thử với Stx2 tinh khiết .55 Hình 3.16 Đánh giá khả phát độc tố que thử pH khác 56 Hình 3.17 Đánh giá khả phát độc tố que thử nhiệt độ .56 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumin Centers for Disease Control and CDC Prevention CFU colony-forming unit CT Cholera toxin ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay CFU Colony-forming unit HC Hemorrhagic colitis HUS Hemolytic uremic syndrome HRP KN KT LD50 LOD NaCtr PBS PCR SDS Horseradish peroxidase SE Staphylococcal enterotoxin SEA Staphylococcal enterotoxin A SEB Staphylococcal enterotoxin B SEM Scanning electron microscope Shiga toxin-producing Escherichia coli Shiga toxin type 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine Tetraoctylammonium bromide STEC Stx2 TMB TOAB Lethal dose 50 Limit of detection Natri citrate Phosphatee-buffered saline Polymerase chain reaction Sodium dodecyl sulfate Albumin huyết bị Trung tâm Kiểm sốt Phịng ngừa dịch bệnh Đơn vị hình thành khuẩn lạc Độc tố Cholera ELISA Đơn vị hình thành khuẩn lạc Xuất huyết đường ruột Hội chứng tán huyết tăng urê máu HRP Kháng nguyên Kháng thể Liều gây chết 50% Giới hạn phát Natri citrate PBS Phản ứng khuếch đại gene SDS Ngoại độc tố vi khuẩn Staphylococcus aureus Ngoại độc tố loại A vi khuẩn Staphylococcus aureus Ngoại độc tố loại B vi khuẩn Staphylococcus aureus Kính hiển vi điện tử quét Vi khuẩn E coli tổng hợp độc tố Shiga Độc tố Shiga loại TMB TOAB MỞ ĐẦU  Lý chọn đề tài Các vấn đề vệ sinh an tồn thực phẩm ln thách thức lớn tất quốc gia toàn giới, đặc biệt nước phát triển Việt Nam Tình trạng ngộ độc thực phẩm ngày có xu hướng gia tăng phức tạp hơn, với nhiều nguyên nhân, vi sinh vật nguyên nhân chủ yếu, gây 66% vụ ngộ độc thực phẩm toàn giới Các lồi vi khuẩn gây bệnh truyền qua thực phẩm bao gồm Salmonella spp., Campylobacter spp., Listeria monocytogenes., Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens số chủng E coli sinh độc tố Shiga (Shiga toxin–producing Escherichia coli hay STEC) Các vi khuẩn lây nhiễm vào thực phẩm, tiết độc tố phát triển tới số lượng đủ lớn thực phẩm xâm nhập vào đường tiêu hóa người theo đường ăn uống Phần lớn độc tố vi sinh vật bền nhiệt, không bị bất hoạt trình chế biến thực phẩm Chính điều đặt thách thức lớn việc phát hiện, kiểm soát tác nhân gây bệnh thực phẩm đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm STEC bốn nhóm E coli gây bệnh truyền qua thực phẩm người, gây nhiễm trùng nguy hiểm với triệu chứng tiêu chảy nặng, xuất huyết đường ruột hội chứng tán huyết tăng urê máu (HUS) E coli O157:H7 kiểu huyết phổ biến vụ dịch giới Một số loại thực phẩm điển hình liên quan đến vụ ngộ độc STEC gồm có thịt bị, thịt lợn, giá đỗ, sữa chưa tiệt trùng, rau sống… Ngoài đường ăn uống, vụ ngộ độc STEC xảy lây nhiễm từ người sang người tiếp xúc trực tiếp với động vật môi trường nuôi động vật nhiễm khuẩn Khác với nhóm vi khuẩn C.botulinum, S aureus, B cereus, Salmonella phát triển thực phẩm đến số lượng đủ lớn sản sinh độc tố, STEC lại thuộc nhóm vi khuẩn tiết độc tố sau xâm nhập cư trú bề mặt đường tiêu hóa người theo đường ăn uống Độc tố Shiga (Stx) STEC tiết độc tố tự nhiên nguy hiểm biết đến Đây loại độc tố bền nhiệt, gồm loại chính: Stx1 Stx2 Khi tiến hành thí 3.6 Xác định ngưỡng phát hiện, thời gian phát que thử Ngưỡng phát que thử định nghĩa giới hạn thấp độc tố mà que thử có khả phát Các mẫu độc tố Stx2 tinh khiết với nồng độ từ đến 20 ng/mL pha nước để xác định ngưỡng phát thời gian phát que thử Mỗi nồng độ lặp lại 30 lần Kết phân tích cho thấy, sau phút xuất rõ tín hiệu màu vạch C sau gần 10 phút xuất rõ tín hiệu màu vạch T Đồng thời, tín hiệu màu có xu hướng giảm tương ứng với giảm nồng độ độc tố (Hình 3.12) Vạch C Vạch T 20 ng/mL 10 ng/mL ng/mL ng/mL 1,5 ng/mL ng/mL ng/mL Hình 3.12 Đánh giá ngưỡng phát que thử phát Stx2 tính khiết Nồng độ thấp mà que thử có khả phát Stx2 tinh khiết với độ lặp lại cao (> 95%) ng/mL (Bảng 3.5) Ở nồng độ 1,5 ng/mL, có 16/30 (53 %) que cho kết dương tính Do vậy, kết luận sơ ngưỡng phát que thử với Stx2 tinh khiết nước ng/ml Khi so sánh với ngưỡng phát phương pháp miễn dịch khác phân tích Stx2 thực phẩm, que thử phát triển nghiên cứu chúng tơi có giới hạn phát trung gian [55] Một số nghiên cứu gần chế tạo que thử phát nhanh độc tố có ngưỡng phát 0,5 µg/mL (SEA) [67], 0,1 ng/mL (Stx2) [12], ng/mL (SEB) [59]…Đối với độc tố Stx2, liều lượng gây chết 50% chuột (LD50) xác định 290 ng/kg [11], đó, ngưỡng phát que thử đảm bảo thấp ngưỡng gây bệnh độc tố Với ngưỡng phát ng/mL, que thử có ý nghĩa việc đánh giá mức độ an toàn thực phẩm, giúp phát nguồn thực phẩm lây nhiễm Stx2 nồng độ thấp 52 Bảng 3.5 Kết đánh giá ngưỡng phát que thử phát Stx2 mẫu Stx2 tinh khiết Nồng độ Số que Số que Tỷ lệ dương tính (ng/ml) thử dương tính (%) 20 30 30 100 10 30 30 100 30 30 100 30 29 96,67 1,5 30 16 53 30 27 30 0 3.7 Xác định độ đặc hiệu que thử với độc tố khác Trong nghiên cứu này, đánh giá độ đặc hiệu thử que nước tiến hành phản ứng chéo với độc tố vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm khác (độc tố CT vi khuẩn Vibrio cholera, độc tố SEA, SEB vi khuẩn Staphylococcus aureus) Độ đặc hiệu que thử thể khả phát đặc hiệu độc tố Stx2 mà khơng xảy tượng dương tính giả mẫu khác 30 que thử phát nhanh độc tố Stx2 sử dụng để đánh giá độ đặc hiệu nước Kết cho thấy, có 30/30 que cho kết âm tính (hiện lên vạch) (Hình 3.13) Hình 3.13 Hình ảnh đánh giá độ đặc hiệu que thử Stx2 nước Đánh giá phản ứng chéo que thử với số độc tố vi khuẩn khác SEA, SEB, CT nồng độ 50 ng/mL, sau 30 lần lặp lại thí nghiệm (Hình 3.14), kết cho thấy que thử phát Stx2 khơng xuất tín hiệu màu vạch T độc tố SEA, SEB CT, vạch C cho tín hiệu màu rõ nét que 53 thử Do vậy, kết luận sơ độ đặc hiệu que thử 100 % Kết đánh giá độ đặc hiệu que thử thể Bảng 3.6 Hình 3.14 Kết thử nghiệm phản ứng chéo que thử Stx2 với độc tố SEA, SEB, CT Chú thích: Màu tím: que thử SEA Màu da cam: que thử SEB Màu xanh cây: que thử CT Màu xanh da trời: que thử Stx2 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ đặc hiệu que thử Nội dung Số lượng Số que thử với nước 30 Số que thử với độc tố CT 30 Số que thử với SEA 30 Số que thử với SEB 30 Số que âm tính thật (1 vạch) 120 Số que dương tính giả (2 vạch) Độ đặc hiệu 120/120 = 100% 54 3.8 Xác định độ nhạy que thử Sau xác định ngưỡng phát que thử nước nồng độ độc tố ng/mL, tiếp tục sử dụng nồng độ để xác định độ nhạy que thử Độ nhạy que thử tỷ lệ trường hợp thực có độc tố có kết xét nghiệm dương tính tồn trường hợp có độc tố Độ nhạy đánh giá khả phát độc tố que thử mẫu có độc tố 30 que thử tiến hành thử nghiệm với mẫu độc tố Stx2 ng/mL Kết cho thấy, có 29/30 que cho kết dương tính với nồng độ độc tố ng/ml (que thử Stx2 số 29 khơng xuất vạch thử nghiệm) (Hình 3.15) Như vậy, độ nhạy que thử 96,67 % với thời gian phát ≤ 10 phút Hình 3.15 Hình ảnh đánh giá độ đặc hiệu que thử với Stx2 tinh khiết 3.9 Đánh giá khả hoạt động que thử điều kiện pH nhiệt độ khác Nhiệt độ pH môi trường yếu tố ngoại cảnh, ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng kháng nguyên kháng thể ổn định cộng hợp kháng thể-nano vàng Nhiệt độ cáo thấp làm giảm hoạt tính sinh học kháng thể, ảnh hưởng đến thấm hút màng que thử pH môi trường liên quan đến ổn định liên kết hạt vàng nano kháng thể màng cộng hợp, giải phóng kháng thể khỏi màng hiên màu que Trong nghiên cứu này, tiến hành thử nghiệm que thử khoảng pH trải dài từ 4,0 đến 9,0 Kết phân tích (Hình 3.16) cho thấy khoảng pH từ 6,0 đến 8,0, que thử cho phép phát Stx2 nồng độ ng/mL Tuy nhiên, pH 5,0 9,0, ngưỡng phát 55 Stx2 que thử bị tăng lên đến ng/mL Tại pH 4, que thử không xuất màu vạch T C Nguyên nhân hạt vàng bị kết tụ, không dịch chuyển đến vị trí vạch C T màng nitrocellulose Do vậy, khoảng pH phù hợp để que thử hoạt động khoảng pH 6-8 Đây khoảng pH nằm khoảng pH tối ưu cho sinh trưởng phát triển STEC [3], [26] Mặt khác, thực phẩm có nguy nhiễm khuẩn cao có pH nằm khoảng 6-8 như: sữa, trứng, đậu nành, thịt bò, thịt lợn Khi thử nghiệm que thử nhiệt độ biến đổi từ đến 45 ºC (Hình 3.17), que thử có khả hoạt động tốt với ngưỡng phát độc tố ng/mL toàn dải nhiệt độ khảo sát Các kết cho thấy que thử tạo nghiên cứu thích hợp với phân tích trường, vốn có thay đổi lớn điều kiện môi trường thử nghiệm 2 5 (ng/mL) Vạch C Vạch T Hình 3.16 Đánh giá khả phát độc tố que thử pH khác Vạch C Vạch T - + 5ºC - + 15ºC - + 25ºC - + 35ºC - + 45ºC Hình 3.17 Đánh giá khả phát độc tố que thử nhiệt độ khác 56 3.10 Đánh giá khả phát độc tố que thử số thực phẩm Các loại thực phẩm thường liên quan đến vụ dịch STEC bao gồm loại rau, quả, sữa, thịt bò [12], [51] Trong E coli O157:H7 bị bất hoạt nhiệt độ 64,5 ºC, lượng độc tố Stx2 vi khuẩn tiết vào thực phẩm có khả gây bệnh [5] Trong nghiên cứu này, 10 loại thực phẩm nguy qua xử lý nhiệt lựa chọn nhiễm chủ động độc tố để đánh giá khả phát Stx2 dịch chiết thực phẩm que thử Đối với mẫu thử thực phẩm, nồng độ hạt nhỏ mẫu cao lấp lỗ mao dẫn màng hút mẫu, làm cho tốc độ dòng chảy giảm, thời gian cho kết chậm ảnh hưởng đến phản ứng kháng nguyên kháng thể xảy liên kết khơng đặc hiệu que thử Do đó, cần phải pha loãng mẫu để đảm bảo phản ứng que thử diễn bình thường Mẫu pha loãng với đệm PBS 0,01M theo tỉ lệ 1:1 cho trình phát độc tố Stx2 que thử Kết phân tích phát Stx2 loại thực phẩm que thử tóm tắt Bảng 3.7 Bảng 3.7 Đánh giá khả phát Stx2 tinh khiết nhiễm chủ động que thử số thực phẩm nguy TT Thực phẩm Đệm A Không ly tâm Mẫu Mẫu âm dương Đệm A Ly tâm Đệm B Không ly tâm Mẫu âm Mẫu dương Mẫu âm Mẫu dương Đệm B Ly tâm Mẫu Mẫu âm dương Cơm - + - + - + - + Sữa tươi - + - + - + - + Sữa ngô + + - + + + - + - + - + - + - + Sữa đậu nành Thịt lợn + + + + + + - + Thịt bò + + + + + + - + Giò lợn + + + + + + + + Thịt gà + + + + + + + + Giá đỗ - + - + - + - + 10 Khoai tây - + - + - + - + Chú thích: Đệm A: PBS 0,01M, pH 7,4; Đệm B: PBS 0,01M, BSA 1%, SDS 0,1 % 57 Kết cho thấy, số thực phẩm cơm, rau củ, sữa tươi, sữa đậu nành, cần pha loãng mẫu theo tỉ lệ 1:1 với đệm chiết PBS 0,01M que thử có khả phát độc tố Stx2 nồng độ ng/mL dịch chiết Tuy nhiên, loại thực phẩm sữa ngô loại thịt chiết đệm PBS, xảy tượng dương tính giả mẫu âm khơng có mặt độc tố Stx2 Hiện tượng dương tính giả khắc phục sau ly tâm mẫu (đối với sữa ngô) khơng có tác dụng mẫu thịt Ngun nhân tương tác khơng đặc hiệu số hợp phần thịt (protein, lipid) với kháng thể Stx2-BB12 vốn sử dụng đồng thời làm kháng thể bắt kháng thể phát nghiên cứu Để loại bỏ liên kết không đặc hiệu, tiến hành bổ sung vào đệm chiết PBS hai thành phần BSA (1%) SDS (0,1%) (Đệm B) để thử mẫu cịn tượng dương tính giả sau ly tâm Kết cho thấy kết hợp ly tâm sử dụng đệm chiết cho phép loại bỏ tượng dương tính giả mẫu thịt bò thịt lợn đảm bảo khả phát Stx2 nồng độ ng/mL dịch chiết Tuy nhiên, mẫu thịt gà giò chưa khắc phục tượng dương tính giả Mặt khác phương pháp ly tâm khó áp dụng trường Do vậy, nhóm nghiên cứu tập trung nghiên cứu xây dựng quy trình chuẩn bị xử lý mẫu trước sử dụng que thử để loại bỏ ảnh hưởng chất thực phẩm đến kết phân tích que thử Trong nghiên cứu tương tự, nhóm tác giả Kathryn H Ching cộng (2015) tiến hành chế tạo que thử phát độc tố Stx vi khuẩn STEC thử nghiệm khả phát Stx2a số thực phẩm sữa, rau xà lách, thịt bò Đối với mẫu sữa, loại sữa với nồng độ chất béo 0, 1, % pha loãng theo tỉ lệ 1:10 đệm PBS, bổ sung độc tố Stx2 với nồng độ khác để đánh giá khả phát độc tố que thử Kết cho thấy, giới hạn phát que thử sữa khơng béo, sữa có nồng độ chất béo 1-2% 0,1 ng/mL ng/mL Đối với rau xà lách thịt bị, mẫu pha lỗng với đệm PBS theo tỉ lệ 1:10 (w/v), bổ sung độc tố Stx2 với nồng độ khác sau ly tâm thu dịch thử nghiệm trực tiếp với que thử Que thử cho giới hạn phát độc tố Stx2 bổ sung thêm rau thịt bò ng/mL ng/mL Các phép thử cho kết thời gian 10 phút [12] Qua thấy, khả phát que thử chịu ảnh hưởng 58 lớn yếu tố mẫu phân tích pH, protein lipid Nồng độ protein hay lipid cao mẫu gây tượng kết tụ hạt vàng Do đó, cần xây dựng quy trình xử lý mẫu để đảm bảo loại bỏ yếu tố gây cản trở đến tốc độ dòng chảy phản ứng kháng nguyên kháng thể xảy que thử 59 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Trong nghiên cứu này, xây dựng quy trình chế tạo thành cơng que thử phát nhanh độc tố Stx2 vi khuẩn E coli gây ngộ độc thực phẩm với điều kiện cho trình chế tạo que thử sau: + Kháng thể Stx-BB12 đồng thời làm kháng thể phát kháng thể bắt giữ cho trình chế tạo que thử + Dịch huyền phù nano vàng 30 nm tổng hợp theo phương pháp sinh trưởng hạt cộng hợp với kháng thể phát hiện, đệm sử dụng cho kháng thể cộng hợp đệm PBS 0,01M, pH 7,4 có chứa saccarose 10 % + Điều kiện kháng thể cố định lên màng nitrocellulose: nồng độ kháng thể 0,5 mg/mL, tốc độ phun 40 nl/s, độ ẩm ≤ 50%, nhiệt độ 20-30 °C, liều lượng kháng thể in lên vạch C vạch T 0,15 0,25 µg/mm - Một số thơng số kỹ thuật que thử đánh sau: giới hạn phát ng/mL, thời gian phát 10 phút, độ nhạy 96,67 % độ đặc hiệu 100 % với mẫu Stx2 tinh khiết - Que thử có khả hoạt động tốt dải pH từ 6,0 đến 8,0, nhiệt độ từ đến 45 ºC Bước đầu thử nghiệm que thử số loại thực phẩm có nguy cơ, que thử có khả phát Stx2 nồng độ ng/mL dịch chiết thực phẩm với loại thực phẩm sữa, cơm, rau, thịt bò, thịt lợn Hiện tượng dương tính giả xảy số mẫu thực phẩm thịt gà, giò lợn 4.2 Kiến nghị - Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu thực phẩm nguy trình phát độc tố que thử - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng thực phẩm đến khả hoạt động que thử - Nghiên cứu tích hợp phát độc tố Stx1 Stx2 que thử 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alahi M E E., Mukhopadhyay S C (2017) “Detection methodologies for pathogen and toxins: A review,” Sensors (Switzerland) 2017 Alex S., Tiwari A (2015) “Functionalized Gold Nanoparticles: Synthesis, Properties and Applications—A Review,” J Nanosci Nanotechnol ANSES (2011) “Characteristics and sources of Enterohaemorrhagic E coli (EHEC),” Data sheet foodborne Biol hazards Bahadır E B., Sezgintürk M K (2016) “Lateral flow assays: Principles, designs and labels,” TrAC - Trends in Analytical Chemistry 2016 Baker C A., Rubinelli P M., Park S H., Carbonero F., Ricke S C (2016) “Shiga toxin-producing Escherichia coli in food: Incidence, ecology, and detection strategies,” Food Control, vol 59 pp 407–419, 2016 Centers for Disease Control and Prevention (2017) “CDC Yellow Book 2018: Health Information for International Travel,” in CDC Yellow Book 2018: Health Information for International Travel, 2017 Chaivisuthangkura P., Pengsuk C., Longyant S., Sithigorngul P (2013) “Evaluation of monoclonal antibody based immunochromatographic strip test for direct detection of Vibrio cholerae O1 contamination in seafood samples,” J Microbiol Methods Chen C., Wu J (2012) “A fast and sensitive quantitative lateral flow immunoassay for cry1AB based on a novel signal amplification conjugate,” Sensors (Switzerland) Chen W., Zhang J., Lu G., Yuan Z., Wu Q., et al (2014) “Development of an immunochromatographic lateral flow device for rapid diagnosis of Vibrio cholerae O1 serotype Ogawa,” Clin Biochem 10 Chen Z P., Peng Z F., Zhang P., Jin X F., Jiang J H., et al (2007) “A sensitive immunosensor using colloidal gold as electrochemical label,” Talanta 11 Cheng L W., Henderson T D., Patfield S., Stanker L L., He X (2013) “Mouse in vivo neutralization of Escherichia coli Shiga toxin with monoclonal antibodies,” Toxins (Basel) 12 Ching K H., He X., Stanker L H., Lin A V., McGarvey J A., et al (2015) “Detection of shiga toxins by lateral flow assay,” Toxins (Basel)., vol 7, no 4, pp 1163–1173 13 Frank C., Werber D., Cramer J P., Askar M., Faber M., et al (2011) “Epidemic Profile of Shiga-Toxin–Producing Escherichia coli O104:H4 Outbreak in Germany,” N Engl J Med 14 FRENS G (1973) “Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions,” Nat Phys Sci 15 Gholamzad M., Khatami M R., Ghassemi S., Malekshahi Z V., Shooshtari M B (2015) “Detection of Staphylococcus enterotoxin B (SEB) using an 61 immunochromatographic test strip,” Jundishapur J Microbiol., vol 8, no 16 Guerrero Y., González-Aguilar G (2013) “Shiga Toxin Detection Methods: A Short Review,” arXiv Prepr arXiv1312.4748 17 Hao M., Zhang P., Li B., Liu X., Zhao Y., et al (2017) “Development and evaluation of an upconverting phosphor technology-based lateral flow assay for the rapid, simultaneous detection of Vibrio cholerae serogroups O1 and O139,” PLoS One 18 He X., Kong Q., Patfield S., Skinner C., Rasooly R (2016) “A new immunoassay for detecting all subtypes of Shiga toxins produced by Shiga toxinproducing e coli in ground beef,” PLoS One 19 He X., Patfield S., Hnasko R., Rasooly R., Mandrell R E (2013) “A Polyclonal Antibody Based Immunoassay Detects Seven Subtypes of Shiga Toxin Produced by Escherichia coli in Human and Environmental Samples,” PLoS One 20 He X., Quiñones B., McMahon S., Mandrell R E (2012) “A single-step purification and molecular characterization of functional Shiga toxin variants from pathogenic Escherichia coli,” Toxins (Basel) 21 Herizchi R., Abbasi E., Milani M., Akbarzadeh A (2016) “Current methods for synthesis of gold nanoparticles,” Artif Cells, Nanomedicine Biotechnol 22 Jazayeri M H., Amani H., Pourfatollah A A., Pazoki-Toroudi H., Sedighimoghaddam B (2016) “Various methods of gold nanoparticles (GNPs) conjugation to antibodies,” Sensing and Bio-Sensing Research, vol pp 17–22, 2016 23 Jenkins J A., Wax T J., Zhao J (2017) “Seed-Mediated Synthesis of Gold Nanoparticles of Controlled Sizes to Demonstrate the Impact of Size on Optical Properties,” J Chem Educ 24 Ji Y., Ren M., Li Y., Huang Z., Shu M., et al (2015) “Detection of aflatoxin B₁ with immunochromatographic test strips: Enhanced signal sensitivity using gold nanoflowers.,” Talanta 25 Johannes L., Römer W (2010) “Shiga toxins from cell biology to biomedical applications.,” Nat Rev Microbiol 26 Juneja V K., Mukhopadhyay S., Ukuku D., Hwang C.-A., Wu V C H., et al (2014) “Interactive effects of temperature, pH, and water activity on the growth kinetics of Shiga toxin-producing Escherichia coli O104:H4 3.,” J Food Prot 27 Karmali M A (1989) “Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli,” Clinical Microbiology Reviews 1989 28 Kavaliauskiene S., Dyvelingelem A B., Skotland T., Sandvig K (2017) “Protection against shiga toxins,” Toxins (Basel)., vol 9, no 29 Khreich N., Lamourette P., Boutal H., Devilliers K., Créminon C., et al (2008) “Detection of Staphylococcus enterotoxin B using fluorescent immunoliposomes as label for immunochromatographic testing,” Anal Biochem 62 30 Kim Y A., Lee E H., Kim K O., Lee Y T., Hammock B D., et al (2011) “Competitive immunochromatographic assay for the detection of the organophosphorus pesticide chlorpyrifos,” Anal Chim Acta 31 Koczula K M., Gallotta A (2016) “Lateral flow assays,” Essays Biochem 32 Kong Q., Patfield S., Skinner C., Lh S., Ag G., et al (2016) “Validation of Two New Immunoassays for Sensitive Detection of a Broad Range of Shiga Toxins,” Austin Immunol., vol 1, no 2, pp 1–7 33 Lang A L., Tsai Y L., Mayer C L., Patton K C., Palmer C J (1994) “Multiplex PCR for detection of the heat-labile toxin gene and shiga-like toxin I and II genes in Escherichia coli isolated from natural waters,” Appl Env Microbiol 34 Lành L T (2015) “Nghiên cứu chế tạo vàng nano số ứng dụng,” Luận án Tiến sỹ 35 Liu B H., Hsu Y T., Lu C C., Yu F Y (2013) “Detecting aflatoxin B1 in foods and feeds by using sensitive rapid enzyme-linked immunosorbent assay and gold nanoparticle immunochromatographic strip,” Food Control, vol 30, no 1, pp 184–189 36 Liu L., Luo L., Suryoprabowo S., Peng J., Kuang H., et al (2014) “Development of an immunochromatographic strip test for rapid detection of ciprofloxacin in milk samples,” Sensors (Switzerland) 37 Locking M E., Pollock K G J., Allison L J., Rae L., Hanson M F., et al (2011) “Escherichia coli o157 infection and secondary spread, Scotland, 1999-2008,” Emerg Infect Dis 38 Mai S (2015) “Nghiên cứu phát triển hệ thống sắc kí miễn dịch cạnh tranh phát nhanh độc tố ruột tụ cầu sữa,” Tạp chí khoa học ĐHQGHN Khoa học Tự nhiên Công nghệ, vol 31, no 1, pp 23–31 39 Makhsin S R., Razak K A., Noordin R., Zakaria N D., Chun T S (2012) “The effects of size and synthesis methods of gold nanoparticle-conjugated MαHIgG4 for use in an immunochromatographic strip test to detect brugian filariasis,” Nanotechnology 40 Melton-Celsa A R (2014) “Shiga Toxin (Stx) Classification, Structure, and Function,” Microbiol Spectr 41 Minh P Đ., Lương H V (2015) “Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát độc tố vi khuẩn tả,” Tạp chí Y-Dược học quân sự, vol 2, p 18 42 Moongkarndi P., Rodpai E., Kanarat S (2011) “Evaluation of an immunochromatographic assay for rapid detection of Salmonella enterica serovars Typhimurium and Enteritidis.,” J Vet Diagn Invest 43 N.L P., A.I E., P.M.A L., A K ger, M.E S., et al (2012) “Prevalent STEC serotypes isolated from cattle, foods and environment in Argentina,” Zoonoses Public Health 44 Nakajima H., Kiyokawa N., Katagiri Y U., Taguchi T., Suzuki T., et al 63 (2001) “Kinetic Analysis of Binding between Shiga Toxin and Receptor Glycolipid Gb3Cer by Surface Plasmon Resonance,” J Biol Chem 45 NanoComposix (2016) Lateral flow assay development guide 2016 46 Nataro J P., Kaper J B (1998) “Diarrheagenic Escherichia coli.,” Clin Microbiol Rev 47 Niu J., Zhu T., Liu Z (2007) “One-step seed-mediated growth of 30-150 nm quasispherical gold nanoparticles with 2-mercaptosuccinic acid as a new reducing agent,” Nanotechnology 48 Niu K., Zheng X., Huang C., Xul K., Zhi Y., et al (2014) “A colloidal gold nanoparticle-based immunochromatographic test strip for rapid and convenient detection of Staphylococcus aureus.,” J Nanosci Nanotechnol 49 O’Loughlin E V., Robins-Browne R M (2001) “Effect of Shiga toxin and Shiga-like toxins on eukaryotic cells,” Microbes and Infection 2001 50 O´Farrell B (2013) “CHAPTER 2.4 - Lateral Flow Immunoassay Systems: Evolution from the Current State of the Art to the Next Generation of Highly Sensitive, Quantitative Rapid Assays,” Immunoass Handb 51 Pacheco A R., Sperandio V (2012) “Shiga toxin in enterohemorrhagic E.coli: regulation and novel anti-virulence strategies,” Front Cell Infect Microbiol 52 Pearce M C., Jenkins C., Vali L., Smith A W., Knight H I., et al (2004) “Temporal Shedding Patterns and Virulence Factors of Escherichia coli Serogroups O26, O103, O111, O145, and O157 in a Cohort of Beef Calves and Their Dams,” Appl Environ Microbiol 53 Polifroni R., Etcheverría A I., Sanz M E., Cepeda R E., Krüger A., et al (2012) “Molecular characterization of shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from the environment of a dairy farm,” Curr Microbiol 54 Posthuma-Trumpie G A., Korf J., Van Amerongen A (2008) “Development of a competitive lateral flow immunoassay for progesterone: Influence of coating conjugates and buffer components,” Anal Bioanal Chem 55 Rasooly R., Balsam J., Hernlem B J., Rasooly A (2015) “Sensitive detection of active Shiga toxin using low cost CCD based optical detector,” Biosens Bioelectron., vol 68, pp 705–711 56 Rasooly R., Do P M (2010) “Shiga toxin Stx2 is heat-stable and not inactivated by pasteurization,” Int J Food Microbiol 57 Rayavarapu R G., Petersen W., Ungureanu C., Post J N., Van Leeuwen T G., et al (2007) “Synthesis and bioconjugation of gold nanoparticles as potential molecular probes for light-based imaging techniques,” Int J Biomed Imaging 58 Rivas L., de la Escosura-Muñiz A., Pons J., Merkoỗi A (2014) Lateral Flow Biosensors Based on Gold Nanoparticles,” in Gold Nanoparticles in Analytical Chemistry, 2014 59 Rong-Hwa S., Shiao-Shek T., Der-Jiang C., Yao-Wen H (2010) “Gold 64 nanoparticle-based lateral flow assay for detection of staphylococcal enterotoxin B,” Food Chem., vol 118, no 2, pp 462–466 60 Rong-Hwa S., Shiao-Shek T., Der-Jiang C., Yao-Wen H (2010) “Gold nanoparticle-based lateral flow assay for detection of staphylococcal enterotoxin B,” Food Chem., vol 118, no 2, pp 462–466 61 Shim W B., Kim J S., Kim M G., Chung D H (2013) “Rapid and sensitive immunochromatographic strip for on-site detection of sulfamethazine in meats and eggs,” J Food Sci 62 Singh J., Sharma S., Nara S (2015) “Nanogold based lateral flow assay for the detection of Salmonella typhi in environmental water samples,” Anal Methods 63 Skinner C., Patfield S., Stanker L., He X (2013) “Development of Monoclonal Antibodies and Immunoassays for Sensitive and Specific Detection of Shiga Toxin Stx2f,” PLoS One 64 Song C., Liu C., Wu S., Li H., Guo H., et al (2016) “Development of a lateral flow colloidal gold immunoassay strip for the simultaneous detection of Shigella boydii and Escherichia coli O157: H7 in bread, milk and jelly samples,” Food Control 65 Thorpe C M (2004) “Shiga toxin-producing Escherichia coli infection.,” Clin Infect Dis 66 Tsen H Y., Jian L Z (1998) “Development and use of a multiplex PCR system for the rapid screening of heat labile toxin I, heat stable toxin II and shiga-like toxin I and II genes of Escherichia coli in water,” J Appl Microbiol 67 Upadhyay N., Nara S (2018) “Lateral flow assay for rapid detection of Staphylococcus aureus enterotoxin A in milk,” Microchem J., vol 137, pp 435–442 68 Urusov A E., Zherdev A V., Dzantiev B B (2014) “Use of gold nanoparticle-labeled secondary antibodies to improve the sensitivity of an immunochromatographic assay for aflatoxin B1,” Microchim Acta 69 Valério E., Chaves S., Tenreiro R (2010) “Diversity and impact of prokaryotic toxins on aquatic environments: A review,” Toxins 2010 70 Wang J., Katani R., Li L., Hegde N., Roberts E L., et al (2016) “Rapid detection of Escherichia coli O157 and shiga toxins by lateral flow immunoassays,” Toxins (Basel)., vol 8, no 71 WILLFORD J., MILLS K., GOODRIDGE L D (2009) “Evaluation of Three Commercially Available Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits for Detection of Shiga Toxin,” J Food Prot 72 Wiriyachaiporn S., Howarth P H., Bruce K D., Dailey L A (2013) “Evaluation of a rapid lateral flow immunoassay for Staphylococcus aureus detection in respiratory samples,” Diagn Microbiol Infect Dis 73 Wong R., Tse H (2009) Lateral Flow Immunoassay 2009 74 Wu W., Zhao S., Mao Y., Fang Z., Lu X., et al (2015) “A sensitive lateral 65 flow biosensor for Escherichia coli O157:H7 detection based on aptamer mediated strand displacement amplification,” Anal Chim Acta 75 Xiulan S., Xiaolian Z., Jian T., Xiaohong G., Jun Z., et al (2006) “Development of an immunochromatographic assay for detection of aflatoxin B1 in foods,” Food Control, vol 17, no 4, pp 256–262 76 Yamasaki E., Sakamoto R., Matsumoto T., Morimatsu F., Kurazono T., et al (2013) “Development of an immunochromatographic test strip for detection of cholera toxin,” Biomed Res Int 77 Yonekita T., Ohtsuki R., Hojo E., Morishita N., Matsumoto T., et al (2013) “Development of a novel multiplex lateral flow assay using an antimicrobial peptide for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli,” J Microbiol Methods 78 Zhang Z., Wang S., Xu H., Wang B., Yao C (2015) “Role of 5aminolevulinic acid-conjugated gold nanoparticles for photodynamic therapy of cancer,” J Biomed Opt., vol 20, no 5, pp 051043-1 79 Zhao P., Li N., Astruc D (2013) “State of the art in gold nanoparticle synthesis,” Coordination Chemistry Reviews 2013 80 Zhao X., He X., Li W., Liu Y., Yang L., et al (2010) “Development and evaluation of colloidal gold immunochromatographic strip for detection of Escherichia coli O157,” African J Microbiol Res 66 ... Mục đích nghiên cứu: Xây dựng quy trình chế tạo que thử sắc ký miễn dịch phát nhanh độc tố Stx2, chế tạo thử nghiệm đánh giá thông số kỹ thuật que thử, thử nghiệm khả phát độc tố que thử số thực... kể lượng cộng hợp phát chạy đến vị trí Kết tương đồng với kết nghiên cứu Ching cộng (20 16) chế tạo que thử phát độc tố Stx2 [ 12] Trong số nghiên cứu chế tạo que thử phát độc tố khác, liều lượng... nguy Đối tượng nghiên cứu: độc tố Shiga (Stx2) vi khuẩn STEC Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu khả phát độc tố Stx2 que thử nước số thực phẩm nguy nhiễm chủ động độc tố  Nội dung nghiên cứu: Luận văn