Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí ôxy hóa Fe(II), khử nitrate trong một số môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng

Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vi khuẩn kỵ khỉ ô x y hóa Fe(II), khử nitrate trong một số môi trường sình thái và khả năng ứng dụng của chủng.. Mã sổ: QG..[r]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẮP ĐHQG

Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vi khuẩn kỵ khỉ ô x y hóa Fe(II), khử nitrate trong số mơi trường sình thái khả ứng dụng chủng

Mã sổ: QG 07 23

Chủ trì đề tài: TS Đinh Thúy Hằng

Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

' H Ọ C Quoc GIA HA N Ọ I

tNJG TÁM THỎNG TIN THƯ VIỆN

o ự ẹ i u

BÁO CÁO KÉT QUẢ THỰC H Ệ N ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CÁP DHQG

BÁO CÁO TÓM TẮT

1 Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vỉ khuẩn kỵ khí ơxy hoả Fe(II), khử nitrate trongmột số môi trường sinh thái khả nâng ứng dụng chúng.

2 Mã số: QG.07.23

3 Thời gian thực biện: năm (2007 - 2009)

4 Cấp quản lý: Đại học Quốc gia Hà nội

5 Chủ trì đề tài: TS Đinh Thuý Hằng

Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - ĐHQGHN

Điện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: dthang@vnu.edu.vn Cán tham gia: CN Nguyễn Thị Tuyền

ThS Nguyễn Minh Giảng Mục tỉêu nội dung nghiên cứu

M ục tiêu:

- Nghiên cứu vả so sánh đa dạng sinh học vi khuẩn ôxy hoá Fe2+/khử NO3- số môi trường sinh thái khác

- Phân lập nhóm vi khuẩn đại diện, chiếm đa số loại môi trường sinh thái nghiên cứu đặc điểm phân loại, sinh lý, sinh hoá chúng

- Nghiên cứu khả ứng dụng chủng vi khuẩn phân lập vào việc kết hợp loại bỏ Fe2+, Mn2+, NO3” môi trường ô nhiễm

Nội dung nghiền cửu:

- Mau trầm tích đáy hồ, mẫu đất ruộng lúa ngập nước mẫu trầm tích ven biển lấy theo yêu cầu đảm bảo kỵ khí (tránh tiếp xúc với ơxy), đưa phịng thí nghiệm giữ 4°c tiến hành phân tích vi sinh vật

- Số lượng vi khuẩn ơxy hố Fe(II)/khử NO3- xác định theo phương pháp MPN (Most Propable Number) môi trường dịch thể chứa Fe(II) làm nguồn điện tử NO3- chẩt nhận điện tử điều kiện kỵ khí hồn tồn Thành phần khống mơi trường đàm bào tương ứng với môi trường sinh thái địa điểm lấy mẫu

- Đa dạng thành phần loài ttong mẫu khác xác định thông qua phương pháp sinh học phân tử, tách DNA tổng số trục tiếp từ lơ thí nghiệm nồng độ pha loãng khác dãy MPN phân tích tính đa dạng cùa đoạn gen 16S rARN cùa tập đoàn vi sinh vật thu !ô phưomg pháp PCR/DGGE

- Các chùng vi khuẩn ơxy hoả Fe(ÍI)/khừ NCV đại diện, chiếm đa số địa điểm lấy mẫu phàn lập từ ống pha lỗng cao có vi sinh vật phát triển cùa dăy MPN phương pháp ống thạch bán lòng

chùng cỏ hoạt tính sinh học (khả chuyển hóa Fe(II) NO3- ) cao nghiên cứu khả ứng dụng chúng vào việc kết hợp loại bỏ Fe(II), Mn(II), NO3- môi trường ô nhiễm

8 Các kết đạt được

- Ba dạng môi trường khác gồm có ao nước ngọt, ruộng lúa ngập nước trầm tích ven biển chọn để tiến hành nghiên cứu đa dạng vi khuẩn ơxy hố Fe(II) khử NO3- Đây dạng môi trường vi khuẩn tham gia chu trình chuyển hố sắt nitơ đóng vai trị quan trọng Mầu bùn đáy (dưới 10 cm bề mặt bùn) môi trường sinh thái kể thu thập sử dụng để phân tích nhóm vi khuẩn kỵ khí

Sổ lượng vi khuẩn ơxy hố Fe(II), khử NO3- xác định phương pháp MPN môi trường dịch thể nước (đối với mẫu ao mẫu ruộng lúa) hoậc nước lợ (đối với mẫu trầm tích ven biển) chứa Fe(II) làm chất cho điện tử, NO3' làm chất nhận điện tử acetate/C0 làm nguồn cacbon Sự sinh trưởng vi khuẩn ống MPN nhận biết thông qua thay đổi màu sắc môi trường nuôi cấy sang màu vàng nâu Fe(II) bị ơxy hố thành Fe(III)

- DNA tổng số từ ống MPN đại diện có vi sinh vật phát triển tách chiết sử dụng làm khuôn phân ứng PCR khuyếch đại đoạn gen I6S rDNA có độ dài 550 bp Phân tích điện biến tính đoạn gen cho thấy tính đa dạng cao vi khuẩn ống MPN Một số băng điện di đại diện cắt gel để đọc trình tự, qua xác định nhóm vi khuẩn chiếm ưu môi trường nghiên cứu, cụ thể Anaeromyxobacter, Pseudomonas Paracoccus.

- Đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật sinh trưởng điều kiện oxy hoả Fe(II) khử NO3- dãy MPN thông qua phương pháp lai in situ sử dụng đầu dò huỳnh quang (FISH) đặc hiệu cho ba nhóm vi khuẩn a-, 0- y-Proteobacterỉa.

12 chùng vi khuẩn kỵ khí phân lập tinh (4 chùng dạng môi trường sinh thái) Tính đa dạng cùa chủng mật di truyền xác định thơng qua phân tích ARDRA đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA đài 1500 bp sừ dụng hai enzyme Mspỉ Haeììl Các chùng đại diện cho nhóm ARDRA giải trình tự để xác định vị trí phân loại cá nhóm vi khuẩn mà chúng đại diện

- Các kết nghiên cứu công bố 02 báo khoa học, 01 báo cáo Poster tham gia hội nghị sinh thái sinh vật 02 trình tự gen đăng ký GenBank

- Đã tham gia đào tạo 01 học viên cao học Tình hình sử dụng kỉnh phí

- Tổng kinh phí đề tài duyệt: 60.000.000 VNĐ

- Tổng kinh phí đề tài chi: 60.027.400, bao gồm mục:

+ Chi phí thuê mướn: 24.000.000

+ Chi phí nghiệp vụ chun mơn: 29.522.400

+ Văn phòng phẩm: 505.000

SUMMARY

1 Project title: Diversity o f anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria in some ecological environments and their potential use.

2 Code: QG.07.23

3 Duration: 2007 - 2009

4 Organizer: Vietnam National University Hanoi (VNUH) Project leader: Dr Dinh Thuy Hang

Institute of Microbiology and Biotechnology, VNUH 6 Key participants: BSc Nguyen Thi Tuyen

MSc Nguyen Minh Giang Objectives and study contents

Objectives

- Comparatively study biodiversity of Fe(II) oxidizing - nitrate reducing bacteria in some ecological environments in Vietnam

- Isolate representative strains that dominate in each environment and study their physiological, and phylogenetic characteristics

- Study the application potential o f the isolates in elumination o f Fe(II), Mn(II) and NO3- in contaminated water sources

Study contents

- Collect anaerobic mud samples from representative environments in Vietnam and keep at °c as the sources for microbiological studies

- Determine the number of Fe(II) oxidizing-nitrate reducing bacteria in these environments by using MPN method carried out in anoxic liquid media containing Fe(II) as electron donor, N 3- as electron acceptor and trace acetate as corbo source Mineral content of the media would respect to the natural conditions where the samples have been collected

Species composition of the microbial communities in these environments would be analyzed via PCR-DGGE method applied for 16S rDNA of the samples of the MPN series

- Isolate representative strains from the MPN tube of the highest dilution by performing dilution series in semi-liquid agar tubes

Study physiology and phylogeny of the isolated strains, afterward select strains for the study o f application potential in elimination of Fe(II), Mn(II) and NO3- in contaminated waters

8 The obtained results

involvement o f bacteria in Fe and nitrogen cycles Samples at 10 cm depth below the sediment surface were used for this study

Number o f Fe(II) oxidizing, nitrate reducing bacteria was enumerated via MPN method earned out in anoxic media with freshwater mineral content (for the samples from freshwater pond and paddy soil) or brackish water mineral content (for the sample from estuarine environment) These media contained Fe(II) as electron donor, NO3- as electron acceptor and trace acetate as carbon source Growth of bacteria in the MPN series was recognized by colour changing in the media, from white (Fell precipitation) to dark brown (Felll precipitation)

Total DNA from representative MPN samples was purified and used in the PCR experiments to amplify 550 bp fragments of the V3 region o f the 16S rDNA and used for analyzing diversity of bacteria in the communities with DGGE method Most prominent DGGE bands were excised, reamlified and sequenced to determine the phylogenetic affiliation of the respective baterial groups

Diversity of the bacterial communities in the samples was also analyzed by using in situ hybridization (FISH) with fluorescent probes specific for the a-, P- and y-Proteobacteria.

12 bacterial strains were isolated and purified (4 strains for each studied environment) Genetic diversity of these isolates was studied via ARDRA analyzes of Ỉ6S rDNA with two endonucleases Mspl and HaelU 16S rDNA of the strains represented for the RFLP groups were sequenced and comparatively aligned with the database to identify the phylogenetic affiliation of the ARDRA groups

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỐNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn tham gia chu trình Fe 2

1.2 Vi khuẩn oxy bố Fe(II) pH trung tính 3

1.2.1 Vi khuẩn hiếu khí oxy hố Fe(II)

1.2.2 Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hố Fe(II)

1.2.3 Vi khuẩn khử nitrate oxy hoá Fe(II)

1.3 Tiềm ứng dụng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate

1.3.1 Ảnh hưởng nhiễm nitrogen nguồn nước

1.3.2 Ảnh hưởng nhiễm sắt nguồn nước

1.3.3 Khả ứng dụng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c u 7

2.1 Nguyên vật liệu 7

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.2 Hoá chẩt

2.1.3 Thiết bị dụng cụ

2.2 Phuxmg pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate

2.2.2 Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate

2.2.3 Tách DNA tổng sổ từ mẫu quần thể từ chùng vi sinh vật 2.2.4 Phân tích đa dạng vi sinh vật phương pháp ARDRA

2.2.5 Phưcmg pháp điện di biến tính DGGE

2.2.6 Giải trình tự gen 16S rDNA dựng phân loại 10

2.2.7 Phương pháp FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 11

2.2.8 Định lượng Fe(II), Mn(II) nitrate 12

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

3.1 Xác định sổ lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate ] các mơi trường Dghiên cứu

3.2 Phân tích cấu trúc quần thể điện di biến tính (DGGE) 16 3.3 Mức độ oxy hóa Fe(II), khử nitrate vi sinh vật mẫu 17 3.4 Phản lập vi khuẩn oxy hóa Fe(ll) khử nitrate từ mẫu nghiên cứu 17 đánh giá tính đa dạng chủng phân lập

3.5 Phân tích đa dạng vi khuẩn môi trường nghiên cứu 21

bằng phương pháp FISH

của chủng vi khuẩn đại diện

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục Các trình tự gen

Phụ lục Tham gia đào tạo khoa học

DANH MỤC CÁC CHỬVIÉT TẮT

ALF968 Fluorescence probe against a -Proteobacteria ARDRA Amplified ribosomal DNA restriction analyses

BET42a Fluorescence probe against fi-Proteobacteria

BSA Bovin serum albumin

Cl Chloroform - isoamylalcohol

CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

DAP1 4’,6-diamino-2-phenylindole

DNA Acid deoxyribonucleic

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate

DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis

EDTA Ethylene-diamine-tetraacetic acid

FISH Fluorescence in situ hybridization

GAM42a Fluorescence probe against y-Proteobacteria

MPN Most probable number

MQ Milli Q water

PBS Phosphate buffered saline

PCI Phenol-chloroform-isoamylalcohol

PCR Polymerase chain reaction

OD Optical density

rDNA Ribosomal DNA

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium dodecy] sulfate

TAE Tris/Acetate/EDTA

TBE Tris/Borate/EDTA

MỞ ĐẦU

Trong tự nhiên sát nguyên tố cỏ mặt với hàm lượng đáng kể, sau carbon, nitơ, phospho lưu huỳnh (Ehlich, 1996) Là nguyên tố kim ioại, tồn dạng ion với điện oxy hoá khử khác nhau, gồm Fe(II) Fe(III) Trong hai dạng kể chi có Fe(II) tồn dạng hồ tan nước Tuy nhiên, có tính khử cao, Fe(II) nhanh chóng bị oxy hoá thành Fe(III) phản ứng hoá học với oxygen khơng khí Do ion Fe(II) thường tìm thấy điều kiện mơi trường khơng có oxygen, ví dụ đáy thuỷ vực, tầng nước ngầm hay mơi trường có pH thấp (Konhauser, 1997; Nealson, Saffarini, 1994)

Trong oxy hoá Fe(II) oxygen theo đường sinh học diễn mơi trường có pH thấp oxy hố Fe(II) nitrate trình diễn điều kiện pH trung tính (Ehrlich, 1996) Trong tự nhiên, trình oxy hố sắt (II) với chất nhận điện từ nitrate chủ yếu diễn ranh giới hiếu khí (có oxygen) kỵ khí (khơng có oxygen) lớp trầm tích đáy thuỷ vực Oxy hố Fe(II) kết hợp với khử nitrate đóng vai trị quan trọng mơi trường nhiễm với nồng độ Fe(II) cao (do thiếu oxygen) NƠ3- cao (đo chất hữu bị phân huỳ tạo thành) (Weber et aL, 2006b) Các loài vi khuẩn với khả tiến hành phàn ứng oxy hố khử lúc thực hai nhiệm vụ, thứ chuyển Fe(II) hoà tan nước dạng Fe(III) kết tủa, hai loại bỏ NO3-, chuyền thành dạng N2 khơng độc hại

Nhiều cơng trình nghiên cứu giới cho thấy có mặt phổ biển nhóm vi khuẩn oxy hố Fe(II) khử nitrate với mật độ cao (106 tể bào/g trầm tích) điều kiện mơi trường khác nhau, bao gồm nước ngọt, nước lợ nước mặn nhiều vị trí địa iý khác giới (Straub, Buchholz-Cleven, 1998) Tuy nhiên Việt nam chưa có cơng trình nghiên cứu đề cập đến trình sinh học dùng Fe(II) để khử NO3” loài vi khuẩn đảm nhiệm trình Do vậy, đề tài ' Đa dạng sinh học vi khuẩn kỵ k h í oxy hoả Fe(IĨ), kh nitrate sổ môi trường sinh thái khả ứng dụng chúng ’’ đặt với mục tiêu nghiên cứu tính đa dạng vi khuẩn khử nitrate sử dụng Fe(II) nguồn điện tử sổ dạng môi trường sinh thái đặc trung Việt Nam, đồng thời tìm hiểu khả ứng dụng chúng việc xử lý nguồn nước nhiễm ion sắt kim loại nitrogen

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn tham gia chu trình Fe

Sắt kim loại phổ biến nguyên tố có mặt trái đất với hàm lượng lớn thứ tư, sau carbon, oxygen nitrogen Thông thường sắt tồn đạng Fe2Ơ3 tan nước có màu vàng nâu Trong mơi trường pH trung tính, dạng hịa tan nước Fe(II) chi tồn điều kiện khơng có oxygen, ví dụ đáy thủy vực, nơi oxygen hòa tan nước bị vi sinh vật hiếu khí sử đụng đề phân hủy hợp chất hữu Q trình oxy hóa - khử Fe(II) Fe(III) có vai trị thiểt yếu chu trình sinh địa hóa mơi trưởng q trình chuyển hố vật chất quan ưọng có mặt từ sớm ưái đất Fe(II) thành phần dạng khoáng phổ biến siderite (khống chất có chứa FeCƠ3), vivianite (Fe3(PC>4)2.8H2 0) pyrite (Fe$2), mơi trường kỵ khí có tính acid yểu đến mơi trường trung tính (Straub et ai, 2001) Oxy hóa sắt diễn theo hai đường hố học sinh học, q trình sinh học cỏ vai trị đặc biệt quan trọng nhiều dạng mơi trường sinh thái khác (hình 1.1) Với oxy hóa khử cặp Fe(II)/Fe(III) +770 mV môi trường acid +200 mV dối với mơi truờng trung tính, Fe(II) sử dụng chất cho điện tử để cung cấp đương lượng khử cho q trình đồng hóa carbon thành sinh khối nhờ vi khuẩn oxy hóa Fe(II) điều kiện kỵ khí hiếu khí, cịn Fe(III) sử dụng là chất nhận điện tử cuối điều kiện kỵ khí để oxy hoá hợp chất hữu (Weber et a i, 2006a).

Hình 1.1 Chu trình chuyển hố sắt tự nhiên (Ehrlich, Newman, 2008)

1 - Vi sinh vật môi trường acid; - Vi sính vật kỵ khỉ mơi tnxờng trung tính (khừ nitrate, quang hợp kỵ khi)' 3 - Quá trình hóa học mơi trưcmg trung tinh với nồng độ oxygen cao; - Quá trinh hóa học; - Quá trình sinh học; - H2S từ vi sinh vật; - + 2, trình sinh học hóa học; - -“-CO}2", trinh hóa học; - chuyền H+ quá trình sinh học hỏa học; Í0 - Ọ trình sinh học hóa học.

Vi khuẩn oxy hóa Fe(II) bao gồm nhiều nhóm có đặc điểm sinh lý khác nhau, ví dụ tự dưỡng dị dưỡng, quang dưỡng hóa dưỡng, ưa acid trung tính, hiếu khí ky khí Mặc dù vai trị q trình chuyển hóa sắt nhờ vi khuẩn môi trường lớn hiểu biết sinh lý sinh hóa nhóm ví sinh vật cịn nhiều giới hạn Hầu hết nghiên cứu công bổ trinh oxy hóa Fe(II) tập trung vào vi khuẩn hiếu khí ưa acid Thiobacciỉlus ferrooxidans (Temple, Colmer, 1951; Ehrlich, 1996), phát triển mơi trường có pH 1-2, nơi có Fe(II) Fe(III) dạng ion hịa tan Tuy nhiên, pH trung tính chất sản phẩm q trình chuyển hóa sắt lại hịa tan, điều gây khó khăn cho việc nghiên cửu sinh ]ý vi sinh vật tham gia (Straub et a i, 2001) Mặc dù vậy, vi khuẩn tham gia chuyển hố sắt điều kiện mơi trường trung tính, bao gồm oxy hố Fe(II) khử Fe(III) lại đa dạng đóng vai trị quan trọng chu trình vật chất tự nhiên

1.2 Vi khuẩn oxy bố Fe(II) pH trung tính

1.2.1 Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II)

Mặc dù q trình oxy hóa Fe(II) oxygen khơng khí pH trung tính xảy nhanh, nhiều nghiên cứu cho thấy oxy hố Fe(II) cịn đường sinh học hồn tồn cạnh tranh với q trình hố học Vi khuẩn hiếu khí oxy hố Fe(II) pH trung tính mơ tả các đại điện thuộc ba chi Gaỉỉionelỉa, Leptothrix Marinobacier (Kuetzing, 1919; Ehrenberg, 1919) Ngoài ra, theo nghiên cứu gần đây, số vi khuẩn oxy hoá Fe(II) hiếu khí tìm thấy xếp vào phân lớp a-, p- Ỵ- Proteobacterìa (Edwards et a l, 2003; Emerson, Weiss, 2004; Dhillon et a i, 2005; Rentz et a i, 2007) Nhu với phát triển phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tranh đa dạng nhóm vi sinh vật ngày trở nên phong phú

1.2.2 Vi khuẩn quang họp ky khí oxy hỏa Fe(II)

Trong khu vực có ánh sáng, Fe(III) có the tạo thành thơng qua hoạt tính oxy hóa Fe(II) vi khuẩn quang hợp có khà sử dụng Fe(II) nguồn điện tử để tạo các đương lượng khử cho q trình đồng hóa carbon vơ (Weber et aỉ., 2006a) Vi khuẩn quang hợp kỵ khí vi khuẩn oxy hỏa Fe(II) kỵ khí biết đến (Widdel et aỉ., 1993) Hiện nay nhóm vi khuẩn mơ tà với nhiều đại diện thuộc chi Chỉorobium, Rhodobacier, Thiodictyon, Rhodovuỉum, Rhodomicrobium (Ehrenreich, Widdel, 1994; Heising, Schink, 1998; Heising et aì., 1999; Straub et a l, 1999; Kappler, Newman, 2004).

Tuy nhiên q trình oxy hóa Fe(II) bàng quang hợp môi trường tự nhiên bị giới hạn ở độ sâu 200 um đất trầm tích hạn chế ánh sáng (Ciani et a l, 2005) Hơn nữa, nghiên cứu gần rầng vi khuẩn quang hợp oxy hóa Fe(II) khơng có khả sử dụng Fe(II) dạng khoảng mà chi oxy hóa Fe(II) dạng hịa tan (Kappler, Newman 2004), đó, chúng khơng đỏng vai trị đáng kể chu trình chuyển hố sắt cạn

1.2.3 Vi khuẩn khử nitrate, oxy hóa Fe(II)

Vi khuẩn oxy hố Fe(II) kỵ khí đóng vai trị quan trọng chu trinh chuyển hố sắt, đặc biệt lóp trầm tích nơi vi sinh vật bị hạn chế oxygen hoà tan (Lack eí al., 2002; Weber et al., 2001; Senn, Hemond, 2002; Straub et al., 2001; Weber et a i, 2006c) Với hiệu điện oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) pH vào khoảng +200 mV, Fe(ll) ừờ thành nguồn điện tử cho q ưình hơ hấp kỵ khí, khử nitrate thành N2 số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Straub et a i, 1996; Benz et a i, 1998; Weber et a i, 2006c) Quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate tóm tát theo phương trình phản ứng sau:

10 Fe2+ + N 3“ + 24 H20 = 10 Fe(OH)3 ị + N2 T + H2 1

Trong tự nhiên, q trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử nitrate chù yểu diễn ranh giới hiếu khí (có oxygen) kỵ khí (khơng có oxygen) lớp trầm tích đáy thủy vực Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate phân lập từ lớp trầm tích ao, hồ nước Bremen (Đức) năm 1996 (Straub et a i, 1996) Một số cơng trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy có mặt phổ biển nhóm vi khuẩn với mật độ cao (1 tế bào/g trầm tích) điều kiện mơi trường khác nhau, bao gồm cà nước ngọt, nước lợ nước mặn nhiều vị trí địa lý khác giới (Straub et a l, 1998) Các loài vi khuẩn phổ biến nhóm nảy biết đến lả lồi thuộc chi Chromobacteríum Klebsiella (Benz et aỉ.y 1998; Senko eí a i , 2005; Weber etaỉ., 2006b).

Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phần lớn sinh trường dị dưỡng, phụ thuộc vào chất hữu (vi dụ acetate) để cung cấp nguồn carbon cho việc tổng hợp thành phần tế bào (Straub et al., 1996; Benz et a l, Ỉ998) Bằng phương pháp MPN, người ta xác định vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate chiếm 0,8% tổng số vi khuẩn khử nitrate nói chung, nhóm sinh trưởng dị dưỡng thường gặp nhóm sinh trưởng tự dưỡng (Straub et a l, 1998) Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tự dưỡng biết điến với hai đại diện Ferroglobus pỉacidus, vi khuẩn cổ ưa nhiệt (Hafenbradl et a l, 1996), vi khuẩn ưa ấm thuộc phân lớp p-Proteobacteria (Weber et a l, 2006b) Đối với lịch sừ tiến hoá, sinh vật sinh trường tự dưỡng vơ nhóm vi khuẩn oxy hoả Fe(II) khử nitrate tự dưỡng đóng vai trị quan trọng, góp phần tạo nguồn carbon hữu ban đẩu để trì sống

1.3 Tiềm ứng dụng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate 1.3.1 Ảnh hưởng nhiễm nitrogen nguồn nước

Ảnh hưởng tới môi trường sinh thái

- Ả n h hưởng độc hại: Nitrogen ammonia dạng ammonia độc hại đối vói lồi thủy sinh, đặc biệt cá Ở pH trang tính, 99% N-ammonia tồn dạng N Rị+, khi pH khoảng 9, dạng NH3 tăng đảng kể Do mức độ độc hại N- ammonia nghiêm trọng pH môi trường tăng, thường hậu sau có lượng nước thải với độ kiềm cao đổ ngồi mơi trường

- Giảm oxygen hòa tan thủy vực: ammonia thường dẫn đến việc tăng nhu cầu oxygen cho trình sinh hóa thủy vực Theo tính tốn, mg ammonia thải ngồi mơi trường địi hỏi lượng oxygen hòa tan tăng thêm 4,6 mg, chủ yếu hoạt động nhóm vi khuẩn tham gia vào q trình nitrate hóa Hậu việc tăng nhu cầu oxygen làm thiếu oxygen cho lồi thủy sinh khác sống mơi trường - Gây tượng p h ủ dưỡng ao hồ: việc tăng hàm lượng nitrogen ao hồ kéo theo sinh trưởng rầm rộ cùa tảo thực vật thủy sinh, dẫn đến tâng nhu cầu oxygen đêm làm ảnh hưởng đến hoạt động sống động vật thủy sinh - Làm giảm hiệu chỉorỉn: ammonium kết hợp với chlorin tạo hợp chất

chloramin có tác dụng kháng khuẩn hom so với chlorin dạng tự

- Ầ n mòn: ammonium nồng độ mg/L gây ăn mịn cho đường ống dẫn nước cơng trình kim loại nước

Ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng

- Gây bệnh thiếu máu: nitrate nguyên nhân gây bệnh thiếu máu (Methemoglobinemia) người bị khử thành nitrite hệ đường ruột, sau liên kết với hemoglobin dạng methemoglobin, không cỏ khả vận chuyển oxygen Ở người khỏe mạnh, hàm lượng methemogỉobin máu giữ ổn định mức 1 - 2% nhờ enzyme methemoglobin reductase Trè em dễ bị ảnh hường cùa bệnh so với người trưởng thành có độ pH dày cao hom, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn khử nitrate sinh trưởng Vitamin c biết đến với khả bảo vệ giữ nồng độ methemoglobin mức thấp

- Gây bệnh ung thư: nitrite tạo từ nitrate cịn kết hợp với amine thứ cấp để tạo thành nitrosamine, tác nhân gây đột biến gen số bệnh ung thư ung thư dày, ung thư bàng quang (Tricker, Preussmann, 1991; Lundberg, 2004) Theo quy định quốc tế, giới hạn nitrate nước uổng 10 mg/L

1.3.2 Ảnh hirởng nhiễm sắt nguồn nước

oxygen cho thể) Ngồi sắt cịn tham gia vào thành phần số enzyme oxy hoá khử cataỉase, peroxydase vả cytochrome (những chất xúc tác sinh học quan trọng thể) Sắt đóng vai trò quan ưọng việc sản xuất lượng oxy hố, vận chuyển oxygen, hơ hấp ty lạp thể bất hoạt gốc oxy hóa cỏ hại Tuy nhiên tải sắt thể gây ứ đọng sắt mô tim, gan, tuyến nội tiết , dẫn đến rối loạn trầm trọng chức quan (Trần Thị Kiều My Nguyễn Hà Thanh, 2006)

Cơ thể hấp thu sắt dạng Fe(II) Pepsin tách sắt khỏi hợp chất hữu chuyển thành dạng gắn với acid amine đường Acid chlohydric khử Fe(III) thành Fe)II) để hấp thu Vì nên lượng sắt dư thừa nước uống cho dù dạng Fe(II) hay Fe(III) gây nguy hiểm cho người

Tác hại thừa sắt thể gây nhiều tranh cãi Người ta cho não mục tiêu thừa sắt, tích lũy sắt mơ não nguyên nhân bệnh thần kinh Parkinson Alzheimer, sắt coi chất gây ung thư mạnh, thường gặp ung thư gan sắt du thừa tích luỹ tim động mạch gây nên bệnh tim phá vỡ động mạch, sắt thừa lắng đọng lách phá vỡ tiết insulin gây bệnh đái tháo đường nghiên trọng

1.3.3 Khả ứng dụng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate

CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Dối tượng nghiên cứu

Mầu bủn vả trầm tích thu thập ba môi trường sinh thái đại diện khác nhau: mầu bùn đáy ao nước chân ruộng ngập nước thu Từ Liêm, Hà Nội, mẫu trầm tích nước lợ thu ven biển Vân Đồn, Quảng Ninh Mâu chân ruộng ữầm tích ven biển thu thập ừong ống thủy tính nút xoáy cho phép khoan sâu tới 60 cm bề mặt trầm tích (hình 2.1) Mẫu đáy ao thu thập binh thuỷ tinh, sau bổ sung nước vào tồn thề tích để giảm thiểu ảnh hường cùa oxygen khơng khí Mầu bảo quản nhiệt độ °c tiến bành thí nghỉệm

Ỉ Hình 2.1 Mẫu bùn trầm tích thu thập ngồi mơi trường tự nhiên, đảm bảo kỵ khí nghiêm ngặt

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sừ đụng nghiên cứu vi sinh vật hóa chất có tiêu chuẩn chất lượng cao hãng cung cấp lớn nhu Merck (Đức), Sigma (Mỹ) Hoá chất số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử hãng Bioneer (Hàn Quốc), Fermentas (Đức), Qiagen (Mỹ), ABI (Mỹ), BioRad (Mỹ) cung cấp

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ sử dụng nghiên cửu

Nghiên cứu thực Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - ĐHQGHN, sử dụng thiết bị chuyên môn dùng ừong vi sinh vật học, sinh học phân tử hố phân tích đạt tiêu chuẩn quốc tế

2.2 Phirong pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate

Số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate xác định thông qua phương pháp MPN (American Public Health Association, 1969) môi trường dịch thể kỵ khí hồn tồn có thành phần khống tương úmg với nước (dùng cho mẫu bùn đáy ao chân ruộng ngập nước) nước lợ (dùng cho mẫu trầm tích ven biển) (bàng 1)

Băng 2.1 Mơi trường kbống kỵ khí nirớc nước lợ cho vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate (Ratering, 1999).

Thàob phần Nước Nước lợ

Nước cất lít lít

NaCl g 13,7 g

MgCl2.6H20 0,4 g 5,9 g

CaCl2.2H20 0,15 g 0,81 g

KC1 0,5 g 0,58 g

KBr - 0,05 g

MgS04.7H20 0,25 g 0,25 g

NH4CI 0,25 g Hỗn hợp NH4CI (0,25 g)

KH2PO4 , g KH2PO4 (0,25 g) chuẩn

bị trước 50 ml nước cất Khử trùng 121 °c 25 phút, lấy 80 °c, sục khí N2 phút, làm nguội nước máy, sau thêm dung dịch sau (đã khử trùng riêng nhiệt màng lọc):

Hỗn hợp Vitamin ml ml

Hỗn hợp vi lượng ml ml

Vitamin BI (Thiamin) ml ml

Vitamin B12 , ml , ml

Vitamin B2 ml ml

Na-Acetate M I ml ml

NaNƠ3 I M (chất nhận điện tử) ml (5 mM) ml (5 mM) FeS04 M (chất cho điện tử) 10 ml (10 mM) ml (10 mM)

NaHC03 M 30 ml 30 ml

Chuẩn pH 7-7,2, sau chia mơi trường sang bình serum ống nghiệm sục khí N2) đậy bình ống nghiệm bầng nút cao su có kẹp nhơm hay nút vặn có lỗ hở

Mẩu bổ sung vào ống MPN với tỷ lệ 10% thể tích Thí nghiệm ủ 28 °c tuần, phát triển vi khuẩn ống MPN ghi nhận thông qua đổi màu môi trường từ trắng đục (màu Fell) sang vàng nâu (màu cùa Felll)

2.2.2 Phân lập vỉ khuẩn kỵ kh ío xy hoả Fe(IỈ) kh nitrate

ngược đầu 28°c bóng tối Khuẩn lạc đom phát triển pha loãng tách pipet Pasteur chuyển sang mơi trường dịch thể thích hợp (nước hay nước lợ)

2.2.3 Tách DNA tồng sổ từ mẫu quần thể chủng vi sinh vật

DNA tổng số quẩn thể vi sinh vật từ ống MPN tách chiết theo phương pháp Zhou cộng (1996) mô tà với cải biến nồng độ đệm phosphate 120 mM thay cho 100 mM nồng độ proteinase K 14 mg/ml thay cho 10 mg/ml DNA genome chủng đom tách theo phương pháp cùa Marmur (1961) Sản phẩm DNA sau tách chiết hoà tan nước bảo quản - °c

2.2.4 Phân tích đa dạng vi sinh vật phương pháp AKDRA

ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses) đuợc sử dụng để nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền vi sinh vật dựa phân tích kết xử lý gen 16S rDNA enzyme giới hạn (Ravenschlag et a i, 1999) Gen 16S rDNA chủng đơn khuếch đại phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27 F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) 1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T), sau xử lý bàng hai enzyme giới hạn Mspỉ HaeIII (Fermentas) (bảng 2.2) Sản phẩm DNA sau xử lý enzyme phân tách điện gel agarose 2% 100 V thời gian 30 phút Các chủng vi khuẩn xếp nhỏm đựa tương đồng phổ băng điện di

Bảng 22 Phản ứng cắt gen Ỉ6S rDNA enzyme giói hạn Mspl Hall

Nước cắt vơ trùng 18 ụl

1 Ox đệm R (hoặc đệm Tango) p.1

Trộn ly tâm nhanh, sau ủ hỗn hợp phản ứng 37 °c

2.2.5 Phương pháp điện di biến tính DGGE

Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA: Vùng V3-V5 gen I6S rDNA với độ dài 550 bp (hình 2.2) khuếch đại phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCT ACG GGA GGC AGC AG) và 907R (CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT) (Muyzer et a i, 1993) “Touch-down” PCR sừ dụng để tăng độ đặc hiệu giảm hình thành sàn phẩm phụ phản ứng khuyeechs đại Đẻ tạo tính ổn định cho việc phân tách trình tự DNA gel điện di biến tính, kẹp GC khoảng 40 bp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GCC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) gắn vào đầu 5’ cùa mồi GM5F

Sản phầm PCR

Enzyme Hae III (hoặc Msp I)

10^1 (0,1 -0,5 p.g ADN) |il (1 0u/|il)

6U 5f

£<*># Tuel “ / A _ ^ miEc1f *

16S rDNA 0

VI V2 V3 , V4 j V5

i ♦

+ EcS1BrL a c ĩ WIAB2 WBAC7 £*1406

HÕA2 ♦

itw

Hình 2.2 Vùng V3-V5 vị trí mồi gen 16S rDNA Lactobacillusplantarum Thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt PCR khuyếch đại đoạn V3-V5 vi khuẩn sau: Bảng 2.3 Thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt PCR khuyếch đại vùng V3-V5

gen 16S rĐNA

Thành phần phản ứng Thể tích (jil) Chu kỳ nhiệt (touch-down PCR)

h2 m q 27 Taq polymerase đưa vào phàn ứng sau

IOx Taq b u ffe r bước biến tính 94 °c phút

BSA nhiệt độ đạt 80 °c Nhiệt độ gắn mồi

MgCl2(20 mM) đặt cao hon °c so với nhiệt độ lý

dNTP (2,5 mM loại) thuyết (tức 65 °C) Sau chu kỳ nhiệt Mồi GM5F-GC (50 pmol/nl) độ gắn mồi giảm 0,5 °c đạt Mồi 907R (50 pmol/fi.l) tới 55 °c, nhiệt độ phản ứng tiến hành

ADN khuôn thêm 15 chu kỳ Thời gian kéo dài chuỗi

Taq polymerase cùa mơi phút

Tổng thể tích phản ứng 50

DGGE: Điện di tiến hành gel polyacrylamide 6% với dải biến tính urea/formamid từ 30% đến 60% Quá trình điện di thực điện di Dcode™ System (BioRad) nhiệt độ 60 °c 200 V 3,5 h Sau điện di, gel polyacrylamide nhuộm dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) 30 phút, sau rửa nước chụp ảnh duới tia u v máy GelDoc (BioRad) Băng điện di cắt nước qua đêm °c Dịch DNA dùng lảm khuôn để thục phản ứng PCR chu trình nhiệt phản ứng PCR cho DGGE với cặp mồi GM5F (khơng có kẹp GC) 907R Sàn phẩm PCR tinh giải trình tự

2.2.6 Giải trình tự gen 16S rDNA dựng phân loại

3110 Avant Appied Biosystems Trinh tự gen sau phân tích so sánh với trình tự 16S rDNA lồi có liên quan công bố Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search Cây phân loại dựng theo phương pháp neighbour-joining (Stou, Nei, 1987), định dạng tiến hành dựa 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985)

2.2.7 Phương pháp F ISH (Fluorescence In Situ Hybridization) (Amann et al., 1992)

Nguyên lý: FISH phương pháp lai sử dụng đầu dị thích hợp bắt cặp với rRNA nhàm xác định phả hệ cùa vi sinh vật quần thể cách trực tiếp, không qua bước phân lập ni

Chuẩn bị bóa chất:

Formaldehyde 37% PBS I Ox

5 M NaCl I M Tris-HCl

0,5 M EDTA SD SỈ0%

Formamide DAPI (0,02 mg/ml)

Đầu dò: đoạn oligonucleotide đài 18-20 nucleotide gán chất huỳnh quang sulphoindocyonide (CY3, hấp phụ bước sóng 552 nm) Các đầu dò sử dụng nghiên cứu liệt kê bảng (nồng độ ng/^1)

Bảng 2.4 Các đầu dò sử dụng nghiên cứu

Tên đầu dò Đối tượng bắt cặp Trình tự (5’-> 3’) Formam ide (%)

ALF968 a -Proteobacteria GGTAAGGTTCTGCGCGTT

BET42a p -Proteobacíeria GCCTTCCCACTTCGTTT 35

GAM42a y-Proteobacteria AAACGATGTGGGAAGGC 35

Bảng 2.5 Chuẩn bị đệm lai đệm rửa

Dung dịch gổc Thê tích

2 ml đệm lai 50 mi đệm rửa

5 M NaCl 360 ml 900 mM

1 M Tris/HCl 40 ụ\ ml 20 mM

Form amide % phụ thuộc đâu dò

0,5 M EDTA 0,5 ml mM

Nước cât vô trùng dân tới ml dân tới 50 mi

SDS 10% (bô sung cuối

cùng để tránh kết tủa) 2 ịil 50 ịiị 0,0 1%

- Hoà 0,5 g mẫu đất/bùn ưong 1,5 ml PBS lx

- Bổ sung formaldehyde vào mẫu tới nồng độ - 4% cố định °c thời gian ỉà 30 phút không 24 h

- Ly tâm, loại phần dịch rửa lại cặn tế bào bàng PBS IX

- Ly tâm, loại PBS lx bổ sung 1,5 ml hồn hợp dung dịch etanol/PBS (1:1) - Bảo quản tế bào cố định -2 °c

Lai với đầu dò:

- Lấy 15 - 20 mẫu hồ vớí ml nước cất vô trùng vả đưa lên màng polycarbonate (0 , ịim) - Để khơ mẫu khơng khí bảo quản hộp kín -2 ° c sử dụng - Chia màng thành phần nhỏ để tiến hành lai (một màng có đường kính 25 mm chia làm - phần sử dụng cho đầu dò khác nhau) Dùng bút chì đánh dấu mẫu (bằng số) - Chuẩn bị ml đệm lai eppendorf (bảng 2.5)

- Chuẩn bị dung dịch đầu dò: trộn fil đầu dò (2 ng/|il) với 18 jnl đệm lai ống eppendorf 0,5 ml, giữ đá, tránh ánh sảng

- Đặt miếng giấy thẩm vào ống Falcone 50 ml, đổ phần đệm lai lại vào ống

- Đặt mảnh màng polycarbonate lên lam kính, mặt có mẫu lên Các mẫu lai với đẩu dị đặt trẽn lam kính

- Nhỏ hỗn hợp đầu dò lên mẫu đặt tồn lam kính vào falcon có miếng giấy lọc thấm đệm lai chuẩn bị trước (ở tư nằm ngang) lai 46°c thời gian 90 phút (nhưng khơng q h)

- Chuẩn bị 50 ml đệm rửa ống falcon 50 ml

- Chuyển nhanh mẫu sau lai vào đệm rửa làm nóng trước bể ổn nhiệt 48 °c 15 phút Gạn bớt đệm đổ mẫu đĩa Petri Dùng kẹp gắp mẫu, nhúng qua nước cất vô trùng vài giây đặt lên giấy thấm cho khô (mật có mẫu trên).

Nhm đối chửng quan sát:

- Đe nhuộm đối chứng, nhỏ 50 nl dung dịch DAPI lên mồi mẫu, giữ phút tối, sau rửa nhanh nước cất rửa cồn 80% vài giây để khô khơng khí (đặt hộp tối) Mầu bảo quản -2 ° c vài ngày mà tín hiệu huỳnh quang khơng bị thay đổi

- Phủ lớp Citifluor/Vecta shield (4:1 v/v) quan sát kính hiển vi huỳnh quang

2.2.9 Định lượng Fe(II), Mn(II) nitrate

Định Iưựng Fe(II) thuổc thử phenanthroiin {DIN 38406 E1-], 1983)

Chuẩn bị:

Dung dịch HC1 25% (rửa dụng cụ): dụng cụ thủy tinh thí nghiệm phải rửa qua dung dịch HC125% sau tráng nước cất trước sử dụng

Dung dịch H2SO4 loãng (hạ pH): H2SO4 đặc : nước = : Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm):

CH3COONH4 40 g

CH3COOH 50 mi

Nước cất đủ 100 ml

Dung dịch phenanthrolin 21 mM (tạo phức): C12H9C1N2.H20 0,5 g

Nước cất đủ 100 ml

(Bảo quản lọ tối, hạn sử dụng tuần) Dung dịch chuẩn:

FeS04.7H20 2,78 mg

HC1 25% 6,25 ml

Nước cất đù 100 ml

Tiến hành:

- Sau thu mẫu, hạ pH tới bàng dung dịch H2SO4 loãng (1% thể tích)

- Thêm vào 50 ml mẫu ml dung dịch ammonium acetate, trộn bàng vortex Hỗn hợp phải có pH nàm khoảng 3,4 - 5,5 (tối ưu 4,5)

- Thêm ml dung dịch phenanthrolin, trộn

- Thêm nước 100 ml, trộn Giữ nhiệt độ phòng 15 phút - Đo OD bước sóng 510 nm

- Đường cong chuẩn tiến hành với nồng độ Fe(C) khoảng từ - 50 ỊiM Định Iưọng nitrate tbuổc thử acid disulfofemic (Lê Đức, 2004)

Nguyên lý: ĩon NƠ3~ tác dụng với acid disulfofemic tạo thành nitrodisulfofemic, phàn ứng với ammonia (NH3) đặc tạo thảnh phức có màu vàng, xác định bước sóng 410 nm Nồng độ NO3- cho phép 0,5 - mg/L

Chuẩn bị:

Dung dịch acid disulfofemic:

Phenol tinh khiết không màu 25g H2SO4 đặc (tinh khiết) 150 ml H2SO4 bốc khói (oleum) 75 ml

Trộn đều, đun sơi cách thủy bình cầu gắn ống sinh hàn hồi lun Dung dịch chuẩn:

K N 03(đ ã sấ y k h ô 105 °C) 0,1631g

Nước cất 500 mỉ

CHClj lml

Nước cất dẫn đủ 1000 ml

Tiến bành:

- Mầu nước (chúa không mg/L NO3) lấy vảo ống nghiệm, trung hòa đến pH - Chuyển mẫu sang chén sứ, cô cạn đun cách thủy

- Thêm ml dung dịch acid disulfofemic, hòa tan phần cặn đũa thủy tinh - Thêm 20 ml nước cất, ml NH3 đặc ml KOH 12N

- Thêm nước cất cho đủ 50 ml (trong bình định mức) - Đo OD bước sóng 410 tun

- Đường chuẩn xây dựng nồng độ dung dịch chuẩn khoảng từ 0-10 mM Định lượng M n(n) thuốc th formaldoxime (Brewer and Spencer, 1971)

Nguyên lý: Mangan phản ứng màu với formaldoxime (formaldehyde oxime) môi trường kiềm tạo thành phức có màu cam đị đậm, xác định bước sóng 450 nm Để khơng hình thành kết tủa hydroxiđ, pH tối ưu cùa phương pháp lả , - 8,9

Chuẩn bị:

Dung dịch formaldoxime:

20g Hydroxygenlamine hydrochloride hòa tan 450 ml nước cất, thêm 10 ml dung dịch formaldehyde 37% thêm nước đến 500m]

Dung dịch ammonia (NH3)

Hỗn hợp formalđoxime:ammonia theo ti lệ 5:2 (thể tích) Dung dịch chuẩn (100 )ag mangan/ml):

Hòa tan 0,2876 g permanganate kali (KMn04) 100 ml nước cất, thêm ml dung dịch H2SO4 đầm đặc, dẫn acid sunfurous (SO2 nước) cho đán dung dịch màu Đun sơi dung dịch để loại bỏ SO2 thừa sau iàm lạnh Bổ sung nuớc cho đù lít

Tiến hành:

- Đưa 35 mi mẫu pH = , - 8,9

- Thêm ml hỗn hợp Formaldoxime/Ammonia vào lắc xoay tròn, - Sau - 30 phút đo quang phổ hấp thụ bước sóng 450 nm

CHƯƠNG IU KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xấc định số lưọng vi ldraẩn oxy hỏa Fe(]I), khử NO3' tại mỏi trưừng nghiên cứu

Ba môi trường đại diện lựa chọn để tiến hành nghiên cứu gồm có bủn đáy ao nước ngọt, chân ruộng lúa ngâp nước trầm tích nước lợ ven biển Đây mơi trường có hoạt động vi sinh vật chu trình chuyển hố sắt nitrogen cao (Ratering, Schnell, 2000) số

lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO 3" trong mẫu thu thập xác định thông qua

pbưcmg pháp MPN sử dụng môi trường địch thể chứa FeSC>4 làm chất cho điện tử NaNƠ3 làm chất nhận điện tử cuối Thành phần khống mơi tnrờng tương ứng với điều kiện nước (đối với mẫu bùn đáy ao chân ruộng ngập nước) nước lợ (đối với mẫu bùn ven biển) Sự phát triển vi sinh vật sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(n) ống MPN nhận biết thông qua biến đổi màu sắc môi trưởng từ ừấng xanh (màu Fe(II)) sang màu vàng nâu (màu Fe(ni)) (hình 3.la)

Hình 3.1 Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử N O3- trong môi trưởng

sinh thái khác nhau, (a) - Nhận biết có mặt vĩ khuẩn ống MPN thông qua biến đổi màu sắc môi trường từ trắng xanh (Fell) sang vàng nâu (Felll) (b) - Sổ lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(n), khử N (V xác định thÔDg qua

phương pháp MPN

Kết cùa thí nghiệm MPN (hình 3.1b) cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 cao mẫu bùn chân ruộng ngập nước (9,3 X 103 tế bào/g bùn), cao hẳn so với mẫu trầm tích nước lợ ven biển (4,3 X 103 tế bào/g trầm tích) mẫu bùn đáy ao nước (1,5 X tế bào/g bùn) Mật độ mối tương quan số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NCV với điều kiện môi trường vùng sinh thái tìm thấy ữong số nghiên cứu trước (Weber et al., 2006b,c; Ratering, Schnell, 2000; Hauck et al., 2001; Ratering, 1999; Straub et a i, 1996).

3.2 Phân tích cấu trú c quần thể điện di biến tính DGGE

Để Xác định nhóm vi khuẩn oxy hố Fe(II)/khử NO3- chiếm ưu môi trường nghiên cứu, chúng tơi tiến hành phân tích cấu trúc quần thể ống MPN độ pha loãng 10" (là nồng độ gần tới hạn cùa dãy MPN mẫu) bẳng phương pháp PCR-DGGE đoạn gen 16S rDNA (hình 3.2) Các băng điện di đuợc cắt từ gel sử dụng lảm khuôn cho phản ứng PCR tiếp sau để xác định trình tự so sánh với trình tự 16S rDNA cơng bố ngân hàng đữ liệu GenBank

R lì

•+• Pseudomonas sp. Paracoccus SD -►

Anaeromvxobơcter

SV.+-Hình 3.2 Phổ điện di biến tính (DGGE) phân tích đoạn gen Ỉ6S rDNA quần thể vi sinh vật ống MPN mẫu nghiên cứu A - Bùn ao nước ngọt; R - Bùn chân ruộng ngập nước; B - Bùn trầm tích ven biển

Cỏ thể thấy lồi Anaeromyxobacter có mặt dạng môi trường nghiên cứu Đây nhóm vi khuẩn nằm phân lớp h-Proteobacteria, chi có lồi nhất cơng bố A dehaỉogenans với sổ đại diện chưa định đanh đến loài Các

chủng Anaeromyxobacter cơng bố sinh trường kỵ khí khử Fe(III), chưa có chùng nghiên cứu khả sinh trưởng khừ NO3”, sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Treude

et ai., 2003; Straub, Buchholz-Cleven, 1998; Straub et al., 1996) Trong môi trường nuôi cấy sử dụng (cũng điều kiện tự nhiên), Fe(III) đồng thời tồn với Fe(II) đo kết chuyển hoá Fe(II) đường hoá học (phàn ứng với lượng nhị oxygen mơi trường) đường sinh học (đo vi sinh vật oxy hố Fe(II) khử NC>3_) Do vậy, có mặt cùa lồi sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) Anaeromyxobacter điều kiện môi trường nghiên cứu (cũng tự nhiên) mắt xích khép kín chu trình chuyển hố sẳt

Pseudomonas nhóm vi khuẩn đóng vai trị việc oxy hố Fe(II) NO3 Tuy nhiên, môi trường nước lợ (và nước biển) bàng phương pháp điện di biến tính chưa xác định nhỏm chiếm ưu Nguyên nhân cạnh tranh vi khuẩn khử NO3- nói chung so với nhóm kỵ khí khác, đặc biệt khử sulfate môi trường (Schlafleigh, 2000)

3 J Mức độ oxy hoá Fe(II) khử NƠ3~ vi sinh vật mẫu nghiên cứu

Nồng độ Fe(II) NO3” ưong môi trường nuôi cấy xác định theo thời gian để đánh giá khả sinh trưởng vi sinh vật mẫu làm giàu (hình 3.3)

£ $

Thời gian (ngày)

1

Thời gian (ngày)

Hình 3.3. Hoạt tính oxy bố Fe(II) (A) khử N O3 (B) quần thể vi sinh vật

ba môi trường nghiên cứu sau làm giàu phưong pháp MPN Ký hiệu: o đối chứng khơng có vi sinh vật; ■ mẫu bùn đáy ao nước ngọt; •m ẫu bùn chân ruộng ngập nước; A mẫu trầm tích nước lợ ven biển

Như quần thể vi sinh vật làm giàu thể khả sinh trường với Fe(II) NO3- cao Ở mẫu, lưọng nitrate mơi trường bị khử gần hồn tồn sau ngày (hình 3.3B), nhiên lượng Fe(II) khơng giảm tương ứng (hình 3.3A) Hiện tượng cỏ thể lý giải bằng có mặt nhóm vi khuẩn Anaeromyxobacter cà mẫu phân tích, làm chuyển hố Fe(III) ngược lại thành Fe(II)

3.4 Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3- tử mẫu nghiên cứu đánh giá tính đa

dạng chủng phân lập

Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3" phân lập theo phương pháp pha loâng dãy ống thạch bán lịng (1%) (Widdel, Bak, 1992) (hình 3.4a) Các khuẩn lạc đom phân lập dựa khác hình dạng kích thước khuẩn lạc Mồi khuẩn lạc tách riêng nuôi cấy kỵ khí mơi trường dịch thể chứa Fe(II) (10 mM) NƠ3“ (5 mM) binh serum có nút cao su kẹp nhơm (hình 3.4b) 12 khuẩn lạc đơn phân lập từ ống MPN độ pha

V** hỌC tìU O C GIA HM NỤI

‘VỤNG TÂM THÒNG TIN THỰ VIỆN

lỗng cao nhếỉ có vi sinh vật phát triển (bảng 3.1) đại diện cho vi khuẩn oxy hố Fe(n), khừ NO3" chiếm đa số ba mơi trưởng nghiên cứu

Hình 3.4 Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NOj đại diện môi trườg nghiên

cứu (a) Phân lập chủng đơn thơng qua phương pháp ống thạch kỵ khí bán lỏng; (b) Ni cấy chủng đơn vi khuẩn oxy hóa Fe(n), khử NO3” môi trường dịch thể điều kiện ky khí hồn tồn

Bảng 3.1 Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khửNC>3 phân lập từ mơi tnròug nghiên cứu

Nguồn phân lập ChÙDg vi khuấn Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Chân ruộng lúa ngập nước (Tù Liêm, Hà Nội)

INI Hình trịn, bề mật nhẵn, kích thước -2 mm

EN2 Hình trịn, bề mặt khơng nhăn, kích thước 0,25-0,5 mm IN Hình trịn, bể mặt xù xi, kích thước 0,25-0,5 mm IN4 Hình trịn, bề mặt xù xi, kích thước -2 mm

Trầm tích nước lợ biển (Vân Đồn, Quảng Ninh)

IN5 Hình trịn, bề mặt nhẵn, kích thuớc 0,25 mm

IN6 Hình bầu dực, be mặt nhẵn, kích thước 0,25-0,5 mm IN Hình trịn, bề mặt xù xi, kích thước 0,8 mm

EN8

Hình trịn tia, mật đọ tể bao ngồi phía ừong, kích thuớc 1-1,5 mm

Đáy ao nước (Từ Liêm, Hà Nội)

IN9 Hình trịn, bề mặt xù xi, kích thước 0,5-1 mm

IN10 Hình trịn khơng đều, kích thước 0,5-1 mm INI Hình trịn, bề mặt nhẵn, kích thước 0,2-0,3 nun

INI Hình đĩa lồi hai mặt, kích thước 2-2,5 mm

Hue III \Isp\

Hình 3.5 Phổ điện di gen 16S rDNA 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NC>3~ sau xử lý enzyme giới hạn HaeIII Mspl INI - IN 12: Kỷ hiệu

cùa 12 chùng đơn phân lập từ mẫu nghiên cứu; M: Marker kb (Bioneer, Hàn quốc)

Từ kết phân nhóm bảng 3.2 kết hợp với nguồn gốc phân lập 12 chủng (bảng 3.1), nhận thấy tính đa dạng di truyền 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NCV phụ thuộc vào địa điểm thu mẫu ban đầu Mầu trầm tích nước lợ ven biến thể mức độ đa dạng di truyền cao với chủng phân lập từ mẫu (IN5, IN6, IN7, ĨN8) thuộc vào nhóm ARDRA khác (nhóm 2, nhóm 3, nhóm nhỏm 5) Tiếp đến ỉà mẫu bùn đáy ao nước với chủng (IN9, IN 10, INI 1, IN 12) thuộc vào nhóm ARJDRA khác (nhỏm 1, nhổm nhóm 4) Thể tính đa dạng di truyền thấp !à mẫu bùn chân ruộng ngập nước với chủng (INI, IN2, IN3, IN4) thuộc vào nhóm ARDRA khác (nhóm nhóm 2)

Bàng 3.2 Tính đa dạng di truyền 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate phân lập (INI - IN 12) dựa phân tích ARDRA

Nhỏm

ARDRA Chủng vi khuẩn

Các đoạn DNA tạo sau xử lý 16S rDNA băng enzyme giói hạn (bp)

H aelll Mspl

1 INI, IN2, IN4, INI 200, 300 300, 500

2 IN3, IN8 200, 300 500

3 IN5, IN9 200, 300 500, 800

4 IN6, IN 10, IN12 200, 300, 500 300, 500

5 IN7 200, 900 500

Ba chủng IN2, ĨN7 IN 12 đại điện cho nguồn phân lập đại diện cho nhóm ARDRA (bảng 3.2, tên chủng in đậm) lựa chọn để tiến hành phân tích trình tự đầy đù gen 16S rDNA định danh khoa học Chùng ĨN2 đại diện cho nhóm ARDRA-1 gồm chùng từ hai dạng môi trường nước ngọt, chiếm 30% tổng số chủng phân lập Tương tự, chùng IN I2 đại diện cho nhóm ARDRA-4 gồm chủng từ mơi trường nước lợ ao nước ngọt, chiếm 25% tổng số chùng phân lập Chủng IN7 làm thành nhóm

riêng biệt (ARDRA-5), chi tìm thấy mơi trường nước lợ ven biển Kết so sánh trình tự 16S rDNA chùng nảy với ngân hàng liệu GenBank cho thấy chủng IN2 có độ tương đồng cao với Anaeromyxobacter dehalogenans (99%), chùng IN7 với Pseudomonas stutzeri (98%) chủng IN 12 với Paracoccus ferooxydant (97%) (hình 3.6).

.0.02.

100

100

100

-B a c illu s su b íiỉis (FJ544386)

f

rLttc 671 - -•

E

Anaeromyxobacíer sp FAcl2 (AJ504438)

Anaeromyxo bacler dehalogenans 2CP1 (NR027547)

•Aỉtaeromyxobacler clone (AB293367)

IN2

Paracoccus marinus (AB185959) 'aracoccusferooxydant (AY954687)

cIN12

100 \-P aracoccvs sp (AM 989037) P seudom onasp u ứ d a (FJ217182) P seudom onas stu izeri (EU518705)

TN7

• Ơ-Proteobacteria

a-Proteobacteria

100

ĩ I— IP seudom onas nitroreducens PS2 (FJ588866)P seudom onas a lcaìigenes X B5 (GQ150490)

y-Proteobacteria

Hình 3.6 Cây phân loại thể mối liên quan chủng IN2, IN7, IN12

loài gần gũi dựa trình tự gen 16S rDNA Cây dựng theo phương pháp neighbor-joining, đơn vị = 0,02 Knuc trình tự nucleotide Các số hiển thị vị trí phân nhánh kết phân tích bootstrap 0 phép so sánh (chì có giá trị 50% trình bày hình) B subtiỉis loài vi khuẩn chọn làm outgroup Các ký hiệu hiển thị ngoặc kép iả mã trình tự gen

16S rDNA ngân hàng gen

Như nhóm ARDRA-4 vói chủng IN 12 làm đại diện loài Paracoccus tìm thấy hai dạng mơi trường nước lợ ven biển ao nước Paracoccus chi vi khuẩn nằm phân lớp a -Proteobacteria, gồm lồi sinh trường kỵ khí tuỳ tiện, hơ hấp bàng nitrate oxygen (Schapleigh, 2000) Kết hợp với kết phân tích PCR-DGGE thấy Paracoccus Pseudomonas hai nhóm oxy hố Fe(II) khử NO3” chiếm ưu trong ba dạng môi trường nghiên cứu, Paracoccus có vai trị quan trọng hom ao nước Pseudomonas ruộng ngập nước Đại diện cùa hai nhóm tìm thấy mơi trường nước lợ ven biển, đo ảnh hường nguồn nước từ đất liền

Paracoccus (đại diện chủng IN6) Pseudomonas (đại diện chủng IN7)cũng có mặt

dạng mơi trưởng náy.

3.5 Phân tích đa dạng vỉ khuẩn mối trvờng nghiên cứu phưong pháp FISH

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) phương pháp trực tiếp xác định mối liên quan phả hệ vi kHiiẩn môi trường sống chúng thông qua đầu dị đánh dấu huỳnh quang bắt cặp với RNA ribosome Theo kết so sánh trình tự gen 16S rDNA, chủng đại diện cho nhóm ARDRA c hính được xếp vào phân lớp a-, p- y-Proteobacteria (hình 3.6), thí nghiệm FISH chúng tơi sử dụng ba đầu dị ALF968, BET42a GAM42a tương ứng bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn thuộc ba phân lớp (hỉnh 3.7)

Hình 3.7 Hinh ảnh hiển vi tế bào vi khuẩn ưong mẫu nghiên cứu bắt cặp với

Tỷ lệ vi khuẩn nhóm tính theo tỷ lệ số tế bào bắt cặp với đầu dò tương ứng tổng số tế bào nhuộm DAPI Phần khơng bắt cặp với ba đầu dị sử dụng gọi phần không xác định (KXĐ) Thí nghiệm lai với đầu dị chi cho kết mẫu từ hai môi trường nước ruộng ngập nước bùn đáy ao, mẫu trầm tích ven biển khơng cho kết dương tính đầu dị Kết thống kê số tế bào bắt cặp với đầu dị tổng số tế bào nhuộm DAPI trình bày hình 3.8

Hình 3.8 Kết phân tích đa dạng vi sinh vật mẫu phương pháp FISH

Kết quà thu cho thấy số vi sinh vật không bắt cặp với ba đầu dị sử dựng thí nghiệm FISH chiếm phần lớn tổng số tế bào nhuộm DAPI mẫu ruộng

đầu dò huỳnh quang

Ruộng ngập nước Bùn đáy ao

ALF968

20%

ALF968 _ 30%

GAM42a

20%

BET42a

20%

ngập nước (60%) bùn đáy ao (50%) Trong phần tế bào có bắt cặp với đầu dị, nhóm a - Proteobacteria chiếm 20% 30% (trên tổng số tế bào nhuộm DAPI) tương ứng mẫu ruộng ngập nước ao Theo kết nghiên cứu PCR-DGGE gen I6S rDNA (phần 3.2), vi khuẩn thuộc phân lớp a -Proteobacteria với đại diện chi Paracoccus đâ tìm thấy chiếm đa số mơi trường ruộng ngập nuớc, lại khơng tìm thấy mơi trường bùn đáy ao Tiểp theo, đầu dị BET42a (p-Proteobacteria) cho kết dương tính với 20% tổng số tế bào nhuộm DAPI mẫu bùn đáy ao khơng có tín hiệu với mẫu ruộng ngập nước Điều phù hợp với kết phân tích PCR-DGGE (phần 3.2), vi khuẩn thuộc phân lớp y- Proteobacíeria với đại diện chi Pseudomonas tìm thấy chiếm ưu môi trường ruộng ngập nước, khơng tìm thấy mẫu bùn đáy ao Cuối cùng, đầu đị GAM42a (y- Proteobacterià) cho kết duơng tính với 20% tổng sổ tế bào nhuộm DAPI mẫu ruộng ngập nước lại khơng cỏ tín hiệu mẫu bùn đáy ao, nhiên đại diện cùa phân lớp p-Proteobacteria lại không xác định phân tích PCR-DGGE Như việc bổ sung thơng tin từ thí nghiệm phân tích FISH góp phần làm rõ nét tranh đa dạng vi khuẩn oxy hóa Fe(II)/khù nitrate mơi trường nghiên cứu

Đối với mẫu trầm tích nước ]ợ ven biển, hai phương pháp phân tích đa đạng không phụ thuộc bước phân lập PRC-DGGE FISH khơng đem lại thơng tin tính đa dạng vi sinh vật oxy hóa Fe(II)/khử nitrate Tuy đại diện thuộc chi Paracoccus (a- Proteobacteria) Pseudomonas (y-Proteobacteria) tìm thấy mơi trường (phân tích ARDRA, phần 3.4), vai trị ưu cùa chúng mơi trường khơng xác định Sự có mặt chủng Paracoccus Pseudomonas mơi trường trầm tích ven biển nhiều khả ảnh hường nguồn nước từ đất liền Nhóm vi sinh vật thực chiếm ưu mơi trường nằm ngồi giới hạn đặc hiệu đầu dị sử dụng nghiên cứu F1SH cặp mồi sử dụng PCR-DGGE

3.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân hoại hoạt tính sinh bọc chủng vỉ khuẩn đại diện

Hai chủng vi khuẩn IN2 IN12 đại diện cho hai nhóm vi khuẩn chiếm ưu môi trường nghiên cứu Anaeromyxobacter Paracoccus (phần 3.4) Hơn thế, q trình thí nghiệm nhận thấy rầng hai chùng thể khả sinh trường cao số chủng phân lập Để tìm hiểu khả ứng dụng nhóm vi khuẩn oxy hố Fe(II) khử nitrate, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh lý cùa hai chủng

của hàm lượng protein tổng số theo thời gian ưong dịch nuôi vi khuẩn với Fe(III) làm chất nhận điện tò cuối (hỉnh 3.9) Cả hai chủng không sinh trường khử SO42"

Thời gian (ngày)

Hình 3.9 Khả sinh trưởng khử Fe(III) cùa hai chủng IN2 (■) IN 12 ( • ) thơng qua xác đinh hàm lượng protein tổng số dịch tế bào biến đổi theo thời gian Băng 3.3 Đặc điểm sinh lý hai chủng vi khuẩn IN2 IN12

Đặc điểm sinh lý IN2 IN12

Hô hấp oxygen (sinh trưởng hiếu khí) - + +

0% - + + +

1% + + + + + +

Sinh trưởng phụ thuộc độ mặn cùa 2% + + + + + +

môi trường (% NaCl) 3% + + + + + +

4% + + + + +

5% + 4- + +

Lactate + + + + + +

Chất cho điên tử (để khử nitrate) Acetate + + + ■+ H—b

Ethanol + + + + + +

Benzoate + + + +

Chất nhận điện tử (để oxy hoá Na- lactate)

n o3~

Fe(III) SO42"

+ + + + + +

+ + +

Chú thích: + + +: sinh trưởng mạnh; + +: sinh trưởng trung bình; +: sinh trường yếu; không sinh trưởng

Đối với nguồn điện từ khác phục vụ cho trình khử nitrate, Fe(II) sử đụng để phân lập nuôi cấy từ ban đầu, lactate, acetate, benzoate ethanol

oxy hoá hai chủng IN2 IN12 Trong trường hợp benzoate, acid hữu chứa vịng thơm thường khó bị oxy hố hợp chất cịn lại, chủng INI thể khả oxy hoá hẳn so với chủng IN2

Độ mận lả Ưong yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sinh lý cùa vi sinh vật tự nhiên, tiến hành nghiên cứu ảnh hường nồng độ muối môi trường khả sinh trưởng hai chủng vi khuẩn quan tâm Kết nghiên cứu cho thấy chủng IN2 có nhu cầu muối để sinh trưởng, chủng INI2 thi khơng Trong chủng IN I2 sinh trưởng mơi trường khơng cần bổ sung NaCl chủng IN2 chi phát triển NaCl có mặt nồng độ 1% trở lên Tuy nhiên, chủng IN2 lại có khả chịu muối cao IN12, chủng phát triển tốt nồng độ muối 5% tốc độ sinh trường IN 12 bị ảnh hưởng đáng kể nồng độ muối cao hom 3% Điều phù hợp với đặc điểm phân bố hai chùng vi khuẩn tự nhiên, cụ thể chủng IN2 đại diện cho nhóm vi khuẩn tìm thấy nhiều dạng mơi trường khác nhau, bao gồm nước nước lợ, chùng IN 12 đại diện cho nhóm chi tim thấy bùn đáy thuỷ vực nước

M &

9 •

r ۥ

0.02

Hỉnh 3.10

930

1000 1000

SaciiầíS subttito (FJ544 386)

AnMTomyivbacter clone (AB2933Ổ7) Anotromyxìbacter dehabgtnans (EP067314)

N2

KMr

UArumromyìobactor sp FAcl2 (AJ504438) La dehabgenans 2CP1 (NR027547) ^Anaervmymbacter clone (DQ39499Ố)

Bacúkiĩ subttỈB (FJ544386) -Paracoccus arninopMus (D32239)

■Paracoccus aminovorans (D3224Q) 'aracoccus sp (AM989037)

■Paracoccus marịms (AB185959) _'Pơracoocus denUrựkans (AI288159) iĨÕÕÍParacoccus jimoxydant (AY954687)

Hình thái tể bào vị trí phân loại hai chủng IN2 ĨN12 Hình thái tế

bào quan sát kính hiển vi quang học, độ phóng đại 0 lần (đơn vị = Jim) Cây phân loại dựng theo phương pháp neighbor-joining, đom vị = 02 Knuc trình tự nucleotide Các số hiển thị vị tri phân nhánh kết phân tích bootstrap 0 phép so sánh (chi có giá trị 500 trình bày hình) B subtilis loài vi khuẩn chọn làm outgroup.

GenBank cho phép xếp chùng IN2 vào chi Anaeromyxobacter (!oài gần gũi A dehaỉogenans, 99% tương đồng) Như chùng IN2 bổ sung vào danh sách chi Anaeromyxobacter với tên khoa học Anaeromyxobacter sp IN2 mã trình tự gen 16S rDNA trong GenBank FJ939131 (hình 3.10) Anaeromyxobacter chi biết đến với đại diện sinh trưởng kỵ khí bắt buộc bàng oxy hố hợp chất hữu để khử Fe(III) (Treude et aỉ., 2003) Trong nghiên cứu này, lần vi khuẩn Anaeromyxobacter mà đại diện chùng ĨN2 thể khả sinh trưcmg oxy hoá Fe(II)/khử nitrate, nhiên hình thức sinh trưởng khơng vượt trội so với sinh trường kỵ khí khử Fe(III),

Chủng IN12 gồm tế bào hình oval có kích thước 1,5x1.5-2 um, chuyển động chậm So sánh trình tự gần đủ gen 16S rDNA với ngân hàng liệu GenBank cho phép xếp chúng IN 12 vào chi Paracoccus (loài gần gũi p aminovorans, 98% tương đồng) Paracoccus chi vi khuẩn nằm phân lớp a -Proteobacíeria, gồm nhiều lồi có khả hơ hấp oxygen (sinh trưởng hiếu khí), đồng thời hơ hấp khử nitrate (Shapleigh, 2000) Nhiều đại diện chi Paracccus tìm thấy điều kiện tối ưu cho khử nitrate, đáy thuỷ vực (Shapleigh, 2000) hay hệ thống xử lý nước thải loại bỏ nitrogen, ví dụ như P denitrificans, p ferooxygendans (Bitton, 1999) Chùng IN 12 định danh khoa học Paracoccus sp IN 12 có mã trinh tự gen 16S rDNA GenBank GU084390 (hình 3.10).

Mặc đù phân lập thông qua bước làm giàu bàng dãy MPN với chất cho nhận điện tử tương ứng Fe(II) nitrate, hai chủng IN2 IN 12 lại đại diện cho hai nhóm vi khuẩn khác tham gia chu trình sắt mơi trường trung tính, cụ thể oxy hố Fe(II) thành Fe(IlI) nitrate khử Fe(III) thành Fe(II) bàng hợp chất hữu Tuy có khả sinh trường cao mơi trường có Fe(II) nitrate nhung chủng IN2 khỏ có khả úng dụng vào mục đích loại bỏ Fe(II) nitrate nguồn nước nhiễm bị ảnh hưởng khả sừ dụng Fe(III) làm chất nhận điện từ cuối để tạo lượng Khác với IN2, chủng IN12 vi khuẩn chi sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(ll) nitrate, khơng có khả khử Fe(III) Hơn nữa, chủng vi khuẩn có khả sinh trường nhiều kiện mơi trường khác có mặt hay khơng có mặt oxygen, thích nghi với nhiều loại nguồn điện tử khác (như Fe(II), acid hữu cơ, rượu) sinh trường tốt môi trường có độ mặn dao động dải 0-3% (đặc trưng cho môi trường nước nước lợ) Với ưu điểm kể trên, chùng IN 12 hứa hẹn có tiềm ứng dụng vào việc loại bị nitrogen Fe(II) nguồn nước ô nhiễm

3.5 3.5

- _

E

■ 2.5 a

-QJ Uh

- 2

- 1.5

0

Thời gian (ngày)

Hình 3.11 Loại bị Fe(II) (•) N 3- (■) môi truờng chủng vi khuẩn IN 12

Hoạt tính oxy hóa Fe(II) khử nitrate chủng IN 12 xác định điều kiện kỵ khí với Fe(II) chất cho điện từ nitrate làm chất nhận điện tử cuối Kết xác định nồng độ chất cho nhận điện từ môi trường biến đổi theo thời gian cho thấy giảm nồng độ Fe(II) nitrate diễn song song với tốc độ đáng kể (hình 3.11)

KẾT LUẬN

- Số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NOị” mẫu bùn thu thập thủy vực nước ngọt, chân ruộng ngập nước vùng nước lợ ven biển xác định nằm khoảng 103 - 104 TB/g, mẫu bùn chân ruộng ngập nước có số lượng tế bào vi khuẩn cao (9,3 X 103 TB/g)

- Phân tích thành phân lồi phương pháp PCR-DGGE gen 16S rDNA cho thấy Anaeromyxobacter nhóm chiếm ưu có mặt ba dạng mơi trường sinh thái trên, đóng vai trị khép kín chu trình chuyển hố sẩt môi trường nghiên cứu thông qua khả sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) Hai nhóm Paracoccus Pseudomonas tìm thấy tương ứng mẫu bùn ao ruộng, hai nhóm vi khuẩn thực trình oxy hố Fe(II) khử NƠ3- hai dạng mơi trường sinh thái kể trên Ngồi ra, chủng vi khuẩn thuộc chi Paracoccus (ÍN6) Pseudomonas (IN7) cịn tìm thấy mơi trường nước lợ ven biển, chứng tỏ nhóm vi khuẩn đóng vai trị định mơi trường nước lợ

- Vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NCV mơi trường nghiên cứu có tính đa dạng cao Mười hai chủng đom phân lập từ mẫu MPN xếp vào nhóm ARDRA khác trong phân tích sử dụng hai enzyme giới hạn HaeIII Mspỉ Ba chủng đại diện IN2, ĨN7 IN 12 có ưình tự gen 16S rDNA có độ tương đồng cao với lồi vi khuẩn Anaeromyxobacíer dehaỉogenans (99%), Pseudomonas stutzeri (97%) Paracoccus ferrooxydant (98%).

- Hai chùng vi khuẩn IN2 IN 12 đại điện cho hai nhóm tham gia chu trình chuyển hố sắt số môi trường sinh thái khác Việt nam, chủng IN2 tham gia khừ Fe(III) thành Fe(II) hợp chất hữu chùng IN 12 tham gia oxy hố Fe(IÍ) thành Fe(III) nitrate Vai ưò sinh thái hai chủng khẳng định thông qua đặc điểm sinh lý chúng, cụ thể khả sinh trưởng với chất cho nhận điện tử khác mức độ sinh trưởng nồng độ muối khác môi trường

- So sánh trinh tự gần đủ cùa gen 16S rDNA với lồi cơng bố GenBank cho phép định danh hai chủng vi khuẩn Anaeromyxobacter sp IN2 (mã trình tự đăng ký GenBank FJ939131) Paracoccus sp IN 12 (mã trinh tự đăng ký GenBank GU084390)

- Với hoạt tính cao việc oxy hố Fe(II) khử nitrate, chủng IN 12 có tiềm úng đụng thực tế việc xử ]ý nguồn nước nhiễm nitrogen ion kim loại Fe(II)

KIẾN NGHỊ

- Nghiên cứu tìm giá thể phù hợp để tạo chế phẩm chứa vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate - Nghiên cứu thử nghiệm áp dụng vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate để xử lý nước ngầm

nhiễm sắt nitơ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1 Lê Đửc (2004) Một sổ phương pháp phân tích mơi trường NXB ĐHQGHN.

2 Trần Thị Kiều My, Nguyễn Hà Thanh (2006) Chuyền hóa sắt thể tải sắt một số bệnh máu Hội nghị Khoa học ngành Huyết học - Truyền máu Quốc gia

Tiếng Anh

3 Amann RI, Stromley J, Devereux R Key R, Stahl DA (1992) Molecular and microscopic identification of sulfate-reducing bacteria in multispecies biofilms Appl Environ Microbiol 58: 614-623.

4 American public health association (1996) Standard methods for the examination of water and waste water including bottom sediments and sludge 604-609

5 Benz M, Brune A, Schink B (1998) Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria Arch Microbiol 169: 159-165. Bitton G Wastewater Microbiology Willey-Liss, Inc Toronto, Canada, 1999.

7 Brewer PG, Spencer DW (1971) Colorimetric determination of manganese in anoxic waters Limnology and Oceanography 16: 107-110

8 Ciani A, Goss KU, Schwarzenbach RP (2005) Light penetration in soil and particulate minerals Europ J Soil Sci 56: 561-574.

9 Dhillon A, Edwards K, Webb E, Roger D, Sogin M (2005) Marinobacter aquaeolei gene expression studies for clues to neutrophilic iron oxydation NAỈ 2005 biannual meeting o f the NASA Astrology Institute.

10 DIN 38406-EỈ-1 (1983) German standard methods for the examination of water, waste water and sludge; cation (group E); determination of ừon (El)

11 Edwards KJ, Rogers DR, Wirsen CO, McCollom TM (2003) Isolation and characterization of novel psychrophilic, neutrophilic, Fe-oxidizing, chemolithoautotrophic a - and p- Proteobacteria from the deep sea Appl Environ Microbiol 69: 2906-2913.

13 Ehrenberg (1919) Microbiology o f the iron - depositing bacteria, “Gallionella ferruginea"

Ellis D, Methuen & Co Ltd.

14 Ehrenreich A, Widdel F (1994) Anaerobic oxidation of ferrous iron purple bacteria, a new type o f phototrophic metabolism Appl Environ Microbiol 60 (12) 4517-4526.

15 Ehrlich HL, Newman DK (2008) Geomicrobiology, 5th Edition, CRC Press.

16 Emerson D, Weiss JV (2004) Bacterial iron oxidation in circumneutral freshwater habitats: findings from the field and the laboratory Geomicrobiol J 21:405 - 414.

17 Felsenstein J (1985) Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap Evolution 39: 783-791.

18 Gounot AM (1994) Microbial oxidation and reduction of manganese: consequences in groundwater and applications FEMS Microbiol Rev 14: 339.

19 Hafenbradl D, Keller M, Dirmeier R, Rachel R, Rossagel p, Burggraf s, Huber H, Stetter KO (1996) Ferroglobus placidus gen nov., sp nov., a novel hyperthermophilic archaeum that oxidizes Fe2+ at neutral pH under anoxic conditions Arch Microbiol 166: 308-314. 20 Hauck s, Benz M, Brune A, Schink B (2001) Ferrous iron oxidation by denitrifying

bacteria in profiindal sediments of a deep lake (Lake Constance) FEMS Microbiol Ecol 37: 127-134

21 Heising s, Schink B (1998) Phototrophic oxidation of ferrous iron by a Rhodomicrobium vannielii strain Microbiol 144: 2263-2269.

22 Heising s, Richter L, Ludwig w , Schink B (1999) Chlorobium ferrooxidans sp nov., a phototrophic green sulfur bacterium that oxidizes ferrous iron in coculture with a “Geospirillum" sp strain Arch Microbiol 172:116-124.

23 Hohmann c , Winkler E, Morin G, Kappler A (2009) Anaerobic Fe(II)-oxygendizing bacteria showAs resistance and immobilize As during Fe(III) mineral precipitation Environ Sci Technol.

24 Kappler A, Newman DK (2004) Formation of Fe(III)-minerals by Fe(II)-oxidizing photoautotrophic bacteria Geochim Cosmochim Acta 68:1217-1226.

25 Konhauser KO (Ỉ997) Bacterial iron biomineralisation in nature FEMS Microbiol Rev 20' 315

26 Kuetzing (1919) Microbiology o f the iron - depositing bacteria, “Leptothrix ochracea Ellis D, Methuen & Co Ltd.

27 Lack JG, Chaudhuri SK, Kelly SD, Kemner KM, O'Connor SM, Coates JD (2002) Immobilization of radionuclides and heavy metals through anaerobic bio-oxidation of Fe(II) Appl Environ Microbiol 6 8: 2704-2710

28 Lundberg JO, Weitzberg E, Cole JA, Benjamin N (2004) Nitrate, bacteria and human health Nature' 593-602

29 Lovley D.R (1991) Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction Microbiol Rev 55: 259. 30 Lovley D.R (1997) Microbial Fe(III) reduction in subsurface environments FEMS

Microbiol Rev 20: 305.

31 Marmur Ỉ (1961) A procedure for the isolation of deoxygenribonucleic acid from microorganisms JM o l Biol 3: 208-218.

32 Muyzer G, De Waal EC, Utterlinden AG (1993) Profiling of complex microbial population by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rARN Appl Environ Microbiol 59: 695-700.

33 Nealson K.H, Saffarini D (1994) Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology and regulation Annu Rev Microbiol 48: 311. 34 Ratering s (1999) Iron cycle in Italian rice field soil: localization of the redox processes and

charactarization of the involved microorganisms PhD Dissertation Department of Microbiology, University of Marburg (Germany)

35 Ratering s, Schnell s (2000) Nitrate-dependent iron(II) oxidation in paddy soil Environ Microbiol 3: 100-109.

36 Ravenschlag K, Sahm K, Pemthaler J, Amann R (1999) High bacterial diversity in permanently cold marine sediments Appl Environ Microbiol 65: 3982.

37 Renz JA, Kraiya c , Luther GW, Emerson D (2007) Control of ferrous iron oxydation within circumneutral microbial marts by cellular activity and autocatalysis Environ Sci Technol 41: 6084-6089

38 Saitou N, Nei M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Mol Biol Evol 4: 406-425.

39 Shapleigh JP (2000) The Denitrifying Prokaryotes In Dworkin M, Falkow s, Rosenberg E Schleifer KH, Stackerbrandt E, eds The prokaryotes: an evolving electronic resource fo r the microbiological community Springer-Verlag, New York.

40 Senko JM, Dewers TA, Krumholz LR (2005) Effect o f oxidation rate and Fe(II) state on microbial nitrate-dependent Fe(III) mineral formation ,4/?/?/ Environ Microbiol 71: 7172- 7177

41 Senn DB, Hemond HF (2002) Nitrate controls on iron and arsenic in an urban lake Science 296: 2373-2376

43 Straub KL, Buchholz-Cleven BEE (1998) Enumeration and detection o f anaerobic ferrous ừon-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments Appl Environ Microbiol 64:4846-4856.

44 Straub KL, Rainey FA, Widdel F (1999) Rhodovulum iodosum sp nov and Rhodovulum

robiginosum sp nov., two new marine phototrophic ferrous-iron-oxidizing purple bacteria Ị

Int J Syst Bacteriol 49: 729-735

45 Straub KL, Benz M, Schink B (2001) Iron metabolism in anoxic environments at near ' neutral pH FEMS Microbiol Ecol 34: 181-186.

46 Temple KL, Colmer AR (1951) The autotrophic oxidation of iron by a new bacterium: Thiobacilỉus ferrooxidans J Bacteriol 62: 605-611.

47 Treude N, Rosencrantz D, Liesack w , Schnell s (2003) Strain FAcl2, a dissimilatory iron- reducing member of the Anaeromyxobacter subgroup of Myxococcales FEMS Microbiol

E co l44:261-269

48 Tricker AR, Preussmann R (1991) Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurrence, formation, mechanisms and carcinogenic potential Mut Res 259: 277-289.

49 Vandenebeele J, De Beer D, Germonpre R, Van De Sande R, Verstraete w (1995) Influence of nitrate on manganese removing microbial consortia from sand filters Wat Res. 29: 579

50 Weber KA, Picardal FW, Roden EE (2001) Microbially catalyzed nitrate-dependent ■ oxidation of biogenic solid-phase Fe(II) compounds Environ Sci Technol 35: 1644-1650.

51 Weber KA, Achenbach LA, Coates JD (2006a) Microorganisms pumping iron: anaerobic microbial iron oxidation and reduction Nature 4: 752-764.

52 Weber KA, Pollock J, Cole KA, O’Connor SM, Achenbach LA, Coates JD (2006b) Anaerobic nitrate-dependent iron(II) bio-oxidation by a novel Lithoautotrophic Betaproteobacterium, strain 2002 Appl Environ Microbiol 72: 686-694.

53 Weber KA, Urrutia MM, Churchill PF, Kukkadapu RK, Roden EE (2006c) Anaerobic redox cycling of iron by freshwater sediment microorganisms Environ Microbiol 8: 100-

113

54 Widdel F, Schneil s, Heising s, Ehrenreich A, Assmus A, Schink B (1993) Ferrous iron oxygendation by anoxygengenic phototrophic bacteria Nature 362: 834.

55 Widdel F, Bak F (1992) Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria In Balows A Trilper HG, Dworkin M, Harder w, Schleifer KH eds The Prokaryotes, 2nd ed Springer Berlin Heidelberg New York: 3352-3378

56 Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996) DNA recovery from soils of diverse composition Appl Environ Microbiol, 62: 316-322.

PHỤ LỤC

IN2 16S rDNA 1429 bp, Ánaeromyxobacíer sp.

t a c a c a t g c a g tc g a g c g a g a a a g c c c g c a a g g g tg a g t a a a g c g g c g c a c g g g t g c g t a a c a c g tg g g t a a tc t g c c c t a g a g t c c g g a a t a a c t c g c c g a a a g g c g t g c t a a t g c c g g a t g a g a c c a c g g g a g c c t c g g c t c c t g c g g g a a a a g g t g g c c t c t g t a c a c a a g c t a t c g c t c t a g g a t g a g c c c g c g g c c c a t c a g c t c g t t g g c g g g g t a a t g g c c c a c c a a g g c a a c g a c g g g ta g c tg g tc tg a g a g g a c g a t c a g c c a c a c t g g a a c tg a g a c a c g g t c c a g a c tc c t a c g g g a g g c a g c a g t g g g g a a t c t t g c g c a a t g g g c g a a a g c c t g a c g c a g c a a c g c c g c g t g t g t g a t g a a g g t c t t c g g a t c g t a a a g c a c t g t c g c g a g g g a c g a a t a a g g g a c g g g c g a a c a g t c c g t tt c g a tg a c g g t a c c t c g a g a g g a a g c a c c g g c t a a c t c t g t g c c a g c a g c c g c g g t a a t a c a g a g g g t g c a a g c g t t g t t c g g a a t t a t t g g g c g t a a a g c g c g t g t a g g c g g c c t a g c a a g t c g g a t g t g a a a g c c c t c g g c t t a a c c g a g g a a g t g c g t t c g a a a c t a c t g g g c t t g a g t a c c g g a g a g g g t g g c g g a a t t c c c g g t g t a g a g g t g a a a t t c g t a g a t a t c g g g a g g a a c a c c a g t g g c g a a g g c g g c c a c c t g g a c g g a t a c t g a c g c t g a g a c g c g a a a g c g t g g g t a g c a a a c a g g a t t a g a t a c c c t g g t a g t c c a c g c t g t a a a c g a t g a g c g c t a g g t g t t g c g g g t g t t g a c c c c t g c a g t g c c g c a g c t a a c g c a t t a a g c g c t c c g c c t g g g a a g t a c g g c c g c a a g g c t a a a a c t c a a a g g a a t t g a c g g g g g c c c g c a c a a g c g g t g g a g c a t g t g g t t t a a t t c g a c g c a a c g c g c a g a a c c t t a c c t g g t c t t g a c a t c c t c g g a a t c c c t c a g a g a t g a g g g g g t g c c c g c a a g g g a a c c g a g a g a c a g g t g c t g c a t g g c t g t c g t c a g c t c g t g t c g t g a g a t g t t g g g t t a a g t c c c g c a a c g a g c g c a a c c c c t g c c g t t a g t t g c c a t c a t t c a g t t g g g c a c t c t a a c g g g a c t g c c g g c g t c a a g c c g g a g g a a g g t g g g g a t g a c g t c a a g t c c t c a t g g c c t t t a t g a c c a g g g c t a c a c a c g t g c t a c a a t g g c c g g t a c a g a g g g t c g c c a a g t c g c g a g a c g g a g c t a a t c c c a g a a a a c c g g t c t c a g t t c g g a t t g g a g t c t g c a a c t c g a c t c c a t g a a g t c g g a a t c g c t a g t a a t c g c g g a t c a g c a c g c c g c g g t g a a t a c g t t c c c g g g c c t t g t a c a c a c c g c c c g t c a c a c c a t g g g a g t c a g t t g c t c c a g a a g t g g c c g c g c c a a c c c g c a a g g g a g g c a g g tc

IN12 16S rDNA 1319 bp, Paracoccus sp.

TAACGCGTGGGAATGTGCCCTTCTCTACGGAATAGCCCTGGGAAACTGGGAGTAATACCGTATACGCC CTATTGGGGAAAGATTTATCGGAGAAGGATCAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGC CTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACNATGNGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGC GTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAA GAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTAC TGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACCGGAAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAAC TGCCTTTGAAACTATCGGTCTGGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTC GTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAA AGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCG GGCAGCATGCTGTTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGAT TAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC GCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCGCAGGACAGCCCGAGAGATCGGGTCTTCTCGTAAGAGACCTG TGGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCG CAACCCACGTCTTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAAGAAACTGCCGATGATAAGTCGGAG GAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGG TGACAGTGGGTTAATCCCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTT GGAATCGCTAGTAATCGCGGAACAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC GTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGACGGCCGTGCGCCAACCTCGCAAGAGGAGGCAGCGGACCA CGGTAGGCTCAGCGACTGGGGTGAAGT

IN7 I6S rDNA 576 bp, Pseudomonas sp.

TGCAGTCGAGCGGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATAAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAT CTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGT

Phụ lục Tham gia đào tạo sau đại học

Học viên cao học:

Nguyễn Thị Tuyền

Khố cao học 2007 — 2009, Bộ mơn Vi sinh, ĐHKHTN, ĐHQGHN

Tên đề tài: Vi khuẩn sinh tnrởng nhờ ơxy hố Fe(II), khử nitrat Việt nam: tỉnh đa dạng khả ứng dụng.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

Nguyễn Thị Tuyền

VI KHUẨN OXY HÓA Fe(H) VÀ KHỬ NITRATE Ở VIỆT NAM: TÍNH ĐA DẠNG VÀ T lỂM NĂNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC s ĩ KHOA HỌC

Phụ lục Các cơng trình khoa học cơng bố

STT Tên cơng trình cơng bố Tác giả Noi đăng

1 Đa dạng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3 số môi trường sinh thái Việt Nam

Nguyễn Thị Tuyển, Đinh Thuý Hằng

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, VAST

2 Nghiên cứu vi khuẩn ưu tham gia chu trinh Fe điều kiện môi trưởng khác Việt Nam

Nguyễn Thị Tuyển, Nguyễn Minh Giảng, Đinh Th Hằng

Tạp chí Khoa học

Cơng nghệ,

ĐHQGHN Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn oxy hoá

Fe(II), khử N 3' số môi trường sinh thái Việt Nam khả ứng dụng

Nguyền Thị Tuyền, Đinh Thuý Hẳng

Poster tham gia Hội nghị toàn quốc đa dạng sinh thái sinh vật, Hà Nội 10/2009 Trình tự gen 16S rDNA cùa chùng vi

khuẩn Anaeromyxobacter sp IN2

Nguyên Thị Tuyên, Đinh Thuý Hằng

FJ939131, GenBank

5 Trinh tự gen 16S rDNA chủng vi khuẩn Paracoccus sp ĨN1

Nguyễn Thị Tuyền, Đinh Thuý Hằng

Luân vãn t h c * 9 e ĩk h o â học

L Ờ I C Ả M Ơ N

v ề tà i luận văn được thực với hỗ trợ kinh phí từ đ ể t i P ặ c biệt cấp

Đại học Quốc gia Hà Nội, mã s ố (3(3.07.23.

Để có th ể hồn thành luận văn này, trước tiên, muốn bày tổ lỏng biết ơn

õâu ôắc tới Tiến õTĐinh Thúy Hằng, Trưởng phịng 5inh thái */i 5inh vật, Viện Vi ỗítih

v ậ t Công nghệ 5inh học, Đạ\ học Quốc gia Hà Nội dã định hướng nghiên cứu, trực

tiếp hướng dẫn và bảo tậ n tình cho tơi su ố t thời gian nghiến cứu.

Tôi mong muốn dược 0Ởi lời cảm ơn chân thành n h ât tới Ban lãnh ảạo vằ các cán bộ Viện v\ sinh vậ t Công nghệ Sinh học, Đại học Quôc gia Hà Nội ăẵ tạo

diểu kiện thuận lợi vẩ trang thiất bị sở v | t c h ấ t cho tơi Hồn thành nghiên cứu này.

Qua đây, 'Dổi muốn bày tỏ ỉịng biết ơn chân thành tới cấc thầy giáo, cán Khoa Sinh học, Trường Pại Học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội dã giúp đỡ và trang bị kiến thức hừu ích cho tơi trong su ố t thời gian học

tậ p tại trường.

Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn õâu sắ c tới ỳ a đmh, bạn bè thân thiết,

nhữn^ người ỉuỗn cổ vũ, độnq viên vượt CỊU3 khố khăn trình học tập và nghiên cứu.

//à /Vọ/, ngày # tháng ÀA năm S009 Học viên

Nguyễn Thị Tuyển

Phụ lục Các cơng trình khoa bọc cơng bố

STT Tên cơng trìn h công bổ Tác giả Nơi đăng

1 Đa dạng vi khuẩn oxy hoá Fe(ỈI), khử NC>3~ số môi trường sinh thái Việt Nam

Nguyễn Thị Tuyển, Đinh Th Hằng

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, VAST

2 Nghiên cứu vi khuẩn ưu thể tham gia chu trình Fe điều kiện môi trường khác Việt Nam

Nguyễn Thị Tuyền, Nguyễn Minh Giảng, Đinh Thuý Hằng

Tạp chí Khoa học

Cơng nghệ,

ĐHQGHN Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn oxy hoá

Fe(II), khử NO3" sổ môi trường sinh thái Việt Nam khả ứng dụng

Nguyền Thị Tuyền, Đinh Thuý Hằng

Poster tham gia Hội nghị toàn quốc đa dạng sinh thái sinh vật, Hà Nội 10/2009 Trình tự gen I6S rDNA chùng vi

khuẩn Anaeromyxobacter sp IN2

Nguyễn Thị Tuyền, Đinh Thuý Hằng

FJ93913I, GenBank

5 Trình tự gen 16S rDNA chủng vi khuẩn Paracoccus sp ĨN12

Nguyên Thị Tuyên, Đinh Thuý Hằng

VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM• ã ằ ô

VIETNAM ACADEMY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

ISSN 1811-4989

TẠP CHÍ

CƠNG NGHỆ S inh h ọ c

Tọp chí Cõng nghệ Sinh học 7(3): 371-379,2009

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI KHUẨN OXY HÓA Fe(n), KHỬ N 3" TẠI MỘT SĨ MƠI

TRƯỜNG SINH THÁI Ở VIỆT NAM

N g n y ễ n T h ị T u y ề n 1, Đ ỉn h T h ú y H ă n g 1

1 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội

2 Viện Vi sừth vật vò công nghệ sinh học, Đợi học Quôc gừi Hà Nội

TÓMTẲT

V i khuẩn oxy hỏa-Fe(II), khủ NOj_ mẫu bùn thu thập thủy vực nước Qgọt, chân ruộng ngập nước vủng nước lọ ven biển nghiên cứu số lượng tính đa đạng thành phần lồi Kết thí nghiệm MPN (M ost Probable Number) cho ba dạng môi trưởng Qghiên cứu, mẫu bùn chân ruộng ngập nước có sá lượng tể bào vi khuán cao (9,3 ■ 1Ọ3 TB/g), gấp Ịần mẫu bùn thủy vực nước vả Lần so với mẫu bùn ven biển Dựa khác biệt hình thái khuẩn lạc, 12 chủng đơn phân Lập từ mẫu MPN khác Theo kết phân tích ARDRA sử đụng hai enzyme hạn chế H a éĩĩỊ M spl, các chủng náy xếp vào nhóm di truyền khác nhau, chúng tỏ tỉnh đa dạng cao vi khuân ox y hóa Fe(n), khử NO}~ m trường nghiên cửu Phân tích thành phẩn lồi quần thể độ pha loãng tới hạn cùa dãy MPN phương pháp PCR-DGGE 16S iĐ N A cho thây A naerom yxobacter sp có mặt ị cả ba dạng mơi trường sinh thái Kết hợp với nghiên cửu chùng đơn phân lập từ dạng môi trưởng nghiên cứu cho thấy, nhóm Paracoccus Pseudom onas hai nhỏm vi khuẩn chinh thực trinh oxy hóa Fe(U), khử NO}’, lương úng đóng vai trị quan trọng bung môi trườnẹ 30 nước Dgọt chân ruộng ngập nước Giải trình tự 16S rDNA 50 sánh kêt với Qgân hàng dử liệu đôi với ba chủng đại diện là IN2, IN7 IN 12 cho phép xếp chùng tương ứng vào chi vi khuân Anaerom yxobacter,

Pseudomonas Paracoccus Ba chi vi khuẩn kể nhóm chiếm ưu chu trinh chuyển

hỏa sắt ba dạng môi tniờng sinh thái nghiên cửu đây.

T kk ổ a : Anaeromyxobacter, ARDRA, DGGE, khứ NOị~, Paracoccus, Pseudomonas, vi khuẩn o xy hóa Fe(Il), ỉ ó S r D N A

MỞĐẰU

sát lả ừong nhũng kim loại phổ biến trên trái đất Thông thường sắt tồn dạng oxide Fe(UI) ỉt tan oước có màu vàng nâu Trong mơi trường pH bung tính, dạng hịa tan nước (Fe(n)) chi tồn điêu kiện khơng có oxy, ví dụ đáy thủy vực, nơi oxy hòa tan nước bị cảc vị sinh vật hiếu kỉú sủ dụng để phân hủy hợp chât hữu Với hiệu điện the oxy hóa khừ Feỉ+/Feĩ+ pH vào khoảng +200 mV, ion Fe(n) trở thảnh nguồn điện từ cho trinh hỏ hấp kỵ khí, điển hình khử N03“ thành N2 số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Benz et ai, 1998) Q trình oxy hóa Fe(n) NOr diễn sau:

10 Fe2+ + N O f + 24 H20 — 10 Fe(OH) ị +N2 T + 9H2 T

Trong tự nhiên, trinh oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử NƠ3~ chủ yếu diễn ranh giới hiếu khí (có oxy) kỵ khí (khơng có oxy) tronẹ lớp tràm tích đáy thủy vực Oxy hóa Fe(II) ket hợp với

khử N(V đóng vai trị quan trọng môi tnrcmg ô nhiễm với Dồng độ Fe(n) cao (do thiếu oxy) N (V cao (do chất hữu bị phân hủy tạo thành) (Weber et ai., 0 ) C ác loài v i khuẩn v ó ị khả n ăn g tiến hành phản ứng oxy hóa khử nảy lúc thực hai nhiệm vụ, thứ chuyển Fe(H) hỏa tan nước dạng Fe(in) kết tủa, hai loại bò NO}~, chuyển thành dạng N2

Vi khuẩn dùng ion Fe(n) làm nguồn cho điện từ để khử N Ọ r phân lập từ lớp trầm tích ao, hồ nước Bremen, Đức năm 1996 (Straub et ai, Ị996) Một số công trinh nghiên cứu tiếp saụ cho thấy có mặt phổ biển nhóm vi khuân với mật độ cao (1 tế bào/g trầm tích) điêu kiện môi trường khác bao gôm nuớc ngọt, nước lợ nước mặn nhiều vị trí địa lý khác giới (Straub Buchholz, 1998) Các lồi vị khuẩn phổ biển nhóm biết đến loài , thuộc chi C h r o m o b a c te r iu m và K le b s ie lla (Benz et

Nguyễn Th| Tuyên & Đinh Thuý Hầog

khuẩn nảy châu Áu vói điểu kiện sinh thái hồn tồn khác biệt v i n ớc ta T rong n gh iên cứu này, chủng tiến hành tìm hiểu tính đa d ạn g cù a vi khuẩn khứ N 3_ sử dụng Fe(IĨ) n guồn đ iện từ một số m ôi trường sinh thái đại đ iện V iệ t N am

VẶT LỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u Phtnnig pbỉp tha mẫu

M ầu đ ợc thu thập ba m ôi trường sinh thái đại diện khác nhau: m ẫu bùn đảy ao n c Dgọt chăn ruộng ngập nước đ ợc thu ngoại thành H N ộ i, mẫu trâm tích nước lợ thu ven biên V ân Đ ôn

- Quáng Ninh Mầu thu thập ống thúy

rinh nút xo y với tồn thê tích binh đ ê giậm thiêu

sự ảnh hưởng cùa oxy không tới quân thê vi sinh

vật mẫu M âu bảo quàn nhiệt độ ° c cho đến tiến hành thí nghiệm

X ic đ ịn h sổ lư ự n g v ỉ k h u ẩ n o x y h ó a F e (II), k h NO]" b ằ n g p h n g p h p M P N

S ố lượng vi khuấn ox y h óa Fe(II), khử N C V được xác định theo phương pháp M P N (M ost

Propable Num ber), A m erican Public Health

A ssociation, 1969) với tích 10% bùn đáy tram tích mơi trường khống dịch thể chúa

N ạN O ) (5 m M ), FeSƠ4 (1 m M ) làm chất nhận

chất ch o điện tử M ôi trường dịch thể kỵ hồn tồn c ó thành phần khoáng tương ứng với nước (dùng ch o mau tù ao til chân ruộng ngập nước) hoặc nước [ợ (dùng ch o m ẫu lấy từ Vân Đ ồn - Quảng N in h ) chuấn bị theo phương pháp W iddel Bak (1 9 ) m ô tá D ảy pha loàng đư ợc thực đên độ pha loăng 10‘\ mẫu đ ợc ũ tủ ấm lại ° c tuần.

Phân lập vi khuẩn o s y hóa Fe(II), k b N Ọ T băng phương pháp ấng thạch bán lỏng

Ó ng M PN nồng độ pha loảng cao có vi

khuân oxy hóa Fe{II), khử NOj' phát triền sử

dụng làm nguồn phân lập cảc khuẩn lạc đơn V iệc phán lập tiến hành theo phương pháp pha loãng trên dày õng thạch bán lón g (1% ) (W idd el, Bak

1992) với mịi trướng có thành phần tương tụ

mỏi trướng dùng phương pháp M PN Ó ng

thạch bán lóng sau bổ sung nguon vi sinh vật (]0°o) từ ông MPN (nguồn phản lặp) sục khí N; Ú ứ tư the dáo ngược đầu 28°c bóng tơi Khn lạc đơn phát triển ống pha loãng

được tách pippet Pasteur chuyên sang raôi

trường d ịch th ể th ích h ợ p (n c n g ọ t h a y n c lợ).

X c đ ịn h h m lư ợ n g F e ( I I ) v ì N Ọ f tr o n g môi t r n g n u ô i c ấ y

Mầu vi sinh vật oxy hóa Fe(II), khử NCV đưọc nuôi cẩy môi trường ky khỉ dạng dịch thể chúa

F e(II) ( m M ) N O j~ (5 m M ) tron g binh serum đ ậy k in b ăng nút c a o su M ầu d ịch n u ô i cấ y {1 mỉ) đ ợ c thu sau m ỗ i h đ ể x c đ ịnh n ô n g đ ộ Fe(II) vả

N03‘ Nồng độ Fe(II) xác định phương

pháp s o m àu b c só n g S nm , s d ụ n g thuốc thừ

phenanthrolin) (DIN 38406-E1-1, 1983) Nồng độ

N 3‘ đ ợ c xác đ ịn h bàng p h n g pháp so màu b ớc só n g nm , sử d ụ n g th u ôc thử disulfofem ic acid (L ê Đ ứ c, 0 ).

T c h D N A tổ n g số

D N A tổn g s ổ củ a quần th ể v i sinh vật từ M P N đ ợc tách ch iế t th eo p hư ơn g pháp đ o Zhou đ ồng tác g iả (1 9 ) m tà v ó i cải b iến v ề nồng độ đệm p hosphate v n n g đ ộ p rotein ase KL D N A g en o m e cb ủ n g đơn đ ợ c tách th eo phương

pháp Marmur (1961) DNA sau tách chiết

đ ợc hòa tan n c b ảo quản - ° c cho

các thí nghiệm

P h â n tích đ a d n g c ủ a c c c h ủ n g đ n pbirữQg p h p A R D R A

A R D R A (A m p lified R ib o so m a l D N A

R estriction A n a ly se s) p h n g pháp thường sù dụng đ ể n ghiên cứu m ứ c đ ộ đa d ạn g v ề di truyền

cùa vi sinh vặt dựa trẽn phân tích kết xừ lý 16S

rD N A en z y m e hạn ch ế 16S rD N A cùa ch ù ng đ an sau đ u ợ c k hu ếch đại phản ứng PC R Sừ dụng cặp m i F (A G A G T T T G A TCC TG G C TC A G ) 1492R (G G T T A C C TT GTT A C G A C T T ) đ ợ c xử lý b àng hai e n z y m e hạn chế

Ađspl H a e ỉĩ ỉ (F erm entas) Sản phẩm D N A sau xử lý enzyme phân tách bàng điện di gel agarose 2% 100 V thời gian 30 phút

Các ch ù n g vi khuân đ ợc x êp n hóm dựa tiromg đ ôn g p hổ băng đ iện di.

P h â n tk h cấ u tr ú c q u ầ n t h ể b ằ n g phuromg p háp đ iệ n di b iế n tín h ( D G G E )

Đ oạn 16S r D N A vớ i đ ộ dài 5 bp đ ợ c khuếch

đại ĩ0n g Phàn_ửng PCR sừ d ụ n c*p m°' GM5F (CCT ACÕ GGA GGC AGC AG) 907R (CCG

Tạp Công nghệ Sinh học 7(3): 371-379,2009

1 9 ) Đ ể tạo tính ổ n đ ịnh c h o v iệ c phân tách trinh tự D N A g e l đ iện di b iên tính , k ẹp G C gơm 4 bp đ ợ c gắn v o đầu ’ củ a m i G M 5F Đ iệ n di đ ợ c tiến hành g e l p o ly a cr y la m id e 6% v i dải b iến tính u rea/form am id từ đ ến 60% Q uá trinh đ iện di đ u ợ c thự c h iện b ằn g b ộ đ iện di D c o d e ™ S y stem (B io R a d ) n hiệt đ ộ ° c 0 V 3,5 h Sau k hi đ iệu d i, g e l p oly a cry la m id e đ ợ c nhuộm trong dung d ịch etjiidium b rom id e (5 m g /m l)

30 phút, sau rửa nước chụp ảnh duới tia u v

trên m áy G e lD o c (B io R a d ) B ă n g đ iện di đ ợ c căt thôi D N A ữ o n g nư ớc qua đ êm ° c , sau đ ỏ dùng làm khuôn đ ể thực h iện P C R v i cặp m ồi G M 5F,

907R Sản phẩm PCR tinh vả

giải trình tự.

Giải trình tự 16S rDNA

Đ o n 16S rD N A củ a ch ù ng đơn sàn

phẩm PCR từ băng điện biến tính tiến

hành phản ứ n g đ ọ c trình tự v i A B l Prism B ig D y e

Terminator cycle sequencing kit đọc trình tự

m áy tự đ ộn g 0 A van t A p p ied B io sy stem s Trinh tự gen sau đư ợc phân tích so sánh v i trình tự 16S rD N A cùa lồi có liên quan cô n g b ổ D atabase D D B J/E M B L /G en B an k sừ đụng phần m ềm B L A S T Search C ây phân loại đ ợc dựng theo phư ơn g pháp n eigh b ou r-join in g (S aitou , N e i, 1987), trong định d ạn g câ y đ ợ c tiên hành dựa 1000 phép s o sảnh đa ch iề u (F elsen stein , 1985).

K Ế T Q U Ả V À T H Ả O L U Ậ N

X c đ ịn h sổ lư ợ n g v i khuẩn o x y h ó a F e (II), k h

N 3~ tạ i c c m ô i tr n g n g h iê n u

S ổ lư ợ n g vi khuẩn o x y h óa Fe(II), khử N O f trong cá c mẫu bùn đ áy thu thập m ô i trường sinh thái khác xác đinh thõng qua phưcmg

pháp MPN sừ dụng môi trường dịch thê chứa FeS04

làm chất ch o đ iện tử vả N a N O j ỉàra chất nhận đ iện tử cu ố i Thành phẩn k h oán g m ôi trường

tương ứng với điêu kiện nước (đối với mẫu bùn

đ áy ao chân ruộng ngập n c) h o ặ c n ớc lợ (đối vớ i m ẫu bùn ven b iền ) S ự phát triển cùa v i sin h vật

sinh tmờng nhờ oxy hóa Fe(U) ống MPN nhận biết thông qua biến đổi màu sắc môi

trường từ trắng xanh (m àu cù a F e(II)) san g m àu vàng nâu (m àu cù a F e(lII)) (H ìn h la ).

Kết q cùa thí nghiệm MPN (Hình lb) cho thấy sơ lượng vi khuằn oxy hóa Fe(II), khử NOj" cao

trong mẫu bùn chân ru ộn g ngập n c (9 ,3 X o tế

b o /g b ùn ), ca o h n hẳn s o v i m ẫu trầm tích n c

lợ v en b iển (4,3 X 103 tể b o /ẹ trầm tích ) v mẫu bùn

đ áỵ ao nư ớc n g ọ t ( ,5 * 103 tê b o /g b ùn ) M ậ t đ ộ m o i tu n g quan giữ a s ố lư ợ n g v i khuân o x y h óa

Fe(n), khử NO-f với điều kiện môi trường

m ỗ i vù n g sin h thái n h cũ n g đ ã đ ợ c tìm thấy trong m ột s ố n g h iên cử u trước đầy R atering (1 9 ) khi n g h iê n u ch u trình ch u y ên h ỏa săt tron g đật

trồng lúa Italy phát nồng độ ion sắt

ữ o n g m ôi trường n ày ca o vả c c loài th am g ia

chu trinh chuyển hóa sắt đóng vai ưị quan trọng

trong ch u trình ch u yển h ó a vật ch ất B ê n cạn h đ ó , nhiều n gh iên u khác cũ n g c h o th ây số lư ợ n g vi khuần o x y h ó a F e(U ), khử N O ị~ n h iề u v ù n g khác nhau g iớ i d ao đ ộ n g k h oản g từ • 103 đến • 10* tế b o /g m ẫu k h ô (W eb er e i a l., 0 ; R atering, S ch n ell, 0 ; H au ck e t a l., 0 ; Straub

et ai, 1996).

P h â n tích c ấ u trứ c q u ầ n th ể b ằ n g đ iệ n d ỉ b iế n tín h D G G E

Đ ể x ả c đ ịn h c c n h ó m v i khuẩn o x y h ỏ a F e(II),

khử N 03" chiếm ưu thể môi trường nghiên

cứ u , ch ú n g tiến hành p hân tích cấu trúc q u ần thể trong cảc ố n g M P N đ ộ pha lo ã n g 10 _J (là n n g đ ộ gần tới hạn cù a d ãy M P N đ ối v i c m ẫu ) b àn g p h n g pháp P C R -D G G E đ oạn 16S r D N A (H ìn h ) C ác b ăn g đ iện di đ ợ c cắt từ g e l sử d ụ n g làm k hu ôn ch o p hàn ứ n g P C R tiê p sau đ ể x c đ ịn h trình tự so sánh v i c c trinh tự 16S r D N A c ô n g b ố ừ o n g ngân h n g liệ u G en B an k

C ó thê thây răng, c c loài A n a e r o m y x o b a c te r có mặt dạng m ôi trường n g h iê n u Đ â y nh ỏm vi khuẩn nam p hàn lớp Ỗ -P ro te o b a c te ria ,

hiện chi có lồi công bổ A d e h a lo g ẹ n a n s cù n g v i m ộ t số đại d iện ch a định

danh đ ên loài C ác ch ủ n g A n a e r o m y x o b a c te r c ô n g b ố đ ều sinh trường k ỵ khừ Fe(III), c h a có ch ủ n g đ ợ c n gh iên u v ề khả n ă n g sin h trường khử N O f , sử d ụ n g F e(II) làm ch ất ch o đ iện tư (T reud e e t a l., 0 ; Straub, B u c h h o lz -C le v e n , 1998 Straub e t a l., 1996) T ron g m ôi trư ờn g n u ôi cấy sử d ụ n g đ â y (c ũ n ẹ đ iều k iện tự n h iên ), F e(III) đ n g thời ton v i F e(II) d o kết quà ch u y ển h ó a Fe(II) b ăng c o n đ n g hóa h ọ c (ph ản ứ n g v i

lượng nhó oxy mơi tniờng) đưcmg sinh học (do vi sinh vật oxy hóa Fe(II), khừ NO3')

D o vậy, c ỏ m ặt củ a c c lồi sin h trường k ỵ khí

khừ Fe(III) Anaeromỵxobacter điều kiện

Nguyễn Thị Tuyển & Đinh

nhiên) mẩt xích khép kín chu trình chuyến hóa sắt

Nhóm vi khuẩn Pseudomonas chiếm ưu ơong mẫu bùn chân ruộng ngập nước Đây chi th u ộ c p h â n lớ p Ỵ-pro te o b a c te ria , cỏ n h i ề u đ i diện

sinh trưởng ky khứ NƠ3', bạo gồm lồi có sú dụng Fe(II) làm chât cho điện từ (Weber

et ai, 2006; Ratering, Schnell, 2000; Schtad 2000) Đối vởi mẫu bùn ao trâm tích vtafl

bằng phương pháp P C R -D G G E thực Ỉ l

chúng tơi chưa xác định nhóm vi khuỈH hóa Fe(II) khử N 03~ chiếm uru thê Tụy nhiên, « thông tin vẩn đề bổ sung khỉ t] hành nghiên cứu đa dạng chủng đcm phầQ| từ môi trường kể

Hlnh Xác định số lượng vi khuần oxy hóa Fe(ll), khử N03' mơi trường sinh thái khác A Nhận biỉtsựot

mặt vl khuản ống MPN thông qua biến đồi màu sác môi trường từ trẳng xanh (Fe(ll)) sang vàngiéi (Fe(lll)) B Số lượng vi khuản oxy hóa Fe(ll), khừ N03' xác định thông qua phương phảp MPN.

A R B

Pseudomonassp.

Anaeromyxobacter sp.

Hinh Phổ điện di biến tinh (DGGE) phân tích đoạn 16S

rDNA quần thề vi sinh vật ống MPN mảu nghién cửu A Bùn ao nưởc ngọt; R Bún chần ruộng ngâp nước: B Bún trầm tich ven biẻn.

J

Hình Phản lặp vi khuần oxy hóa Fe(ll), khử NOj‘

tại mơi trưóg nghiên cứu A Phân lập chửng (ton

qua phương pháp ống thạch kỵ bán lỏng; B Nuởor

chủng đơn vi khuần oxy hóa Fe{ll), khử NO3' mfli Iwfr’i

d|Ch thẻ điều kiện kỵ hoàn toàn

Tạp chí Cơng nghệ Smh học 7(3): 371-379,2009

Thời gãn (ngày)

2 3

Thời gian (ngày) B

Hlnh Hoạt tinh oxy hốa Fe(ll) (A) vả khử NCV (B) quần thề vi sinh vật ba môi trường nghiên cứu sau làm

giàu bẳng phương pháp MPN Ký hiệu: o Đối chứng không cỏ VSV; ■ Mẫu bùn đáy ao nước ngọt; Mẫu bùn chân mộng

ngập nước; A , Mău trầm tlch nước lợ ven biển.

Mức độ oxy hóa Fe(n) khử NO) vi sinh

vật mSu nghiên cứu

Nồng độ Fe(II) NO}' ừong môi trường nuôi cấy xác định theo thời gian để đánh giá khà sinh tmởng vi sinh vật mẫu làm giàu (Hình 3)

Như vậy, guần thể vi sinh vật làm giàu qua dãy MPN the khả sinh trường với Fe(H) NOị' cao Ở cà mẫu, luợng nitrate môi truờng bị khử gần hồD tồn sau ngày (Hình 3B), nhiên lượng Fe(n) không giảm tương ứng (Hinh 3A) Hiện tượng cỏ thể lý giải

sự c ó m ặt củ a n hóm v i khuẩn A n a e r o m y x o b a c te r

trong mẫu phân tích, làm chuyển hóa Fe(in) thảnh Fe(Et)

P h â n lậ p v ỉ k h u ầ n o x y h ó a F e ( n ) , k h N 3~ t

cic m ẫ u n g h iê n cứu v đ n b g iá tín h đ a d n g c ủ a

cic chủng phân lập

Vi khuẩn oxy hỏa Fe(ÌI), khử N 03" phân lệp theo phương pháp pha lọãng dãy ống thạch bán lỏng (1%) (Widdel, Bak, 1992) (Hình 4a) Các khuẩn 'lạc đơn phân lập dựa khác hỉnh dạng, kích thước khuẳn lạc Mỗi khuẩn lạc đutợc tách riêng ni cấy kỵ khí môi trường dịch thể chửa Fe(II) (10 mM) NO3" (5 mM) ừong bỉnh serum có nút cao su kẹp nhôra (Hinh 4b) 12 khuẩn lạc đom phân lập từ MPN độ pha loãng cao nhât có vi sinh vặt phát triển (Bàng 1)

là đại diện cho vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NOj"

c h iế m đa s ố ba m i tnrịmg n g h iê n u

Tính đa dạng 12 chủng vi khuẩn phân lập phân tích bẳng phương pháp ARDRA, sử

d ụ n g hai e n z y m e bạn c h ế H a e ìữ v M s p l {H ìn h 5).

Kết thu cho thấy, chủng xếp vào nhóm di truyền khác (Bảng 2) Từ kết quà phân nhóm bàng kết hợp với nguồn gốc phân lập 12 chủng (Bàng 1), nhận thấy tính đa dạng di truyền chùng vi khuẩn oxy hóa Fe(H), khử NO3’ phụ thuộc vào địa điểm thu mẫu ban đầu Mầu trầm tích nước lợ ven biến thể mức độ đa dạng truyền cao với chủng phần lập từ mẫu (IN5, IN6, IN7, EN8) thuộc vào nhóm khác (nhóm 2, nhóm 3, nhóm nhóm 5) Tiếp đến mẫu bùn đáy ao nước với chủng (IN9, IN10, IN11, IN12) thuộc vào nhóm

k h c (n h ó m 1, n h ó m v n h ó m ) T h ể h iện

tính đa dạng di truyền thấp lậ mẫu bùn chân ruộng ngập nước với chủng (INI, IN2, IN3, IN4) thuộc vào nhóm khác (nhóra nhóm 2)

Ba chủng IN2, IN7 IN12 đại diện cho

Nguyễn Thị Tuyên & Đinh Tbý

n hỏm A R D R A -4 g m ch ủ n g từ m ôi trường nư ớc lợ ao n c ngọt, ch iế m 25% tổ n g s ố cá c ch ủ ng phân lập đ ợ c C hủ ng EN7 làm thánh m ột n bóm riên g b iẹt (A R D R A -5^ , ch ỉ tìm th m trường nư ớc lợ v e o b iên K êt quà s o sánh trình tự 16S rD N A củ a ch ủ n g n ày v ó i ngân hàng d ữ liệu G enB ank ch o thấy, ch ù n g IN c ó đ ộ tư n g đ n g ca o nhẩt v i A n a e r o m ỵ x o b a c te r d e h a ỉo g e n a n s (99% ), ch ủ n g IN v i P s e u d o m o n a s s tu tz e r i (98% ) ch ủ n g IN 12 vớ i P a r a c o c c u s fe r o o x y d a n t (97% ) (H ình 6).

N h v ậ y , n h óm A R D R A -4 v i ch ù ng EN 12 làm đại diện c c loài P a r a c o c c u s đ ợ c tim thây trong hai dạng m ôi trường n ớc lợ v en b iển ao n ớc P a r a c o c c u s ch i v i khuẩn nầm trong

phân lớp a-proteobacterria, g m c c loài sinh! k ỵ k h í tù y tiện , b hấp b ằ n g nitrate boệcl (S c h a p le ig h , 0 ) K ết h ợ p v i k ết q u i P C R -D G G E c ó th ể th răng, P a r a

P s e u d o m o n a s b ỉ i n h ỏm c hinh o x y hóa L A [Ậ

N 3" c h iế m u th ế ba d ạn g m b u ị o g í n gh iên u , tron g đ ó P a r a c o c c u s c ó vai trị

trọng h o n a o n c n g ọ t v Pseudomonas IL,

Dgập n c Đ i d iện củ a c ả hai n h óm nảy đuợcl thấy m ô i trư ờn g n c lợ v e n b iển , c ó thể ỉà dai h n g củ a n g u n n c n gọt từ đ ấỉ liền.

D ự a k ết q u ả s o sánh trình tự 16S rONA trên, c c ch ủ n g IN , IN v EN12 đ ịn h d M lần lư ợ t A n a e r o m y x o b a c te r sp EN2, P se u d o m ^ Ế sp IN v P a r a c o c c u s sp IN 12.

Béng VI khuản oxy hóa Fe(ll), khử NO3' phân lập từ môi trường nghiên cứu.

Nguồn phin lfp Chủng vi khuần Đặc điẻni hình thái khuân lạc

Chân ruộng lúa ngập nước (ngoại thánh

Há Nội)

IN1 IN2

Hlnti tròn, bè mặt nhẵn, kich thước - mm

Hình ừủn, bề mặt khdng nhến Kich thước 0,25 - 0,5 mm

IN3 Hỉnh tròn, bề mặt xù xì, kích thước 0,25 - 0,5 mm

IN4 Hinh trịn, bề mặt xù xỉ, kích thước - 211)171

Trầm tlch nước lợ

biển (Vãn Đòn, Quảng Ninh)

IN5 IN6 IN7

Hỉnh trịn, bề mặt nhân, kích thưởc 0,25 rrtm

Hlnh bầu đục, bề mặt nhẵn, klch thước 0,25 - 0,5 mm

Hlnh tròn, bè mặt *0 xi, klch thước 0,8 mm

IN8 Hình trịn tía mật độ té bảo ngồi han phla trong, klch thước ■

1,5 mm Đây ao nirớc

(ngoại thành Há Nội) IN9 IN10

Hlnh tròn, bề mặt xù xl, ktch thước 0,5 -1 mm Hlnh trỏn không đèu, klch thước 0,5 -1 mm

IN11 Hinh tròn, bè mặt nhẵn, kfcti thước 0.2 - 0,3 mm

IN12 Hinh đìa lồi hai mặt, kich thước - 2,5 mm

12 Wl^ n oxy Fe(">- NOì sau xử lý cảc * K C fm W

Hàn Ouòc^ ~ ° đơn phâ" lập k mẫu nghién cưu; M; Master tị(Ejẽynfl«

Tạp chi C n g nghệ S in h học 7(3): 371-379, 2009

BAng Tinh đa dạng vè <& truyèn 12 chủng vi khuẩn oxy hỏa Fe(ll), khử NOT đâ phân lập (IN1 - IN12) dựa trén phân tích ARDRA

Nhịm ARDRA

Chùng vi khuẩn Các đoạn DNAtạo sau xử lý 16S rONA enzyme

hạn ché (bp)

H a m MsfA

1 IN1.IN2, IN4 IN11 200.300 300,500

2 IN3, IN8 200,300 500

3 IN5, IN9 200,300 500, 800

4 INS, IN10, IN12 200, 300, 500 300,500

5 BI7 200, 900 500

m

100

100

M 2

-B a c illu s sub tU is (F J 4 )

n -ịUl/M

I-IN2

Anaeromyxobacter sp FAcl2 (AJ504438)

A n a e r o m y x o b a c te r d e h a ìo g e n a n s 2CP1 (N R 7 ) Y Ô-Proteobacteria

- A n a e r o m y x o b a c te r clone (A B 3 )

621 - P a r a c o c c u s m a r im ts ( A B 9 )

I -Pa° a r a c o c c u s fa r o o x y a n í (A Y )

rIN1

100 \-P a c o c c u s sp (A M 9 J )

k- a-P roteob acteria

P s e u d o m o n a s p u tid a (F J217182) P s e u d o m o n a s s tu ize ri (E U 18705)

I N 7

P s e u d o m o n a s a ỉc a h g e n e s X B (G Q 1504 90) ■Pseudom onas m tr o r s d u c e n s P S (F J588866)

>, T'-Proteobacteria

Hỉnh Cây phân loại mề mối Nén quan chủng IN2, IN7, IN12 loảí gằn gũi dựa trẽn trình tự 16S

rONA Cây được dựng theo phương pháp neighbor-joining, đom vị = 0,02 K^c trinh tự nucleotide Các số hiền thị

vi tri phân nhánh lả Kết quỏ phân tích bootstrap 1000 phép so sánh (chì có giá tri 50% binh bày

hlnh) B subtilislà loài vi khuẩn chọn lám outgroup.

K É T L U Ậ N

Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(H), khử N 03 toong mui bùn thu thập thùy vực nước ngọt, chân ruộng ngập nước vùng nước lợ ven biển

được x c đ ịnh Dằm k h o ả n g 103 - 104 T B /g ,

trong mẫu bùn chân ruộng ngập nưóc cỏ số lượng tể bào vi khuẩo cao (9 , • rB/g) Vi khuẩn oxy hóa Fe(ĨI), khử N 03~ nơi trường nghiên cứu có tính đa dạng cao tíười hai chùng đơn phân tập từ mẫu MPN tếp vào nhóm ARDRA khác ữong phân tích ử dụng hai enzyme giới hạn HaeĩU Mspl Phân ích thảnh phàn lồi phương pháp PCR-DGGE

đ i v i 16S r D N A c h o thấy A n a e r o m y x o b a c te r m ộ t n h ữ n g n h ó m c h iế m ưu th ế c ó m ặt ba d n g m i tnrcm g sinJb thái trên, đ ó n g vai trị k h é p k ín ch u trinh ch u y ên h ó a sắt c c m ô i trường n g h iê n u th ô n g qua k n ăng sin h trưởng k ỵ k hí k h Fe(IH ) K ết h ợ p v i k ết quà n g h iê n u cá c ch ủ n g đom phân lập đ ợ c từ cá c d ạn g m ô i trư ờn g

n g h ie n cư u trên c h o th ây P a r ữ c o c c u s và

P s e u d o m o n a s hai n h ó m v i khuẩn ch ín h th ự c h iện

q uá trình o x y h ỏ a Fe<n), k h N O f , tư n g ứ n g đ ó n g

vai trị quan trọn g m ô i trường a o n c n g ọ t v a chân ruộng n g ậ p n c B a ch ù n g đ ại d iện la IN IN v IN 12 c ó trình tự 16S rD N A c ó đ ộ tư n g đ n g

Nguyên Thi Iuyén & Đ i n f d e h a ỉo g e n a n s (9 % ), Pseudomonas s tu tz e r i (9 % )

và Paracoccus ferrooxydant (98%), đặt tên lả Anaeromyxobacter sp IN2,

Pseudomonas sp IN7 và Paracoccus sp IN 12 Hai chùng IN2 EN7 chủng vi khuẩa có tiềm ứng dụng việc xử lý nguồn ũ ước ngầm nhiễm sắt nitrate.

L i c ả m o n : Nghiên c ứ u n y đ ợ c th ự c n h s ự

hỗ trợ kinh phi từ đề tài QG.07.26 Tác già xin trán trọng cám ơn Viện Vi sinh vật Cóng nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điêu kiện quả trinh thực để tài.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

American public health association (1969) Standard methods for the examination of water and waste water including bottom sediments and sludge 604-609.

Benz M, Bnine A, Schiok B (1998) Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria Arch Microbiol 169: 159-165.

DIN 38406-E1-1 (1983) German standard methods for the examination of water, waste water and sludge; cation (group E); determination of iron (El).

Felsenstein J (1985) Confidence limits on phytogenies: an approach using the bootstrap Evolution 39: 783-791. Hauck s, Benz M, Brune A, Schink B (2001) Ferrous ừon oxidation by denitrifying bacleria in profundal sediments of a deep lake (Lake Constance) FEMS Microbiol Ecoi 37; 127-134.

Lê Đức (2004) Một Jố phựcmg pháp phán tích mơi trường Nhà xuât bàn Đại học Quõc gia Hà Nội.

Marmur J (i 961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms J Mol BioI 208-218.

Muyzer G, De Waal EC, Utterlindea AG (1993) Profiling of complex microbial population by denaturing gradient

ge! electrophoresis analysis of polymerase amplified genes coding for 16S rARN.

Microbiol 59: 695-700.

Ratering s (1999) Iron cycle in Italian localization of the redox processes and chi the involved microorganisms PhD

Department of Microbiology, University of (Germany).

Ratering s, Schnell s (2000) Nitrate-depeodeatl oxidation in paddy soil Environ Microbiol Ỉ: I094J Saitou N, Nei M (1987) The neighbor-joining new method for reconstructing phylogenetic tm

BiolEvo! 4:40 -4

Shapleigh JP (2000) The Denitrifying Dworkin M, Falkow s, Rosenberg E, Stackerbrandt E, eds The prokaryotes: t

electronic resource for the microbiological

Springer-Verlag, New York.

Straub KL, Benz M, Scbink B, Widdel F (1996) Ah nitrate-dependent microbial oxidation of fenoui nt

Environ Microbiol 62: 1458-1460.

Straub KL, Buchholz-Cleven BEE (1998) Em and detection of anaerobic ferrous iron-oxiđiàDti reducing bacteria from diverse European sedanofc

Environ Microbiol 64: 4846-4856.

Treude N, Rosencrantz D, Liesack w, ScbndlSI Strain FAcl2, a dissimilatory iron-reducing meata

Anaeromyxobacier subgroup of Myxococcda I Microbiol Ecol 44: 261 -269.

Weber KA, Umitia MM, Churchill PF, Kukbàp Roden EE (2006) Anaerobic redox cycling flf ãí freshwater sediment microorganisms Environ lit*

8: 100-113.

Widdel F, Bak F (1992) Gram-negative mesoph&i

reducing bacteria In BaJows A, TrQper HG, Dual

Harder w, Schleifer KH eds The Prokaryota, Í Springer, Berlin Heidelberg New York: 3 52-3371 Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996) DNA reantf soils of diverse composition Appl Environ hôơdi 316-322.

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(3): 371-379, 2009

STUDY ON DIVERSITY OF ANAEROBIC Fe(II)-OXIDIZING, N O3 -REDUCING

BACTERIA IN SOME ECOLOGICAL ENVIRONMENTS IN VIETNAM

Nguyen Thỉ Toyen1, Dính Thuy Hang2, *

'H a n o i U n iv e r s ity o f S c ie n c e , V N U

2Institute o f Microbiology and Biotechnology, VNJJ

S U M M A R Y

Fe(H)-oxydizing, NOj'-reducmg bacteria in sediment samples collected from freshwater aquifer,

flooded paddy soil and estuarine area were quantified and analysed on species composition The MPN results showed that among the three studied environments, flooded paddy soil had the highest number o f

these bacteria (9.3 • 103g_l), five and two times higher than that of freshwater aquifer and estuarine

sediment, respectively Based on distinguish colony characteristics, 12 strains of Fe{n)-oxidizing, NOj reduing bacteria were isolated from MPN series and were set into five genetically different groups as

proposed by ARDRA analyses with two restricition enzymes H aeU l and M spl, showing relatively high

diversity of this bacterial group in the studied environments Analysing species composition in the communities developed in MPN tubes at the highest dilution via PCR-DGGE of 16S rDNA revealed that Anaerom yxobacter species presented in all three above environments In combination with the culture-

dependent studies, it was revealed that Paracoccus and Pseudom onas were dominant groups playing

important roles in freshwater aquifer and flooded paddy soil, respectively Sequencing of 16S rDNA from three representative strains IN2, IN7 and EN 12 suggested that they are respectively belonged to Anaerom yxobacter, Pseudom onas and Paracoccus genera.

Keywords: Fe(II)-oxidizing, NO3~-reducing bacteria, DGGE, ARDRA, Anaeromyxobacter, Paracoccus,

Pseudomonas, ỈÓSrDNA

chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ X X (2009) 0-0

Nghiên cứu vi khuẩn ưu tham gia chu trình Fe điều kiện m ôi trường khác V iệt Nam

Nguyễn Thị Tuyền1, Nguyễn Minh Giảng2, Đinh Thúy Hằng2-*

'Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hù Nội.334 Nguyễn Trãi, Hà Nội

2 Viện Vi s in h v ậ t Công n g h ệ Sinh h ọ c , Đ i h ọ c Q u ố c g i a H N ộ i, ì 4 Xuân Thúy, Hà N ộ i

Nhận ngày tháng năm

T óm tắt Hai chúng vi khuấn IN2 IN 12 phân lập từ bùn đáy nước ngọt, đại diện ch o hai

nhóm vi khuẩn tham gia chu trinh chuyển hố sảt đây, bao gơm khứ Fe(IIl) băng họp chất hữu oxy hóa Fe(II) bàng nitrate Hai chủng vi khuấn nói trẽn có đặc điêm sinh lý

hoàn toàn khác biệt Chùng IN2 phân lập từ mẫu bùn chân ruộng ngập nư ớc trực

khuẩn, sinh trướng ky khí bảt buộc Fe(III) nitrate, thích hợp với mơi trường có nơng độ

m uối cao hom 1% Chừng I N I phàn lập từ mầu bùn đáy ao nước ngọt vi khuắn kỵ khí tùy

tiện, có tế bào hình oval thích hợp với m trướng có nồng độ m uối từ - 3% C húng IN 12 thề

hiện hoại tính khứ nitrate, oxy hóa Fe(II) cao, có tiềm ứng dụng thực tế việc xừ

lý nguồn nước nhiềm nitơ ion kim loại F e(li) G iải trinh tự 16S rA D N so sánh kết quà

với ngân hàng liệu hai chúng IN2 IN 12 cho phép định đanh chúng tương

ừng tà A n a e r o m y x o b a c te r sp 1N2 (m ã trình tự F J939131) P a c o c c u s sp IN 12 (m ã trinh tự

GU084390).

Từ khóa: A n a e r o m y x o b a c le r , P a co c cu s, V i khuân khứ F e (lll) V i khuẩn khứ nitrate, o x v hóa Fe(II), 16S rADN.

M ỡ đ ầ u

Trong tự nhiên sắt uyên tổ có mặt với hàm lượng đáng kể sau ‘bon, nitơ, phospho lưu huỳnh []] Là >t nguyên tố kim loại, sắt tồn dạng I với điện oxy hoá khử khác nhau, gồm [II) Fe(Ill) Trong hai dạng ké chi có

; ỉl) tồn ỏ' dạng hoà tan nước, tuv

lên có tính ,khừ cao Fe{ll) nhanh chóng

ic giá liên hệ ĐÌ': t84 37547694 •mail: dlliiiimaAnu.cdu.ui

bị oxy hoá thành Fe(IIl) phản ứng hoá học với oxy khơng khí Do ion Fe(II) thường chi tìm thấy điều kiện mơi trường khơng có oxy, ví dụ đáy thuỳ vực hay tầng nước ngầm hay mơi trường có pH thấp

[2,3]-Các vi sinh vật tham gia chu trình sắt gồm

c ó ( i ) vi k h u â n OXV lio Fe(11) oxy n h

Thiobaúllus ferro o x yd a m [I], nitrate

một số loài Chrom obacterium , K leb siella [4] hay bang quang hợp Chìorobium ,

N.T Tuyên nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học T ụ Nhiên Công nghệ XX (2009) 0-0

í lồi Geobacter, Sewanella, aeromyxobacter [6, 7, 8] Trong oxy hoá II) oxy theo đường sinh học chi n mơi trường có pH thấp oxy hố (II) thành Fe(lU) bàng nitrate khừ Fe(III) tnh Fe(U) bàng số hợp chất hữu co i trình diễn điều kiện pH trung tính, ép kín chu trình chuyển hố sẳt [1] liều cơng trình nghiên cứu cho thấy có phả biến hai nhóm vi khuẩn iều điều kiện môi trường khác nhau, bao m cà nước ngọt, nước lợ nước mặn iều vị trí địa lý khác giới [7,

Trong báo chủng tịi trình bày ưng kết nghiên cứu thực hai ủng vi khuẩn đại diện cho nhóm vi khuẩn ,y hố Fe(ll) bang nitrate khứ Fe(lll), rợc phân lập từ mơi trirịng thiếu oxy in đáy nước Việt nam

Nguyên liệu phương pháp

/ N g u n v i s i n h v ậ t

Các chúng vi khuẩn đưcrc phân lập từ thi >hiệm nuôi tich lũy trẽn mẫu bùn tự nhiên Dng mơi trượng kỵ khí sir dụng Fe(ll) Oi" làm chất cho nhận điện tứ tương ửng ] Mau bùn tự nhiên thu thập ò' đáy ao rớc chân ruộng ngập nước ngoại ành Hà Nội

I

? N g h i ê n c ứ u c c đ ặ c đ iè tỉì s i n h l ý

Đặc điếm sinh trướng cùa chủng vi uẩn tien liành nghiên cứu môi rờiig kỵ dịcli thể sử dụng chất cho ận điện tử khác (bao gồm oxy) nồng độ muối khác Sự sinh trương ỉ vi khuẩn điều kiện nuôi cấy khác

nhau đánh giá thông qua thay đổi độ đục môi trường so với đôi chứng không co vi khuẩn

2.3 Nghiên cứu hình thái

Hinh thái cùa chủng vi khuẩn đurợc xác định tế bào pha sinh trường lũy tiến Dịch tế bào ly tâm 10.000 vòng/phút phút, sau sinh khối hịa 200 Ịi! nước muối 0,9% dùng làm tiêu lam kính phù agar Ảnh tế bào chụp duới kinh hiển vi đối pha, độ phòng đại 0 lẩn

2 T c h A D N t ổ n g s ố , n h â n g e n ỉ S r A D N v x c đ ị n h v ị t r í p h â n l o i

ADN tổng số từ chùng vi khuẩn tách chiết theo phương pháp cùa Marmur (196 ]) [1 0] với số thay đổi để tối ưu hóa Gen mà hóa cho I6S rARN (1500 bp) khuếch đại phàn ứng PCR sử dụng cập mồi 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) I492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T) Sản phẩm PCR tinh giải trinh tự với ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing kit đọc trình tự máy tự động 3110 Avant Appied Biosystems Trình tự gen sau phân tích so sánh với trình tự 16S rADN cùa lồi có liên quan công bố Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search Cây phân loại dựng theo phương pháp neighbour- joining [1 1], định dạng tiến hành dựa 0 phép so sánh đa chiều [1 2]

2 Đ n h g i ã h o t t i n h s i n h h ọ c c u a c c c h u n g

17 khuân

N.T Tuyềh nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ tập (2009) sõ trang 3 trate (5 mM) íàm chất nhận điện tử Fe(II)

tặc Mn (II) (10 mM mồi loại) ỉàm chất cho ện tử bình serum đậy kín nút cao Mầu dịch ni cấy (5 ml) thu thập sau ỗi 24 h xác định nồng độ nguồn cho t nhận điện từ môi trường Nồng độ trate xác định phương pháp so àu sử dụng thuốc thử axit desulfofemic [13] ồng độ Fe(ll) xác định bàng phương láp so màu ỡ bước sóng 510 nm, sữ dụng uốc thử phenanthrolin [14], Nồng độ Mn (II) rợc xác định theo phương pháp 'imaidoxime [15]

Vi khuẩn kliử Fe(Iỉl) ni cấy trường kỵ khí dịch thể, chứa Fe(IIi) Ịng phức hợp với citrat (tan nước) làm lất nhận điện từ (15 mM) Na-acetate (10 M) làm chất cho điện từ Sinh trường cùa vi luẩn nhận biết thông qua màu ia mòi trường (màu xanh đậm e(lll)-citrate tạo ra)

Kết thào luận

/ P h â n lậ p v i k h u â n

Hai chủng 1N2 INI2 đưọc phân lập từ í nghiệm làrtí giàu bùn đáy thủy vực nước ;ọt chân ruộng ngập nước qua dãy MPN r dụng môi trường kỵ dịch chứa Fe(l[) NO,- làm chít cho nhận điện tử tirơng Ig Nglìiêtr cíhỊ đa dạng vê đặc điểm di lyền gen I6S pADN phtrong pháp 3GE ARDRA đơi với nhóm vi khn oxy Fe(ll) khữ NOi" hai mơi trường sinh íi kề Việt nam cho thấy chùng IN2 đại ịn cho nhóm vi khn ln có mặt cà ■>i trưịng nghiên cứu chùng

1 chi tim thây bùn đáy thuy vực nước ?t [16] Dựa tinh đại diện đổi với hai 5m vi khuấn tham liia chu trình ln hố sắt mơi trưịng nghiên cửu,

hai chủng lựa chọn đê tìm hiêu sâu đặc tính sinh học khả ứng đụng thực tế

3.J Nghiên cửu đặc điếm sinh lý hai chúng vi khuân 1N2 IN I2

Báng ] Đặc điểm sinh lý cúa hai chúng vi khuẩn IN2 va IN 12

Đặc điểm sinh lý 1N2 IN12

Hô hấp oxy

(sinh trường hiếu khí)

-+ -+

0% - + + +

Sinh trưởng 1% + + + + + +

phụ thuộc độ mặn môi 2%

+ + + + + +

trường 3% + + + + + +

(% NaCl) 4% + + + + +

5% + + + +

Lactate + + + + + +

Chất cho điên từ

Acetate + + + + + +

(khử nitrate) Ethanol + + + + "4" +

Benzoate + + + +

Chấi nhận ov»

1

+ + + + 4* + điện tứ (oxy

hoá lactate)

Fe( III) - + + +

so42~ —

N.T Tiạ/ỈH nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ XX (2009) 0-0

ện từ cịn chủng INI2 khơng có khà iy Cả hai chùng không sinh trường lử so/".

Đối với nguồn điện tử khác phục cho q trình khử nitrate, ngồi Fe(ll) irợc sừ dụng để phân lập nuôi cấy từ ban ầu, lactate, acetate, benzoate ethanol trợc oxy hoá bời hai chùng IN2 [NI2 rong trường hợp benzoate, axit hữu nứa vòng thơm thường khó bị oxy hố íc hợp chất cịn lại, chủng IN 12 thể khà ẫng oxy hoá hom hẳn so với chủng 1N2

Độ mặn yếu tố môi trường uart trọng ảnh hưởng đến sinh lý vi sinh ật tự nhiên, chủng tỏi tiến ành nghiên cứu ảnh hưởng cùa nồng độ muối ong môi trường khả sinh trưòng hai chùng vi khuẩn quan tâm Kết ghiẽn cứu cho thấy chimg IN2 có nhu cẩu tuổi để sinh trưởng, chùng INI2 khơng, 'rong chùng IN 12 sinh trường lôi trường không cần bồ sung NaCI chùng N2 chi phát triển NaCI có mặt nồng độ % trờ lên Tuy nhiên, chủng IN2 lại cỏ khả lăng chịu muối cao hon IN 12, chùng 'hát triển tốt nồng độ muối 5% đỏ 3C độ sinh trưởng IN 12 bị ảnh hường kề nong độ muối cao hom 3% Điều ày phù hợp với đặc điểm phân bố chúng vi kịiuần tự nhiên, cụ thể ]à húng 1N2 đạhdi,ện cho nhóm vi khuẩn m thấy í>h(ềủ /Ịạng mơi trường khác nhau,

ỈO g ô m nước và nƯỚC lợ

lùng IN 12 đại diện cho nhóm chi tim thấy ỏ1 in đáy thuý vực nưóc [16]

2 Nghiên cứu hình thái tế bào g ia i trình

‘ gen Ỉ6S rADN cua hai chưng vi khuân ỈN2 r ỈN ỉ 2

Chúng IN2 gồm nhũng tế bào dạng trực uẩn, kích thước 1x4-5 |im chuyến động tích

cực (hình 1); chủng rN 12 gồm tế bào hinh oval có kích thước 1,5x1.5-2 fim, chuyên động chậm (hình 1)

Giải trình tự gần đủ gen mã hóa cho I6S rARN (1300 bp) hai chủng ĨN2 IN 12 so sánh với ngân hàng dừ liệu GenBank cho phép xếp chủng ỈN2 vảo chi Anaeromỵxobacler (ioài gân gũi nhât A dehalogenans, 99% tương đồng) chùng INI2 vào chi Paracoccus (loài gần gũi p aminovorans, 98% tương đồng).

Anaeromyxobacter chi thuộc phản lớp Ồ-Proteobacteria, biết đếnvới đại diện sinh trưởng kỵ khí bắt buộc oxy hoá hợp chất hữu để khừ Fe(IlI) [8] Trong ngân hảng liệu gen 16S rADN cùa chi này có lồi A dehaỉogenans số chùng chưa định danh đến tên chi Chùng IN2 đưọc bổ sung vào danh sách chi Anaeromyxubacter với tên khoa học Anaeromyxobacter sp IN2 mã trình tụ gen ]6S rADN GenBank FJ939I31 (hình 1C) Trong nghiên cứu này, lần đẩu tiên vi khuân Anaeromyxobơcter mà đại diện [à chùng IN2 thê khả sinh trưởng bang oxy hố Fe([l), khử nitrate, nhiên hình thức sinh trường khơng vượt trội so với sinh trưởng kỵ khí khử Fe(!il)

N.T T ự y và nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ tập (2009) sô'trang

0 02

m

ế ễ v h P * ■

f %• .

; V • ;

Ị * / é ,

ệ ^ *

• * Paracoccus sp IN12

?3Ũ

] 000

1000

-Bãciỉíis subtiìis (FJ544 3SÕ!

- AnơenimvĩữbiKler clone (AB293367)

i Anjenmyrnhjcter dehnii-gi-.'U'S ! EF067314)

1N2

0.02

-Anaeromyxobacter sp FAcl2 (AJ504438)

A dehabgenans 2CP1 (HR027547)

—AnaeromyT&bacter clone (L‘Q394ỹ9ó)

-Bacúkỉs subtiíis (FJ5443S6)

588

—Paracoccus aminophiíus (D32239) r-Parucoccus aminovonans (D3224Ũ)

■Paracoccus sp (AM939Ũ37)

1Ũ0õCị]V)12

-Panacữccus marinus (AB185959)

IParacoccus d em tn fica n s (/J288159) lũũõlParacoccus fcrooxydant (AY954687)

Hinh I Hình thái tế bào vị tri phân loại cùa hai chủng IN2 IN 12 Hình thái tể bào quan sát trẽn kính hiến vi quang học, độ phóng đại 1000 lẩn (đơn vị = Ị.im) Cây phân loại dựng theo phương pháp neighbor-joining, đơn vị = 0,02 Kmii: trinh tự nucleotide Các số hiên thị vị trí phân nhánh kết phân tích bootstrap đơi với 1000 phép so sánh (chi có giá trị trẽn 500 trình bày hình) B subtilis là

loài vi khuẩn chọn làm outgroup.

3.3 N g h iê n ciiru h o t tin h s in h h ọ c v k h n ă n g ứ n g d ụ n g c u a c h u n g v i k h u â n I N 12

Trong nghiên cứu đa dạng vi khuẩn khứ nitrate, oxy hoá Fe(ll) Việt Nam, P a r a c o c c u s sp vói đại diện chủng IN 12 chiếm ưu thé điều kiện nước [16] Chủng vi khuân thẻ sinh trưởng nhiều kiện môi trường khác nhau có mặt hay khơng có mặt oxy, thích nghi với nhiéu loại nguồn điện tứ khác (như Fe(II), axit hữu co, rưọu) sinh trường tốt mơi trường có độ mặn dao động dải 0-3% (đặc trưng cho mỏi trường nước nước lợ) Đây lý

do để tiến hành tìm hiểu ứng dụng chùng vi khuấn việc loại bò nitơ Fe(II) nguồn nước thài õ nhiễm,

6 NT Tuyên nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cõng nghệ XX (2009) 0-0

0

Thời gian (ngây)

Hlnh Loại bò Fe(ll) (•) vả NO," (■) mơi

trường tác động cùa chủng vi khuẩn IN ] 2.

Bên cạnh khà sử dụng Mn(II) làm chất cho diện từ để khử nitrate kiểm tra, nhiên chùng IN 12 không thề sinh trường rỏ rệt điều kiện nuôi cấy Theo số nghiên cứu cơng bố, hoạt tính oxy hoá M 11(11) khử nitrate bàng đường sinh học xác định số quẩn thể vi sinh vật ỏ đáy thuỳ vực, chưa có chủng vi sinh vật đưọc phán lập phịng thí nghiêm với hoạt tính kể tren [! 9, 20].

4 Kết luận

Hai chủng vi khuẩn 1N2 IN 12 đại diện cho hai nhóm tham gia chu trình chuyển hố

sắt số mơi trường sinh thái khác Việt nam, chủng IN2 tham gia khử Fe(ill) thành Fe(ll) bẩng họp chất hữu chùng 1N12 tham gia oxy hoá Fe(ll) thành Fe(lll) nitrate Vai trò sinh thái cua hai chúng khãng định thông qua đặc điềm sinh lý chúng, cụ thể lả nãng sinh trưởng với chất cho nhặn điện tử khác

nhau mức độ sinh trường nồng độ muối khác môi trường

So sánh trinh tự gần đù gen 16S rADN với lồi cơng bố GenBank cho B phép định danh hai chùng vi khuân — Anaeromyxobacter sp IN2 (mã trình tự đăng £ ký GenBank FJ939 ] 31) Paracoccus sp IN 12 (mã trình tự đăng ký GenBank GU084390).

Với hoạt tính cao việc oxy hố Fe(II) và khử nitrate, chùng IN 12 có tiềm ứng dụng thực tế việc xử lý nguồn nước nhiễm nitơ ion kim loại Fe(II).

Lòi cảm ơn

Nghiên cứu thực nhờ hỗ trợ kinh phí từ đề tài ỌG.07.23 Tác già xin chân thành cảm ơn Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, ĐHQGHN tạo điều kiện trình thực đề tải.

Tài liệu tham khảo

[1] H.L Ehrlich, Geomicrobiology 3'J Ed revised

and expanded, Marcel Dekker Inc., New York,

1996.

[2] K.H Nealson and D Saffarini, Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology and regulation, Annu Rev Microbiol 48 (1994) 311.

[3] K O Konhauser, Bacterial iron biomineralisation in nature FEMS Microbiol

Rev 20(1997)315.

[4Ị K.L Straub, M Benz B Schink, F Widdel Anaerobic nitrate-dependent microbial oxidation of ferrous iron Appl Environ

Microbiol 62(1996) 145

N.T Tuyên nnk./ Tạp chi Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ tập (2009) só trang 1

oxydationby anoxygenic phototrophic bacteria,

Nature 362 (1993) 834.

[6] D.R Lovley, Dissimilatory Fe(Ill) and Mn(IV)

reduction, Microbiol Rev 55 (1991) 259. [7] D.R Lovley, Microbial Fe(lll) reduction in

subsurface environments, FEMS Microbiol

Rev 20(1997)305.

[8] N Treude D Rosencrantz, w Liesack s

Schnell Strain FAc12, a dissimilatory iron- reducing member of the Anaeromyxobac/er subgroup of Myxococcales, FEMS Microbiol

Ecol 44 (2003)261.

[9] K.L Straub, B.E.E Buchholz-Cleven, Enumeration and detection of anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments Appl Environ

Microbiol 64 ( 1998) 4846

[10] J Marmur J, A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms J

Mol Biol (1961)208.

[11] N Saitou M Nei The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Mol Biol EraI (1987) 406.

[12] J Felsenstein Confidence limits on phyloeenies: an approach using the bootstrap

Evolution 39 (1985) 783

(1.1] Lê Đức, MỘI so phương pháp phân lich mõi

trường, NXB ĐHỌGHN, 2004.

[14] DIN 38406-E1 - ], German standard methods for the examination of water, waste water and sludge; cation (group E); determination of iron (El )~ 1983.

[15] P.G Brewer, D.w Spencer, American Sociaty of Limnology and Oceanography, Colorimetric determination of manganese in anoxic water, 16 (1971) 107.

[16] Nguyễn Thị Tuyển Đinh Thúy Hằng, Đa dạng vi khn oxy hố Fe(ll), khứ N số mơi trường sinh thái Việt Nam, Tạp chí Cóng

nghệ sinh học, 2009 (sẩp đăng).

[17] J.p Shapleigh, The Denitrifying Prokaryotes In M Dworkin, s Falkow, E Rosenberg, K.H Schleifer, E Stackerbrandt, eds The

prokaryotes', an evolving electronic resource for the microbiological community, Springer-

Verlag, New York, 2000.

[18] G Bitton, Wastewater Microbiology, Wiley- Liss, Inc Toronto, Canada 1999.

ỊI9] A.M Gounot, Microbial oxidation and reduction of manganese: Consequences in groundwater and applications, l-'UMS

Microbiology Review 14 (1994) 339

[20] J Vandenebeele, D De Beer, R Germonpre R Van De Sande, w Verstraete Influence of nitrate on manganese removing microbial

consortia from sand filters Hal Rex l o t 29

(2) (1995) 579.

Study, bacteria o f the iron cycle that dominate in different

t 6: environments in Vietnam

Nguyen Thi Tuyen1, Nguyen Minh Giang2, Dinh Thuy Hang2

1 Department o f Biology,College ofSciences, Vietnam National University Hanoi, Ì34 Nguven Trai Hanoi

■ Institute o f Microbiology andBiatechnnlogv, Vietnam National University Hanoi 144 Xuan thuv Hanoi

A b s t r a c t T w o bacterial strains IN and IN 12 w er e isolated from fresh water sediments and

represented for two major groups of the iron cycle in these environments, including the reduction of Fe(lll) with organic compounds and oxydation o f Fe(II) with nitrate These two strains possessed

8 NT Tuyên nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ XX (2009) 0-0

of rod-shaped cells, grown strictly anaerobicaly with Fe(IH) or nitrate and best growth was observed at the concentration of NaCI in the medium above 1% Strain IN 12 was isolated from sediment of a fresh water aquifer, contained oval cells that were facultatively anaerobic, grown best at the concentration of NaCI in the medium in the range of - 3% Strain [N12 showed a high activity of Fe(ll) oxidation with nitrate, therefore would have application potential in treatment of waters contaminated with nitrogen and metal ion Fe(II) Sequencing of 16S rDNA and comparative alignment with database allowed to designate these strains with the names Anaeromyxobucler sp ]N2 (sequence number FJ939I31) and Paracoccus sp IN 12 (sequence number GU084390).

V IỆ N K H O A HỌC V À CÔNG N G H Ệ VIỆT N A M VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Ban tổ chức Hội nghị Khoa học Tồn quốc Sình thái và Tài ngun sinh vật lần thứ 3

O

Ban tồ chức Hội nghị Khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên sinh vật ỉần thứ nhận poster:

'Đa dạng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate số môi trường sinh thái Việt Nam”

Của tác giả:

Nguyễn Thị Tuyền Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quôc gia Hà Nội Đỉnh Thúy Hằng Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quôc gia Hà Nội

Bài poster tác giả biên tập dự kiến trưng bầy Hội nghị.

Đa dạng vi khuẩn oxy hóa Fe(ll), khử nitrate số môi trường

sinh thái Việt Nam

N g u y ễ n T h i T u y è n V B in h T h u y h t ịn g

'Đ»1 hoc Khoa hoe Tự nínén Đai hoc Quốc gia Hâ NỘI

1 VHn Vi jmh vậl vi C6ng nghệ Sinh hoc Đai hpc Quốc gia Hả NỘI

Mờ đẩu

Trong lự nhiện quâ lónh 0* y hơa F e (ll) ch âi rvhơn diện lừ kđ n tra ie chũ yéu d i ễ n r a r a n h Q1Ớ1 h ié u k h i (Củ O xy) v ú k y k h i (K h ô o g c ó * y ) ( /o n g ựjrọ tr m (ic ti đ é y c i c I h ũ y v c O x y t>òd F e ( H ) Kéi h o p vứ< K h ữ n i ir a te c ó t h í S n g v a i I rớ q u a n t r ọ n g i r o n g mộ< t r n g n h iê m vón n n g đ ộ F e (ll> c a o ( o tfi<éu Qxy) v o ô n g d ỏ m l r a i * c a o (ỜQ crtA l h ữ u c o tx p h â n H úy t a o t h a n ĩ i ) íV V ebe r e i a l 0 } C i c I03J VI k r tu n VỬ1 k h n â n g t i é n h â n h p h n ưr»fl »¥ h o a h h ũ n ã y c o t h é C u n g mơí luc Ih c mén đ irợ c ftai Íìíiiệm vụ (0 crtuyẻo Fe<ll> rtòa la n troog nvrO-c vè d a n g Fe<lll> k é l l ũ a v {a) lo i b ố m i r a l e c rtu y Ể n I h ầ n h d a n g N-Q u â tr in h Dxy f i ổ a F e ( l l ) b a n g n i l r a t e d i ỉ n r a n h u - l a u

to Fe;‘ ♦ NO,- * 24 H?0 - >OFe(OHj, ♦ Nj I *9h;Ị

T r o n g n g r tiê n c ứ u n y c t t u n g tỏ i t i ê n n n h lir o h i i u l i n h d a <J«rig c ù a VI k h u i n k h ứ nrtrale sừ đụny Fe(ll) nguồn diện li/lífc mơi sổ Irưởng Sính Ihâi dai diện V iệ t N a m

Sơ đồ thí nghiệm

c i y m lu (tìu r OềỊ M Bun ỠArt rLi^r>9 ng ập nưcrc

Trim l< * V«A m/O c lơ)

Ũ

ỉk r a n p M o m t u

i MPN(F*tll)iTíO» * A c ru i« i

ũ (1

n w u h o n

* r * n o c C=I 1P h â r l*fi oKmg đ» <Ho 1 PC R D G G £16S fO *tA 1 1MI

ũ

a ũ

1 APQRAì& SiONA C « M r g ttv ^ * 1 binh tự rtA ngưng Ị

1 ũ

Kết Thảo luận

số lượng té bào mẫu ngmèn cửu

N íiin b<ếĩ w c o mai CUJ »1 tmuAn o>r to a FtlM j Iroog

f.*c 6*B thống Qua b>ếr\ dố»

m t u i i c c u a m ò' iro o f'S lư 1'ềTQ

»*nh (Fe>ii Mf>g vang r»Ju iF filii

S ố lưOi*^ «1 «»y K * 4H>1| hfHí n 4i» le u c Oiríi Ihồng Qua P*^IOtìg ph*p MPN Sò n /o n g 1* bâo 0: - 10* n ong đo ►i » /0 (♦ bao I'o ng n»i(* lự rư tn g ■» n ự « >0 '

Nghiên ciru nhóm vi khuản chièm ưu thé bẳng PCR-DGGE

P h ố « *» 01 w *« tinh (D O G ỉ) ( M n K h o # n i(3 rONA eúa q uin Ihề ví tinh vặt Irong cAc ống

MPW cua c *c mếu r ^ iể n c w A - §0 fHrti rtọot R - 8un chén i u V ị n ^ tỉ

<VỨC - Ệun dèm lích v«n b4 o

Ar>*r/vrr\ỵ, o b a tie ' (.vProớôoâ acớfd*j co

ãnil Irorg ci } múi (lựong rvạniío (Ui

Ps»ưđtyn»viís P'0/Í0ti»cle''»>cnié»n u

iné (rong m iu b u " o c ^ ả n ruồng n g jp rx/

Đánh giá tinh đa dạng cùa chùng đơn đâ phân lập bàng ARDRA

0 ^ c**n rụoog T rim K lỉn u O c Son d*> »0 lu* * Ị Ìữ n ir tc w ^ (a^f\ ryỊM

P lú fl Itc h AROflA *n 16S rũN A C M l ỉ cn u n g «1 fchuln o » y HOI Flrtilj trtt/

rvlratc «ỈU t h t ir ly blng CMC eruyme J0 fun ô1 Mtpl 'N1 ãã M I? Kỡ

n>«v « y a 12 pí\an <40 đưo< 'ự e*e mÌM ngr.itn c v v M Mame»

<• »2 ngh<r- ÍV I /M đ o t » v»» r * n rr' di fiv»rè" ►*»ac n n a v '•"»! i -ÍVVỊ o Vư-fệfì e#lu

thvxic *»0 đ • 'f>v n-k- OV' đ*v ni<fi >.v> 'V/OC lơ -,e< 1»^ ln*i da đv>a fi trtjfin

c*0 ''*'4' '-<c ,r^a ti Dun díy 40 <a i*!Ập \a mk bu''efií'> ‘v-yig ''flit

K h n n g ứ n g d ụ n g của c h ủ n g Paracoccus s p IN 12

A B

::::

n u

I ’ • m

Pmữceu* *p I»1J i

Tom *■« |Kf tyi

Hojrt tính oiy hị* khir nHr«4> ỊA) V* hkrrh lh*i 1« Mo cú* chu»9 «12

Kết luận

Ý Ỉ i lượng Ự1 U tuin 0«T F*<llị khư n4rM» Ironfl c t í rn iu bur> IÍH1 IKập ứ m úf w c 'KfOc n g ợ c tiín rng nọ4fr n rx V* «v*fl «wơc <0 v*n b itn đư c a < <íkV> nế*« Vong k hoảng ’ »0* (rong dó m iu txr> thjkl >uộr«g n0l p nuO>c co t ổ l i M o »1 M 'uifl A tr c*0 rvyn CA (9 • lỡ ’ TD'fll

* V tU w in 01) h o t F•<r)> u > j n * |t ô !ã> cc <XềI IrOng n g ti^ n c u c o linh đa d«ng Kh* cỞO 12 chung t o n p N n tư CẬC m lu MPN đươc >(p «40 nhóm ARDSA »ư^*c níMư Iroog p h in (>C«1 tư đung n il 'rxrtT* 9«1 nạn M#*m V* Ut4*

tPnftnlttft fftftrn pftftn loa> bịng c+n/png p n PCH OOGE ứị\ «01 0*n 16 S íONA cho m iy

4#wwom|rjo6*ct« It rré< bong nNfrnj r t w * OìArri ưu lh£ ca rritt d ò h t mối Kư eng 4rf»fi iru i rtn, đỏng VN lí* M*p *k> cfxi lilrft tííụyln hc4 »4t lror>fl cầe mử« irưonọ nghiện cưu (nơoo Qua *h» nấng K t i Irưứrtg k | tư* I f ỳ f Mill] Ké* hop vOi k tt ÍỊ\JÌ ngNt^n c u o í c th u n g đ o n pf»jn lip đ c lư E*c d*>9 m6* fiwO«9 r^i4n Cw tfi0 »M|P Paiicoccưt v» Pitưito^ửAii hat nhom w fchuin chim to re M « q u t líirth 0>r ho* f »{ll| kfx> n tia li lương n g dong v » Iro Quan n g Iroog <nửi (<uorvg ao IW*C ng ôã c*4o luũng ng4p mrc

>6*<fKx>s » a ^ n t è l k ỉ IN? v i IN1?C0 I/»V> tư ọ t n l6 S rO N A c e a i <ưor\g dốnfl c * o v ì eae loai VI

* n » u tw nynữ 4K *t ơ#u»ỈOQtnttrt (W%J P isu O e m e rtts tỉu i ỉở'1 |9 * > VI P »<Ko<tut 60 vẳy đưọc đ * lén h/ơl to A n* ũw rr\yiữ t>»cft *fi \ n ĩ P * iu 9o m o o tt H> >N7 v»

P tr tc ó c c u ta p M U

♦Cn^wni lÉ«*M*g*<Unjềrtajii*fiinến<}ưnQ<lyngnon9 v>*e «v ly c*c rtguổn nv/ừe riỊỊèm «W\4m

»é< «* n rlr«t

X Ỉ N C H Ấ N T H À N H C Ả M Ơ N

N jihu'n lU u n.it tlirữi it<ựk h iê n "t»t> >ư h ỗ «|Ọ I m li I>hi lự .tè 1 n ' *ôã I.IV ớôi 'UI rOiijiiiin.nl V4ằ Vi »11.1 'ÔI V., I ^ I^j.i Milll l»Ov IUM UN Ai I9i>ằ]iộ>i Lifrii <!ô<ã> Im iti iliUv h iộ n 'l è «.n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Đ Ề C Ư Ơ N G

Đ È T À I K H C N T R Ọ N G Đ I Ẻ M / Đ Ặ C B I Ệ T / C Ấ P Đ H Q G H N

Tên đề tài; Đ a dạng sinh học vi khuẩn kỵ khỉ ôxy hỏa sắt (II), khử nitrat trong số môi trường sinh thái khả ứng dụng chúng

Mã số: QG 07 26

Chủ trì đề tài: TS Đinh Thúy Hằng

Cơ quan: Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà nội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐỀ CƯƠNG

ĐỀ TÀI KHCN TRỌNG ĐIỂM/ĐẶC BIỆT/CÁP ĐHQGHN 1 Tên để tài

Tiếng Việt: Đ a d ạn g sinh học v i khuẩn kỵ khỉ ôxy hoá sẳ t (II), khử nitrat trongm ột s ổ

môi trường sinh thái khả ứng dụng chúng.

Tiếng A n h : D iversity o f anaerobic ferro u s iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria in som e

ecological environments and their potential use.

2 Thòi gian thực hiện: 24 tháng (Bắt đầu từ tháng 5/2007 đến tháng 5/2009)

-

(■ -3 Đe tài thuộc lĩnh vự c ưu tiên: Công nghệ sinh học môi trường

4.Đe tài có trùng vói đe tài hoặc đang tỉen hành khơng? Nêu có, nêu lý do

Để tài cỏ liên quan với đề tài Nghiên cứu đăng ký thực từ tháng năm 2006 đến

tháng 12 năm 2007 V ới tiêu đề: “Nghiên cửu m ột s ổ nhỏm v i sinh vậ t tham g ia chu trình

chuyển hố nitơ phospho mơi trường nhiễm khả ứng dụng chúng

trong xử lý ô nhiễm m ôi trường", đề tài nghiên cứu cơ bản đăng ký thực với B ộ Khoa

học Công nghệ tập trung nghiên cứu nhóm vi khuẩn đóng vai trị chủ đạo q trình chuyển hố nitơ phospho ơxy hố ammonium thành NCV, ơxy hố N 2~ thành NOj-, khử N 3" thành N2, tích luỹ phosphat dạng polyphosphat tế bào Trong qui trình xừ lý nước thải giàu chất hữu ammonium tạo nhiều hợp chất hữu cơ, đặc biệt protein bị phân huỷ Khâu cuổi việc loại bỏ hợp chất nitơ nước thải hữu vi khuẩn khử nitrat đảm nhiệm Đây loài vi khuẩn sổng kỵ khỉ hoàn toàn, sử dụng chất hữu nguồn nước ô nhiễm để khử nitrat thành khí nitơ tích luỹ lượng.

5 Chủ trì để tài (K èm theo L ý lịch khoa học theo biểu m ẫu 02/K H C N /Đ H Q G H N )

- H ọ tên: Đinh Thuý H ằ n g Nữ

- Năm sinh: ỉ 970

- Chuyên môn đào tạo: Vi sinh vật

- H ọc hàm, học vị: Tiến s ĩ

- Chức vụ: Nghiên cứu viên

- Đơn vị công tác: Trụng tăm Câng nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nội

- Đ ịa ch ỉ liên hệ: E2, 144 Xuân thuỷ - c ầ u giấy, H nội

- Số điện thoại: 9 Ỉ10402; Fax: 7547407; Email: dthang@vnu.edu.vn

Tóm tắt hoạt động nghiên cứu chủ trì đề tài (Các chương trình, đề tài nghiên cứu

khoa học tham gia, cơng trình cơng bố liên quan tới phương hưởng đề tài) Thời gian Tên để tài/ cơng trình Tư cách tham gia Cấp quản lỷ/noi công bố

1/2006-12/2006

Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong nuôi trồng thuỷ sản '

Chủ tri Cấp Đại học Quốc gia

6/2006-6/2008

Nghiên cứu nhóm vi khuẩn tham gia chu trình nitơ phospho khả ứng dụng chúng xử lý nhiễm mơi trường.

Chủ trì Bộ Khoa học Công nghệ

11/2005-nay

Quĩ gen Vi sinh vật Thành viên tham gia, phụ trách nhóm Prokaryotes

Đê tài độc lập, Bộ khoa học và Cơng nghệ

Tóm tắt hoạt động đào tạo sau đại học chủ trì đề tài năm trở lại đây

Thỏi gian Tên nghiên cửu sinh Tên hoc viên cao hoc • •

6 Cơ quan phối hựp cộng tác viên đề tài (ghi rõ đơn vị cá nhân mời nhặr\ ỉệil mờị ịham gia để tài, nhân tham gia Đe tài phải có bản Lý lịch khoa học biểu, mâu 02/KHCN/ĐHQGHN, ý kiến xác nhận đồng ý tham gia đồng thực ti&ifiiho òếr.

TT Cơ quan phổi^yp* .

' 1 * ' l ? ’ • ' C i - k - i i , ' u b y t A ,

Cộng tác viên

Họ tên Chuyên ngành

2 Trung tâm CNSH Nguyễn Thị Vân Công nghệ sinh học

3 Trung tâm CNSH Nguyên Thị Kim Quy Vi sinh vật học

7 T h u yết m inh cần thiết hình thành d ự án

- Tổng quan c c n g trình nghiên cửu tron g nước liên quan tớ i vấn đề

nghiên u của đ ề tà i (trích dẫn tài liệu nhẩt nước)

Sắt kim loại phổ biến ưên trái đất Thông thường sắt tồn dạng ơxit sát (III) tan nước có màu vàng Trong mơi trường pH trung tính, dạng hồ tan nước (Fe2+) tồn điều kiện khơng có ơxy, ví dụ đáy thuỷ vực, nơi ôxy hoà tan nước bị vi sinh vật hiếu khí sử dụng để phân huỷ cốc hợp chất hữu Với hiệu điện ơxy hố khử Fe3+/Fe2+ pH vào khoảng +200 mV, iông sắt (II) cỏ thể trở thành nguồn điện tử cho q trình hơ hẩp kỵ khí, điển hình là khử nitrat thành N2 số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Benz cộng sự, 1998) Phản ứng ơxy hố khử vi khuẩn thực sau:

10 Fe2+ + 2 NCV + 24 H2 -► 1 0 Fe(OH)3ị + N2t+ H2Í

Trong tự nhiên, q trình ơxy hố (II) với chất nhận điện tử nitrat chủ yếu diễn ranh gịới iiiếu khí (có ơxy) kỵ khí (khơng có ơxy) lớp trầm tích đáy các thuỷ vực ơxy hố sắt (II) kết hợp với khử nitrat đóng vai trị quan trọng môi trường ô nhiễm với nồng độ Fe2+ cao (do thiếu ôxy) NO3' cao (đo chất hữu bị phân huỷ tạo thành) (Weber cộng sự, 2006) Các loài vi khuẩn với khả tiến hành phản ứng ơxy hoả khử lúc thực hai nhiệm vụ, thứ chuyển Fe2+ hoà tan nước dạng Fe3+ kết tủa, hai loại bỏ NO3 , chuyển thành dạng N2 không độc hại.

Vi khuẩn dùng iông sắt (II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrat phân lập đầu tiên tị lớp trầm tích ao, hồ nước Bremen, CHLB Đức năm 1996 (Straub cộng 1996) Một sổ cơng trình nghiên cứu tiếp sau cho thây có mật phổ biên của nhóm vi khuẩn với mật độ cao (1 6 tế bào/g trầm tích) điêu kiện môi trường khác nhau, bao gồm nước ngọt, nước lợ nước mặn nhiều vị trí địa lý khác giới (Straub cộng sự, 1998) Các loài vi khuẩn phổ biến trong nhóm biết đến loài thuộc chi Chromobacterium và Klebsiella (Benz cộng sự, 1998; Weber cộng sự, 2006).

của Cftung việc phát triên chế phẩm sinh học để xử lý nguồn thải đồng thời nhiễm kim loại nặng chất hữu cơ.

- L ý ch ọn đ ề tà i

Tỉnh th i s ự củ a đ ề tà i

Phân huỷ sinh học biện pháp giải ô nhiễm hữu hiệu kiểm chứng nhiều nơi giới Yếu tổ quan trọng hảng đầu định thành công của biện pháp nàỵ thuộc vê vi sinh vật có khả phân huỷ đặc biệt Để cỏ thể cho ra đời sản phẩm sinh học làm môi trường, trước tiên nhà khoa học phải hiểu rõ chưc nâng va chc hoạt động nhiêu nhóm vi sinh vật khác nhau, phân bô chúng môi trường ô nhiễm khơng nhiễm Mặc dù đỏng vai trị khơng nhỏ chu trình chuyển hố vật chất ngồi tự nhiên lồi vi khuẩn có khả đùng Fe2+ để khử nitrat chưa đề cập đến nghiên cửu vi sinh vật, sinh-địa-hố hay mơi trường Việt nam Bên cạnh đó, nghiên cứu cơng bố giới đưa kết khảo sát nhóm vi khuẩn châu Âu với điều kiện sinh thái hoàn toàn khác biệt với nuởc ta Do vậy, đề tài đặt đề cập đến vấn đề chưa nghiên cửu Việt nam mà nhàm đem lại hiểu biết thêm vi khuẩn ơxy hố Fe2+ để khừ nitrat cho khoa học nói chung.

Tinh cấp th iết đáp ứng nhu cầu p h t triển kinh tế - xã h ội

Mục tiêu thứ hai đề tài tìm hiểu khả ứng dụng lồi vi khuẩn ơxy hố Fe2+ để khử nitrat phân lập từ môi trường khác Việt nam Thông qua phản ứng ơxy hố Fe2+ thành Fe3+ khử N0 ~ thành N2, lồi vi khuẩn có khả nãng loại bỏ NO3- Fe2+ cỏ mơi trường nhiễm Hơn nữa, lồi vi khuẩn phân lập dùng để nghiên cứu thêm khả nãng loại bỏ số kim loại khác theo cơ chế tương tự đổi với sắt, ví dụ chuyển Mn2+ tan nước thành Mn4+ kết tùa.

8 Địa bàn tiến hành nghiên cứu (xã, huyện, tỉnh, vùng) Hiểu biết thực tễ tác giả địa bàn nghiên cứu:

Mẩu để nghiên cứu đa dạng phân lập vi khuẩn ôxy hoả Fe2+/khử N 3” lấy môi trường nước nước lợ Mầu môi trưởng nước trầm tích đáy hồ địa bàn Hà nội chân ruộng lúa ngập nước vùng ngoại thành quanh Hà nội; mẫu mơi trường nước lợ mẫu trầm tích ven biển vịnh Hạ long.

Tinh đại diện địa bàn nghiên cửu:

theo tiêu chí mà để tài đặt ra. 9 Mục tiêu đề tài

- Nghiên cửu vả so sánh đa dạng sinh học vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khử N 03' sổ môi trưởng sinh thái khác nhau.

Phan lạp cac nhom VI khuan đại diện, chiêm đa sô loại môi trường sinh thái nghiên cửu đặc điểm phân loại, sinh lý, sinh hoá chúng.

- Nghiên cửu khả ứng đụng chủng vi khuẩn phân lập vào việc kết hợp loại bỏ Fe2+, Mn2+, NO3" mơi trường nhiễm.

10 T óm tắ t nội dung nghiên cứu đề tài

- Mầu trầm tích đáy hồ, mẫu đất ruộng lúa ngập nước mẫu trầm tích ven biển được lấy theo yêu cầu đảm bảo kỵ khí (tránh tiếp xúc với ơxy), đưa phịng thí nghiệm và giữ °c tiến hành phân tích vi sinh vật.

- Số lượng vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khử NO3' dược xác định theo phương pháp MPN (Most Propable Number) môi trường địch thể chứa Fe2+ làm nguồn điện tử NO3- là chất nhận điện tử điều kiện kỵ khí hồn tồn Thành phẩn khống cùa mơi trường dảm bào tương ứng với môi trường sinh thái địa điểm lấy mẫu.

- Đa dạng thành phần loài mẫu khác xác định thông qua phương pháp sinh học phân tử, tách ADN tổng sổ trực tiếp từ lơ thí nghiệm nồng độ pha lỗne khác dãy MPN phân tích tính đa dạng cùa đoạn gen 16S rARN của tập đoàn vi sinh vật thu lô bàng phương pháp PCR/DGGE.

- Các chủng vi khuẩn ơxy hố Fe27khử N 3~ dại diện, chiếm đa số địa điểm lẩy mẫu phân lập từ ống pha lỗng cao có vi sinh vật phát triển dãy MPN bằng phương pháp ống thạch bán lỏng.

- Các chủng vilchuẩn phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hố phân loại dựa trình tự 16S rADN Kết nghiên cứu làm sở để tuyển chọn các chủng có hoạt tính sinh học (khả chuyển hóa Fe2+ N 3“ ) cao nghiên cứu khả ứng dụng chúng vào việc kết hợp loại bỏ Fe2+, Mn2+, N 3“ môi trường ô nhiễm.

11 Các chuyên đề nghiên cứu dự kiến đề tài (ỉẽn nội dung cùa chuyên đề) 1 Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn ôxy hố Fe2+/ khử N 3" sổ mơi trường

sinh thải khác nhau.

trong lỉnh vực môi

mvc tiêu nghiên cứu 3 Tim hiểu khả ứng dụng chủng vi khuẩrTphanlạịrđ—

trưởng Ọc

12 Câu trúc dự kiến báo cáo kêt đê tài (chi tiế th ^ lả ^ k ^

— -1. T q u a n tà i liệu: về vi khuẩn ơxy hố Fe2+/ khử NCV đưa ra^ mục)

2 Vật liệ u p h n g p h p d ù n g tro n g nghiên cửu:

- Kỹ thuật lấy mẫu kỵ khí bảo quản mẫu.Kỹ thuật lây mâu kỵ khí bảo quản mẫu.

Các phương pháp vi sinh vật: phân lập ni cấy vi khuẩn kỵ khí định lượn • kh ẩ băng phượng pháp MPN, nghiên cửu đặc tính sinh lý cùa v s v (điều kiện s h trườn

tAi tm ntiA /"*<■* oViát tkí/ili °

mã hóa 16S rARN.

- Các phương pháp phân tích hố học: phân tích số yếu tố sinh địa hóa mơi trường, đo nồng độ Fe2+/Fe3+ NO3- thí nghiệm với vi sinh vật

3 K ế t qu ả thảo luận:

- Xác định số lượng vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khừ N 3~ thơng qua phương pháp MPN

- So sánh đa dạng nhỏm vi khẩn địa điểm lấy mẫu khác thông qua phương pháp PCR/DGGE đoạn gen 16S rARN.

- Phân lập chủng vi khuẩn đại điện.

- Phân loại chủng vi khuẩn phân lập được.

- Đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng vi khuẩn phân lập được. - Khả ứng đụng cùa chủng vi khuẩn phân lập được.

4 Kết luận, s Kiến nghị

6 Tài liệ u th a m khảo.

13 Tính đa ngành liên quan đê tài

Với nội dung đề trên, đề tài sử dụng chủ yếu kiến thức vi sinh vật học, sinh học phân tử vả công nghệ môi trường.

14 Phương pháp luận phương pháp khoa học sử dụng đe tài

Các vấn đề đặt khuôn khổ đê tài giải quyêt thông qua phương pháp vi sinh vật học truyền thống kết hợp với phương pháp sinh học phân tử tiên tiến

Đề tài thực điều kiện trang thiết bị sờ vật chất cỏ Trung tâm Cồng nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà nội, đặc biệt trang thiết bị phòng Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật.

16 Khà hợp tác quoc te

- Đề tải cô trợ giúp cổ vấn khoa học từ viện Max Planck Vi sinh vật biển Bremen CHLB Đức Viện Kỹ thuật & kiểm tra chất lượng Quốc gia (NITE) Nhật bản.

17 C ác h o t động nghiên cứu đe tài

- Nghiên cứu lý thuyết: tổng quan tài liệu vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khử N 3'

- Điêu tra khảo sát: xác định sô lượng đa dạng vê thành phần lồi vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khử N 3“ mơi trường sinh thái khác nhau.

- Viết báo cáo khoa học: đưa tranh tổng quát phân bổ vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khử NO3” tự nhiên vai trị chúng chu trình chuyển hoá vật chất

- Nghiên cứu khả ứng đụng chủng vi khuẩn phân lập từ đề tài vào việc loại bỏ Fe2+, NO3- Mn2+ môi trường ô nhiễm

18 Kết dự kiến

18.ĩ K ê t qu ả k h o a học

- Có khả bổ sung loài vi khuẩn cho khoa học Việt nam giới - Dự kiến công bổ kểt nghiên cứu thu từ đề tài báo khoa học 18.2 Kết ứng dụng

- Các kết điều tra đánh giá thu từ đề tài làm sở khoa học cho việc phát triển sinh phẩm làm ô nhiễm môi trường.

- Các chủng vi khuẩn thu ừong đề tài nhiều khả nguồn nguyên liệu để phát triển sinh phẩm.

18.3 Kết đào tạo

- Số cử nhân đào tạo khuôn khổ đề tài: 0 - Số thạc sĩ đào tạo khuôn khổ đề tài: 0 18.4 Kết tăng cường tiềm lực cho đơn vị

- Thông qua đề tài cán tham gia có hội củng kỹ làm việc với nhỏm vi sinh vật kỵ khí tiếp cận với phương pháp sinh học phân tử tiên tiến dùng nghiên cứu đa dạng, sinh thái phân loại vi sinh vật.

19 Nội dung tiến độ thực cùa đề tài (các công việc cân triêrì khai, thời hạn thực hiện sản phẩm đạt được)

TT Hoạt động nghiên cứu Thời gian thực hiện Sản phẩm khoa học Từ thảng Đến tháng

1 Thu thập viét tổng quan tài liệu 1/2007

3/2007 Tông quan tài liệu

2 Xây dựng để cương nghiên cứu chi tiết 2/207

3/2007 Đê cương KH

Chuyên đê 1: Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn ơxy hố Fe2+/ khử N O f một số môi trường sinh thái khác nhau. Chuyên để 2: Phân lập, phân loại nghiên cửu đặc điểm sinh lý sinh hoả các chủng vi khuẩn ơxy hố Fe2+/ khử NOj" từ số môi trường sinh thái khác nhau Việt nam.

Chuyên đề 3: Tìm hiểu khả ứng dụng chủng vi khuẩn 'phân lập được lĩnh vực môi trường.

3 Lây mâu, đặt thí nghiệm, xử lý kêt quả 3/2007 9/2008 Chuyên đê 1: Nghiên cứu đa dạng

vi khuẩn ơxy hố Fe2+/ khử N 3~ một sổ môi trường sinh thái khác nhau.

4/2007 10/2007 Báo cáo chuyên đề, viết 1 báo khoa học Chuyên đề 2: Phân lập, phân loại

nghiên cứtr-đặc điểm sinh lý sinh hố các chủng vi khuẩn ơxy hố Fe2+/ khử N 3' từ sổ môi trường sinh thái khác nhau Việt nam.

10/2007 4/2008 Báo cáo chuyên đề, viết 1 báo khoa học

C h u y ê n đề 3: Tìm hiểu khả ứng dụng chủng vi khuân phân lập được lĩnh vực môi trường.

4/2008 8/2008

Xừ ]ý kêt quả 8/2008 9/2008

4 Viết báo cáo chuyên đê 8/2008 9/2008 Hoàn chinh

báo cáo chuyên đề

5 Bổ sung số liệu/thử nghiệm/ứng dụng 9/2008 11/2008

Tống kết số liệu 11/2008 12/2008

6 Viêt báo cáo tông hợp 11/2008 12/2008

Hội thảo lân ci Hồn thiện báo cáo

7 Nộp sản phẩm 11/2008 12/2008

8 Nghiệm thu để tài 1/2009

20 Phân bo kỉnh phí (Tưỳ theo đặc điêm chun mơn đề tài, mục/tiểu mục trong bảng có thay đổi cho phù hợp)

TT Nội dung Kinh phí

Năm thử 1 Năm thử 2

1 Điểu tra khảo sát, thí nghiệm, thu thập số liệu 12 000 000 12 000 000 Th khốn cơng lao động nước 0 0 0 0 0 0 2 Thuê, mua săm trang thiêt bị, nguyên vật liệu 14 500 000 14 500 000

Mua vật tư, hố chât dùng cho chun mơn 14 500 000 14 500 000

3 Chi khác 3 500 000 3 500 000

Mua văn phòng phâm 500 000

In ân, photocopy 500 000

Q uản lý phí 000 000 000 000

4 T ông kinh phí 30 000 000 30 000 000

21 Tài liệu tham khảo để viết đề cương - Tài liệu tiếng Việt

1 Báo cáo khoa học Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, Hà nội 1999 Nhà xuât bản Khoa học Kỹ thuật.

2 Bộ khoa học công nghệ môi trường Tuyển tập báo cáo khoa học hội nghị môi trường toàn quốc, năm 1998 Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật.

- Tài liệu tiến g A n h

1 K L Straub M Benz, B Schink, F Widdel Anaerobic, nitrate-dependent m icro b ial oxidation o f ferrous iron A p p lied a n d E nvironm ental M icrobiology (1996) 62: 1458-1460.

2 M Benz A Brune, B Schink Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at neutral p H by chem oheterotrophic nitrate-reducing bacteria Archives o f

3 K.L Straub and B.E.E Buchholz-Cleven Enumeration and detection of anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments Applied and Environmental M icrobiology (1998) 64: 4846 - 4856.

4 J.M Senko, T.A Dewers and L.R Krumholz Effect of oxidation rate and Fe(II) state on microbial nitrate-dependent Fe(III) mineral formation A p p lied Environmental Microbiololy (2005), 71: 7172-7177.

5 K A Weber, J Pollock, K.A Cole, S.M O’Connor, L.A Achenbach and J.D Coates Anaerobic nitrate-dependent iron (II) bio-oxidation by a novel lithoautotrophic betaproteobacterium, strain 2002 Applied and Environmental Microbiology (2006), 72: 686-694.

6 K.A Weber, M.M Urrutia, P.F Churchill, R.K Kukkadapu and E E Roden Anaerobic redox cycling of iron by freshwater sediment Microorganisms Environmental Microbiology (2006), 8: ỈOO-Ỉ13.

7 K Zengler, 2000 Anaerobic, nitrate-dependent utilization of hydrocarbons by marine members of the alpha and, gamma subclass of Proteobacterỉa Luận vãn Tiến sỹ, Đại học Bremen, CHLB Đức.

Ngày 26 thảng 01 năm 2007 CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

Đinh Thuý Hằng

Ngày 'ỉ tháng năm 2007

THÙ TRƯỞNG ĐƠN VỊ

L U

-Số-stfâl /KHCN

CỘNG HÒA XẢ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT n a m' Độc lập - Tự - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày ũẫ tháng ” nâm 2007 QUYẾT ĐỊNH CỬA GIÁM Đ ố c ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Về vỉệc phê duyệt danh mục đé tài đăc biệt cấp ĐHQGHN năm 2007 củá Trung tầm Công nghệ Sinh học

GIÁM ĐỐC ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Căn Nghị định số 07/2001/NĐ-CP ngày 1 tháng năm 2001 Chính phù Đại học Quốc gia;

Căn Quyết định số 14/2001/QĐ-TTg ngày 12 tháng năm 2001 Thủ tướng Chính phủ về việc tổ chức lại Đại học Quốc gia Hà Nội;

Căn vào Quy chế Tổ chức Hoạt động Đại học Quốc gia ban hành theo Quyết định số 16/2001/QĐ-TTg ngày 12 tháng năm 2001 Thủ tướng Chính phủ;

Căn Hướng đẫn số 973/KHCN ngày 19/3/2007 Giám đốc ĐHQGHN “Quản lý các đề tài khoa học công nghệ ĐHQGHN";

Theo đề nghị Hội đồng ngành/liên ngành Ông Trường Ban Khoa học - Công nghệ, ĐHQGHN.

Điều ỉ : Phê duyệt danh sách đề tài đặc biêt cấp ĐHQGHN nẫm 2007 Trung tâm Công nghệ Sinh học (Phụ lục kèm theo)

Điều : Kinh phí đề tài đặc biệt nói chuyển vào tài khoản Trung tâm Công nghệ Sinh học

Điều 3: Giám đốc Trung tâm Cơng nghệ Sinh học có trách nhiệm:

- Lập hội thẩm định để cương đề tài có mức kinh phí 100 triệu đồng. - Ký hợp với chủ nhiệm đề tài sau có đề cương chi tiết ĐHQGHN phê duyệt. - Cấp kinh phí cho chủ nhiệm đề tài theo Quyết định này.

- Theo dõi quản lý việc triển khai thực đề tài; Đánh giá tiến độ chất lượng triển khai đề tài sau 1 năm thực hiện.

- Báo cáo lãnh đạo ĐHQGHN đề xuất kiến nghị cho phép đề tài tiếp tục đình việc nghiên cứu tiếp tục năm 2008.

Điểu : Ông Chánh Vãn phịng, ơng Trưởng Ban Khoa học - Cơng nghệ, Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học chủ nhiệm đề tài có trách nhiệm thi hành định này.

QUYẾT ĐỊNH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

* * * Độc lập - Tự — Hanh phúc

Đơn vị: Trung tâm Công nghệ Sinh học = = = = = = = = =

Số: /HĐ-KHCN

HỢP ĐỒNG THỰC HIỆN ĐẺ TÀI KHCN CỦA ĐHQGHN

(DÀNH CHO CÁC ĐÊ TÀI ĐẶC BIỆT, CẤP ĐHQGHN, NCCB, CÁP c SỞ)

• Căn cư quyet đinh so 1562/KHCN ngày 02 tháng 05 năiĩỉ 2007 củâ Giám đốc Đậi học Quốc gia Hà nội việc thành lập đề tài bổ nhiệm chủ nhiệm đề tài NCKH cấp ĐHQGHN

- Căn cư vào dê cương nghiên cứu đê tài mã số QG.07.26 số kinh phí phê duyệt

Chúng gồm:

Bên giao (Bên A, đơn vị chủ ữì): Trung tâm Cơng nghệ Sinh học - ĐHQGHN

Đại diện: TS Dương Văn Hợp

Chức vụ: Giám đốc

Bên n h ận (Bên B, chủ trì đề tài): TS Đinh Thúy Hằng

Đom vị công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

Điện thoại: +4 911 04 02

Là chủ nhiệm để tài NCKH ĐHQGHN, mã số QG.07.26

Hai bên thỏa thuận sau:

Điều I : Bên B chịu ưách nhiệm tổ chức triển khai nội dung nghiên cứu ừong năm 2007 - 2009 cụ thể đây:

- Nghiên cứu đa dạng cùa vi khuẩn ồxy hỏa Fe2+/khừ N O ' ữong số môi trường sinh thái khác Việt nam

- Phân lập, phân loại nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa chùng vi khuẩn ơxy hóa Fe2+/khử N o r đại diện

- Tìm hiểu khả ứng dụng chủng vi khuẩn phân lập lĩnh vực môi trường

Điều 2: Bên B nộp cho bên A sản phẩm khoa học theo nội dung tiến độ thực cùa đề tài theo đợt: đợt trước ngày 01/06/2008 đựt trước ngày 01/06/2009

Đợt 1: Báo cáo tiến độ

Đợt 2: Báo cáo nghiệm thu vả sản phẩm cùa đề tài (theo đề cương)

Điều 3: Kinh phí cùa đề tài:

— l±J —

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT n a m' Độc lập - Tự - Hanh phúc

S Ố ^ a / K H C N

Hà Nội, ngấyŨẴ tháng 5* năm 2007

QUYẾT ĐỊNH CỦA GIÁM Đốc ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

v ể việc phê duyệt danh mục để tài đặc biệt cấp ĐHQGHN năm 2007 củá Trung tám Công nghệ Sinh học

GIẮM ĐỐC ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Căn Nghị định số 07/2001/NĐ-CP ngày tháng năm 2001 Chính phù Đại học Quốc gia;

Căn Quyết định số 14/2001/QĐ-TTg ngày 12 tháng năm 2001 Thủ tướng Chính phủ vé việc tổ chức lại Đại học Quốc gia Hà Nội;

Cản vào Quy ch ế Tổ chức Hoạt động Đại học Quốc gia ban hành theo Quyết định số 16/2001/QĐ-TTg ngày 12 tháng năm 2001 Thủ tướng Chinh phủ;

Căn Hướng dẫn số 973/KHCN ngày 19/3/2007 Giám đốc ĐHQGHN “Quản lý các để tài khoa học công nghệ ĐHQGHN” ;

Theo để nghị Hội ngành/liên ngành n g Trường Ban Khoa học - Công nghệ, ĐHQGHN

Điều : Phê duyệt danh sách đề tài đặc biệt cấp ĐHQGHN năm 2007 cùa Trung tâm Công nghệ Sinh học (Phụ lục kèm theo).

Điều 2: Kinh phí đề tài đặc biệt nói chuyển vào tài khoản Trung tâm Công nghộ Sinh học.

Điểu : Giám đốc Trung tâm Cồng nghệ Sinh học có trách nhiộm:

- Lập hội đồng thẩm định đề cương đề tài có mức kinh phí 100 triệu đổng. - Ký hợp đồng với chủ nhiệm đề tài sau có đề cương chi tiết ĐHQGHN phê duyệt. - Cấp kinh phí cho chủ nhiệm đề tài theo Quyết định này.

- Theo dõi quản lý viêc triển khai thực hiên đề tài; Đánh giá tiến độ chất lượng triển khai đề tài sau 1 năm thực hiện.

- Báo cáo ỉãnh đạo ĐHQGHN đề xuất kiến nghị cho phép đề tài tiếp tục đình chi việc nghiên cứu tiếp tục năm 2008.

Điêu : Ơng Chánh Vãn phịng, ơng Trưởng Ban Khoa học - Công nghệ, Giám đốc Trung tâm Công nghê Sinh học chủ nhiộm đề tài có trách nhiệm thi hành định này.

QUYẾT ĐỊNH

Đại học Q uốc gia Hà Xôi

DANH SÁCH ĐỀ TÀI ĐẶC BIỆT ĐUỢC PHÊ DƯYỆT NĂM 2007 (Kèm theo định số 4S6& /KHCN ngày QÍL tháng 5"năm 2007)

Đơn vị kinh phí: triệu đồn

TT Mã sơTTẻn đề tài/Chủ trì Tổng

kinh phí

Kinhp 2007

1 QG.07.23

Đa dạng sinh học vi khuẩn kỵ khí oxy hố sắt 2, khử nitrat môi tnrờng sinh thái khác khả ứng dụng chúng TS Đinh Thúy Hằng

60 30

2 QG.07.24

Nghiên cứu đặc điểm sinh học thăm dò khả nãng phân huỷ độc tố số chủng Microcystis phân lập hổ Hoàn Kiếm, Hà Nội

TS Nguyễn Thị Hoài Hà

100 50

Đ ẠI H Ọ C QƯÓC GIA HÀ NỘI CỘNG HÒA X Ã HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

- M A - — — Độc lập — Tự - Hạnh phúc

Đ on vị: Trung tâm Công nghệ Sinh học = = = = = = = = =

Sổ: /HĐ-KHCN

HỢP ĐỎNG T H ự C HIỆN ĐÈ TÀI KHCN CỦA ĐHQGHN

(DÀNH CHO CÁC ĐỀ TÀI ĐẶC BIỆT, CẤP ĐHQGHN, NCCB, CẮP c sở)

- Căn định số 1562/KHCN ngày 02 tháng 05 năm 2007 Giám đốc Đại học Quốc gia Hả nội việc thành lập đề tài bổ nhiệm chù nhiệm đề tài NCKH cấp ĐHQGHN.

- Căn vào bàn đề cương nghiên cứu đề tài mẵ số QG.07.26 số kinh phí phê duyệt

Chúng gồm:

Bên giao (Bên A, đơn vị chủ ừì): Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

Đại diện: TS Dương Văn Hợp

Chức vụ: Giám đốc

Bên nhận (Bên B, chủ tri đề tài): TS Đinh Thúy Hằng

Đơn vị công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

Điện thoại: +4 911 04 02

Là chủ nhiệm đề tài NCKH ĐHQGHN, mã sổ QG.07.26

Hai bên thỏa thuận sau:

Điều ỉ : Bên B chịu trách nhiệm tổ chức triển khai nội dung nghiên cứu năm 2007 - 2009 cụ thể đây:

Nghiên cửu đa dạng vi khuẩn ôxy hóa Fe2+/khử NO3- số mơi trường sinh thái khác Việt nam

- Phân lập, phân loại nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa cùa chùng vi khuẩn ơxy hóa Fe /khừ NOj đại diện.

- Tỉm hiểu khả ứng dụng chủng vi khuẩn phân lập lĩnh vực môi trường

Điều 2: Bên B nộp cho bên A sản phẩm khoa học theo nội dung tiến độ thực đề tài theo đợt: đợt trước ngày 01/06/2008 đợt trước ngày 01/06/2009

Đợt 1: Báo cáo tiến độ

Đợt 2: Báo cáo nghiệm thu sản phẩm đề tài (theo đề cương)

Điều 3: Kinh phí cùa đề tài:

- Kinh phí năm 2007 - 200«: 30 000 000 (Ba mươi triệu đồng).

- Kinh phí năm 2008 - 2009:30 000 000 (Ba mươi triệu đồng).

Kinh phí nảy bao gồm khoản góp nghĩa vụ theo qui định hành Nhà nước Sổ kinh phí chủ trì đề tài sỗ nhận Phòng Tài vụ đơn vị.

Điều 4: Bên B có trách nhiệm chi tiêu kinii phí cấp theo mục đích, ché độ tài chính hành tốn vói phồng tài vụ, chậm trước n g y Điều 5ỉ Hai bên cam kết thực điều khoản ghi hợp đồng Trong trình thưc hợp đồng, hai bên phải thơng báo cho vấn đề nảy sinh vả bàn bạc giải

Điều 6: Hợp đồng làm thành bản, Bên A giữ bàn, Bên B giữ ỉ bàn, gửi đến Phòng Tài vụ quan.

Hà nội, ngày 14 tháng năm 2007

ĐẠI DIỆN BÊN B

Đ ẠI H Ọ C Q U O C G IA H A NỤ1

Vỉện VI sinh vật Công Bghệ *áni» học

CỘNG HOÀ XẢ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc

PHIẾU ĐỀ NGHỊ

THAY ĐỔI TRONG QƯÁ TRÌNH THựC HIỆN ĐỀ TÀI KHCN CỦA ĐHQGHN

1 Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vi khuẩn kỵ khí ơxy hoả sẳt (II), khử nitrat sổ

môi trường sinh thái khả ứng dụng cùa chủng

2 Mă số đề tài: QG.07.26

3 Chủ tri đề tài: TS Đinh Thúy Hằng

4 Cơ quan chủ trì: Viện Vi sinh vật Cơng nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà nội 5 Những thay đổi tiến độ, thời gian nghiên cứu:

Xỉn lui lai thời gian nghiệm thu đề tài tháng (từ tháng 6/2009 sang tháng 10/2009) chủ trì đề tài nghỉ gián đoạn tháng (từ 9/2008 đến hểt tháng 12/2008) theo chế độ nhà nurớc dành cho Đà Mẹ ừẻ sơ sinh.

ố Những thay đổi khác:

- Xin rút khơng đăng ký hưởng dẫn sinh viên làm khố luận tốt nghiệp đối tượng nghiên cửu vi khuẩn kỵ khí địi hỏi kỹ thí nghiệm cao thời gian dài, khó phù hợp với loại hình đào tạo (đã đề xuất báo cáo tiến độ kỳ tháng 1 năm 2008).

- Hoạt động khoa học thay thể: gửi tham gia hội nghị khoa học quốc gia sinh thái tài nguyên sinh vật.

Ngày thảng năm 2009 Ngày ì/ tháng ) nám 2009 Ngày 18 tháng năm 2009

C quan chủ quản duyệt Cơ quan chủ tri Chủ nhiệm đe tài

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - T ự d o - Hạnh phúc

BIÊN BẢN HỌP

HỘI ĐỒNG KHOA HỌC NGHIỆM THU CAP c SỞ ĐẾ TÀI ĐẶC BIỆT CAP ĐHQGHN MÃ số : QG.07.23

1.Tin đ é tài:

Đa dạng sinh học vi khuẩn kị khí oxy hóa sắt n, khử nitrate số môi trường sinh thái khả ứng dụng chúng

2 Chủ trì: T $ , &ĩ'ỵUL

3 Q uyết định th ành lậ p H ộ i đ ồn g K h oa h ọ c nghiệm thu đề tài số 149 /QĐ-CNSH ngày

23 tháng 10 năm 2009

4 Ngày họp H ộ i đồng: 28/1012009

5 Danh sách th àn h viên H ộ i đồng:

1 TS Dương Văn Hợp TS Lê Thu Hiền

3 TS Nguyễn Huỳnh M inh Quyên TS Đào Thị Lương

5 TS Nguyễn Quỳnh Uyển TS Nghiêm Ngọc Minh TS Nguyễn Thị Hoài Hà

Chủ tịch Hội đồng Phản biện

Phản biện Thư ký ủ y viên ù y viên y viên

a Có mạt; Ỷ người

b. Vắng m ặt 0 ngưịi

6 người trình b y báo cáo:

Họ tê n - S t W i TLi >.'ij

7 K ết q u ả đánh g iá :

Sô phiêu phát ra: Số phiếu hợp lệ:

7-Kết quả: -ffí

8 Tháo luận Hội đồng

- 7 $ Ì^Cị\u.yCrỉ t h iy iĩỉì ki n\t} C\ I U | 'ì) dec ✓ A ù / ; M\a7viị Ìàtì

Hu ì d (>\*Ị c \ t \ h <\ <^y3 fc ít' J

- C ^ v u ' K t / i H-D >vìiA (Or/j ' Ì ^ iÍ i /ị I r u ~ r t K ' \

~ *7~ s -0 » » \./j ^ / u ì t / ) /vny i'l n t? Ă ĩ

N K a o X í ' f G<Uy H ũ ỉ doxjj

— Ị) I \ A o b t £ * ; i , Till T A l t f C o

-V* i ) ỉ f r \ ị t o Y O u ị Í i i O I C Ìk-c s\ c v a h < r ) C í K O

+ 'Ỵĩửr^Ị ỢítCi n <4 y W\n ỵj f i n

•+ í \ ĩ c I f ^ w < K ( - i í " i r u Ậ} C i i f í ^ u o n Ậ i \ f i n h 1 c r a i 1\ Ĩ > I ít / i

J , ơ > J

'WC \Ắ vi '1 O U u A m

4 ‘V T Ai , , ,

• l \ U v f z 7- i t A c £ A ^ + Í V | ũ Oi-.-) (■•Ki ỷi > f ^ir>*

V c c L ^ ís ^ A n (VC,,

C í l c < v í v ^ i ; _ \ / ị £ C Ỵ ( _J ự a ( I I I ) á <\ ể J c { M J y ^ o i y

l<^ n ù ó c e ù c l * f c f i i a o ' n K o i ) V ' / C / Ui y

)<^L H o rT u -H''-A*Wt sCi.t2x.-f A t >1 ^ 1' * ->J '.'ii fV *? 'Vi PJuih it*iTíJ i T S' A/'juiyio ^ i ‘*y»i/> /Iíim6

+■ C o VỊ IV (virf* if/ , ^ j n ( w \ "KvvvC A ôã i) r ( I

4 / ^

■4 ICiTf ^ I f i c-v i\ + k r \ i L l ; - I* /- <r > r,t<- u ù ' r lIIIV * y ' ' ỹ ^ ' '

' r ' i \ II ',

1 iU t ' ■' ' , IM r ì.; ( )»w t o r / H /, < ;,,, ,u ; yl / i f * ỹ lv ã.) ' t m ^ h i ‘ Vj V -u f c i u , k y ctưC (c Ọ J./1/J ci U i-\ I~ x rí n

t C ( ũ | l v o i : D i t ,(1 ^ Ki'ii.^j- ivjCift]' CH A ht hi pj * * n U f j ; x J ir> J j :tr

fc L ( V >.' r I • I \ I\ IV 11 ( f \ c M il I J , k I

/ > '• • ' ■ > ' • • ■,

;■ u j U ' ( i „ K j U ^ '.M -, u " <‘f ^ H ^ ( r

1 >

) c iV Í j I I I ^ Í > J v - * t ; I / \ I *■ > j ' < ' )

• N í í í ì I A ’ f X , .-J r " , ^ : " J ( w W O l ( ' - ■■•

K L ■ỉnt ; k c - ; - 1 -"M\ f\ t v J ) ■ + v ‘ j 1 Uv ^ i I \ I A » > f 7 c iV < j u ^ (

/■

•1 ■ V ■ V t

HI I ^ ằj'ô' ã ^ t \ p X ijl A x' V c ^ 'i c 1 <;

rv:0 ltll < «\ ^ ~

V ! t ' C ị • Ị

ÌẴịi

' $ ^ !(J í C A | ù l / | ■ • T t ' T q f u o l i Ể* c „ / , y ^ • 'r l T > /

■ỉ - ' •

t ĩ o a - ị r<t.i ^Vĩ r ri it tu /Ị f t <4:-ì

cVv^ q f u a l i Ể * c „ / , y H \ c t r ị f <~ì'ỳ ^ i i > i '7

u^i.ữL V IC I c J a i’ II v'À »ii ^ ã ã ' ^

ô I&/vtiV'jj t-ì JCÍm b A J it io c c J -ct-i1 c ^ i '1 y h s t i x A »vr c l

Kết luận của Chả tịch Hội đổng: .

p j * n ~ p - r ' í : o ; »\

2 T V<5vì f í X ■ i i u ' c H u Ị r h p -fi }'l c* ■•/

- D l ' f r J o U - ^ i «1 ^ -Ij CÌ<Ả H-ỡ ^ ' v í o r i M A

THƯKÝ HỘI ĐỔNG (Họ, tên chữ ký)

Y

' f t t ' w ĩ ì i ì í m 1

PHIÉU ĐĂNG KÝ

KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u ĐẺ TÀI KHCN

Tên đề tài:

Mã sổ:

Cơ quan quẳn lý đề tài:

Địa chi: Điện thoại:

Ctf quan chủ trì đề tài: Địa chi:

Điện thoại:

Tổng chi phí thực chi: Trong đó:

- Từ ngân sách NN: - Nguồn khác: Thời gian nghiên cú u:

- Thời gian bất đầu: - Thời gian kết thúc: Tên cán phối họ p

- Chù trì đề tải: - Cán tham gia:

Đa dạng sinh học vi khuân kỵ khí oxy hỏa Fe(]l) khừ nitrate sô môi trường sinh thái vả khà ừng dụng cùa chúng

QG.07.23

Đại học Quốc gia Hả Nội

144 đường Xuân Thủy, cầu Giấy - Hà Nội 37 54 86 64

Viện Vi sinh vật vá Công nghệ sinh học ĐHQGHN Nhà E2 144 Xuân Thúy, cầu Giấv - Hà Nội

37 54 74 07 60.027.400

100%

khơng có năm 6/2007

10/2009 nghiên cứu:

TS Đinh Thúy Hằng CN Nguyễn T hị Tuyền ThS Nguyền Minh Giáng

Sô đăng ký đê tài Sị chứng nhận dãrití ký KQNC Bào mậi

A Phô biến rộng rãi

Ngày Ngày

Tóm tắt ý nghĩa, kết nghiên cứu:

- Ba dạng mơi trường khác gồm có ao nước ngọt, ruộng lúa ngập nước irầm tích ven biến chọn đê tiến hành nghiên cứu đa dạng cua vi khn ịx> hố Fe(ll) khứ NO',' Đáy dạng mơi trường vi khn tham gia chu trinh chun hố sắt nitơ đóng vai trị quan trọng Mầu bùn đáy (dưới 10 cm bề mặt bùn) mòi trường sinh thái kẻ thu thập sử dụng đê phân tích nhóm vi khuân kv khí

DNA tổng số tử ống MPN đại diện có vi sinh vật phát triển tách chiết sử dụng làm khuôn phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen I6S rDNA có độ dài 550 bp Phàn tích điện di biến tính đoạn gen cho thấy tính đa dạng cao cùa vi khuấn ống MPN Một số băng điện di đại diện cắt thơi gel để đọc trình tự, qua xác định đưọc nhóm vi khuẩn chiếm ưu môi trường nghiên cứu, cụ thê Anaeromvxobacter Pseudomonas Paracoccus.

- Đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật sinh trường điều kiện oxy hoá Fe((l) khừ NO} dãy MPN thông qua phương pháp tai in situ sứ dụng đầu dò huỳnh quang (FISH) đặc hiệu cho ba nhóm vi khuân CX- P- ỵ-P roieobacteria.

12 chủng vi khuân kỵ khí phân lập tinh (4 chúng đối vói dạng mơi trường sinh thái) Tính đa dạng chúng mặt di truyền xác định thông qua phân tích ARDRA đoạn gen mã hố cho 16S rRNA dài 1500 bp sừ dụng hai enzvme M.spị Haeìỉỉ Các chùng đại diện cho nhóm ARDRA giài trình tự đè xác định vị trí phân loại cùa cá nhóm vi khuẩn mà chúng đại diện

- Bằng phương pháp xác định lượng Fe(II) NO}' mơi trường ni cấy theo thời gian, chúng vi khn IN 12 chúng minh cỏ chuyên hoá hai hợp chất cao, chủng có tiềm sử dụng lình vực mơi trường Bên cạnh sừ dụngMn(I!) thay cho Fe(ll)cũngđã nghiẻn cứu, tuv nhiên chung IN 12 không thê kha nãng ứng dụng để loại bó Mn(IỈ) mơi trưịng

- Các kết q nghiên cứu công bố 02 báo khoa học báo cáo Poster iham gia

h ội n g h ị v ề s in h th i s in h v ặ t v trin h tự g e n d ă n tỉ ký tr o n g G e n B a n k

- Đã tham gia đào tạo 01 học viên cao học

Kiến nghị qui mô đối tuọng áp dụng kết nghiên cứu:

- Nghiên cứu tìm giả thể phù hợp đè tạo chế phẩm chứa vi khuẩn oxlì Fe(II) khư nitrate

- Nghiên cứu thừ nghiệm áp dụng vi khuân oxy hóa Fe(II) khư nitrate dề xử lý nước ngầm nhiễm sắt ni tơ

Chức vụ Chù nhiệm đê tài Thú trường quan chù trì đe tài

Chủ tịch hội đơiiii đánh uiá thức

ĩ i lii-'f/Mj

Thu trưởng quan

Họ tên Đinh Thúy Hăng Dươníì Vãn Họp Dưong Vãn Hợp p

Học vị TS

Ký tên

Đóng dấu

ý h ị V SINH H O ầ y ậ ìì

V '•*.-»‘'71

i \ V