Experimental research on CC14 induced liver cirrhosis treatment using stem cell therapy

MỤC LỤC MỤC LỤC i TÓM TẮT iii ABSTRACT .iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii BÁO CÁO TÓM TẮT ix MỞ ĐẦU .x CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU LIÊN QUAN xii ĐẾN ĐỀ TÀI xii 1.1 Giới thiệu bệnh xơ gan .1 1.2 Dịch tễ học xơ gan 1.3 Nguyên nhân gây bệnh 1.4 Hậu 1.5 Biện pháp điều trị xơ gan hạn chế 1.6 Mơ hình chuột xơ gan CCL4 1.7 Cơ sở lý thuyết việc sử dụng tế bào gốc điều trị xơ gan 1.8 Nội dung nghiên cứu đề tài .8 CHƯƠNG VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP .12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Phương pháp thu nhận máu cuống rốn 13 2.3 Phương pháp thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn 14 2.4 Phương pháp phân lập tế bào gốc trung mô ứng viên 14 2.5 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô ứng viên 15 2.6 Thu nhận nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc ứng viên từ tủy xương chuột 16 2.7 Các nguyên tắc xác định tế bào gốc trung mô ứng viên 17 2.8 Phương pháp xác định hình thái tế bào 18 2.9 Phương pháp colony assay 18 2.10 Phương pháp xác định tiềm biệt hóa- Biệt hóa thành tế bào tạo mỡ 18 i 2.11 Phương pháp nhuộm hóa tế bào Oil Red 20 2.12 Phương pháp xác định kiểu hình miễn dịch 20 2.13 Phương pháp gây xơ gan chuột CCl4 21 2.14 Đánh giá hoạt độ men AST, ALT, huyết tương chuột 22 2.15 Đánh giá Bilirubin albumin huyết tương chuột (theo hướng dẫn NSX kít) .23 2.16 Phương pháp đánh giá biểu gen liên quan đến xơ hóa (procollagen α1(I), fibronectin, ecto-5’-nucleotidase mức phiên mã) 23 2.17 Phương pháp đánh giá cấu trúc mô học gan 26 2.18 Phương pháp nhuộm hố mơ miễn dịch 27 2.19 Phương pháp cấy ghép tế bào lên chuột xơ gan .28 2.20 Phương pháp đánh dấu huỳnh quang GFP tế bào .28 CHƯƠNG KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 30 3.1 Kết nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy xác định đặcđiểm tế bào gốc 31 3.1.1 Kết thu nhận MSC máu cuống rốn .31 3.1.2 Thu nhận nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột 39 3.2 Kết nội dung 2: Xây dựng mơ hình chuột xơ gan CCl4 .45 3.2.1 Kết khảo sát nồng độ CCL4 45 3.2.2 Kết tạo chuột xơ gan với quy trình nồng độ chuẩn hóa (1.0ml/kg) 50 a Kết so sánh mức độ biểu gen real time RT-PCR .51 3.3 Kết nội dung 3: Kết thử nghiệm cấy ghép tế bào gốc mơ hình chuột xơ gan 58 3.3.1 Kết điều trị xơ gan gằng liệu phép BM-MSC .58 3.3.2 Kết điều trị xơ gan gằng liệu phép UCB .66 3.3.3 Kết đánh giá vai trò tế bào ghép 74 CHƯƠNG KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .79 Tài liệu tham khảo 81 ii TÓM TẮT Trong phương pháp điều trị bệnh suy thoái tế bào gan hay xơ gan nay, phương pháp ghép tế bào mô gan hiệu nhất; nhiên số lượng tế bào/mô gan cần cho cấy ghép người lớn (dẫn đến tình trạng cung khơng đủ cầu), điều dẫn tới thúc đẩy việc tìm kiếm nguồn tế bào khác Việc cấy ghép tế bào gốc tế bào tiền thân nghiên cứu gần đây, so sánh với việc cấy ghép tế bào gan trưởng thành triển khai thu nhận kết khả quan Nghiên cứu vai trò việc sử dụng tế bào gốc điều trị xơ gan cần thiết đầy hứa hẹn trị liệu xơ gan Trong nghiên cứu này, tiến hành gây tạo chuột xơ gan hóa chất CCL4 đánh giá hiệu điều trị xơ gan chuột tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người tủy xương chuột Trong trình thực đề tài, đạt số kết sau: - Phân lập, nuôi cấy đánh giá đặc điểm tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người (MSC) Các tế bào sau thu nhận nuôi cấy biểu profile marker: CD14-/CD34-/CD45-/HLA-DR-/CD13+/CD44+/CD90+/CD166+ Các MSC sau ni cấy có khả tự làm biệt hóa thành xương mỡ Các MSC lưu trữ PTN Tế bào gốc dạng: Trữ lạnh Nitơ lỏng; Ni cấy trì điều kiện in vitro - Phân lập, nuôi cấy đánh giá đặc điểm tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột Các tế bào sau thu nhận nuôi cấy biểu marker bề mặt sau: CD117-/CD34-/CD45-/ CD44+/CD90+/Sca-1+Các mMSC có khả tự làm biệt hoàn thành xương mỡ mMSC lưu trữ PTN Tế bào gốc dạng: Trữ lạnh Nitơ lỏng; Nuôi cấy trì điều kiện in vitro - Tạo thành cơng chuột xơ gan sử dụng hóa chấtCCl4 - Thử nghiệm điều trị chuột xơ gan cấy ghép tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người tuỷ xương chuột theo phác đồ ghép khác (tĩnh mạch cửa gan tĩnh mạch đuôi) mô hình chuột xơ gan Kết ghi nhận cho thấy cải thiện tiêu chức gan albumin, bilirubin, biểu gen xơ hoá cấu trúc mô học iii ABSTRACT In present, the most effective therapy for treatment of hepatocellular recession or cirrhosis is liver transplantation, however the number of cells / tissues need for transplant in humans has limited This leads to the impulse to find other sources of cells In recent studies, stem cells or progenitor cells hav been used as another alternative source for liver cirrhosis, compared to the transplantation of mature hepatocytes, these cells obtained better results Research on the role of stem cells in the treatment of liver cirrhosis is essential and promising in the treatment of cirrhosis In this study, we generated cirrhosis miceusing CCl4 chemicals and evaluate the effectiveness of treatment in cirrhosis mice of umbilical cord blood and mouse bone marrow - derived mesenchymal stem cells We have achieved some results follows: - Isolation, culture and assess the characteristics of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood (MSC) The collected cells after culture and marker expression profile: CD14-/CD34-/CD45-/HLA-DR-/CD13 + / CD44 + / CD90 + / CD166 + The MSCs have capableb of self-renewal and differentiation into bone and fat The MSCs are currently stored stem cells in the laboratory in two forms: Cryopreserved in liquid nitrogen; Maintained in vitro conditions - Isolation, culture and assess the characteristics of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow The collected cells have surface marker expression as follows: CD117-/CD34-/CD45- / CD44 + / CD90 + / Sca-1 + The mMSCsare capable of selfrenewal and differentiation into bone and fat mMSCs are stored stem cells in the laboratory in two forms: Cryopreserved in liquid nitrogen; Maintained in vitro conditions - Create cirrhotic mice successfully using chemical CCl4 - Evaluation effects of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood and bone marrow transplantation (hepatic portal vein and tail vein) in mouse model of liver fibrosis Results reported showed an improvement in liver function as albumin, bilirubin, the expression of the gene fibrosis and histological structure iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAT Anfa- antitrypsin ALB Albumin ALT Alanine Transaminase AST Aspartate Aminotransferase BM Bone marrow BM-MSC Tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương CCl4 Carbon Tetraclorua CD Cluster of Differentiation FBS Fetal bovine serum GFP Green flouresence protein HE Hematoxylin and eosin MSC Mesenchymal stem cell PAS Periodic acid-Schiff stain PBS Phosphate buffer saline Placebo-Po Đối chứng tiêm PBS tĩnh mạch cửa gan Placebo-Ta Đối chứng tiêm PBS vào tĩnh mạch đuôi Po Tiêm vào tĩnh mạch cửa gan Ta Tiêm vào tĩnh mạch đuôi TBG Tế bào gốc TBG Tế bào gốc TGF Transforming growth factor UCB Umbilical cord blood α-SMA α-Smooth mucle actin v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bảng số hoạt tính mơ học Knodell-Ishak ( Ishak Modified HAI) Bảng 3.1 Các marker dùng để nhận diện TBG trung mô ứng viên 35 Bảng 3.2 Kết đánh giá marker bề mặt MSC ứng viên 43 Bảng 3 Phần trăm chuột sống (tỷ lệ sống) liều CCl4 thời điểm tuần 0, tuần 45 Bảng Giá trị men AST, ALT lơ thí nghiệm thời điểm tuần tuần 46 Bảng Bảng kết mức độ viêm xơ gan chuột (theo hệ thống tính điểm Knodell- Ishak index (Ishak Modified HAI) 50 Bảng Bảng giá trị men AST, ALT, bilirubin albumin thời điểm tuần tuần 11 51 Bảng Mức độ viêm xơ gan dựa đánh giá mô học theo thang điểm KnodellIshak index (Ishak Modified HAI) 62 Bảng Chỉ tiêu sinh hóa chuột tiêm UCB 66 Bảng Kết biểu gen xơ hoá chuột sau ghép UCB 68 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1 Hướng chiến lược điều trị bệnh gan liệu pháp tế bào Hình Thao tác thu máu cuống rốn từ dây rốn 13 Hình 2 Thao tác cho chuột uống 22 Hình Thao tác lấy máu chuột 23 Hình Thao tác sinh thiết gan chuột .25 Hình Tiểu thùy gan bình thường với vùng tế bào .27 Hình Thu nhận tế bào đơn nhân phương pháp ly tâm gradient tỷ trọng 31 Hình Quần thể tế bào đơn nhân 31 Hình 3 Quần thể TBG trung mô ứng viên .32 Hình Quần thể TBG trung mơ ứng viên .32 Hình Cụm TBG trung mơ ứng viên hình thành 33 Hình Kết phân tích biểu số marker TBG trung mô ứng viên sau lần cấy chuyền 34 Hình Tế bào đối chứng (a) tế bào tạo mỡ sau 21 ngày cảm ứng (b) 38 Hình Tế bào tạo mỡ nhuộm với Oil red .39 Hình (a) Tế bào vừa thu nhận từ tủy xương; (b) Quần thể tế bào sau 24 ni cấy (Độ phóng đại 100 lần) .39 Hình 10 Tế bào tuỷ xương sau nuôi cấy 40 Hình 11 (a) Quần thể tế bào sau ngày nuôi cấy; (b) Quần thể tế bào sau 15 ngày ni cấy ( Độ phóng đại 40 lần) 40 Hình 12 (a) Tế bào sau cấy chuyền ngày; (b) Tế bào sau cấy chuyền ngày (Độ phóng đại 100 lần) 41 Hình 13Một số kiểu hình tập đồn MSC ni cấy mật độ thấp (Độ phóng đại 100 lần 40 lần) .42 Hình 14 Kết phân tích Flow cytometry MSC ứng viên 43 Hình 15 Kết nhuộm Oil red 44 Hình 16 Biểu đồ so sánh khối lượng chuột 46 Hình 17 Biểu đồ so sánh hoạt độ men AST ALT lơ thí nghiệm thời điểm tuần tuần 47 Hình 18 Cấu trúc đại thể gan chuột sau tuần .48 Hình 19 Kết nhuộm H&E cấu trúc vi thể lô chuột tuần .49 Hình 20 Biểu đồ so sánh mức độ biểu gen Fibronectin, Intergrin, Nt5e, Procollagen TGF-B sau tuần xử lý CCL4 52 Hình 21 Gan chuột bình thường 54 Hình 22 Gan chuột uống CCl4 sau tuần .54 Hình 23 Gan chuột bình thường nhuộm Hematoxylin Eosin 55 Hình 24 Cấu trúc vi thể mẫu gan xơ hóa 1/6 nhuộm Masson trichrome 56 Hình 25 Cấu trúc vi thể mẫu gan xơ hóa 2/6 nhuộm Masson trichrome 56 Hình 26 Cấu trúc vi thể mẫu gan xơ hóa 3/6 5/6 nhuộm Masson trichrome .57 Hình 27 Cấu trúc vi thể gan bệnh nhân xơ gan nhuộm Masson trichrome 57 Hình 28 Kết AST, ALT, Bilirubin Albumin nhóm thí nghiệm điều trị BM-MSC 59 Hình 29 Kết thay đổi biểu gen xơ hoá nhóm thí nghiệm điều trị BM-MSC .60 vii Hình 30 Kết nhuộm HE Trichrome nhóm thí nghiệm điều trị BM-MSC 61 Hình 31 Kết nhuộm collagen type α-SMA nhóm thí nghiệm điều trị BM-MSC 63 Hình 32 Kết thay đổi biểu gen xơ hố nhóm thí nghiệm điều trị UCB .67 Hình 33 Cấu trúc mơ học nhóm chuột thí nghiệm nhuộm H&E 69 Hình 34 Cấu trúc mơ học nhóm chuột thí nghiệm nhuộm Masson's trichrome 70 Hình 35 Cấu trúc mơ học nhóm chuột thí nghiệm nhuộm hóa mơ miễn dịch với kháng thể kháng collagen type 72 Hình 36 Cấu trúc mơ học nhóm chuột thí nghiệm nhuộm hóa mơ miễn dịch với kháng thể kháng SMA-α 72 Hình 37 Các vùng mô phát sáng chuột ghép tế bào 75 Hình 38 Tế bào ghép tồn mô gan phát sáng ánh sáng huỳnh quang 76 Hình 39 Tế bào dương tính GFP, AAT, ALB mơ gan chuột ghép tĩnh mạch đuôi 77 Hình 40 Tế bào dương tính GFP, AAT, ALB mô gan chuột ghép tĩnh mạch cửa gan 77 Hình 41 Tế bào sau ghép tồn gan dương tính với hAFP, hAlb 78 Hình 42 Tế bào sau ghép tồn gan dương tính với AAT a Tế bào dương tính với AAT, b Tế bào dương tính với GFP, c ghép chồng hình a b (Hong Li cs 2010) .78 viii BÁO CÁO TÓM TẮT ix MỞ ĐẦU Gan quan có khả tái sinh trường hợp tổn thương mạn tính khả tự tái tạo gan khơng cịn sau dẫn đến tình trạng xơ hóa.Xơ gan bệnh nguy hiểm, tần suất cao, điều trị khó khăn.Việt Nam nước có tỷ lệ viêm gan xơ gan cao (~20%) so với nhiều nước Thế giới.Các biện pháp điều trị xơ gan chưa thực mang lại kết mong đợi.Hiện tại, phương pháp điều trị có hiệu cho xơ gan (xơ hóa gan) cấy ghép gan.Ghép gan cách chữa trị hiệu cao cho xơ gan giai đoạn cuối Ghép gan thường cần đến biến chứng bệnh não, cổ trướng hay giãn tĩnh mạch xuất huyết khơng thể kiểm sốt chức sinh hóa bị suy giảm nghiêm trọng Các chuyên gia xác định nguy lợi ích ghép gan cho bệnh nhân.Tỉ lệ tử vong cải thiện nhiều năm qua nhờ sử dụng thuốc suy giảm miễn dịch giữ cho gan ghép vào không bị công tổn thương.Trung bình 80% bệnh nhân ghép gan kéo dài sống sau năm năm.Tuy nhiên, số lượng bệnh nhân cần ghép gan vượt xa số lượng gan hiến tặng.Một bệnh nhân cần ghép gan phải trải qua trình đánh giá phức tạp trước cho vào danh sách chờ ghép gan Nói chung, gan ghép cho bệnh nhân tiên đốn có hội sống sót dài sau cấy ghép Sự sống sót sau ghép gan cần theo dõi chặt chẽ kết hợp với chăm sóc chu đáo Mặc dù cấy ghép gan liệu pháp tốt giúp kéo dài đời sống cho bệnh nhân, việc hiến tặng quan rào cản lớn liệu pháp.Số lượng bệnh nhân chờ ghép gan ngày tăng, mơ hiến tặng ngày khan Với kiến thức tảng chuyên sâu tế bào gốc y học tái tạo, nhà khoa học đặt niềm tin vào việc sử dụng tế bào gốc tái tạo mô gan bệnh nhân xơ gan Liệu pháp sử dụng tế bào gốc trưởng thành có nhiều ưu điểm như: nguồn thu nhận dồi dào, ghép tự thân, vượt qua rào cản đạo lí Việc phát triển liệu pháp ứng dụng tế bào gốc điều trị xơ gan cấp thiết mở hướng điều trị xơ gan nói riêng bệnh thối hố tế bào nói chung Do đó, đề tài nghiên cứu điều trị thực nghiệm chuột xơ gan CCl4 liệu pháp tế bào gốc đề xuất với mục tiêu sau: Mục tiêu chung: Nghiên cứu điều trị thực nghiệm chuột bệnh xơ gan tế bào gốc Mục tiêu cụ thể: x ... better results Research on the role of stem cells in the treatment of liver cirrhosis is essential and promising in the treatment of cirrhosis In this study, we generated cirrhosis miceusing CCl4... sources of cells In recent studies, stem cells or progenitor cells hav been used as another alternative source for liver cirrhosis, compared to the transplantation of mature hepatocytes, these cells... ABSTRACT In present, the most effective therapy for treatment of hepatocellular recession or cirrhosis is liver transplantation, however the number of cells / tissues need for transplant in humans