Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định thành phần loài và phân lập một số loài tảo trong ống tiêu hóa của nghêu vân Meretix lusoria, nhằm góp phần trong nghiên cứu đa dạng nguồn thức ăn tươi trong nuôi trồng thủy sản.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN THÀNH PHẦN LOÀI VÀ ĐẶC ĐIỂM TĂNG TRƯỞNG CÁC LOÀI TẢO PHÂN LẬP TỪ ỐNG TIÊU HÓA CỦA NGHÊU VÂN (Meretrix lusoria) Đặng Ngọc Thùy1* TÓM TẮT Nghêu vân, Meretrix lusoria, loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ phổ biến khu vực Đông Đông Nam Á (Yoosukh & Matsukuma, 2001) Trong ống tiêu hóa nghêu vân thu cảng Gomso, Hàn Quốc ghi nhận tổng cộng có 34 lồi vi tảo Trong đó, 32 lồi vi tảo phân loại dựa đặc điểm hình thái kính hiển vi quang học Tuy nhiên, có hai giống tảo Neorhodella sp Minutocellus sp phân lập nuôi thành công Tốc độ tăng trưởng tỉ lệ phân chia tế bào hai lồi tảo đạt cao ni nhiệt độ 18oC cụ thể 1,62 ± 0,39 2,24 Neorhodella sp 0,39 ± 0,01 0,56 Minutocellus sp Từ khóa: Meretrix lusoria, Minutocellus, Neorhodella, nghêu vân, vi tảo I ĐẶT VẤN ĐỀ Nghêu vân, Meretrix lusoria, loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ phổ biến khu vực Đông Đông Nam Á (Yoosukh & Matsukuma, 2001) Nó thường tìm thấy cửa sơng vùng triều nơi có độ mặn từ 20 ‰ 33 ‰ sinh vật sống đáy độ sâu đến 10 cm điều kiện hiếu khí (Lee et al., 2007) Nghêu vân xem loài nhuyễn thể quan trọng nuôi trồng phát triển Nhật Bản, Hàn Quốc Trung Quốc, (Chung, 2007) Theo Karnjanapratum ctv., (2013), Meretrix lusoria giàu axit béo đa khơng bảo hịa (46,84-49,18% tổng số axit béo) với tỉ lệ cao DHA (13,33-16,47% tổng số axit béo) EPA (4,75-7,11% tổng số axit béo) khoáng vi lượng Na, K, Ca, Mg, Fe, Zn, Cu Cr Vì vậy, nghêu vân nguồn dinh dưỡng tuyệt vời có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng Vi tảo đóng vai trị quan trọng hệ sinh thái biển nguồn thức ăn sơ cấp loài thủy sản đặc biệt ấu trùng hai mảnh vỏ ấu trùng số loài giáp xác lồi cá ni trồng thủy sản Vi tảo sử dụng cho việc nuôi dưỡng ấu trùng thường nằm kích thước (nanoplankton) khoảng từ 2-20μm (Brown et al., 1997) Cho đến nay, việc nuôi thâm canh nhuyễn thể chủ yếu dựa vào việc sản xuất loại tảo sống, thường chiếm khoảng 30% tổng chi phí sản xuất giống (Coutteau Sorgeloos, 1992) Một số nghiên cứu trước phát triển chủng tảo thực sản xuất giống thủy sản vẹm xanh Mytilus galloprovincialis (Pettersen et al., 2010), hàu Thái Bình Dương Crassostrea gigas (Knuckey et al., 2002; Barille’ et al, 2003), trai Greenshell ™ Perna canaliculus (Ragg et al., 2010), hàu Châu Âu Ostrea edulis (Ronquillo et al., 2012), bào ngư Haliotis diversicolor (Chen, 2007) Mục tiêu nghiên cứu xác định thành phần loài phân lập số loài tảo ống tiêu hóa nghêu vân Meretix lusoria, nhằm góp phần nghiên cứu đa dạng nguồn thức ăn tươi nuôi trồng thủy sản Trung Tâm Quan Trắc Môi Trường & Bệnh Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản * Email: thdolly@yahoo.com 58 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phân loại tảo thơng qua đặc điểm hình thái tảo ni cịn xen tạp lồi tảo khác, việc phân lập phải thực tiếp có giống tảo Và trường hợp vi tảo nuôi bị nhiễm khuẩn, chúng xử lý Spenicillin 100µg/ml sau kiểm tra lại mơi trường thạch LB để đảm bảo khơng cịn khuẩn lạc vi khuẩn 2.3 Khảo sát tăng trưởng tảo ni Hình Nghêu vân thu cảng Gomso Nghêu vân thu thập từ cảng Gomso, Buan-gun, Jeollabuk, Hàn Quốc vào tháng 10 năm 2014 Vi tảo thu từ đường tiêu hóa nghêu xác định dựa đặc điểm hình thái thơng qua việc sử dụng kính hiển vi quang học kết nối với máy ảnh kỹ thuật số Khóa phân loại tảo thực theo phương pháp Tomas, 1997 Presscott, 1951 2.2 Phân lập tảo Vi tảo phân lập phịng thí nghiệm phương pháp Pasteur pipette kính hiển vi đảo ngược (Hoshaw Rosowski, 1973) Vi tảo nuôi môi trường f/2 (Guillard Ryther, 1962; Fritz Industries, Inc 1997) 18oC 12:12 chu kỳ sáng/tối ánh sáng huỳnh quang màu trắng 90 mmol photon Để có giống tảo thuần, lồi tảo phân lập kiểm tra hàng ngày kính hiển vi đảo ngược mơi trường thạch LB nhằm kiểm tra nhiễm khuẩn Trong trường hợp loài Mỗi giống tảo sẻ nuôi giếng nuôi cấy mơ, có chứa ml mơi trường ni cấy f/2 vô trùng với điều kiện nuôi không thay đổi, ngoại trừ yếu tố nhiệt độ 18, 22, 26, 30 oC Thí nghiệm cho giống tảo lập lại lần Số lượng tế bào đếm 24 buồng đếm hồng cầu Neubauer, tất thí nghiệm thu hoạch sau tuần Tốc độ tăng trưởng tảo tính sau: µ (ngày1) = ln (F1/F0)/(t1-t0), F = sinh khối thời điểm thu hoạch t1 (tế bào/ml) F0 = sinh khối thời điểm bắt đầu, t0 (tế bào/ml) (Guillard, 1973) Từ tốc độ tăng trưởg (μ), tỉ lệ phân chia tế bào ngày (n) ước tính cách sử dụng phương trình sau: n = μ/[ln (2)], n tỉ lệ phân chia tế bào ngày (Giovagnetti ctv., 2012) III KẾT QUẢ 3.1 Phân loại tảo thông qua đặc điểm hình thái Thơng qua đặc điểm hình thái vi tảo ghi nhận thu tổng số 34 lồi tảo diện ống tiêu hóa nghêu vân (Bảng 1), có lồi vi khuẩn lam (Cyanobacteria), loài tảo lục (Chorophyceae), loài tảo hai roi (Dianophyceae), 21 loài tảo silic (Bacillariophyceae) loài chưa xác định U4 U5 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 59 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Bảng Thành phần loài tảo diện ống tiêu hóa nghêu vân Meretrix lusoria Bacillariophyceae Actinoptychus undulatus Cyanobacteria Merimopedia sp Cyclotella striata Cocconeis sp Coscinodiscus excentricus Coscinodiscus oculus-iridis Coscinodiscus radiatus Coscinodiscus sp Coscinodiscus subtilis Coscinodiscus wailesii Cylindrotheca closterium Diploneis crabro Navicula rhynchocephala Chlorophyceae Botryococcus sp Chlorella sp Coelastrum sp Crucigenia tetrapedia Pandorina sp Pediastrum duplex Scenedesmus sp Tetrastrum sp Navicula sp1 Dinophyceae Diplosalis sp Navicula sp2 Prorocentrum micans Navicula sp3 Chưa xác định U4 Nitzschia sp1 Nitzschia sp2 U5 Paralia sulcata Pleurosigma sp Triceratium favus Trachyneis aspera 3.2 Phân lập tảo Trong 34 loài vi tảo ghi nhận phân lập thành công ni hai giống tảo U4 U5 (Hình 2) Sau có giống tảo thuần, hai tảo phân loại phương pháp sinh học phân 60 tử phịng thí nghiệm khoa vi sinh trường Đại học Pukyong, Hàn Quốc với U4 Neorhodella sp thuộc tảo đỏ Rhodellophyceae U5 Minutocellus sp thuộc tảo silic Bacillariophyceae TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Hình Hai lồi vi tảo phân lập thành công (U4 U5) 3.3 Khảo sát tăng trưởng tảo Hình Tăng trưởng Neorhodella sp theo nhiệt độ Hình cho thấy mật độ Neorhodella sp có xu hướng tăng nhanh ni cấy nhiệt độ cao từ 0,17 x 104 tế bào/ml đến 2,96 ± 1,17 x 104 tế bào/ml 26oC đạt tối đa mật độ tối đa 5,52 ± 0,23 x 104 tế bào/ml 30oC Tuy nhiên, sau ngày nuôi cấy, mật độ tế bào giảm mạnh nhiệt độ 30oC 18oC tiếp tục tăng lên với số lượng tế bào 5,65 ± 0,55x104 tế bào/ ml 5,34 ± 1,01 x 104 tế bào/ml 22oC TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 61 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Hình Tăng trưởng Minutocellus sp theo nhiệt độ Tương tự Neorhodella sp., Minutocellus sp có xu hướng tăng mật độ tế bào khoảng ngày đầu (Hình 4), sau giảm mạnh từ 276,5 ± 0,54 x 104 tế bào/ml đến 210,5 ± 0,79 x 104 tế bào/ml 26oC Và đến ngày cuối thí nghiệm, mật độ Minutocellus nhiệt độ nuôi ổn định với số lượng tế bào thấp khoảng 150,5 ± 17,2 x 104 tế bào/ml 30oC cao 240,3 ± 12,2 x 104 tế bào/ ml 18oC Bảng Tốc độ tăng trưởng tỉ lệ phân chia tế bào Neorhodella sp Minutocellus sp nhiệt độ khác (n = 3) Loài tảo Nhiệt độ (°C) 18 22 26 30 Tỉ lệ tăng trưởng μ (ngày 1) Neorhodella sp Minutocellus sp 1,55±0,10 0,39±0,01 1,49±0,20 0,37±0,05 0,44±0,08 0,36±0,08 0,47±0,02 0,32±0,02 Tỉ lệ phân chia tế bào (ngày–1) Neorhodella sp Minutocellus sp 2,24 0,56 2,15 0,53 0,63 0,52 0,68 0,46 – Kết tính tốn tốc độ tăng trưởng cho thấy Neorhodella sp Minutocellus sp nuôi 18oC có tỷ lệ tăng trưởng cao nhất, 1,62 ± 0,39 0,39 ± 0,01 Trong đó, tốc độ tăng trưởng thấp cụ thể Neorhodella sp 26oC (0,45 ± 0,13) , Minutocellus sp 30oC (0,32 ± 0,02) Điều đồng nghĩa với tỉ lệ phân chia tế bào đạt cao 18oC, với dao động loài 0,63 - 2,24 Neorhodella sp 0,46 - 0,56 Minutocellus sp (Bảng 2) 62 IV THẢO LUẬN Các kết 22 loài tảo silic trình bày đường tiêu hóa cho thấy tảo thức ăn nghêu vân Meretrix lusoria Điều phù hợp với mục đích phân lập sử dụng tảo làm thức ăn cho giai đoạn ấu trùng vị thành niên hàu Thái Bình Dương , trai Greenshell™, bào ngư (Ragg ctv., 2010; Barille’ ctv., 2003, Knuckey ctv., 2002, Chen , 2007) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Trung tâm Nuôi trồng vi tảo nước mặn Hàn Quốc Marine (KMMCC) sử dụng kỹ thuật mao dẫn pipette môi trường f/2 vừa để phân lập ni cấy lồi tảo Hàn Quốc (Hur, 2008) Tuy nhiên, họ nuôi cấy vi tảo mức nhiệt độ 15, 20 25°C mẫu chúng tơi trì 18°C Ngồi ra, số lồi trình bày nghiên cứu nuôi cấy KMMCC, Cyclotella striata (Kützing Grunow), Paralia sulcata (Ehrenberg Cleve), Trachyneis aspera (Ehrenberg Cleve) Prorocentrum micans Ehrenberg Hai loài Neorhodella sp Minutocellus sp tốc độ tăng trưởng tối đa đạt nhiệt độ 18oC, chúng có tốc độ tăng trưởng chậm mật độ tế bào giảm nuôi nhiệt độ 26oC Điều cho thấy khoảng nhiệt độ tối ưu cho phát triển tốt hai chủng từ 18oC đến 22oC Theo công bố Giovagnetti ctv., (2012), Minutocellus RCC967 tăng trưởng tối ưu điều kiện ánh sáng có cường độ 100 mmol photon m-2 s-1 20oC, với điều kiện đạt tốc độ tăng trưởng cao (0,82 ± 0,02) sau giảm cường độ ánh sáng tăng cao Ngược lại, tỷ lệ tăng trưởng Minutocellus RCC703 tăng lên phạm vi ánh sáng 500 mmol photon m-2 s-1 đạt tốc độ tăng trưởng cao (1,97 ± 0,15) Dựa kết tốc độ tăng trưởng, Minutocellus sp nuôi điều kiện 90 m-2 s-1 18oC tương ứng với giống Minutocellus RCC967 Kết nghiên cứu cho thấy Minutocellus sp có xu hướng giảm phân chia tế bào nhiệt độ tăng lên Cịn với hai chủng Minutocellus RCC967 RCC703 có xu hướng tăng phân chia tế bào tăng cường độ ánh sáng V KẾT LUẬN Từ ống tiêu hóa nghêu vân, Meretrix lusoria, ghi nhận 34 lồi vi tảo Trong ni cấy thành cơng hai loài tảo Neorhodella sp Minutocellus sp Đồng thời xác định nhiệt độ tốt cho phát triển hai loài tảo từ 18ºC đến 22ºC TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 63 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TÀI LIỆU THAM KHẢO Barille´, L., Haure, J., Pales-Espinosa, E., Moranỗais, M., 2003 Finding new diatoms for intensive rearing of the pacific oyster (Crassostrea gigas): energy budget as a selective tool Aquaculture, 217: 501–514 Brown, M.R., Jeffrey, S.W., Volkman, J.K., Dunstan, G.A., 1997 Nutritional properties of microalgae for mariculture Aquaculture, 151: 315-331 Chen, Y C., 2007 Immobilization of twelve benthic diatom species for long-term storage and as feed for post-larval abalone Haliotis diversicolor Aquaculture, 263: 97–106 Chung, E Y., 2007 Oogenesis and sexual maturation in Meretrix lusoria (Röding 1798) (Bivalvia: Veneridae) in Western Korea Journal of Shellfish Research, 26(1): 71–80 Coutteau, P., Sorgeloos, P., 1992 The use of algal substitutes and the requirement for live algae in the hatchery and nursery rearing of bivalve molluscs: an international survey J Shellfish Res., 11: 467– 476 Fritz Industries, Inc., 1997 Supplied Fritz f/2 Algae Food Dallas, TX U.S.A 75217 Giovagnetti, V., Cataldo, M L., Conversano, F., Brunet, C., 2012 Growth and photophysiological responses of two picoplanktonic Minutocellus species, strains RCC967 and RCC703 (Bacillariophyceae) European Journal of Phycology 47(4): 408–420 Guillard, R.R.L., 1973 Methods for microflagellates and nanoplankton In: Stein, J (Ed.), Handbook of Phycological Methods Cambridge Univ Press, Cambridge: 80–81 Guillard, R.R.L., and Ryther, J H., 1962 Studies on marine planktonic diatoms I Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacaea (Cleve) Gran Canadian Journal of Microbiology, 8: 229-239 Hoshaw, R.W., Rosowski, J.R., 1973 Methods for microscopic algae In: Stein, J.R (Ed.), Handbook of Phycological Methods Culture Method and Growth Measurement Cambridge Univ Press, Cambridge, 53– 68 Hur, S.B., 2008 Korea Marine Microalgae Culture Center - List of Strains Algae Volume 23(3): 1-68 Kirsten M.M., Michael D J L., Robert G S., 2010 Bangiophytes: From one Class to Six; Where Do We Go from Here? Red Algae in the Genomic Age Cellular Origin, Life in Extreme Habitats and Astrobiology Volume 13, 2010, pp 241-259 Karnjanapratum, S., Benjakul, S., Kishimura, H., 64 Tsai, Y H., 2013 Chemical compositions and nutritional value of Asian hard clam (Meretrix lusoria) from the coast of Andaman Sea Food Chemistry, 141: 4138–4145 Knuckey, R M., Brown, M R., Barrett, S M., Hallegraeff, G M., 2002 Isolation of new nanoplanktonic diatom strains and their evaluation as diets for juvenile Pacific oysters (Crassostrea gigas) Aquaculture, 211: 253–274 Lake Michigan Mass Balance (LMMB) Methods Compendium,1997 ESS Method 150.1: Chlorophyll – Spectrophotometric Volume 3, Chapter Lee, A.C., Lin, Y H., Lin, C R., Lee, M.C., Chen, Y.P., 2007 Effects of components in seawater on the digging behavior of the hard clam (Meretrix lusoria) Aquaculture, 272: 636–643 Pettersen, A K., Turchini, G M., Jahangard, S., Ingram, B A., Sherman, A D H., 2010 Effects of different dietary microalgae on survival, growth, settlement and fatty acid composition of blue mussel (Mytilus galloprovincialis) larvae Aquaculture, 309: 115–124 Presscott, G W., 1951 Algae of the Western Great Lakes Area Cranbrook Institute of Science, Bloomfield Hills, MI Bulletin No 31 Ragg, N L C., King, N., Watts, E., Morrish, J., 2010 Optimising the delivery of the key dietary diatom Chaetoceros calcitrans to intensively cultured Greenshell™ mussel larvae, Perna canaliculus Aquaculture, 306: 270–280 Ronquillo, J D., Fraser, J., McConkey, A J., 2012 Effect of mixed microalgal diets on growth and polyunsaturated fatty acid profile of European oyster (Ostrea edulis) juveniles Aquaculture, 360-361: 64–68 Sarno, D., Kooistra, W H C F., Medlin L K., Percopo, I., Zingone, A., 2005 Diversity in the genus Skeletonema (Bacillariophyceae): Skeletonema costatum (Bacillariophyceae) consists of several genetically and morphologically distinct species with the description of four new species J Phycol, 41: 151–176 Tomas, C R., 1997 Identifying Marine Phytoplankton Florida Marine Research Institute, St Petersburg, U.S.A Academic Press Yoosukh, W., & Matsukuma, A., 2001 Taxonomic study on Meretrix (Mollusca: Bivalvia) from Thailand Phuket Marine Biological Center, 25(2): 451–460 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN THE SPECIES COMPOSITION AND GROWTHS OF MICROALGAE ISOLATED FROM THE DIGESTIVE SYSTEM OF HARD CLAM (Meretrix lusoria) Dang Ngoc Thuy1* ABSTRACT Hard clam, Meretrix lusoria, is an abundant bivalve species in East and Southeast Asia (Yoosukh & Matsukuma, 2001) A total of 34 microalgae species were isolated from the digestive tract of hard clam in Gomso, Korea Among them, 32 species were identified based on morphological characteristics by microscopic observation Besides, Neorhodella sp and Minutocellus sp were successfully isolated to monospecies Both Neorhodella sp and Minutocellus sp showed the highest growth at 18 oC with the specific growth rate and number of divisions per day of 1.62±0.39 and 2.24, and 0.39±0.01 and 0.56, respectively Keywords: Meretrix lusoria, Neorhodella, Minutocellus, microalgae, hard clam Người phản biện: TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh Ngày nhận bài: 18/11/2015 Ngày thông qua phản biện: 18/12/2015 Ngày duyệt đăng: 25/12/2015 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2 * Email: thdolly@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 65 ... sát tăng trưởng tảo nuôi Hình Nghêu vân thu cảng Gomso Nghêu vân thu thập từ cảng Gomso, Buan-gun, Jeollabuk, Hàn Quốc vào tháng 10 năm 2014 Vi tảo thu từ đường tiêu hóa nghêu xác định dựa đặc điểm. .. Trachyneis aspera 3.2 Phân lập tảo Trong 34 loài vi tảo ghi nhận phân lập thành công nuôi hai giống tảo U4 U5 (Hình 2) Sau có giống tảo thuần, hai tảo phân loại phương pháp sinh học phân 60 tử phịng... 3.1 Phân loại tảo thông qua đặc điểm hình thái Thơng qua đặc điểm hình thái vi tảo ghi nhận thu tổng số 34 lồi tảo diện ống tiêu hóa nghêu vân (Bảng 1), có lồi vi khuẩn lam (Cyanobacteria), loài