Xác định gián tiếp Cloxacillin bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử ( F-AAS)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -o0o PHÙNG THỊ PHƢƠNG XÁC ĐỊNH GIÁN TIẾP CLOXACILLIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ (F-AAS) Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Luận HÀ NỘI - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -o0o PHÙNG THỊ PHƢƠNG XÁC ĐỊNH GIÁN TIẾP CLOXACILLIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ (F-AAS) TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI – 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung chất kháng sinh 1.1.1 Lịch sử đời 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đánh giá tác dụng 1.2 Giới thiệu Cloxacilin 1.2.1 Cấu tạo phân tử tính chất 1.2.2 Đặc điểm tác dụng 1.2.3 Điều chế chung 10 1.2.4 Giới hạn cho phép Cloxacilin thực phẩm 11 1.2.5 Tình hình lạm dụng kháng sinh Việt Nam giới 11 1.3 Các phƣơng pháp phân tích Cloxacilin 14 1.3.1 Phương pháp quang học 14 1.3.2 Phương pháp điện hóa 15 1.3.3 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 16 1.3.4 Sắc ký mỏng (TLC) 18 1.3.5 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 19 1.3.6 Phương pháp phân tích vi sinh (ELISA) 22 1.3.7 Phương pháp phân tích dòng chảy (FIA) 22 1.3.8 Phƣơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử 23 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 26 2.1.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 26 2.1.2 Phương pháp áp dụng 26 2.1.3 Nội dung ngiên cứu 27 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất 28 2.2.1 Trang thiết bị dụng cụ 28 2.2.2 Hoá chất 28 CHƢƠNG - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Khảo sát điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử lửa Ag 30 3.1.1 Khảo sát chọn vạch phổ hấp thụ 30 3.1.2 Khảo sát khe đo 31 3.1.3 Khảo sát cường độ dòng đèn catot rỗng 32 3.1.4 Khảo sát thành phần hỗn hợp khí cháy 33 3.1.5 Khảo sát tốc độ dẫn mẫu 34 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng tới phép đo phổ F – AAS Ag 35 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng loại axit nồng độ axit 35 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng thành phần mẫu 36 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng cation 39 3.3 Xây dựng đƣờng chuẩn đánh giá phép đo F – AAS Ag 47 3.3.1 Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính xây dựng đường chuẩn 47 3.3.2 Kiểm tra số phương trình hồi quy 50 3.3.3 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ)51 3.3.4 Tính nồng độ chất phân tích dựa dường chuẩn 52 3.4 Đánh giá sai số độ lặp lại phƣơng pháp đo Ag 53 3.5 Tổng kết điều kiện đo phổ F – AAS Ag 55 3.6 Khảo sát điều kiện phân huỷ Cloxacilin 55 3.6.1 Ảnh hưởng môi trường KOH đến hiệu suất phân huỷ Cloxacilin giải phóng clo 56 3.6.2 Ảnh hưởng nhiệt độ phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất 57 3.6.3 Ảnh hưởng thời gian phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất 58 3.6.4 Ảnh hưởng thời gian đến kết tủa AgCl 59 3.7 Giới hạn phát 60 3.8 Xác định Cloxacilin mẫu thực 61 3.8.1 Lấy mẫu 61 3.8.2 Xử lý mẫu 62 3.8.3 Chuẩn bị mẫu phân tích mẫu 63 3.8.4 Xác định độ thu hồi 65 3.9 Kết phân tích số mẫu thực 66 KẾT LUẬN 68 BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAS Atomic absorption spectrometry (Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử) AbsAg Absortion of Siliver (Độ hấp thụ quang Ag) AMO Amoxicillin AMP Ampicilin A6AP Acid 6-amino penicillanic CE Capillary electrophoresis (Điện di mao quản) CLO Cloxacillic CZE Capillary zone electrophoresis (Điện di mao quản vùng) F-AAS Flame atomic absorption spectrometry (Phổ hấp thụ nguyên tử lửa) HCL Hollow cathde lamp (Đèn catốt rỗng) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantity (Giới hạn xác định) RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) OXA Oxacillin SS Sum of square (tổng bình phương) MỞ ĐẦU Từ lâu việc sử dụng rộng rãi kháng sinh bổ sung vào thức ăn gia súc cho thấy chúng dùng để chống nấm mốc mà cịn có tác dụng kích thích tăng trưởng, tăng cường hiệu sử dụng thức ăn, giảm tỉ lệ chết còi cọc, tăng khả sinh sản Tuy nhiên, sử dụng thức ăn có bổ sung kháng sinh thời gian dài dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh sản phẩm, lượng kháng sinh tồn dư gây dị ứng, gây bệnh cho người sử dụng sản phẩm Đồng thời bổ sung kháng sinh vào thức ăn gia súc gây tượng nhờn thuốc phát triển loại vi khuẩn độc hại kháng thuốc Ở Việt Nam, theo nghiên cứu số tác giả, kháng sinh sử dụng tràn lan thức ăn cho lợn, gia cầm tình trạng tồn dư kháng sinh thịt phổ biến Các nghiên cứu cho hầu hết sở chăn nuôi sử dụng kháng sinh khơng hợp lí (khơng xét nghiệm kháng sinh đồ, sử dụng theo kinh nghệm không liều lượng), số sở chăn nuôi không dùng thuốc quy định, bán chạy sử dụng thuốc khơng hiệu Từ dẫn đến tồn dư kháng sinh thực phẩm cao gấp hàng chục hàng nghìn lần so với tiêu chuẩn quốc tế(CODEX) Chính vậy, kháng sinh đối tượng cần phải kiểm soát dư lượng thực phẩm độc tính, tác dụng phụ gây cho người sử dụng thực phẩm có tồn dư lượng kháng sinh Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích để xác định dư lượng kháng sinh thực phẩm yêu cầu cần thiết Trên giới, phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) ứng dụng phổ biến Phương pháp có nhiều ưu điểm: độ nhạy độ chọn lọc cao, xác định nhiều ion dung dịch, cho phép phân tích nhanh hàng loạt với độ xác lặp lại cao, thao tác tiến hành đơn giản thuận tiện, tự động hố q trình phân tích Ở nước ta phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử phương pháp tiêu chuẩn để phân tích lượng vết kim loại nhiều đối tượng khác như: đất, nước, khơng khí, thực phẩm,…Ngày cách gián tiếp người ta xác định hàng trăm chất hữu phi kim với độ nhạy, độ xác cao Với kết chúng tơi nhận thấy phương pháp AAS phương pháp thích hợp để xác định gián tiếp Cloxacilin thực phẩm Vì luận văn chúng tơi tiến hành nghiên cứu tìm điều kiện phù hợp để xây dựng quy trình xác định Cloxacilin thực phẩm Từ kết thực nghiệm xây dựng quy trình xác định gián tiếp Cloxacilin phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS) CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung chất kháng sinh (1,2,26) 1.1.1 Lịch sử đời Năm 1929, Alexander Fleming phát khả kháng khuẩn nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu sử dụng kháng sinh, sau hàng loạt nghiên cứu, sản xuất sử dụng kháng sinh phát triển mạnh tác dụng hẳn điều trị bệnh nhiễm khuẩn so với thuốc kháng sinh khác Giới y học định nghĩa: Kháng sinh chất tạo thành chuyển hố sinh học, có tác dụng ngăn cản tồn phát triển vi khuẩn nồng độ thấp, sản xuất sinh tổng hợp tổng hợp theo mẫu kháng sinh tự nhiên 1.1.2 Phân loại Các chất kháng sinh phân lọai dựa vào cấu tạo hoá học gồm nhóm sau: - Kháng sinh β -lactam - Kháng sinh Aminoglycosid - Kháng sinh Tetracylin - Cloramphenicol dẫn xuất - Kháng sinh Macrolid - Kháng sinh Lincosamid - Kháng sinh polypeptide - Các kháng sinh khác: Rifamycin 1.1.3 Đánh giá tác dụng Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho sản phẩm kháng sinh thiên nhiên, không nguyên chất Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho chế phẩm kháng sinh bán tổng hợp 1.2 Giới thiệu Cloxacilin Cloxacilin thành viên nhóm kháng sinh penicillin thuộc họ βlactamase 1.2.1 Cấu tạo phân tử tính chất a Cấu tạo phân tử H H COONH S CH3 CH3 Cl N N O O COOH Hình 1.1 Cấu tạo phân tử cloxacillin b Tính chất vật lý Thuốc dạng bột kết tinh trắng trắng, có mùi, vị đắng dễ hút ẩm Dễ tan nước methanol, tan etanol 96%, thực tế không tan ethylacetat c Tính chất hố học Tác dụng cản trở không gian penicillinase nhân isoxazol mang hai nhóm 5-methyl 3-phenyl vị trí ortho vị trí 4- nối với -CO- Do tác dụng hút điện tử nhân isoxazol, kháng sinh bền với axit hấp thụ tốt uống nên dùng đường uống đường tiêm Bảng 3.23 Ảnh hưởng nhiệt độ phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất Hiệu suất (%) Nhiệt độ(0C) Lần đo Lần đo Lần đo TB Nhiệt độ phòng 250C 72,84 71,98 72,50 72,44 500C 73,98 74,06 74,22 74,09 600C 79,16 79,26 79,12 79,18 700C 83,90 84,14 84,26 84,10 800C 89,96 90,06 90,10 90,04 900C 87,06 87,22 87,18 87,15 980C 85,74 85,90 86,06 85,90 Theo kết đo được, mẫu sau đun 800 C hiệu suất kết tủa cao Vậy chọn đun cách thuỷ 800 C để phân huỷ Cloxacilin 3.6.3 Ảnh hưởng thời gian phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất Để khảo sát ảnh hưởng thời gian đun 800C phản ứng tạo kết tủa AgCl, khảo sát dãy mẫu với nồng độ Ag + Cloxacilin đem kết tủa nhau, môi trường KOH 1,0M, thời gian đun để phân huỷ Cloxacilin thay đổi từ  30 phút Kết khảo sát bảng 3.24: 58 Bảng 3.24 Ảnh hưởng thời gian phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất Thời gian đun Hiệu suất (%) (phút) Lần Lần Lần TB 32,70 32,94 33,01 32,88 10 45,32 45,48 45,53 45,44 15 68,36 68,52 68,55 68,48 20 89,76 89,87 89,80 89,81 25 87,15 87,21 87,35 87,24 30 82,19 82,33 82,48 82,33 Kết khảo sát bảng 3.24 cho thấy, sau tiến hành đun nhiệt độ 800C với khoảng thời gian 20 phút cho ta hiệu suất kết tủa cao Vì chúng tơi chon thời gian đun nhiệt độ 800C 20 phút 3.6.4 Ảnh hưởng thời gian đến kết tủa AgCl Mẫu Cloxacilin sau phân hủy đưa nhiệt độ phòng 250C tiến hành cho kết tủa với Ag+, qua thực nghiiệm cho thấy thời gian làm muồi để tạo kết tủa AgCl khác có ảnh hưởng tới lượng kết tủa thu Vì chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian đến kết tủa AgCl Để tiến hành khảo sát, chuẩn bị dãy mẫu có nồng độ Ag + Cloxacilin nhau, sau tiến hành phân huỷ Cloxacilin điều kiện nghiên cứu đưa dung dịch nhiệt độ phòng dùng HNO3 điều chỉnh môi trường để pH=3,8 tiến hành tạo kết tủa với Ag+, thời gian để tạo kết tủa khác Tiến hành kết tủa, ly tâm lọc tách kết tủa, đưa dung 59 dịch lọc điều kiện nồng độ HNO3 mẫu 2% với NH4Ac 1%, đo lượng dư Ag Kết khảo sát bảng 3.25: Bảng 3.25 Ảnh hưởng thời gian đến kết tủa AgCl Thời gian(phút) Hiệu suất kết tủa(%) 40,56 10 70,39 15 89,67 20 80,24 25 60,17 30 57,32 Qua kết khảo sát bảng 3.25 cho ta thấy để tạo kết tủa AgCl thời gian 15 phút tốt Vì chúng tơi chọn thời gian để kết tủa AgCl 15 phút 3.7 Giới hạn phát Giới hạn phát Cloxacilin có nghĩa tiến hành khảo sát nồng độ cloxacilin nhỏ mà hiệu suất kết tủa nằm mức thấp cho phép phát cloxacilin Mỗi nồng độ tiến hành làm 03 mẫu lấy kết hiệu suất trung bình 03 lần thí nghiệm Kết ghi bảng 3.26: 60 Bảng 3.26 Giới hạn phát Cloxacilin Mẫu số Cloxacilin(ppm) Hiệu suất (%) 0,08 85%) Vì tiến hành phân tích nên lấy lượng mẫu cho hàm lượng Cloxacillin lớn 0,30 ppm để có kết phân tích tốt 3.9 Kết phân tích số mẫu thực Mẫu phân tích xử lý theo quy trình mục 3.7.2, mẫu đo chuẩn bị theo mục 3.7.3 sau tiến hành đo phổ F-AAS theo điều kiện chọn mục 3.4 để xác định nồng độ Ag dư Kết đưa bảng 3.29 Kết kết trung bình mẫu, mẫu đo lần, trừ blank Sử dụng phương trình hồi quy thiết lập mục 3.3, ta tính nồng độ Ag dư mẫu theo biểu thức: X o  S Độ lệch chuẩn: S xo = Y / X B Yo  A B (Y0  Y )2 1   m n B  ( X i  X )2 i Y Y i 1 i  0,3335 (X i 1 i  X )  15,3494 Với m=4, n=7, B= 0,1359; SX/Y = 0,0062 Thay giá trị bảng vào ta tính S Xo; với t(0,95; 5)= 2,571 66 Bảng 3.29 Kết xác định lượng Cloxacilin mẫu (Đã lấy bảng 3.27) Tên CCloxacilin Yo Xo S Xo X o  t.S Xo Mẫu 0,2745 1,9941 0,0022 1,9941± 0,0056 < LOQ Mẫu 0,2749 1,9971 0,0031 1,9971 ± 0,0079 < LOQ Mẫu 0,2754 2,0001 0,0031 2,0001 ± 0,0079 < LOQ Mẫu 0,2752 1,9993 0,0025 1,9993 ± 0,0065 < LOQ Mẫu 0,2753 2,0000 0,0031 2,0000 ± 0,0079 < LOQ Mẫu 0,2737 1,9882 0,0033 1,9882 ± 0,0086 0,7256 Mẫu 0,2750 1,9978 0,0029 1,9978 ± 0,0076 < LOQ Mẫu 0,2740 1,9901 0,0031 1,9901 ± 0,0080 0,3988 mẫu (mg/kg) Qua kết cho thấy 08 mẫu thực phân tích có 02 mẫu xác định hàm lượng Cloxacilin 06 mẫu nhỏ giới hạn định lượng Tuy nhiên 02 mẫu xác định hàm lượng Cloxacilin hàm lượng Cloxacilin mẫu vượt giới hạn cho phép Cloxacilin (theo tiêu chuẩn SanPin) 67 KẾT LUẬN Với mục đích nghiên cứu tìm điều kiện phù hợp, xây dựng quy trình xác định gián tiếp cloxacilin thực phẩm phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử F-AAS, số kết sau: -Tối ưu hoá điều kiện xác định Ag phương pháp F-AAS - Khảo sát chọn lọc mơi trường axit chất cải biến thích hợp cho mẫu phân tích - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phép xác định Ag phương pháp F-AAS - Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn định lượng, giới hạn phát Ag phương pháp F-AAS - Đánh giá sai số, độ lặp lại phép đo Ag phương pháp F-AAS - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất kết tủa Cloxacilin Ag như: Nồng độ KOH, nhiệt độ kết tủa, cation, anion có mẫu phân tích - Xác đinh giới hạn phát cloxacilin theo lượng dư Ag - Đã đưa quy trình định lượng cloxacilin, sở chúng tơi tiến hành định lượng cloxacilin số mẫu thực phẩm Với kết thu thấy kỹ thuật F-AAS kỹ thuật thích hợp để xác định cloxacilin mẫu thực phẩm với nhiều ưu điểm: Phân tích nhanh, hàng loạt, độ xác tương đối cao, độ lặp lại tốt, bị ảnh hưởng thành phần mẫu Chúng hy với nghiên cứu góp phần vào việc ứng dụng kỹ thuật F-AAS để xác định gián tiếp hợp chất hữu thực phẩm, đặc biệt lĩnh vực kiểm tra lượng dư tồn kháng sinh thực phẩm 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y Tế (2007), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam, xuất lần thứ 3, Nhà xuất Y học, Hà Nội Chu Đình Bính (2003), Tách xác định đồng thời Chloramphenicol, Dexamethason axetat Hydrocortuson axetat mẫu thuốc phương pháp HPLC, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học KHTN Hà Nội Cục quản lí Chất lượng Nơng lâm sản Thuỷ sản, công văn số 571 QLCLCL1 ngày 14/04/2011, Tiêu chuẩn SanPiN 2.3.3.1078-01 (2011), quy định lượng dư thuốc thú y Nguyễn Văn Đích (2005), "Khơng nên lạm dụng kháng sinh", Báo y học đời sống, số 27 Đặng Thị Thu Hà (2007), Nghiên cứu xác định gián tiếp Clo-Tetracillin thực phẩm phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử, Luận văn thạc sĩ, ĐH Quốc Gia Hà Nội Trần Thị Thu Hằng (2009), Tách xác định β-Lactam đối tượng sinh học phương pháp điện di mao quản, luận văn thạc sĩ, ĐH Quốc gia Hà Nội Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003), Hố học phân tích – Các phương pháp phân tích cơng cụ Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao, ĐH Quốc gia Hà Nội 10 Ngọc Phương (2006), "Thảm họa lạm dụng kháng sinh cho trẻ", Báo laodong.com.vn, 10-10-2006 69 11 Phạm Thị Quỳnh Lương (2002), Nghiên cứu xác định gián tiếp Chloramphenicol thuốc phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS), Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học KHTN Hà Nội 12 Đàm Thị Minh Tâm (2006), Tách xác định hàm lượng Tetracyclin thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học KHTN Hà Nội TIẾNG ANH 13 Althea W McCormick (2003), " Geographic diversity and temporal trends of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae in the United States", Journal Nature medicine, 9: 424 – 430 14 Attila Gaspar, Melinda Andrasi, Szilvia Kardos (2002), “Application of capillary zone electrophoresis to the analysis and to a stability study of cephalosporins”, Journal of Chromatography B, 775(2), pp 239-246 15 A Fernandez-Gonzalez, R Badia and M.E.Diaz-Gar (2003), “Micellemediated spectrofluorinetric determination of ampicillin based on metal ion-catalysed hydrolysis”, Analytica Chimica Acta, 484(2), pp 239-246 16 Biyang Deng, Aihong Shia, Linqiu Lia and Yanhui Kang (2008), "Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled capillary electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48(4), 1249-1253 17 D Hurtaud, Deleeine B; Sanders P (1994), “Particle beam liquid chromatography-mas spectrometry method with negative ion chemical ionization for the confirmation of oxacillin, cloxacillin and dicloxacillin 70 residues in bovine muscle”, Analyst, 199(12), 2731-2736 18 Daniela P Santos, Marcio F Bergamini and Maria Valnice B Zanoni (2008), “Voltammetric sensor for amoxicillin determination in human urine using polyglutamic acid/glutaraldehyde film”, Sensors and Actuators B: Chemical, 133(2), pp 398-403 19 D.P Raymond (2001), " Impact of a rotating empiric antibiotic schedule on infectious mortality in an intensive care unit", Journal of Critical Care Medicin, 29(6):1101-1108 20 E Benito-pena, A.I.Partal-Rodera, M.E.Leon-Gonzalez, M.C.MorenoBondi (2005), “Evaluation of mixed mode solid phase extraction cartridges for the preconcentration of beta-lactam antibiotics in wastewater using liquid chromatography with UV-DAD detection”, Analytical Chimica Acta, 556(2), 415-422 21 F Belal, M M El-Kerdawy, S M El-Ashry and D R El-Wasseef (2000), "Kinetic spectrophotometric determination of ampicillin and amoxicillin in dosage forms", Il Farmaco, 55(11-12), pp 680-686 22 J.M Cha, S Yang, K.H Carlson (2006), ,"Trace determination of βlactam antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry", Journal of Chromatography A, 1115(1-2), 46-57 23 J.O.Boison, and Keng, L.J.Y (1998), “Multiresidue liquid chromatographic method for determining resideues of mono and dibasic penicillins in bovine muscle tissues”, Journal of AOAC International,81(6), 1113-1120 24 J.O.Boison, and Keng, L.J.Y (1998), “ Improvement in the Multiresidue 71 liquid chromatographic analysis of residues of mono and dibasic penicillins in bovine muscle tissues”, Journal of AOAC International,81(6), 1267-1272 25 M.I Bailon-Perez, A.M.Garcia-Campana, C Cruces-Blanco, M del Olmo Iruela (2008), "Trace determination of β-lactam antibiotics in environmental preconcentration aqueous in samples capillary using off-line electrophoresis", and on-line Journal of Chromatography A, 185(2), pp 273-280 26 Nigel J.K Simpson (2000), Solid-phase extraction, Marcel Dekker, New York 27 Richard P Wenzel, M.D Michael B Edmond, M.D., M.P.H (2000), " Managing Antibiotic Resistance", New England Journal of Medicine, 343:1961-1963 28 WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay for the simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk using liquid chromatography - electrospray mass spectrometry", Analyst, 119(12), 2595-2601 72