PHƯƠNG PHÁP PHỔ đạo hàm và ỨNG DỤNG TRONG xác ĐỊNH ĐỒNG THỜI AMOXICILLIN và CLOXACILLIN TRONG THUỐC KHÁNG SINH

LỜI MỞ ĐẦU Kháng sinh sử dụng nhiều Việt Nam mơ hình bệnh tật nước ta chủ yếu bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm kí sinh trùng nhiễm nấm Amoxicillin Cloxacillin kháng sinh thuộc nhóm Penicillin sử dụng phổ biến nay1 Để nâng cao hiểu điều trị tạo điều kiện sử dụng thuốc thuận tiện, kết hợp Amoxicillin trihydrate Cloxacillin Natri chế phẩm định cho bệnh nhiễm đường hô hấp, sinh dục tiết niệu, da mô mềm, điều trị cấp cứu nhiễm khuẩn có nguy cao Việc định lượng Amoxicillin Cloxacillin viên nang tiến hành chủ yếu phương pháp sác ký lỏng hiệu cao Đây kỹ thuật phân tích đại, có khả định tính định lượng đồng thời chất hỗn hợp với tính chọn lọc, độ nhạy, độ độ lặp cao Tuy nhiên kỹ thuật đòi hỏi chi phí tốn (trang thiết bị, dung mơi hóa chất) thời gian phân tích kéo dài Ngày nay, nhờ hỗ trợ công nghệ thông tin, kỹ thuật quang phổ ứng dụng nhiều công tác kiểm nghiệm thuốc Trong số kỹ thuật này, phương pháp phổ đạo hàm đạo hàm tỷ đối biết đến với ưu điểm bật, cho phép định lượng đồng thời trực tiếp, khơng địi hỏi q trình tách chiết tinh chế hỗn hợp đa thành phần, giúp giảm thiểu thời gian chi phí MỤC LỤC TỔNG QUAN .2 1.1 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHỔ ĐẠO HÀM VÀ PHỔ ĐẠO HÀM TỶ ĐỐI 1.1.1 Phương pháp phổ đạo hàm.2 1.1.1.1 Sự đời phương pháp phổ đạo hàm .2 1.1.1.2 Khái niệm phổ đạo hàm .2 1.1.1.3 Các phương pháp tính tốn2 1.1.1.4 Ứng dụng phổ đạo hàm phân tích định tính 1.1.1.5 Ứng dụng phổ đạo hàm phân tích định lượng.4 1.1.1.6 Quy trình định lượng chất phương pháp quang phổ đạo hàm 1.1.1.7 Ưu điểm, nhược điểm phổ đạo hàm.4-5 1.1.1.8 Ứng dụng phổ đạo hàm 1.1.2 Phổ đạo hàm tỷ đối.5, 1.1.2.1 Đạo hàm tỷ đối giao điểm không (zero-crossing ratio spectra derivative spectrophotometry) 1.1.2.2 Đạo hàm tỷ đối số chia kép (Double divisor ratio spectra derivative spectrophotometry)8 1.1.2.3 Đạo hàm phổ tỷ đối số chia liên tiếp (Successive ratio spectra derivative spectrophotomerty)9 1.1.2.4 Ưu điểm nhược điểm.7 .2 1.1.3 So sánh phương pháp 1.1.3.1 Giống: 1.1.3.2 Khác nhau: 1.2 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH .2 1.2.1 Một số đặc điểm hóa lý Amoxicillin trihydrate Cloxacillin Natri 1.2.2 Một số đặc điểm dược động học Amoxicillin Cloxacillin1, 11 2 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1.3.1 Một số phương pháp định lượng đơn AMO CLO chế phẩm10 1.3.1.1 Định lượng AMO 1.3.1.2 Định lượng CLO 1.3.2 Kết luận phương pháp phân tích tham khảo 2 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU12 2.1 Đối tượng nghiên cứu .2 2.2 Thiết bị hóa chất nghiên cứu 2.2.1 Thiết bị 2.2.2 Hóa chất 2.3 Phương pháp phân tích 2.3.1 Các phương pháp phổ13 2.3.2 Phương pháp HPLC: 14 2.4 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời AMO CLO 2.4.1 Các phương pháp phổ 2.4.1.1 Quy trình xử lý mẫu .2 2.4.1.2 Phương pháp phổ đạo hàm 2.4.1.3 Phương pháp phổ đạo hàm tỷ đối 2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng 2.4.2.1 Điều kiện sắc kí 2.4.2.2 Đánh giá áp dụng phương pháp .2 CHƯƠNG TỔNG KẾT .2 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AMO: amoxicillin PĐHTĐ: phổ đạo hàm tỷ đối CLO: cloxacillin HPLC: sắc ký lỏng hiệu cao PĐH: phổ đạo hàm DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình dạng phổ hấp thu phổ đạo hàm bậc.3 Hình 2: Các phương pháp tính tốn: peak-peak (a); tiếp tuyến-đỉnh (b); peak-zero (c); zero-crossing (d) Hình 3: Ảnh hưởng tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thu phổ đạo hàm bậc 1.3 .2 Hình 4: Sự phân đối xử với peak rộng.3 Hình 5: Ứng dụng phổ đạo hàm lĩnh vực khác nhau.6 Hình 6: (a) Phổ hấp thu dung dịch AMO 100.0 µg.mL-1(1); dung dịch CLO 100.0 µg.mL-1(2); hỗn hợp dung dịch AMO 100.0 µg.mL-1, CLO 100.0 µg.mL-1 (3) phổ tổng cộng (4) (1) (2); (b) Phóng to phổ hình (a) Hình 7: Phổ đạo hàm bậc AMO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) CLO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) Hình 8: Phổ đạo hàm bậc hai AMO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) CLO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) Hình 9: Phổ đạo hàm tỷ đối dung dịch hỗn hợp CLO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) AMO (100.0 µg.mL-1) đơn CLO (100.0 µg.mL-1) với số chia AMO 60.0 µg.mL-1 .2 Hình 10 Phổ đạo hàm tỷ đối dung dịch hỗn hợp AMO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) CLO (100.0 µg.mL-1) đơn AMO (100.0 µg.mL-1) với số chia CLO 60.0 µg.mL-1 Hình 11: Sắc kí đồ tách chất AMO 100.0 µg.mL-1 CLO 100.0 µg.mL-1 .2 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Một số đặc điểm hóa lý Amoxicillin trihydrate Cloxacillin Natri10 .2 Bảng 2: Hiệu chuẩn AMO CLO cách sử dụng phương pháp quang phổ HPLC UV .2 Bảng 3: Kết khảo nghiệm để xác định AMO CLO viên nang FACLACIN so sánh với HPLC DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1: Sơ đồ xử lý mẫu để tiến hành phương pháp quang phổ Sơ đồ 2: Sơ đồ pha dung dịch chuẩn TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHỔ ĐẠO HÀM VÀ PHỔ ĐẠO HÀM TỶ ĐỐI Có thể áp dụng đinh luật Beer để xác định nồng độ chất có phổ hấp thu không xen phủ phương pháp đường chuẩn, phương pháp thêm chuẩn phương pháp vi sai Nhưng dung dịch hỗn hợp mà cấu tử có phổ hấp thu xen phủ việc tính tốn phức tạp Vì vậy, nhiều phương pháp cải tiến dựa sở định luật Beer đời nhằm loại trừ ảnh hưởng cấu tử cản trở mà không cần che, tách, cho phép xác định đồng thời cấu tử dung dịch hỗn hợp nhiều cấu tử có phổ hấp thu xen phủ Trong có phương pháp phổ đạo hàm đạo hàm tỷ đối 1.1.1 Phương pháp phổ đạo hàm.2 1.1.1.1 Sự đời phương pháp phổ đạo hàm Phép đo quang phổ UV-Vis phương pháp lâu đời phương pháp quang phổ phân tử Với độ nhạy cao nên phương pháp ta xác định hàm lượng vết cỡ mg.L-1 (ppm) nhiều nguyên tố Ngoài cịn xác định đồng thời nhiều ngun tố chúng có mặt mà khơng nhiều thời gian để tách Để xác định nguyên tố có hàm lượng ppm người ta thường dùng biện pháp làm giàu sản phẩm nghiên cứu như: phương pháp chiết lỏng lỏng, phương pháp điện kết tủa cộng kết có mặt chất chiết góp… trước đo độ hấp thu sử dụng phương pháp động học trắc quang Tuy nhiên phương pháp hạn chế nhược điểm trường hợp phân tích hỗn hợp chất mà phổ hấp thu chúng chồng phủ lên Để khắc phục nhược điểm đó, nhà khoa học có ý tưởng chuyển đổi phổ hấp thu sang phổ đạo hàm nhằm tìm hướng nghiên cứu Những phần mềm chuyên dụng máy tính điện tử kết nối với máy quang phổ cho phép chuyển phổ hấp thu (hay phổ bậc 0) thành phổ đạo hàm bậc 1, bậc 2, bậc cao 1.1.1.2 Khái niệm phổ đạo hàm Nếu diễn tả độ hấp thu (A) hàm theo bước sóng (λ) phương pháp phổ đạo hàm, độ hấp thu (A) lấy vi phân theo bước sóng (λ) để tạo phổ đạo hàm bậc 1, bậc 2, bậc cao Nếu bậc 0: A=f(λ) Bậc 1: =f’(λ) Bậc 2: =f’’(λ) Bậc n: =fn(λ) (2) Hình 1: Hình dạng phổ hấp thu phổ đạo hàm bậc.3 PĐH bậc tốc độ biến thiên độ hấp thu bước sóng, qua điểm λmax phổ đạo hàm hai phía điểm có cực đại cực tiểu ứng với điểm uốn phổ hấp thu PĐH bậc 2, có cực tiểu λmax phổ hấp thu, ngồi có cực đại phụ phía cực tiểu PĐH bậc cực tiểu cực đại điểm uốn phổ hấp thu cịn có cực tiểu cực đại phụ nằm phía cự tiểu cực đại PĐH bậc lại có cực đại trùng với λmax phổ hấp thu ngồi cịn có cực đại phụ cực tiểu phụ Như từ cực trị phổ hấp thu ta có số cực trị PĐH chất số bậc PĐH cộng 1.1.1.3 Các phương pháp tính tốn2  Phương pháp peak-peak: Khoảng cách pn tỉ lệ với nồng độ chất phân tích (Hình 2a)  Phương pháp tiếp tuyến đỉnh: Khoảng cách tn tỉ lệ với nồng độ chất phân tích (Hình 2b)  Phương pháp peak-zero: Khoảng cách zn tỉ lệ với nồng độ chất phân tích (Hình 2c)  Phương pháp zero-crossing: Xác định nồng độ chất điểm qua phổ đạo hàm chất khác (Hình 2d) Hình 2: Các phương pháp tính toán: peak-peak (a); tiếp tuyến-đỉnh (b); peak-zero (c); zero-crossing (d) 1.1.1.4 Ứng dụng phổ đạo hàm phân tích định tính Phổ đạo hàm phức tạp phổ hấp thu phổ đạo hàm có số cực trị tăng lên Do xét mặt định tính phổ đạo hàm có tính đặc trưng phổ hấp thu Những phổ hấp thu giống lấy phổ đạo hàm xuất khác biệt lớn 1.1.1.5 Ứng dụng phổ đạo hàm phân tích định lượng.4 Theo định luật Lambert-Beer: độ hấp thu (A) tỉ lệ thuận bề dày lớp dung dịch ánh sáng qua (l), với nồng độ chất tan dung dịch (C) với hệ số hấp thu phân tử (ɛ) Đạo hàm bậc 0: A=ɛlC (3) Đạo hàm bậc 1: =Cl (3a) Trong đó: Đạo hàm bậc 2: =Cl (3b)  A, dA, d2A, dnA : biên độ hấp thu PĐH bậc 0,1,2,n  ɛ hệ số hấp thu phân tử (L.mol-1.cm-1; L.mg-1.cm-1)  l bề dày lớp dung dịch mà ánh sáng qua (cm) Đạo hàm bậc n: =Cl (3c) Mặt khác bề dày lớp dung dịch (l) không đổi bước sóng xác định đạo hàm ɛ số Do từ phương trình (3) - (3c) ta thấy giá trị đạo hàm độ hấp thu A cịn phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C chất tan dung dịch Ngồi phổ đạo hàm kết chuyển đổi từ phổ hấp thu giá trị phổ đạo hàm bước sóng có tính cộng giống phổ hấp thu ta đo phổ hỗn hợp nhiều chất At = A1+A2+…+An (4) Do phép định lượng cơng thức tính tốn cho phổ hấp thu áp dụng phổ đạo hàm 1.1.1.6 Quy trình định lượng chất phương pháp quang phổ đạo hàm Bước 1: Chuẩn bị dung dịch chuẩn riêng cấu tử hỗn hợp chúng Bước 2: Ghi phổ hấp thu phổ đạo hàm, tìm bước sóng đo thích hợp mà giá trị phổ đạo hàm chất cần phân tích khác cực đại, giá trị phổ đạo hàm cấu tử Bước 3: Sau xác định bước sóng đo bậc đạo hàm định, tiến hành định lượng chất theo phương pháp đường chuẩn thêm chuẩn 1.1.1.7 Ưu điểm Ưu điểm, nhược điểm phổ đạo hàm.4-5 - Phân tích chất có phổ hấp thu chồng chập lên có cực đại hấp thu - cách vài nm Đơn giản phép tính tốn Xử lý mẫu khơng phức tạp, tốn phương pháp khác (GC, HPLC) Do không cần qua khâu chiết tách xử lý mẫu nên phổ đạo hàm sử dụng rộng rãi kiểm nghiệm thuốc phân tích dạng bào chế định lượng hoạt chất chứa thành phần dạng bào chế chứa thành phần có mặt chất bảo quản tá dược thành phần có ảnh hưởng lớn đến việc - định lượng Tính kinh tế cao chi phí cho thiết bị tốn GC, HPLC Loại bỏ tượng trôi gây không ổn định trang thiết bị thao tác giảm ảnh hưởng tán xạ ánh sáng tiểu phân nhỏ xuất mẫu, qua cải thiện độ xác phép định lượng (Hình 3) Hình 3: Ảnh hưởng tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thu phổ đạo hàm bậc 1.3 Nhược điểm - Phương pháp phụ thuộc máy móc cần có phần mềm chun dụng để chuyển từ phổ hấp thu sang phổ đạo hàm - Khi tăng bậc đạo hàm, độ nhọn dải phổ tăng lên nhiên tín hiệu đạo hàm giảm độ rộng dải phổ thu hẹp lại Đáng ý, tăng n tỷ số tín hiệu – nhiễu (signal to noise ratio) lại giảm đặc biệt với peak tù Chính vậy, để ứng dụng quang phổ đạo hàm phân tích, phải cân nhắc thuận lợi khó khăn để lựa chọn bậc đạo hàm thích hợp Hình 4: Sự phân đối xử với peak rộng.3 1.1.1.8 Ứng dụng phổ đạo hàm Hình 5: Ứng dụng phổ đạo hàm lĩnh vực khác nhau.6 1.1.2 Phổ đạo hàm tỷ đối.5, 1.1.2.1 Đạo hàm tỷ đối giao điểm không (zero-crossing ratio spectra derivative spectrophotometry) Dựa tảng phổ đạo hàm người ta tiến hành đo phổ hấp thu chất Khi đem phổ hấp thu chia cho phổ hấp thu hay nhiều chất hỗn hợp, sau lấy đạo hàm độ hấp thu chất dùng làm chất chia hỗn hợp có giá trị đạo hàm 0, giá trị đạo hàm hỗn hợp tổng giá trị đạo hàm chất lại Xét hỗn hợp gồm chất X, Y, Z với giá trị độ hấp thu hỗn hợp: A = αCx + βCy + γCz (5) Trong đó:  A độ hấp thu hỗn hợp  Cx, Cy, Cz nồng độ chất X, Y, Z  α, β, γ hệ số hấp thu chất X, Y, Z Độ hấp thu chất chuẩn X với nồng độ A0,X = α (6) Phương trình (5) chia phương trình (6), ta được: = + + (7) Mà =k (const) (8)  = + + (9) Đạo hàm bậc phương trình (7) ta được: = + (10) Dựa vào phổ đạo hàm thu được, ta chon bước sóng λy mà = (10) => = Tại λy ta thu giá trị đạo hàm chất Z với X chất chia mà phổ tỷ đối chất Y với X Lập đường chuẩn giá trị đạo hàm theo nồng độ dung dịch chuẩn Z, dựa vào đường chuẩn, ta xác định nồng độ chất Z Tương tự dựa theo đường chuẩn giá trị đạo hàm theo nồng độ (với X chất chia) bước sóng mà phổ tỷ đối Z 0, ta xác định nồng độ chất Y 1.1.2.2 Đạo hàm tỷ đối số chia kép (Double divisor ratio spectra derivative spectrophotometry)8 Trong phương pháp này, số chia độ hấp thu hỗn hợp hai dung dịch chuẩn X0 Y0 = + Tại vùng bước sóng hay số bước sóng định, số hạng thứ không đổi, lấy đạo hàm: = Khi phương trình trờ thành: = Phương trình cho thấy tín hiệu khơng cịn phụ thuộc vào nồng độ X, Y mẫu thử, chọn bước sóng mà phổ đạo hàm cực đại cực tiểu để định lượng Z, tính tương tự cho X, Y 1.1.2.3 Đạo hàm phổ tỷ đối số chia liên tiếp (Successive ratio spectra derivative spectrophotomerty)9 Trong phương pháp này, số chia độ hấp thu chất chuẩn Z = + đạo hàm bậc : = + Lặp lại phép chia lấy đạo hàm thay số chia (tương ứng PĐHTĐ bậc dung dịch chuẩn hai chất Y Z), kết cuối thu được: = ] Trong phương trình, đạo hàm tỷ đối số chia liên tiếp tỉ lệ với nồng độ X, khơng phụ thuộc nồng độ chất cịn lại Do phương pháp định lượng X hỗn hợp thành phần 1.1.2.4 Ưu điểm nhược điểm.7 Ưu điểm: Phép toán đạo hàm tỷ đối giúp loại hay nhiều cấu tử hỗn hợp, xác định chất cịn lại mà khơng ảnh hưởng đến chất chia, làm giảm số đường chuẩn cần dựng thực nghiệm Nhược điểm: Phương pháp phổ đạo hàm tỷ đối áp dụng không thuận lợi trường hợp có chênh lệch lớn nồng độ chất hỗn hợp, dẫn đến chệnh lệch lớn tín hiệu đạo hàm 1.1.3 So sánh phương pháp 1.1.3.1 Giống: Đều dựa phổ hấp thu chất vùng khảo sát để định lượng chất Dựa vào phép toán đạo hàm để chọn bước sóng định lượng chất mà khơng ảnh hưởng chất (giá trị chất bước sóng chọn có giá trị đạo hàm 0) 1.1.3.2 Khác nhau: Phổ đạo hàm tỷ đối có ưu điểm phổ đạo hàm loại trừ hay nhiều cấu tử gây chồng chập phổ phần mềm tính tốn Do loại trừ dễ dàng ảnh hưởng gây sai số số cấu tử có mẫu, khơng cần trải qua trình dùng chất che hay xử lý mẫu qua trình tách chiết phức tạp Nhờ đặc điểm mà phương pháp phổ đạo hàm tỷ đối ưu việt phổ đạo hàm việc định lượng mẫu có cấu tử trở lên 1.2 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH 1.2.1 Một số đặc điểm hóa lý Amoxicillin trihydrate Cloxacillin Natri Bảng 1: Một số đặc điểm hóa lý Amoxicillin trihydrate Cloxacillin Natri10 Công AMOXICILLIN TRIHYDRATE C16H19N3O5S.3H2O (M=419.4) CLOXACILLIN NATRI C19H17ClN3NaO5S.H2O (M=475.9) thức Cl H hóa H H N học H O HO COONa O NH2 H N S CH3 CH3 N 3H2O N H N O S H O COOH H H3C CH3 H2O CH3 H O Tên Acid (6R)-6-(α-D-4- Natri ((6R)-6-3-(2-clorophenyl)-5- khoa hydroxyphenylglycylamino) methylisoxazol-4-carboxamido) học penicilanic trihydrate penicilate monohydrate Tính Bột kết tinh màu trắng dạng tinh thể, Bột kết tinh màu trắng, gần chất vị đắng Khó tan nước, alcol; trắng, có mùi, vị đắng, dễ hút ẩm Dễ vật lý không tan ether, chloroform, tan nước, methanol Tan dầu; tan tốt dung dịch acid ethanol 96% Không tan hydroxyde kiềm lỗng ethylacetate pH (nước) = 3.5 ÷ 5.5 pH (nước) = 5.0 ÷ 7.0 1.2.2 Một số đặc điểm dược động học Amoxicillin Cloxacillin 1, 11 Amoxicillin kháng sinh beta-lactam phổ trung bình sử dụng để điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn Gram dương nhạy cảm với penicillin số vi khuẩn Gram âm Amoxicillin có khả kháng acid dày Nó hấp thu nhanh hấp thu hoàn toàn kháng sinh beta-lactam khác dùng đường uống Sau uống liều 250 mg amoxicillin – giờ, nồng độ amoxicillin máu đạt khoảng - µg.mL-1, uống 500 mg, nồng độ amoxicillin đạt khoảng – 10 µg.mL-1 Tăng liều gấp đơi làm nồng độ thuốc máu tăng gấp đôi Khoảng 60% liều uống amoxicillin thải nguyên dạng qua nước tiểu vòng - Amoxicillin có nồng độ cao dịch mật phần thải qua phân Cloxacillin penicillin bán tổng hợp dùng dạng muối natri để điều trị nhiễm khuẩn tụ cầu vi sinh vật penicillinase dương tính Khơng giống amoxicillin, thuốc kháng sinh hấp thu khơng đầy đủ từ đường tiêu hóa, hấp thu bị giảm có mặt thực phẩm dày Cloxacillin chuyển hóa mức độ hạn chế Thuốc chưa biến đổi chất chuyển hóa tiết nước tiểu cách lọc qua cầu thận tiết ống thận Khoảng 35% liều uống đào thải qua nước tiểu Tuy thành phần chưa biến đổi thải ngồi dùng khơng liều: dùng khơng đủ liều không không trị dứt bệnh cá nhân mà có gây hại cho cộng đồng tượng kháng thuốc vi khuẩn; dùng liều gây hại cho người dùng thuốc, chí tử vong Vì cần kiểm sốt hàm lượng thành phần chặt chẽ thuốc 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1.3.1 Một số phương pháp định lượng đơn AMO CLO chế phẩm 10 1.3.1.1 Phương pháp HPLC Định lượng AMO AMO tách khỏi mẫu nhờ tương tác pha tĩnh pha động cột C18 sau đưa đến đầu dị UV cho tín hiệu định lượng diện tích peak chiều cao peak chọn bước sóng 254 nm Thành phần pha động sử dụng gồm có MeOH: dd KH2PO4 45% w/w (5:95); acetonitrile : dd KH2PO4 0.05M pH 5.0 (1:99) Phép chuẩn độ đo Hàm lượng phần trăm AMO tính hàm lượng phần trăm penicillin toàn phần trừ hàm lượng phần trăm sản phẩm phân huỷ Penicillin tồn phần: Chế phẩm hịa tan vào dung dịch đệm boric pH 9.0 alhydride acetic trước tiến hành phản ứng thuỷ phân môi trường kiềm chuẩn độ bằng Hg(NO3)2 0.02M môi trường đệm acetate pH 4.6 Điểm kết thúc chuẩn độ đo xác định với điện cực so sánh điện cực thuỷ ngân - thuỷ ngân (I) sulfat; điện cực thị điện cực platin Phép đo iod sau phản ứng (định lượng viên nang, viên nén amoxicillin) Thủy phân AMO môi trường kiểm Sản phẩm phân hủy AMO phản ứng với iod Định lượng iod dư Na2S2O3 0.01N với thị hồ tinh bột cho vào thời điểm gần kết thúc định lượng Tiến hành song song với mẫu trắng Kết tính theo phương pháp thừa trừ Phương pháp đo quang phổ tử ngoại Dựa vào định luật Lambert-beer, độ hấp thu tỉ lệ nồng độ chất phân tích Định lượng trực tiếp AMO, sau pha lỗng dung mơi, đo bước sóng 325nm Tiến hành song song với mẫu chuẩn 1.3.1.2 Định lượng CLO Phương pháp HPLC CLO tách khỏi mẫu nhờ tương tác pha tĩnh pha động cột pha đảo cột C18 sau đưa đến đầu dị UV cho tín hiệu định lượng diện tích peak chiều cao peak, chọn bước sóng 225 nm Thành phần pha động sử dụng gồm có acetonitrile : dd KH2PO4 0.05 M pH 5.0 (1:96), acetonitrile : dd KH2PO4 0.02M pH 6.8 (20:80); acetonitrile : dd KH2PO4 2.7 µg.mL-1, pH 5.0 (25:75) Phương pháp chuẩn độ đo Hàm lượng phần trăm CLO tính hàm lượng phần trăm penicillin toàn phần trừ hàm lượng phần trăm sản phẩm phân huỷ Penicillin toàn phần: Chế phẩm hòa tan vào dung dịch đệm boric pH 9.0 alhydride acetic, tiến hành phản ứng thuỷ phân môi trường kiềm chuẩn độ Hg(NO3)2 0.02M môi trường đệm acetate pH 4.6 Điểm kết thúc chuẩn độ đo xác định với điện cực so sánh điện cực thuỷ ngân - thuỷ ngân (I) sulfate; điện cực thị điện cực platin Phương pháp đo quang phổ tử ngoại Dựa vào định luật Lambert-Beer (độ hấp thu tỉ lệ nồng độ chất phân tích) Định lượng trực tiếp CLO qua việc tạo phức imidazole thủy ngân Sau đo độ hấp thu quang bước sóng 346nm Tiến hành song song với mẫu chuẩn Phương pháp vi sinh vật Dựa vào tính chất đường kính vịng vơ khuẩn mẫu thử mẫu chuẩn tỷ lệ thuận với lượng cloxacillin tương ứng có mẫu Phương pháp sử dụng thị: Bacillus subtilis ATCC 6633 1.3.2 Kết luận phương pháp phân tích tham khảo Qua phân tích tài liệu tham khảo, có nhiều phương pháp triển khai cho công tác kiểm nghiệm chế phẩm đơn thành phần amoxicillin cloxacillin Để xác định đồng thời thường dùng phương pháp HPLC tốn chi phí dung mơi, trang thiết bị đắt tiền thời gian phân tích mẫu kéo dài Do vậy, phương pháp phổ đạo hàm tiến hành nhằm xây dựng phương pháp quang phổ tiết kiệm dung mơi hóa chất, thời gian phân tích có khả thay HPLC công tác kiểm nghiệm CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU12 2.1 Đối tượng nghiên cứu FACLACIN 2, thuốc thương hiệu thương mại có sẵn thị trường nội địa (do Công ty Cổ phần Dược Trung ương Pharbaco sản xuất, có chứa 250 mg AMO (dạng amoxicillin trihydrate) 250 mg CLO (dạng cloxacillin natri) tá dược viên 2.2 Thiết bị hóa chất nghiên cứu 2.2.1 Thiết bị  Máy quang phổ chùm tia UNICAM UV 300 (Thermo Spectronic, Mỹ) Bề rộng khe cố định 1.5 nm, kết nối máy tính IBM, phần mềm Thermo Spectronic VISION 32, curvet thạch anh, cm, thông số kỹ thuật: khoảng bước sóng qt 200.0 ÷ 300.0 nm, khoảng bước sóng ghi giá trị phổ 0.1 nm  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Agilent 1100 ghép nối đầu dò DAD  Các dụng cụ thủy tinh khác 2.2.2 Hóa chất  Amoxicillin trihydrate (98.4%), cloxacillin Natri (98.3%), tất tá dược cung cấp Công ty Cổ phần Dược Trung ương Pharbaco  Nước cất hai lần  Tất thuốc thử có phân tích  Kali dihydrophophate (KH2PO4) loại tinh khiết phân tích methanol 2.3 Phương pháp phân tích 2.3.1 Các phương pháp phổ13 Nguyên tắc: Dựa định luật Lambert - Beer (độ hấp thu tỉ lệ nồng độ chất phân tích) - Ta tiến hành quét phổ hấp thu dung dịch cần phân tích, chọn bước sóng định lượng thích hợp để loại bỏ ảnh hưởng chất gây cản trở - Chọn khảo sát nồng độ nằm khoảng tuyến tính nồng độ tín hiệu đo - Kiểm tra độ lặp phương pháp - Kiểm tra độ phương pháp 2.3.2 Phương pháp HPLC: 14 Nguyên tắc: Trong hỗn hợp chất phân tích, cấu trúc phân tử tính chất lí hố chất khác nhau, nên khả tương tác chúng với pha tĩnh pha động khác Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác tách khỏi đến đầu dị ghi nhận tín hiệu bước sóng thích hợp - Thẩm định điều kiện sắc kí - Chọn khoảng nồng độ có phụ thuộc tuyến tính nồng độ giá trị diện tích peak - Kiểm tra độ lặp phương pháp - Kiểm tra độ phương pháp 2.4 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời AMO CLO 2.4.1 Các phương pháp phổ 2.4.1.1 Quy trình xử lý mẫu Đối tượng mẫu dạng thuốc viên nang Vỏ nang thành phần chủ yếu gelatin, polymer, chất dẻo, chất màu, chất bảo quản… nên thành phần thuốc nằm phần bột bên vỏ Cân viên thuốc nang, lấy hết bột thuốc nang, dùng tăm lau vỏ nang, cân lại vỏ nang Khối lượng thuốc nang thuốc hiệu khối lượng nang thuốc trừ vỏ nang thuốc15 Xác định khối lượng trung bình viên, đồng cách nghiền mịn trộn lượng bột 20 viên Cân xác lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 50 mg AMO 50 mg CLO hòa tan với khoảng 50 mL nước cất, đánh siêu âm 20 phút, lọc vào bình định mức 100mL, rửa cặn rắn lần với nước cất, lần 10mL, thêm nước tới vạch dung dịch thử có nồng độ 500 µg.mL-1 Lấy xác 5.00 mL dung dịch định mức 25 mL, thu dung dịch thử có nồng độ 100 µg.mL-1 Sơ đồ 1: Sơ đồ xử lý mẫu để tiến hành phương pháp quang phổ Dung dịch chuẩn: Sơ đồ 2: Sơ đồ pha dung dịch chuẩn - Các dung dịch hỗn hợp chuẩn AMO CLO pha từ dung dịch gốc đơn chất chuẩn - Mẫu tự tạo: pha từ dung dịch chuẩn gốc đơn tá dược gồm bột sắn, bột talc, magnesi stearat theo tỉ lệ nhà sản xuất Hình 6: (a) Phổ hấp thu dung dịch AMO 100.0 µg.mL-1(1); dung dịch CLO 100.0 µg.mL-1(2); hỗn hợp dung dịch AMO 100.0 µg.mL-1, CLO 100.0 µg.mL-1 (3) phổ tổng cộng (4) (1) (2); (b) Phóng to phổ hình (a) Hình cho thấy quang phổ hấp thu AMO CLO chồng chéo lớn vùng bước sóng 200.0÷300.0 nm AMO có độ hấp thu cực đại bước sóng 271.8 nm, CLO cho thấy dải giảm dần độ hấp thu từ 210.0 nm 280.0 nm Nên tiến hành định lượng đồng thời AMO CLO hỗn hợp hai thành phần Muốn định lượng ta phải tiến hành tách chiết chất đo quang bước sóng thích hợp Nhưng làm đòi hỏi kỹ thuật xử lý mẫu phức tạp tốn thời gian Nên ta sử dụng phương pháp phổ đạo hàm phổ đạo hàm tỷ đối (PĐH PĐHTĐ) để xác định đồng thời mà không qua tách chiết 2.4.1.2 Phương pháp phổ đạo hàm Lấy đạo hàm bậc phổ hấp thu đơn chất AMO CLO (60.0 - 140.0 µg.mL -1) khoảng bước sóng khảo sát (1) (2) (3) (4) (5) Nồng độ 60.0 µg.mL-1 Nồng độ 80.0 µg.mL-1 Nồng độ 100.0 µg.mL-1 Nồng độ 120.0 µg.mL-1 Nồng độ 140.0 µg.mL-1 Hình 7: Phổ đạo hàm bậc AMO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) CLO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) Hình Ta thấy 258.7 271.6 nm giá trị PĐH bậc AMO 0, giá trị PĐH bậc CLO khơng có điểm qua Chỉ có 258.7 nm chọn để xác định CLO giá trị PĐH CLO 271.6 nm nhỏ nên sai số định lượng lớn Không xác định AMO phương pháp phổ đạo hàm bậc Ta tiếp tục lấy đạo hàm bậc hình b (1) (2) (3) (4) (5) Nồng độ 60.0 µg.mL-1 Nồng độ 80.0 µg.mL-1 Nồng độ 100.0 µg.mL-1 Nồng độ 120.0 µg.mL-1 Nồng độ 140.0 µg.mL-1 Hình 8: Phổ đạo hàm bậc hai AMO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) CLO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) Ngược lại, hình (b) phổ đạo hàm bậc qua hai điểm 269.6 281.4 nm CLO Tuy nhiên giá trị bước sóng AMO khơng đủ để xác định xác AMO từ phương trình hồi quy tương ứng Điều có nghĩa AMO xác định cách sử dụng kỹ thuật phổ đạo hàm bậc 2.4.1.3 Phương pháp phổ đạo hàm tỷ đối Để tối ưu hóa kỹ thuật này, ảnh hưởng nồng độ chuẩn chia ước tính khảo sát với nồng độ để tuân theo Lambert-Beer 60.0 -140.0 µg.mL -1 Phổ chia chuẩn 60.0 µg.mL-1 coi thích hợp cho việc xác định hai loại thuốc Với AMO: Lấy phổ hấp thu hỗn hợp chứa CLO 100 µg.mL -1 + AMO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) chia cho phổ hấp thu CLO 60.0 µg.mL-1, xử lí PĐHTĐ Bước sóng định lượng xác định qua trùng lặp phổ đạo hàm tỉ đối AMO 100 µg.mL-1 hỗn hợp AMO 100 µg.mL-1 + CLO 100 µg.mL-1 Qua khảo sát nhiều bước sóng lựa chọn bước sóng định lượng 266.2 nm bước sóng có tín hiệu đạo hàm lớn Với CLO: Lấy phổ hấp thu hỗn hợp AMO 100.0 µg.mL-1 + ClO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) chia cho phổ hấp thu AMO 60.0 µg.mL-1, xử lý PĐHTĐ Bước sóng định lượng xác định qua trùng lặp phổ đạo hàm tỉ đối CLO 100 µg.mL-1 hỗn hợp AMO 100 µg.mL-1 + CLO 100 µg.mL-1 Qua khảo sát nhiều bước sóng lựa chọn bước sóng định lượng 258.0 nm bước sóng có tín hiệu đạo hàm lớn (1) Nồng độ CLO 60.0 µg.mL-1 + AMO 100.0 µg.mL-1 (2) Nồng độ CLO 80.0 µg.mL-1 + AMO 100.0 µg.mL-1 (3) Nồng độ CLO 100.0 µg.mL-1 + AMO 100.0 µg.mL-1 (4) Nồng độ CLO 120.0 µg.mL-1 + AMO 100.0 µg.mL-1 (5) Nồng độ CLO 140.0 µg.mL-1 + AMO 100.0 µg.mL-1 Hình 9: Phổ đạo hàm tỷ đối dung dịch hỗn hợp CLO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) AMO (100.0 µg.mL-1) đơn CLO (100.0 µg.mL-1) với số chia AMO 60.0 µg.mL-1 (1) Nồng độ AMO 60.0 µg.mL-1 + CLO 100.0 µg.mL-1 (2) Nồng độ AMO 80.0 µg.mL-1 + CLO 100.0 µg.mL-1 (3) Nồng độ AMO 100.0 µg.mL-1 + CLO 100.0 µg.mL-1 (4) Nồng độ AMO 120.0 µg.mL-1 + CLO 100.0 µg.mL-1 (5) Nồng độ AMO 140.0 µg.mL-1 + CLO 100.0 µg.mL-1 Hình 10 Phổ đạo hàm tỷ đối dung dịch hỗn hợp AMO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) CLO (100.0 µg.mL-1) đơn AMO (100.0 µg.mL-1) với số chia CLO 60.0 µg.mL-1 2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng Dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu: tương tự phương pháp quang phổ thay dung môi nước thành dung môi pha động Dung dịch mẫu lọc qua màng lọc 0.45 µm 2.4.2.1 Điều kiện sắc kí Cột Pha động Tốc độ dịng Detector Thể tích tiêm Chế độ Apollo C18 (150 mm x 4.6 mm, 5µm) KH2PO4 (0.01M) : methanol (45:55, v/v) 1.0 mL.phút-1 225 nm 20 μL Isocratic Thời gian lưu giữ tương ứng 1.57 4.00 phút AMO CLO Các thông số sắc ký độ phân giải (Rs = 15.68), độ khơng đối xứng đỉnh (AF