THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TRONG PHÂN TÍCH HOA HỌC VÀ VI SINH VẬT

VIỆN KIỂM NGHIỆM AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM QUỐC GIA THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TRONG PHÂN TÍCH HĨA HỌC VÀ VI SINH VẬT Chủ biên DS Trần Cao Sơn Nhóm biên soạn: DS Trần Cao Sơn PGS TS Phạm Xuân Đà TS Lê Thị Hồng Hảo CN Nguyễn Thành Trung Hiệu đính PGS Phạm Gia Huệ KS Phạm Thanh Nhã MỤC LỤC LỜI GIỚI THIỆU LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC CHƯƠNG 1: CÁC YÊU CẦU CHUNG 1 Khái niệm thẩm định phương pháp .1 Thẩm định phương pháp tiêu chuẩn (method verification) Thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn (method validation) .2 Thẩm định lại CHƯƠNG II: THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC Tính đặc hiệu/chọn lọc .7 1.1 Định nghĩa: 1.2 Cách xác định: 1.2.1 Trường hợp chung: .7 1.2.2 Các trường hợp đặc biệt: 1.3 Tính đặc hiệu/chọn lọc phương pháp chuẩn: .11 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 11 2.1 Định nghĩa: .11 2.2 Cách xác định khoảng tuyến tính: 12 2.3 Xây dựng đường chuẩn: 12 2.3.1 Đường chuẩn với chuẩn tinh khiết: 13 2.3.2 Đường chuẩn mẫu trắng: 13 2.3.3 Đường chuẩn mẫu thực: 14 2.3.4 Đường chuẩn có sử dụng nội chuẩn: 14 2.4 Các lưu ý xây dựng đường chuẩn: 15 2.5 Giới hạn chấp nhận đường chuẩn: .16 Giới hạn phát 16 3.1 Định nghĩa 16 3.2 Cách xác định 16 3.2.1 LOD phương pháp định tính: .17 3.2.2 LOD phương pháp định lượng: 17 Giới hạn định lượng 20 4.1 Định nghĩa 20 4.2 Cách xác định 20 Độ xác (độ độ chụm) 22 5.1 5.1.1 Định nghĩa 23 5.1.2 Cách xác định 24 5.1.3 Tiêu chí đánh giá: .26 5.2 Độ chụm 23 Độ (trueness) 27 5.2.1 Định nghĩa: .27 5.2.2 Cách xác định độ đúng: 28 5.2.3 Tiêu chí đánh giá 33 Độ ổn định (hay độ vững/độ chắn) phương pháp 34 6.1 Định nghĩa 34 6.2 Cách xác định 35 CHƯƠNG III: THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT 36 Các yêu cầu chung 36 1.1 Chuẩn bị thẩm định 36 1.2 Lựa chọn thông số thẩm định 37 Thẩm định phương pháp tiêu chuẩn (method verification) 37 2.1 Phương pháp định tính .37 2.1.1 Giới hạn phát 37 2.1.2 Xác định độ xác (accuracy:AC), độ đặc hiệu (specificity:SP), độ nhạy (sensitivity:SE), độ lệch dương (Positive deviation:PD) độ lệch âm (negative deviation:ND) 38 2.2 Phương pháp định lượng 40 2.2.1 Giới hạn phát giới hạn định lượng .40 2.2.2 Xác định độ chụm (độ lặp lại độ tái lập nội bộ) 41 CHƯƠNG IV: ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐO .44 Khái niệm độ không đảm bảo đo 44 Các nguồn gây độ không đảm bảo đo 44 Các cách đánh giá độ không đảm bảo đo 45 3.1 Cách 1: Ước lượng độ không đảm bảo đo theo hướng dẫn EURACHEM 45 3.1.1 Bước 1: Xác định đại lượng đo 45 3.1.2 Bước 2: Xác định nguồn gây độ không đảm bảo đo 45 3.1.3 Bước 3: Tính thành phần độ khơng đảm bảo đo .46 3.1.4 Bước 4: Tính độ không đảm bảo đo tổng hợp mở rộng .48 3.2 Cách 2: Ước lượng độ khơng đảm bảo đo từ liệu phân tích mẫu thực 50 3.2.1 Xác định độ không đảm bảo đo mẫu nồng độ 50 3.2.2 Xác định độ không đảm bảo đo mẫu nồng độ khác 51 Công bố độ không đảm bảo đo 51 4.1 Cách viết độ không đảm bảo đo chuẩn tổng hợp .52 4.2 Cách viết độ không đảm bảo đo mở rộng 52 CHƯƠNG V: ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM .53 Phép thử nghiệm lặp lại 53 Phép thử nghiệm tái lập 53 Phép thử nghiệm mẫu lưu 53 Phép thử nghiệm mẫu trắng 54 Phép thử nghiệm mẫu chuẩn .54 Phép thử nghiệm mẫu thêm .54 Sử dụng phương pháp khác .54 Đánh giá phù hợp hệ thống 54 Tham gia chương trình thử nghiệm liên phòng 55 10 Sử dụng biểu đồ kiểm soát 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 Phụ lục 1: Bảng phân phối chuẩn Student với mức ý nghĩa từ 0,10 đến 0,001 .59 Phụ lục 2: Bảng phân phối chuẩn Fisher với k1, k2 bậc tự do, α mức ý nghĩa .60 Phụ lục 3: Lựa chọn đối tượng mẫu để thẩm định phương pháp vi sinh 62 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AOAC (Assosiation of Official Analytical Chemists): Hiệp hội nhà hóa phân tích thức ASTM (American Society for Testing of Materials): Hiệp hội phép thử Mỹ CRM (Certified reference material): Mẫu chuẩn chứng nhận DAD (Diod array detector): Detector mảng diod GC-MS (Gas chromatography mass spectrometry): Sắc ký khí Khối phổ HPLC (High performance liquid chromatography): Sắc ký lỏng hiệu cao HR (High resolution): Độ phân giải cao ICH (International Conference on Harmonization): Hội đồng hòa hợp quốc tế IP (Identification point): Điểm nhận dạng ISO (International Standard Organization): Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế LC-MS (Liquid chromatography mass spectrometry): Sắc ký lỏng Khối phổ LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát LOQ (Limit of Quantification): Giới hạn định lượng LR (Low resolution): Độ phân giải thấp MRLs (Maximum residue Limits): Giới hạn tồn dư tối đa QC (Quality control): Kiểm tra chất lượng S/N (Signal to noise ratio): Tỷ lệ tín hiệu nhiễu SOP (Standard Operation Procedure): Quy trình thao tác chuẩn TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam USFDA (United States Food and Drug Administration): Cục dược phẩm thực phẩm Mỹ USP (United States Phamacopeia): Dược điển Mỹ Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật CHƯƠNG 1: CÁC YÊU CẦU CHUNG Khái niệm thẩm định phương pháp Thẩm định phương pháp khẳng định việc kiểm tra cung cấp chứng khách quan chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt (fitness for the purpose) Kết thẩm định phương pháp sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy kết phân tích Thẩm định phương pháp phân tích phần khơng thể thiếu muốn có kết phân tích đáng tin cậy Hện nhiều thuật ngữ khác sử dụng để khái niệm trên, định trị phương pháp, đánh giá phương pháp, xác nhận giá trị sử dụng phương pháp, phê duyệt phương pháp Tất thuật ngữ cách gọi khác thẩm định phương pháp (method validation) Phòng thử nghiệm thường sử dụng nhiều phương pháp khác Dựa vào nguồn gốc phân loại phương pháp thành hai nhóm: - Các phương pháp tiêu chuẩn: phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học chấp nhận rộng rãi giới TCVN, ISO, ASTM, AOAC… - Các phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội (nonstandard/alternative/in-house method): phương pháp phòng thử nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn nhà sản xuất thiết bị, phương pháp theo tạp chí, tài liệu chuyên ngành Theo yêu cầu ISO 17025, phương pháp phân tích phải thẩm định (method validation) thẩm định lại khi: - Phương pháp áp dụng phương pháp tiêu chuẩn (non-standard method) - Phương pháp phòng thử nghiệm tự xây dựng trước đưa vào sử dụng thành thường qui - Khi có thay đổi đối tượng áp dụng nằm đối tượng áp dụng phương pháp thẩm định phương pháp tiêu chuẩn - Khi có thay đổi điều kiện thực phương pháp thẩm định (ví dụ: thiết bị phân tích với đặc tính khác biệt, mẫu, người phân tích …) Thẩm định phương pháp tiêu chuẩn (method verification) Một phương pháp phân tích trước áp dụng cần có chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt ra, tức phương pháp phải thẩm định Yêu Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật cầu không cho phương pháp thử nội mà cần cho phương pháp tiêu chuẩn Việc thẩm định phương pháp tiêu chuẩn phương pháp nội có khác nhau, cần ý lập kế hoạch thẩm định Có hai yêu cầu chủ yếu việc thẩm định phương pháp tiêu chuẩn: - Phải có kết thẩm định phương pháp tiêu chuẩn, kết phải phù hợp với yêu cầu phòng thử nghiệm - Phòng thử nghiệm cần đảm bảo đạt thơng số mô tả phương pháp tiêu chuẩn Theo yêu cầu ISO 17025, phòng thử nghiệm áp dụng phương pháp tiêu chuẩn cần có hồ sơ đánh giá điều kiện bản, nguồn lực theo yêu cầu phương pháp thử việc đạt kết thử nghiệm có độ xác phương pháp yêu cầu mong muốn phòng thử nghiệm Đối với phương pháp thử ban hành mà khơng có liệu độ xác phòng thử nghiệm phải xác định liệu độ xác phép thử dựa liệu nghiên cứu thử nghiệm Để xây dựng bước thẩm định phương pháp tiêu chuẩn cần kiểm tra: Phương pháp thẩm định hay chưa, thẩm định toàn hay phần? Nền mẫu có giống hay khơng? Khoảng làm việc phương pháp có phù hợp với u cầu phòng thử nghiệm hay khơng? Có loại thiết bị (hãng sản xuất, model) hay khơng? Phương pháp tiêu chuẩn có cho sử dụng loại thiết bị khác khơng? Có lưu ý đặc biệt phương pháp tiêu chuẩn mà phòng thử nghiệm khơng thể đáp ứng khơng? Nếu yếu tố khơng phù hợp, phòng thử nghiệm cần thực phép thử để đánh giá lại phương pháp Các kết đánh giá cần phải tương ứng với kết thẩm định phương pháp chuẩn, không cần phải thẩm định lại toàn phương pháp Việc đánh giá bao gồm: Việc khẳng định có đủ thiết bị, nhân viên, thuốc thử, môi trường điều kiện khác để thực phép thử Kiểm tra thông số phương pháp, theo yêu cầu cụ thể lĩnh vực hóa học vi sinh mô tả chi tiết chương sau Thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn (method validation) Đối với phương pháp không tiêu chuẩn, việc thẩm định phải trải qua nhiều bước trình nghiên cứu khảo sát phương pháp, tối ưu hóa phương pháp đến hoàn thiện phương pháp Thẩm định phương pháp yêu cầu bắt buộc phải thực Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật 52 Xác định độ không đảm bảo đo mẫu nồng độ khác - Thực phân tích mẫu thêm chuẩn (với nồng độ khác nhau) - Phân tích mẫu lặp lại tối thiểu 20 lần, tính kết lần phân tích (các lần phân tích nên bố trí ngày khác nhau) từ xác định độ thu hồi lần phân tích - Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn hệ số biến thiên độ thu hồi phân tích - Độ khơng đảm bảo đo tính theo cơng thức sau: u R (%) t  ,k CVR (%) Trong đó: uR : Độ không đảm bảo đo tổng theo thu hồi (%) CVR : Hệ số biến thiên độ thu hồi (%) n : Số lần thử nghiệm t  ,k : giá trị t-student tra bảng với mức ý nghĩa α = 0,05; k : Bậc tự (k = n-1) Ví dụ: Để đánh giá độ khơng đảm bảo đo, người ta thực mẫu trắng thêm chuẩn khoảng nồng độ từ 10 đến 100 mg/kg, tính độ thu hồi thực lặp lại 20 lần thu giá trị độ thu hồi trung bình 97% độ lệch chuẩn độ thu hồi 7% Tính độ khơng đảm bảo đo sau: CV% = SD 100 =6,87 x U(%)  t  ,n  CV (%) =1,73 x 6,87 = 11,7 % Công bố U sau: từ 10-100 mg/kg ± 11,7% Công bố độ không đảm bảo đo Phải thơng báo thơng tin sau trình bày kết báo cáo thẩm định có yêu cầu a Kết đo b Độ không đảm bảo đo c Mức độ tin cậy sử dụng việc xác định khoảng độ không đảm bảo đo mở rộng Cách viết độ không đảm bảo đo chuẩn tổng hợp Khi sử dụng hệ số phủ k =1 độ khơng đảm bảo đo độ không đảm bảo đo chuẩn viết sau: Kết (đơn vị) với độ không đảm bảo đo chuẩn U (đơn vị) Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật 53 Chú ý: Không sử dụng dấu “±” báo cáo độ khơng đảm bảo đo chuẩn dấu thường gắn với độ tin cậy cao 95% 99% Cách viết độ không đảm bảo đo mở rộng Thông thường, độ không đảm bảo đo mở rộng với hệ số phủ k =2 viết sau: Kết (đơn vị)± U (đơn vị) Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật 54 CHƯƠNG V: ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM Thẩm định phương pháp phân tích khơng phải tất để đảm bảo chất lượng kết thử nghiệm Theo yêu cầu ISO 17025, đảm bảo chất lượng q trình cần thường xun thực Phòng thử nghiệm cơng nhận trì ISO 17025 q trình đảm bảo chất liên tục, ngược lại chương trình đảm bảo chất lượng yếu tố quan trọng giúp trì ISO 17025 Trong khuôn khổ tài liệu nêu lên chương trình cách tổ chức việc đảm bảo chất lượng phòng thử nghiệm Có nhiều cách để phòng thử nghiệm tổ chức chương trình đảm bảo chất lượng Theo quy định ISO 17025 (mục 5.9), phòng thử nghiệm phải có thủ tục kiểm sốt chất lượng để kiểm tra tính hiệu lực phép thử nghiệm thực Dữ liệu kết phải ghi chép cho nhận biết khuynh hướng diễn biến kết cần phải áp dụng kỹ thuật thống kê để xem xét kết Việc kiểm tra phải lên kế hoạch, soát xét lại Các liệu kiểm soát chất lượng phải phân tích liệu nằm ngồi chuẩn mực định phải có hành động khắc phục điều ngăn ngừa kết qủa sai thông báo Chương giới thiệu kỹ thuật cách tổ chức chương trình đảm bảo chất lượng phòng thử nghiệm Phép thử nghiệm lặp lại Cho nhân viên thực việc phân tích tiêu xác định mẫu thử đồng nhất, thiết bị, phương pháp khoảng thời gian tương đối ngắn đánh giá mức độ lặp lại kết kiểm tra Trong phân tích hàng ngày, cần thực song song tối thiểu lần nhằm tránh sai số ngẫu nhiên gặp phải Đánh giá mức độ chênh lệch lần làm với giá trị trung bình, chênh lệch phải thỏa mãn theo yêu cầu phương pháp Phép thử nghiệm tái lập Các phòng thử nghiệm nên bố trí cho nhân viên thực phép thử nghiệm tái lập, cách cho thực thiết bị khác cho nhân viên khác thực phép thử nghiệm (đổi tay nhân viên) Phép thử nghiệm mẫu lưu Có thể bố trí để nhân viên thực phép thử nghiệm mẫu lưu, nhiên để đánh giá kết cần đảm bảo độ ổn định mẫu theo thời gian điều kiện Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật 55 bảo quản phòng; đồng thời nên áp dụng chất biết tương đối bền vững điều kiện định Phép thử nghiệm mẫu trắng Mẫu trắng mẫu tương tự mẫu thử khơng có chất phân tích Việc thực phép thử mẫu trắng yêu cầu cần thiết đa số phương pháp Trong số trường hợp khơng thể có mẫu trắng thực mẫu trắng thuốc thử, tức thực tương tự mẫu khơng có giai đoạn cân mẫu Đối với phương pháp phân tích vi lượng phân tích hàm lượng vết, việc sử dụng mẫu trắng đóng vai trò quan trọng để loại trừ nhiễm chéo q trình phân tích Trong lơ mẫu phân tích (chạy máy) cần chạy mẫu trắng sau khoảng định (ví dụ sau 10 mẫu) để kiểm tra lượng mẫu sót lại hệ thống Số lượng mẫu trắng cần phải chiếm 5% tổng số mẫu phân tích Phép thử nghiệm mẫu chuẩn Mẫu chuẩn chứng nhận (CRM) mẫu chuẩn thứ cấp chứng quan trọng để khẳng định kết phân tích Việc có mẫu chuẩn chứng nhận thường khó khăn kinh phí, cân nhắc sử dụng mẫu chuẩn thứ cấp mẫu kiểm tra Các mẫu mẫu thu từ chương trình so sánh liên phòng thử nghiệm, mẫu chuẩn lại từ mẫu CRM mẫu chuẩn phòng thử nghiệm tự tạo Phép thử nghiệm mẫu thêm Trong trường hợp khơng có mẫu chuẩn, sử dụng mẫu thêm chuẩn cách phổ biến cần thiết Bởi chuẩn thêm vào mẫu thân chất phân tích có tương tác khác với mẫu nên mẫu thêm cần thực cho khác biệt nhỏ Chuẩn cần thêm từ đầu, sau giai đoạn cân đong đảm bảo thời gian để đồng với mẫu Ví dụ như, phép phân tích dư lượng mẫu sinh học thường thêm chuẩn vào ngày hơm trước phân tích, để qua đêm để đồng Sử dụng phương pháp khác Phòng thử nghiệm sử dụng nhiều phương pháp khác để kiểm tra tiêu Tốt so sánh kết phương pháp thực với phương pháp tiêu chuẩn Đánh giá phù hợp hệ thống Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật 56 Thông thường phương pháp phân tích sắc ký hay quang phổ cần có đánh giá để đảm bảo hệ thống phù hợp để phân tích Đánh giá phù hợp hệ thống phép thử để chứng minh hệ thống hoạt động theo mục đích sử dụng Cần đánh giá hàng ngày tùy thuộc vào độ ổn định hệ thống số lượng mẫu phân tích hàng ngày Phép thử đánh giá phù hợp hệ thống phương pháp sắc ký quy định theo nhiều tổ chức (USP, USFDA) sau: - Độ chụm thời gian lưu, diện tích píc sắc ký: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ thống sắc ký xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Số lần bơm tối thiểu lần phải cho RSD nhỏ 2% Nếu RSD lớn 2% cần sử dụng điểm - Độ phân giải hai chất - Hệ số kéo đuôi - Các thông số khác: độ trôi đường nền, nhiễu đường (khi giới hạn phát đóng vai trò quan trọng phương pháp) Tham gia chương trình thử nghiệm liên phòng Tham gia chương trình thử nghiệm liên phòng yêu cầu bắt buộc phòng thử nghiệm muốn cơng nhận ISO 17025 Hàng năm, phòng thử nghiệm cần lập kế hoạch tham gia chương trình thử nghiệm liên phòng, xem hội cách tốt để đánh giá lực thân phòng thử nghiệm Hiện có nhiều tổ chức Việt Nam giới cung cấp chương trình thử nghiệm liên phòng, phòng thử nghiệm cần tìm kiếm chương trình phù hợp với phạm vi phòng để tham gia Mẫu đồng PTN PTN PTN PTN n Các giá trị chung Đánh giá Hình 10: So sánh liên phòng thử nghiệm kiểu mẫu Trừ số trường hợp đặc biệt, thông thường dựa vào kết thu từ chương trình thử nghiệm liên phòng, phòng thử nghiệm cần có hướng xử lý khắc phục: Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật 57 - Nếu |Z|  3: Có số lạc Phòng thử nghiệm cần tìm hiểu ngun nhân gây sai lệch có hành động khắc phục phù hợp, thông thường kết khắc phục cần gửi cho đơn vị tổ chức - Nếu 2