Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-14:2011 trình bày về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 14: bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm bắt nội dung của tiêu chuẩn này.
TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-14:2011 Xuất lần BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN – PHẦN 14: BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU BÒ Animal disease – Diagnostic procedure – Part 14: Haemorrhagic septicemia in cattle disease HÀ NỘI – 2011 TCVN 8400-14:2011 Lời nói ñầu TCVN 8400-14:2011 ñược chuyển ñổi từ 10 TCN 728:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy ñịnh khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật ñiểm a khoản Điều Nghị ñịnh số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 Chính phủ quy ñịnh chi tiết thi hành số ñiều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8400-14:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ công bố TCVN 8400-14:2011 TCVN 8400-14:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-14:2011 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đốn – Phần 14: Bệnh tụ huyết trùng trâu bò Animal disease – Diagnostic procedure – Part 14: Haemorrhagic septicemia in cattle disease CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn khơng thể đưa hết tất vấn đề an tồn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn thích hợp xác ñịnh khả áp dụng giới hạn quy ñịnh trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy ñịnh quy trình chẩn đốn bệnh tụ huyết trùng trâu, bò vi khuẩn Pasteurella multocida gây Thuật ngữ ñịnh nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ ñịnh nghĩa sau: Bệnh tụ huyết trùng trâu bò (haemorrhagic septicemia in cattle disease) Bệnh truyền nhiễm phổ biến trâu, bò vi khuẩn P multocida gây ra, thường xảy thể nhiễm trùng máu với đặc điểm đặc trưng trâu, bò chết nhanh, tỷ lệ nhiễm tỷ lệ chết cao CHÚ THÍCH: Bệnh phổ biến châu Á châu Phi Ở châu Á, bệnh chủ yếu vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B (theo phân loại Cater Haddleston) gây Thuốc thử vật liệu thử Trong tiêu chuẩn sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích sử dụng nước cất nước có chất lượng tương đương, trừ có quy định khác Xem Phụ lục A Phụ lục B mô tả dung dịch thuốc thử TCVN 8400-14:2011 − Thạch máu − Thạch Macconkey − Canh thang BHI − Thạch urê − Môi trường nước pepton Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: − Tủ ấm, trì nhiệt độ 37 oC − Tủ sấy − Nồi hấp − Buồng cấy − Kính hiển vi quang học − Tủ lạnh − Que cấy − Đèn cồn − Đĩa Petri ñể ñổ môi trường − Panh − Kéo − Lamen (coverlip) − Phiến kính − Pipet thủy tinh cỡ − Lọ thủy tinh cỡ: 100 ml, 200 ml, 500 ml 1000 ml Cách tiến hành 5.1 Chẩn ñoán lâm sàng TCVN 8400-14:2011 5.1.1 Đặc ñiểm dịch tễ Động vật cảm nhiễm: Trâu, bò lứa tuổi nhiễm bệnh, nhiên động vật non mẫn cảm với bệnh động vật già Bệnh có tính chất lây lan cục ñịa phương, vùng định, vùng lầy lội, ruộng nước, khí hậu nóng ẩm Bệnh xuất quanh năm hay gặp vào ñầu mùa mưa Bệnh lây lan chủ yếu qua đường hơ hấp Bệnh thường phát có stress như: Sự thay đổi khí hậu đột ngột, điều kiện chăm sóc ni dưỡng vận chuyển ñộng vật 5.1.2 Triệu chứng lâm sàng Bệnh thường xảy thể cấp tính thể cấp tính, vật chết nhanh từ vài h đến hai ngày từ xuất triệu chứng lâm sàng Con vật ñờ ñẫn, sốt từ 41 oC ñến 42 oC, khó thở, có ho khan Con vật chảy nước mắt, nước dãi, nước mũi nhiều Sưng, phù vùng ngực lan xuống cổ yếm Có triệu chứng thần kinh: dữ, điên cuồng Có có tượng bụng chướng to Con vật kiệt sức, suy hơ hấp chết vòng vài h 5.1.3 Bệnh tích Phúc mạc viêm thủy thũng có nước vàng Xoang bao tim, xoang ngực xoang bụng có dịch màu hồng nhạt Phổi viêm Hạch lâm ba xuất huyết lấm tấm, tổ chức liên kết da ñặc biệt hạch lâm ba vùng cổ vùng ñầu Bắp thịt niêm mạc xuất huyết màu hồng tím Trong trường hợp bệnh cấp tính thường khơng thể bệnh tích điển hình TCVN 8400-14:2011 5.2 Lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm Bệnh phẩm: - Máu tim, dịch xoang bao tim: Dùng bơm, kim tiêm pipet lấy máu tim, dịch bao tim - Phổi: Dùng dao cắt nơi có biến đổi bệnh lý tổ chức lành với lượng từ 10 g ñến 200 g ñựng vào lọ miệng rộng túi nilon - Xương ống: Lấy dao cắt hai đầu khớp, róc thịt CHÚ THÍCH: Các dụng cụ lấy mẫu dao, kéo, panh kẹp phải ñược sát trùng cồn 70 % trước sau lấy mẫu Bệnh phẩm phải lấy vô trùng sau gia súc chết nhanh tốt Bệnh phẩm phải ñược bảo quản ñiều kiện lạnh từ oC ñến oC gửi phòng xét nghiệm chậm 24 h sau lấy mẫu kèm theo giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích thơng tin dịch tễ 5.3 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 5.3.1 5.3.1.1 Kiểm tra hình thái vi khuẩn từ bệnh phẩm Cách làm tiêu Bệnh phẩm tổ chức: Cắt miếng nhỏ phủ tạng (gan, lách, phổi) phết lên phiến kính sạch, để khơ Bệnh phẩm máu: Lấy giọt máu nhỏ lên phiến kính sạch, sau dàn mỏng phiến kính khác, để khơ 5.3.1.2 Cố định tiêu Tiêu ñã ñể khô, nhỏ cồn metanol ngập tiêu bản, ñể khơ 5.3.1.3 Nhuộm tiêu Nhuộm Gram theo quy định Phụ lục A Nhuộm Giemsa theo quy ñịnh Phụ lục B 5.3.1.4 Hình thái vi khuẩn Nhuộm Gram: Vi khuẩn P multocida bắt màu hồng (màu vi khuẩn gram âm), lưỡng cực (hai đầu đậm hơn), có dạng cầu trực khuẩn, hình chấm tròn hình que Vi khuẩn khơng có nha bào, lơng có giáp mơ tạo thành vòng sáng xung quanh vi khuẩn Nhuộm Giemsa: Vi khuẩn hình bầu dục, bắt màu tím, lưỡng cực TCVN 8400-14:2011 5.3.2 Tiêm động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm: Chuột bạch thỏ Tiêm động vật thí nghiệm: Máu, tuỷ xương phủ tạng nghiền nát, hoà với nước muối sinh lý 0,9 % theo tỷ lệ 1/10, tiêm cho chuột bạch (từ 0,1 ml ñến 0,2 ml), thỏ (từ ml ñến ml) vào da, xoang phúc mạc tĩnh mạch P multocida làm chết động vật thí nghiệm vòng 24 h ñến 36 h Máu tim phủ tạng ñược lấy ñể phết tiêu kiểm tra trực tiếp kính hiển vi tiến hành phân lập giám ñịnh vi khuẩn 5.3.3 5.3.3.1 Nuôi cấy, phân lập, giám ñịnh vi khuẩn Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Bệnh phẩm cấy vào mơi trường thạch máu, thạch Macconkey, canh thang BHI Hình thái khuẩn lạc mơi trường phân lập sau 24 h nuôi cấy sau: Mơi trường canh thang BHI - Pasteurella mọc làm đục mơi trường, lắc có vẩn nhẹ (vẩn sương mù) mơi trường khơng có cặn đáy Mơi trường thạch máu - Khuẩn lạc P multocida có dạng: Dạng nhầy (M) kích thước to nhất, trắng xám khuẩn lạc nhầy, ướt Dạng (S) kích thước nhỏ bóng, rìa nhẵn, mặt vồng Dạng xù xì (R) thường dẹt - P multocida không gây dung huyết thạch máu - Khuẩn lạc P multocida có mùi nước dãi khô Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn P multocida khơng mọc thạch MacConkey Cấy khuẩn lạc có hình thái đặc trưng vào mơi trường thạch thường thạch máu hay canh thang BHI ủ 37 oC vòng 18 h đến 24 h để tiến hành kiểm tra hình thái vi khuẩn, đặc tính sinh hố 5.3.3.2 Giám định vi khuẩn 1.3.3.2.1 Giám định hình thái vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy Làm tiêu cố ñịnh tiêu bản: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc hòa vào giọt nước sinh lý phiến kính lấy vòng que cấy canh trùng ni cấy vi khuẩn dàn mỏng lên phiến kính, để khơ cố định tiêu lửa đèn cồn Nhuộm tiêu bản: Tiêu sau ñã cố ñịnh, nhuộm phương pháp nhuộm Gram (Phụ lục A) TCVN 8400-14:2011 Hình thái vi khuẩn: Vi khuẩn bắt màu đỏ khơng nhìn rõ lưỡng cực tiêu nhuộm từ tổ chức hay máu, có dạng cầu trực khuẩn đa hình thái: hình bầu dục, hình chấm tròn hình que Vi khuẩn đứng rải rác, khơng thành chuỗi 1.3.3.2.2 Giám định đặc tính sinh hóa Giám định tính chất sinh hóa theo bảng sau: Tính chất P multocida Dung huyết - Glucoza + Lactoza - H2S - Catalaza + Oxidaza + Indol + Ureaza - Phương pháp tiến hành: Phụ lục C 1.3.3.2.3 Thử ñộc lực ñộng vật thí nghiệm Huyễn dịch tiêm: Lấy khuẩn lạc, phân lập ñược từ bệnh phẩm sau giám định hình thái, tính chất mọc mơi trường sinh hố cấy vào mơi trường nước thịt, nuôi cấy tĩnh (không lắc) 37 oC sau 24 h lấy 0,2 ml canh trùng tiêm cho hai chuột theo dõi ngày Đọc kết quả: - Nếu tất chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết trùng có độc lực cao - Nếu nửa số chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết trùng có độc lực yếu - Nếu khơng có chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết trùng khơng có độc lực CHÚ THÍCH: Vi khuẩn tụ huyết trùng phân lập ñược từ ñộng vật thí nghiệm chết sau tiêm bệnh phẩm khơng cần kiểm tra lại độc lực động vật thí nghiệm Kết luận Trâu, bò bị bệnh tụ huyết trùng có đặc điểm sau: − Con vật có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng bệnh tích bệnh − Kết ni cấy, phân lập, giám định sinh hóa xác định vi khuẩn P.multocida − Vi khuẩn có độc lực 10 TCVN 8400-14:2011 Phụ lục A (Quy ñịnh) Phương pháp nhuộm Gram A.1 Thuốc nhuộm A.1.1 Dung dịch tím tinh thể Tím tinh thể (C25H30N3Cl) 2,0 g Etanol 95 % 20,0 ml Amoni oxalat [(NH4)2C2O4.2H2O] 0,8 g Nước 80,0 ml Hồ tan tím tinh thể etanol hòa tan amoni oxalat nước Sau đó, trộn dung dịch với lắc cho tan hết A.1.2 Dung dịch fuchsin basic Fuchsin basic (C20H20ClN3) 1g Etanol 95 % 10 ml Phenol (C6H6O) 5g Nước 100 ml Khi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo tỉ lệ 1:10 (phần thể tích) với nước A.1.3 Dung dịch lugol Kali iodua (KI) 2g Iôt (I2) tinh thể 1g Nước 200 ml Nghiền kali iodua iôt tinh thể, cho nước vào từ từ lắc cho tan 11 TCVN 8400-14:2011 A.1.4 Cồn axeton Etanol 95 % phần Axeton phần A.2 Cách tiến hành Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản, để từ đến sau rửa nước nhanh ñể khô Nhỏ dung dịch lugol, ñể sau rửa nước nhanh để khơ Nhỏ cồn-axeton, rửa nước thật nhanh để khơ Nhỏ dung dịch fuchsin lỗng, để sau rửa nước thấm khô sấy khô A.3 Xem tiêu Nhỏ giọt dầu vào tiêu xem tiêu kính hiển vi quang học với vật kính độ phóng đại 100 lần 12 TCVN 8400-14:2011 Phụ lục B (Quy ñịnh) Phương pháp nhuộm Giemsa B.1 Thuốc nhuộm Giemsa dạng bột 1g Glyxerin [C3H5(OH)3] 60 ml Metanol nguyên chất 60 ml Làm nóng glyxerin đến khoảng 55 oC đến 60 oC nồi ñun cách thủy Thêm thuốc nhuộm Giemsa, trộn ủ h Sau đó, ñể nguội thêm metanol giữ khoảng tuần trước sử dụng Khi sử dụng, pha loãng theo tỷ lệ 1/10 (phần thể tích) dung dịch đệm phosphat 0,01 M (pH 7,0) giữ 30 CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc thử Giemsa thương mại pha loãng theo hướng dẫn nhà sản xuất B.2 Cách tiến hành Sau làm xong tiêu máu, cố ñịnh tiêu metanol nguyên chất 10 rửa nước Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản, ñể 20 ñến 30 rửa nhanh với nước sấy khô B.3 Xem tiêu Nhỏ giọt dầu vào tiêu xem tiêu kính hiển vi quang học với vật kính độ phóng đại 100 lần 13 TCVN 8400-14:2011 Phụ lục C (Quy ñịnh) Phương pháp giám ñịnh sinh hóa vi khuẩn Pasteurella multocida C.1 Giám ñịnh khả lên men ñường glucoza, lactoza, sinh H2S, sinh C.1.1 Môi trường Dùng thạch nghiêng chế từ Kligler TSI Thạch màu đỏ có phần: phần thạch ñứng bên ñể kiểm tra khả lên men ñường glucoza, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng ñể kiểm tra khả lên men ñường lactoza C.1.2 Tiến hành Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính phần thạch ñứng) xuống ñáy ống nghiệm, rút dần que lên tiếp tục cấy bề mặt nghiêng, ni cấy 37 oC điều kiện hiếu khí 24 h C.1.3 Đọc kết a) Lên men ñường lactoza: - Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng - Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng b) Lên men đường glucoza: - Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng; - Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng c) Khả sinh H2S: - Dương tính: Ống nghiệm có màu đen; - Âm tính: Ống nghiệm khơng có màu đen d) Khả sinh hơi: - Dương tính: Thạch ống nghiệm bị nứt hay đẩy lên; - Âm tính: Thạch ống nghiệm khơng bị nứt hay đẩy lên 14 TCVN 8400-14:2011 C.2 Khả sinh indol C.2.1 Thuốc thử Kovac’s Paradimetyl aminobenzaldehyt 5g Cồn amylic (C5H11OH) 75 ml Axit clohydric ñặc 25 ml Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amylic cho tan hết ñể tủ lạnh oC Thêm từ từ ml ñến 10 ml HCl, trộn để tủ lạnh, sau lại tiếp tục bổ sung HCl Bảo quản thuốc thử lọ màu, oC C.2.2 Cách tiến hành Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone môi trường nước peptone có bổ sung tryptophan, ni cấy 37 oC Sau 24 h ni cấy, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ Phản ứng dương tính có vòng màu ñỏ xuất nơi tiếp giáp thuốc thử mơi trường (sinh indol) Phản ứng âm tính khơng có vòng màu đỏ xuất nơi tiếp giáp thuốc thử môi trường C.3 Phân giải Urê Có thể sử dụng mơi trường urê (urea agar base – Christensen) (chuẩn bị môi trường bổ sung urê theo dẫn nhà sản xuất) Cấy vi khuẩn vào mơi trường có urê, ni cấy 37 oC, sau 24 h ñọc kết − Phản ứng âm tính: mơi trường khơng thay đổi màu − Phản ứng dương tính: mơi trường chuyển màu tím C.4 Phản ứng oxidaza Phản ứng ñược tiến hành giấy có tẩm dung dịch % tetra methyl P-phenyl diamine hydroclorua Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch chà sát lên mặt giấy Phản ứng dương tính xuất màu đen tím sau 30 s Phản ứng âm tính giấy tẩm giữ nguyên màu C.5 Phản ứng catalaza Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ mơi trường thạch đặt lên điểm phiến kính Nhỏ giọt dung dịch H2O2 % lên khuẩn lạc phiến kính Phản ứng dương tính thấy có tượng sủi bọt sau vài giây Phản ứng âm tính khơng có tượng sủi bọt 15 TCVN 8400-14:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] OIE, 2008 Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Chapter 2.04.12 [2] P.J.Quin, M.E.Cater, B Markey, G.R.Cater, 1994 Clinical veterinary microbiology [3] Viện Thú y quốc gia - JICA, 2002 Cẩm nang chẩn đốn tiêu chuẩn bệnh gia súc Việt Nam [4] Australian animal health laboratory Pasteurella multocida/ Haemorrhagic septicaemia – PCR assay 16 .. .TCVN 8400-14:2011 Lời nói đầu TCVN 8400-14:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 728:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy ñịnh khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật ñiểm... chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm ñịnh, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8400-14:2011 TCVN 8400-14:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-14:2011 Bệnh ñộng vật – Quy trình chẩn đốn – Phần 14: Bệnh tụ... chi tiết thi hành số ñiều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8400-14:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm