Luận án hướng đến mục tiêu nghiên cứu xác định vị trí, kích thước mảnh mô niêm mạc miệng và môi trường nuôi cấy phù hợp cho nuôi tạo tấm biểu mô; xác định phương pháp phù hợp nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng. Để biết rõ hơn về nội dung chi tiết, mời các bạn cùng tham khảo.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐÀO THỊ THÚY PHƢỢNG NGHIÊN CỨU NUÔI TẠO TẤM BIỂU MÔ TỪ TẾ BÀO GỐC BIỂU MƠ NIÊM MẠC MIỆNG Chun ngành : Mơ - Phơi thai học Mã số : 62720103 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2016 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI: TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI THẦY HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THỊ BÌNH Phản biện 1: PGS.TS Quản Hoàng Lâm Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Hồng Giang Phản biện 3: PGS.TS Trần Vân Khánh Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp Trường Đại học Y Hà Nội Vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện quốc gia - Thư viện thông tin Y học Trung ương - Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ Tổn thương bề mặt nhãn cầu (BMNC) nhiều nguyên nhân khác thường để lại di chứng hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc (limbal stem cell deficiency-LSCD) hậu suy giảm thị lực Trên giới, phương pháp đại để điều trị hội chứng LSCD toàn hai bên mắt ghép biểu mô nuôi cấy từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng tự thân Niêm mạc miệng lựa chọn có nguồn gốc phơi thai cấu trúc mô học với biểu mô trước giác mạc Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu giới cơng bố thành công phương pháp Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu vấn đề Vì vậy, tiến hành “Nghiên cứu nuôi tạo biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng” với mục tiêu sau: Xác định vị trí, kích thước mảnh mô niêm mạc miệng môi trường nuôi cấy phù hợp cho nuôi tạo biểu mô Xác định phương pháp phù hợp nuôi tạo biểu mơ niêm mạc miệng NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đã tìm phương pháp ni tạo biểu mơ niêm mạc miệng hồn tồn sử dụng mảnh biểu mô lớp tế bào đồng nuôi cấy nguyên bào sợi tự thân Trên thực nghiệm, giai đoạn đầu trình nghiên cứu, phương pháp cho tỷ lệ nuôi tạo thành công cao phương pháp mảnh mô thấp phương pháp dịch treo khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Ở giai đoạn 2, nuôi 30 mẫu thỏ với tỷ lệ nuôi tạo thành công 100% Phương pháp đơn giản, hiệu quả, khắc phục nhược điểm tận dụng ưu điểm hai phương pháp nuôi cấy sử dụng giới Nguyên bào sợi tự thân sử dụng thay cho 3T3 loại tế bào có nguồn gốc từ chuột Áp dụng phương pháp để nuôi tạo biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng người, tỷ lệ thành công 90% 2 Sử dụng nhiều phương pháp khác để định danh tế bào biểu mô nuôi cấy Kết quả: tế bào biểu mơ ni cấy có cấu trúc hình thái hóa học giống với biểu mô trước giác mạc Ghép biểu mô phương pháp cho 15 mắt thỏ bị suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc tồn bộ, 60 ngày sau ghép giác mạc thỏ biểu mơ dính sát vào lớp chân bì 17 bệnh nhân ghép biểu mơ có bệnh nhân cải thiện thị lực, số lại khơng tượng tăng sinh xơ mạch vào giác mạc CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 122 trang, chương, bảng, 55 hình, 124 tài liệu tham khảo với tài liệu tiếng Việt, 119 tài liệu nước Phần đặt vấn đề: 02 trang; chương 1: tổng quan tài liệu 34 trang; chương 2: đối tượng phương pháp nghiên cứu 18 trang; chương 3: kết nghiên cứu 38 trang; chương 4: bàn luận 28 trang; kết luận: trang; khuyến nghị: 01 trang; danh mục báo liên quan; tài liệu tham khảo; phụ lục CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc bề mặt nhãn cầu BMNC vùng giới hạn hai đường xám mi mi dưới, bao gồm biểu mô giác mạc, biểu mô kết mạc ranh giới biểu mơ vùng rìa giác mạc nơi có tế bào gốc giác mạc 1.1.1 Giác mạc Biểu mô giác mạc: biểu mô lát tầng khơng sừng hố, gồm 4-6 hàng tế bào, chiếm khoảng 10% bề dày giác mạc Biểu mô chia thành lớp: lớp đáy, lớp tế bào hình cánh, lớp bề mặt 1.1.2 Kết mạc Kết mạc phận phụ thuộc nhãn cầu, trải từ vùng rìa củng giác mạc đến đường xám bờ mi, chia thành phần: kết mạc mi, kết mạc nhãn cầu, kết mạc đồ 1.1.3 Vùng rìa củng-giác mạc Vùng rìa vùng tiếp nối củng mạc với giác mạc, có chuyển tiếp từ biểu mô giác mạc thành biểu mô kết mạc nhãn cầu 1.1.4 Các yếu tố liên quan đảm bảo tồn vẹn BMNC Mắt cần có hệ thống thần kinh toàn vẹn toàn vẹn BMNC giúp cho hình ảnh nhìn thấy tới điểm hội tụ võng mạc Mi mắt, phim nước mắt, tuyến lệ, toàn vẹn hai cung phản xạ điều tiết nước mắt, chức tế bào biểu mô BMNC hỗ trợ nguyên bào sợi, nhu mô chất yếu tố đảm bảo toàn vẹn bề mặt nhãn cầu 1.2 Cấu trúc biểu mô bề mặt khoang miệng Niêm mạc miệng có cấu tạo gồm hai phần chính: biểu mô lớp đệm Biểu mô niêm mạc miệng loại biểu mô tầng Biểu mô niêm mạc má thuộc loại lát tầng khơng sừng hóa Tế bào biểu mô lớp đáy gồm 2-3 lớp sát màng đáy có hình trụ hình đa diện, có khả phân chia để trì quần thể tế bào biểu mô ổn định Các tế bào phân chia thường tạo thành cụm, nhìn thấy nhiều chỗ sâu lõm biểu mô Khi tế bào rời lớp đáy bước vào q trình biệt hóa, tế bào lớn dẹt dần tích lũy xơ keratin lipid bào tương ngày nhiều Ở niêm mạc miệng, tế bào gốc phân chia, tạo tế bào giữ nguyên đặc tính tế bào gốc khả phân chia vô hạn định cho tế bào khác bước vào q trình biệt hố Có nhiều yếu tố định số phận tế bào trở thành gốc hay tế bào tăng sinh chuyển tiếp Các tương tác tế bào biểu mơ mơ liên kết đóng vai trò quan trọng việc điều khiển phát triển mô 1.3 Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa ngun phát, hậu thứ phát Suy giảm vùng rìa xảy tồn góc vùng rìa Biểu lâm sàng giác mạc mờ đục, bề mặt gồ ghề không đều, có tân mạch nơng sâu bề dày giác mạc kết mạc hóa giác mạc Nặng ổ loét giác mạc khó hàn gắn, bờ ổ loét ranh giới rõ gồ lên, xung quanh ổ loét tồn tổ chức xơ tân mạch, BMNC gồ ghề với biểu q trình viêm mãn tính, nhuyễn giác mạc, giác mạc mỏng thủng giác mạc xảy trường hợp nặng 1.4 Những nghiên cứu nuôi tạo biểu mô niêm mạc miệng Yếu tố quan trọng để nuôi tạo biểu mô lựa chọn giá đỡ xác tính phù hợp sinh học, độ xốp, ổn định sinh học đặc tính vật lí Các giá đỡ sử dụng ni cấy tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng gồm nhiều loại khác nhau, màng ối nhiều tác giả sử dụng Việc chuẩn bị mẫu mô niêm mạc miệng xử lý miếng mô cho nuôi cấy có vai trò quan trọng Sau sát khuẩn kỹ khoang miệng, bệnh nhân gây tê chỗ, dùng dao tròn trích thủ mảnh niêm mạc miệng Kích thước mảnh mơ trích thủ thay đổi tuỳ tác giả phụ thuộc vào yêu cầu phương pháp nuôi cấy Mảnh mô xử lý qua nhiều công đoạn phương pháp xử lý mảnh mô khác Có hai phương pháp ni cấy ni mảnh mô dịch treo tế bào Trong nuôi cấy, việc sử dụng nguyên bào sợi chuột bất hoạt 3T3 làm lớp tế bào nuôi gây nhiều lo ngại sản phẩm có nguồn gốc động vật Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy thành cơng nuôi tạo biểu mô mà không cần tới có mặt tế bào Mơi trường ni cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng thông thường kết hợp Ham’s F12 DMEM với tỉ lệ 1:1 Ngồi cần có yếu tố bổ sung khác: Insulin, hydrocortisone, T3, isoproterenol, choleratoxin, hormon tăng trưởng Các thành phần bổ sung thông thường có mặt đầy đủ huyết Huyết bào thai bò (FBS) nhiều tác giả sử dụng, sản phẩm có nguồn gốc động vật Vì thế, có tác giả dùng huyết tự thân người có nhóm máu AB để thay FBS Một số tác giả sử dụng môi trường khơng huyết Có nhiều cách khác để định danh tế bào biểu mô: (1) Quan sát hình thái biểu mơ sống kính hiển vi soi (2) Nhuộm trypan blue: để xác định tỷ lệ tế bào sống chết tế bào (3) Nhuộm giemsa: để quan sát bề mặt biểu mô nuôi cấy (4) Nhuộm Hematoxylin-Eosin (H.E) nhằm đánh giá cấu trúc vi thể biểu mô theo chiều dọc (5) Kỹ thuật hiển vi điện tử: để nghiên cứu cấu trúc tế bào biểu mô (6) Kỹ thuật khuyếch đại chuỗi PCR (polymerase chain reaction): dùng phát marker tế bào biểu mơ niêm mạc miệng (7) Kỹ thuật hố mơ miễn dịch: Đây kỹ thuật đại sử dụng phổ biến đánh giá đặc điểm biểu mơ niêm mạc miệng ni cấy Nhuộm hố mô miễn dịch để xác định marker: K3, K12, connexin-43 (Cx-43), p63, p75, MCSP, β1 intergrin, PPARγ, Ki67, Pax 6, occludin, ZO1, ABCG2, desmoplakin (8) Test tạo cụm: Khi tách phát triển thể, số đặc điểm tế bào gốc giữ lại phản ánh kiểu cụm mà hình thành Tấm biểu mô niêm mạc miệng ứng dụng: (1) Trong nhãn khoa, (2) Điều trị trường hợp bỏng da rộng, cho phẫu thuật đường niệu, tạo hình âm đạo, thực quản tái thiết mi mắt CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1.Đối tượng vật liệu nghiên cứu: -Mảnh mô niêm mạc miệng thỏ chủng Orytolagus Cuniculus khoẻ mạnh -Mảnh mô niêm mạc miệng người -3T3 môn Tế bào-Mô Phôi Lý sinh, Đại học Khoa học tự nhiên cung cấp -Màng ối người xử lý theo quy trình mơn Mơ-Phơi, trường Đại học Y Hà Nội 2.1.2 Mơ hình nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành qua hai giai đoạn: Giai đoạn 1: Tiến hành thực nghiệm thỏ -Nghiên cứu quy trình trích thủ xử lý biểu mô niêm mạc miệng, lựa chọn môi trường nuôi cấy, phương pháp nuôi cấy phù hợp -Đánh giá chất lượng biểu mô -Ghép thực nghiệm thỏ gây bỏng tổn thương tồn vùng rìa Giai đoạn 2: Dựa kết thỏ, giai đoạn tiến hành bệnh nhân suy giảm tế bào gốc vùng rìa tồn với quy trình tương tự 2.2 Quy trình ni cấy 2.2.1 Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết cho nuôi cấy 2.2.2 Thực nghiệm thỏ 2.2.2.1 Chuẩn bị màng ối: Sử dụng màng ối xử lí theo quy trình mơn Mơ-Phơi, trường Đại học Y Hà Nội, tức màng ối loại bỏ biểu mô ammonia 10% 2.2.2.2 Chuẩn bị lớp 3T3 làm nuôi cấy: Chuẩn bị lớp 3T3 (sử dụng mẫu 3T3 qua xử lý mitomycin) 2.2.2.3 Chuẩn bị mảnh mô niêm mạc miệng cho nuôi cấy - Gây mê thỏ đường tĩnh mạch rìa tai, sát trùng khoang miệng - Trích thủ: (1) mặt niêm mạc má phần trung tâm, (2) mặt niêm mạc má cách góc miệng 2mm vng góc, (3) mặt niêm mạc môi dưới, phần trung tâm - Dùng dao tròn trích thủ mảnh niêm mạc với kích thước: đường kính 3mm, 6mm, 8mm + Kiểm tra cấu trúc vi thể mảnh niêm mạc miệng + Mảnh niêm mạc miệng rửa PBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm (1) Nuôi phương pháp mảnh mô: - Cắt mảnh niêm mạc miệng thành mảnh nhỏ 1x1mm - Ủ miếng mô dung dịch dispase II, rửa lại PBS, ngâm EDTA, sau miếng mơ rửa lại mơi trường nuôi cấy - Nuôi cấy mảnh mô xử lý màng ối (2) Nuôi cấy dịch treo: - Cắt mảnh niêm mạc miệng thành mảnh nhỏ 0,5x0,5mm - Ủ mảnh niêm mạc miệng dispase II, bóc mảnh biểu mơ khỏi mơ nền, ngâm mảnh biểu mơ Trypsin-EDTA, sau rửa lại mảnh biểu mơ DMEM+Ham’s F12 có kháng sinh, kháng nấm 10% FBS - Nạo lấy tế bào lớp đáy biểu mô li tâm lấy tế bào biểu mô - Tạo dịch treo có mật độ tế bào 1x10 tế bào/ml - Nuôi cấy lồng nuôi cấy điều kiện 37oC, 5% CO2 Thay môi trường đặn ngày lần - Nếu sử dụng lớp 3T3: 03 ngày thay 3T3 lần (3) Nuôi cấy phương pháp mảnh biểu mơ: Đây phương pháp hồn tồn mới, chưa có tác giả giới sử dụng - Ủ mảnh niêm mạc miệng cắt nhỏ 0,5x0,5mm dispase II, bóc rời mảnh biểu mơ khỏi mơ nền, ngâm mơ sau bóc vào trysinEDTA 0,05%, sau rửa lại DMEM+Ham’s F12 có kháng sinh, kháng nấm 10% FBS - Dán mảnh biểu mô lên màng ối để mặt biểu mô hướng lên - Dán mô xuống đáy giếng nuôi cấy với tỉ lệ mảnh biểu mô/2 mảnh mô - Nuôi cấy điều kiện 370C, 5% CO2, thay môi trường ngày/lần Ở phương pháp nuôi cấy khác nhau, theo dõi liên tục phát triển biểu mơ Khi tế bào biểu mơ mọc kín đáy lồng nuôi cấy, tiến hành tạo tầng cho biểu mô, đánh giá chất lượng biểu mô nuôi cấy sau thu hoạch 2.2.2.3 Mơi trường ni cấy, quy trình nuôi cấy theo dõi - Môi trường nuôi cấy SHEM 1: gồm DMEM/F12 tỉ lệ 1:1 (Gibco-Mỹ), có bổ sung: FBS 10% (Gibco), insulin 5µg/ml (Gibco), EGF 10ng/ml (Gibco), penicillin 100UI/ml (Wako), streptomycin 100µg/ml (Wako), amphotericin B 0,25µg/ml (Gibco) - Môi trường nuôi cấy SHEM 2: gồm DMEM/F12 tỉ lệ 1:1 (có bổ sung: FBS 10%, insulin 5µg/ml, EGF 10ng/ml, triiodothyronin 1,3ng/ml, isoproterenol 0,25µg/ml, hydrocortisone 0,5µg/ml, penicillin 100UI/ml, streptomycin 100µg/ml, amphotericin B 0,25µg/ml 2.2.2.4 Thu hoạch định danh tế bào nuôi cấy Sau nuôi cấy biểu mơ kích thước cm 2, mẫu ni cấy ghép lại cho thỏ thực nghiệm, phần lại tiến hành định danh tế bào biểu mô nuôi cấy kỹ thuật hiển vi quang học, hiển vi điện tử, hố mơ, hố mơ miễn dịch 2.2.3 Thử nghiệm bệnh nhân tự nguyện Tiến hành sau có kết định hướng thực nghiệm thỏ 2.3 Chỉ tiêu nghiên cứu Tỷ lệ nuôi tạo thành công biểu mô Thời gian nuôi cấy Cấu trúc vi thể, siêu vi thể hóa học biểu mơ ni cấy 2.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu Nghiên cứu tiến cứu tiến hành môn Mô-Phôi khoa Kết-Giác mạc Bệnh viện Mắt trung ương, từ tháng 10/1010 đến 10/2013 2.5 Thiết kế nghiên cứu Xử lí số liệu theo phần mềm SPSS 16.0 2.6 Đạo đức nghiên cứu Đề tài phần đề tài độc lập cấp nhà nước “Nghiên cứu quy trình sử dụng tế bào gốc để điểu trị số bệnh bề mặt nhãn cầu”đã thông qua hội đồng đạo đức Y học, Trường Đại học Y Hà Nội 11 Đánh giá tác dụng nguyên bào sợi tự thân, nuôi cấy 19 mẫu sử dụng nguyên bào sợi tự thân thay cho lớp nguyên bào sợi chuột 3T3 (bảng 3.4): Bảng 3.4 Tỷ lệ nuôi tạo thành công biểu mô niêm mạc miệng sử dụng lớp tế bào nuôi khác Tỷ lệ nuôi Số mẫu Số mẫu tạo thành p nuôi mọc công (%) 3T3 (+) 10 10 100 chuột(1) NBS tự thân 19 17 89,47 p1,2>0,05 (2) Giai đoạn 2: Chúng nuôi 30 mẫu theo phương pháp mảnh biểu mơ, có hỗ trợ ngun bào sợi tự thân, tỉ lệ mọc tạo biểu mô 100% Trong số ghép tự thân 15 cho 15 mắt thỏ bị tồn biểu mơ trước giác mạc bên mắt 3.1.4 Hình thái tốc độ phát triển biểu mô nuôi cấy phương pháp khác Tấm biểu mô nuôi cấy mảnh mô nguyên vẹn: - ngày sau nuôi cấy: tế bào phát triển lan xung quanh mảnh mô Ranh giới tế bào bò lan rõ, tế bào có hình tròn, hình đa diện hình thoi dài -10-12 ngày sau ni cấy: tế bào tạo thành lớp phủ kín đáy lồng nuôi cấy Bề mặt biểu mơ khơng phẳng, có chỗ tạo thành gờ cao Ở gờ này, tế bào có hình thoi, nhân tế bào dẹt quan sát kính hiển vi soi ngược - 14-16 ngày sau nuôi cấy: Tấm biểu mơ khơng phẳng, ngồi tế bào biểu mơ có nhiều ngun bào sợi với hình thái điển hình (hình 3.5) Tấm biểu mơ ni cấy dịch treo tế bào 12 - ngày sau nuôi cấy: có nhiều tế bào tròn bám vào đáy, sau đó, tế bào xoè rộng với nhánh bào tương dài - 12-14 ngày sau ni cấy: tế bào biểu mơ phủ kín lồng ni cấy - Sau tạo tầng, nhuộm H.E thấy: biểu mô phẳng, gồm 5-7 hàng tế bào, lớp tế bào có xu hướng dẹt dần Khoảng gian bào biểu mô rộng Không thấy tế bào hình thoi xen lẫn (hình 3.9) Trên kính hiển vi điện tử, khoảng gian bào tế bào lớp biểu mô rộng Các tế bào liên kết với mộng bào tương thể liên kết Trong bào tương tế bào, bào quan phát triển, có hạt glycogen, bó xơ trương lực, lưới nội bào có hạt Tấm biểu mơ ni cấy mảnh biểu mô - 3-4 ngày sau nuôi cấy: Các tế bào có hình tròn, số có hình đa diện với nhánh bào tương dài bò lan.Tế bào lan rộng dần, lúc đầu tế bào có hình đa diện lớn, khoảng gian bào rộng, tế bào phát triển kín đáy lồng ni cấy vào khoảng ngày thứ 10-12, tế bào nằm sát nhau, kích thước nhỏ đi, khoảng gian bào hẹp nhiên quan sát thấy rõ ranh giới tế bào với nhau, nhiều hình ảnh tế bào phân chia - Sau tạo tầng: biểu mô phẳng, gồm 5-7 hàng tế bào, lớp tế bào có xu hướng dẹt dần Khoảng gian bào biểu mô nuôi mảnh biểu mô hẹp so với ni dịch treo Khơng thấy tế bào hình thoi xen lẫn (hình 3.15) Khi quan sát bề mặt biểu mô nuôi cấy vào ngày thứ 14 phương pháp nhuộm giemsa: biểu mơ phủ kín Ở phương pháp mảnh biểu mô, khoảng gian bào hẹp tồn đáy lồng ni cấy, ngược lại với kết phương pháp dịch treo có khoảng gian tế bào rộng có khoảng gian tế bào với kích thước khơng Khơng thấy tế bào hình thoi xen lẫn 13 Dưới kính hiển vi điện tử, bề mặt hàng tế bào có nhiều vi nhung mao ngắn chia nhánh, khoảng gian bào tế bào lớp đáy rộng, tế bào liên kết với cầu bào tương Các tế bào lớp đáy có nhân lớn, màng nhân có lõm nơng, hạt nhân lớn, chất nhiễm sắc phân tán, bào tương có lưới nội bào có hạt ti thể phong phú, nhiều đám hạt glycogen Các tế bào lớp đáy liên hệ chặt chẽ với tế bào lớp đáy mộng thể liên kết với màng đáy thể bán liên kết, bào tương tế bào lớp đáy có nhiều đám hạt glycogen Các tế bào lớp đáy liên hệ chặt chẽ với màng ối thể bán liên kết Hình 3.5 Tấm biểu mô sau nuôi cấy 12 ngày (Nuôi mảnh mơ) Hình 3.9 Lát cắt đứng dọc biểu mô sau 21 ngày nuôi cấy (Nuôi dịch treo) Hình 3.15 Lát cắt đứng dọc biểu mơ sau 21 ngày nuôi cấy (Nuôi mảnh biểu mô) 3.1.5 Hình thái tốc độ phát triển lớp nguyên bào sợi 3.1.5.1 Lớp 3T3 Lớp 3T3 sau chuẩn bị mẫu 3T3 qua xử lí mitomycin, nuôi đáy giếng nuôi cấy Nguyên bào sợi dài, phủ kín đáy giếng sau ngày ni cấy Các ngày sau đó, tế bào thối hóa dần, vậy, sau ngày sử dụng lớp 3T3 phải thay 3.1.5.2 Lớp nguyên bào sợi tự thân Các mảnh mô liên kết tách từ mảnh niêm mạc miệng đồng nuôi cấy giếng nuôi cấy Vào ngày thứ 3, q trình ni cấy, ngun bào sợi có hình thoi dài, đa diện, nhiều nhánh bò lan 14 xung quanh mảnh mơ liên kết, ngày thứ 6, khoảng 1/2 diện tích đáy giếng nuôi cấy phủ nguyên bào sợi tới khoảng ngày thứ 10 tồn đáy giếng phủ kín 3.1.6 Kết định danh tế bào biểu mơ ni cấy hóa mơ miễn dịch Trên tiêu nhuộm hóa mơ miễn dịch phát p63, nhân tế bào biểu mô bắt màu nâu sẫm, đặc biệt nhân tế bào lớp đáy Nhuộm phát K3 K12: K3 K12 thể yếu tế bào lớp đáy Nhuộm P.A.S.: Trong bào tương tế bào lớp có glycogen Khơng thấy tế bào tiết nhày 3.1.7 Kết ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy cho thỏ gây bỏng thực nghiệm Tổng số thỏ sống trình làm thực nghiệm 21, 15 thỏ ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy thời điểm khác Tất thỏ lơ có kết tốt: giác mạc trong, biểu mơ liền tốt, nhẵn bóng, khơng tân mạch Chỉ có thỏ có kết trung bình: tân mạch qua rìa vào chu biên thời điểm 60 ngày không vào đến trung tâm giác mạc 3.2 Kết nuôi cấy biểu mô niêm mạc miệng từ tế bào gốc niêm mạc miệng ngƣời Dựa kết phân tích thỏ, chúng tơi lựa chọn vị trí sinh thiết người mặt trung tâm niêm mạc má Kết cho thấy biểu mô gồm khoảng 10-15 hàng tế bào, không dày niêm mạc vùng tương ứng thỏ Tuy vậy, lớp đáy dày gồm khoảng 3-4 lớp gồm tế bào có kích thước nhỏ, bào tương bắt màu base đậm, lớp Malpighi gồm nhiều hàng (7-10 hàng), kích thước tế bào lớp lớn thỏ vị trí tương ứng, ranh giới tế bào rõ Trên khoảng 2-3 hàng tế bào dẹt, chứa nhân dẹt Trên 15 tiêu nhuộm p63, nhân tế bào đặc biệt lớp đáy bắt màu đậm Các nhú chân bì có kích thước lớn, chia nhánh rõ Mơ đệm lỏng lẻo, tế bào Cấu trúc niêm mạc miệng vùng má nam nữ giống Sau cân nhắc độ phức tạp quy trình kết thành công nuôi tạo hai phương pháp dịch treo mảnh biểu mơ, với kích thước trích thủ mảnh mô, phương pháp mảnh biểu mô lựa chọn nghiên cứu ứng dụng người Kích thước mảnh mơ lựa chọn đường kính 3mm, vị trí sinh thiết mặt vùng má Tỷ lệ nuôi thành công 90% Dựa kết nghiên cứu thực nghiệm thỏ, tiến hành nuôi cấy niêm mạc miệng 17 bệnh nhân (4 bệnh nhân nuôi lần) môi trường SHEM2, với phương pháp nuôi cấy mảnh biểu mô Số biểu mô nuôi 54 (tỷ lệ nuôi thành công 90%, bệnh nhân nuôi cấy không thành công) Số biểu mô ghép lại cho bệnh nhân 22 Với thời gian nuôi cấy tế bào biểu mô 16-28 ngày Tấm biểu mơ ni cấy có khoảng 4-5 hàng tế bào, hàng tế bào dẹt có nhân dẹt Bề mặt tế bào biểu mô nuôi cấy người có vi nhung mao, giống với hình ảnh tế bào bề mặt giác mạc người bình thường Song kích thước vi nhung mao lớn hơn, số lượng so với biểu mô nuôi cấy thỏ, tế bào biểu mô liên kết với cầu bào tương dài (dài so với cầu bào tương nuôi cấy thỏ thực nghiệm) thể liên kết bào tương tế bào có nhiều lưới nội bào có hạt, ti thể, hạt glycogen Golgi nằm gần nhân với túi dẹt không bào, ranh giới tế bào rộng, nhiên hẹp so với khoảng gian bào biểu mô nuôi cấy thỏ Bào tương tế bào biểu mô nuôi cấy có nhiều ti thể dài, mào rõ, chất sẫm màu lưới nội bào có hạt phát triển mạnh, lưới nội bào có lòng hẹp ribosom bám ngoài, khoảng gian bào hẹp 16 Trên tiêu nhuộm hóa mơ miễn dịch phát p63, nhân tế bào biểu mô bắt màu nâu sẫm, đặc biệt nhân tế bào lớp đáy Nhuộm phát K3: K3 thể yếu tế bào lớp đáy rõ tế bào lớp Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy ghép lại cho bệnh nhân đánh giá kết phẫu thuật dựa yếu tố: độ áp biểu mơ, tình trạng biểu mô bề mặt nhãn cầu, tăng sinh tân mạch nông, sâu tổ chức xơ giác mạc Phẫu thuật ghép thành cơng 12 ca Trong ca có thị lực cải thiện, chúng tơi nhận thấy bệnh nhân có cải thiện rõ rệt thị lực nhìn gần, khoảng 10–30 cm CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Về lựa chọn nuôi cấy Nghiên cứu sử dụng màng ối nạo biểu mô ammonia 10% theo quy trình chuẩn mơn Mơ-Phơi, trường Đại học Y Hà Nội Hiện nay, tác giả giới chưa thống sử dụng nuôi cấy dùng màng ối sử dụng nào? Nếu dùng màng ối, loại bỏ biểu mô trước nuôi cấy sử dụng rộng rãi (Kim cs 2008, Lim cs 2009, Nakamura cs 2004) Bên cạnh đó, có nghiên cứu lại khẳng định ưu việt màng ối để nguyên biểu mô (Fukuda cs 1999) Tuy nhiên, không sử dụng màng ối (sử dụng màng polymer nhạy cảm nhiệt hồ fibrin), bề mặt giác mạc sau ghép quan sát thỏ (Higa K cs 2007, Higa K cs 2012, Hayashida cs (2005), Kokaba V cs (2014), Nishida K cs (2004), Hori Y cs (2007), Hori Y cs 2008, Oie Y cs (2010), Hayashida Y cs (2005)) 17 Nghiên cứu Higa K tiến hành mơ hình thỏ bị nạo bỏ biểu mơ giác mạc vùng rìa, khơng gây thương tổn mơ đệm, vậy, kết ghép biểu mô nuôi cấy fibrin cho kết tốt Tuy nhiên, trường hợp tổn thương mô đệm, hay gặp bỏng nặng, sử dụng màng ối lựa chọn phù hợp Chính tác giả Kocaba V cs (2014) sử dụng màng polymer nhạy cảm nhiệt, song không thấy tái tạo trở lại màng Bowman bị hủy trước ghép, sử dụng màng ối hợp với sinh lý hơn.Sudha B cs (2009) khẳng định ưu điểm màng ối Trong nghiên cứu chúng tôi, bệnh nhân Võ Vũ Ngọc Y (31 tuổi) sau ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy 12 tháng, biểu mô nguyên vẹn, điều chứng tỏ biểu mơ ni cấy có tế bào gốc 4.2 Về vị trí kích thƣớc mảnh niêm mạc miệng dùng cho nuôi cấy Khi nghiên cứu cấu trúc vi thể niêm mạc miệng thỏ thấy: niêm mạc vùng má thỏ có lớp biểu mơ dày, đường ranh giới với mơ liên kết bên có nhú cao Khoảng 2-3 hàng tế bào sát đáy có kích thước nhỏ, nhân lớn, biểu dương tính với marker p63 Ở bệnh nhân, niêm mạc vùng mặt má có kết tương tự Kết phù hợp với nhiều công bố giới Priya C G cs 2011, Squier C A cs 2001, Hori Y cs 2007, Inatomi T cs 2006, Dua cs 2003, Ma D H cs 2009, Hayashida Y cs 2005 Để có hai biểu mơ có kích thước 4cm 2, nuôi cấy dịch treo, mảnh niêm mạc cần có đường kính 8mm Một số tác giả trích thủ mảnh mô nhỏ hơn, song nuôi 01 tấm: Nishida K cs (2004) sử dụng đường kính 3mm, Ma D H cs (2009) 6x6mm Khi nuôi mảnh mơ, chúng tơi trích thủ mảnh có đường kính 6mm Phương pháp ni mảnh biểu mơ, đường kính mảnh niêm mạc miệng 3mm Ở phương pháp nuôi cấy mảnh 18 biểu mô, diện tiếp xúc tế bào gốc lớp đáy bộc lộ tối đa, loại bỏ hoàn toàn nguyên bào sợi nên biểu mô nuôi cấy phẳng đẹp 4.3 Về mơi trƣờng ni cấy Mỗi tác giả có cơng thức riêng cho môi trường nuôi cấy Giai đoạn đầu, sử dụng môi trường SHEM1, tỉ lệ mẫu mọc 30%, biểu mơ có tế bào thưa thớt Khi dùng SHEM2 môi trường SHEM1 có bổ sung insulin, hydrocortisone, T3, isoproterenol, tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng tăng sinh tạo thành biểu mô với tỉ lệ từ 89,5%-95% Mặc dù so với nhiều tác giả khác giới, môi trường SHEM2 thiếu choleratoxin Tuy nhiên, với tỉ lệ nuôi tạo thành công biểu mô, môi trường SHEM2 sử dụng tốt để nuôi tạo biểu mô từ tế bào gốc niêm mạc miệng Trong điều kiện nuôi cấy Việt Nam, việc sử dụng kháng sinh kháng nấm môi trường nuôi cấy tế bào, đặc biệt biểu mô niêm mạc miệng cần thiết, đặc biệt với mẫu nuôi cấy thỏ Các tác giả khác sử dụng loại kháng sinh khác nhau, nồng độ hoàn toàn khác Madhira S L cs (2008), Satake Y cs (2008) có sử dụng gentamicin thành phần môi trường nuôi cấy Amphotericin B chất hầu hết tác giả sử dụng, nhiên tính độc nên số nghiên cứu khơng sử dụng Trong môi trường nuôi cấy, huyết bào thai bò sử dụng nhiều nghiên cứu (Nakamura cs 2003, Nakamura cs 2004, Picot 2005) Tuy nhiên, việc sử dụng huyết bào thai bò có bất lợi, đặc biệt vấn đề protein dị loài Để giải vấn đề này, nay, có nhiều nghiên cứu sử dụng huyết tự thân nhiều nồng độ khác cho kết nuôi cấy tốt (Nakamura T cs (2006), Ang L P cs (2006) Priya C G cs (2011) Satake Y cs (2011) Hirayama M cs (2012)) Bên cạnh việc sử dụng huyết 19 tự thân để mong muốn loại bỏ thành phần có nguồn gốc động vật khỏi thành phần nuôi cấy, huyết người có nhóm máu AB sử dụng (Zakaria N cs (2014)) Môi trường không huyết lựa chọn nhiều nghiên cứu, nhiên để áp dụng rộng rãi loại môi trường cần có nhiều nghiên cứu sâu giá thành môi trường (Ilmarinen T cs 2012, Hayashi I cs 1976) Rõ ràng rằng, việc sử dụng mơi trường có huyết cho kết tốt khơng có ni cấy Trong điều kiện thực Việt Nam nghiên cứu chúng tơi có sử dụng huyết bào thai bò nồng độ 10% Các hormon insulin, triiodothyronin, EGF, hydrocortisone, isoproterenol, choleratoxin hầu hết tác giả giới sử dụng nuôi cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng với nồng độ khác 4.4 Về phƣơng pháp nuôi cấy 4.4.1 Phương pháp nuôi cấy mảnh mô: Khi sử dụng phương pháp này, trừ tế bào chu vi mảnh mơ dán vào màng ối dễ bò lan, tế bào khác bị hạn chế mô đệm để tiếp xúc với ni cấy Tấm biểu mô nuôi cấy không phẳng, có gờ lên, nguyên bào sợi Theo chúng tơi, niêm mạc miệng có lớp mơ liên kết lỏng lẻo, đàn hồi mềm dẻo so với mơ liên kết vùng khác Vì vậy, cắt gọt mẫu tay loại bỏ hồn tồn lớp mơ liên kết Những ngun bào sợi mơ liên kết sót lại tăng sinh, chí số mẫu ni cấy chúng chiếm ưu so với tế bào biểu mô Điều ảnh hưởng tới hiệu ghép lại cho bệnh nhân Sự có mặt nguyên bào sợi điều kiện thuận lợi cho tổ chức xơ mạch bò vào giác mạc Khi ni cấy biểu mô giác mạc từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc đề tài trước, nuôi phương 20 pháp mảnh mô không thấy tượng xảy Kanayama S cs (2007) nghiên cứu biểu mô giác mạc niêm mạc miệng nuôi cấy để xác định yếu tố gây tượng kết mạc hóa sau ghép, kết FGF nguyên nhân dẫn tới tượng tân mạch kết mạc hóa giác mạc xảy biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy mà biểu mô nuôi cấy từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc khơng gặp tượng Mặc dù phương pháp nuôi cấy mảnh mô đơn giản nhiều tác giả giới sử dụng, nghiên cứu chúng tôi, chất lượng biểu mô nuôi cấy không đạt yêu cầu đề nên không sử dụng phương pháp 4.4.2 Phương pháp nuôi dịch treo: Khi xử lý tạo dịch treo tế bào mảnh biểu mơ, chúng tơi dùng dispase.Đâylà enzym có tác dụng cắt mối liên kết tế bào màng đáy nhờ lớp tế bào biểu mơ tách rời khỏi mô đệm Kiểm tra cấu trúc mơ sau bóc tách lớp biểu mơ thấy: tồn lớp biểu mơ lột bỏ, khơng tế bào biểu mơ sót lại bề mặt mơ nền, khơng thấy có mặt tế bào mô liên kết mảnh biểu mô Sau sử dụng enzyme trypsin-EDTA để li giải lớp tế bào biểu mô thành tế bào riêng rẽ để nạo lấy tế bào lớp đáy Kiểm tra cấu trúc vi thể phần lại lớp biểu mơ thấy tồn tế bào lớp sát đáy lấy vào dịch treo nuôi cấy Như vậy, với kỹ thuật xử lý tạo dịch treo tế bào đầu dòng có mặt lớp sát đáy tận dụng triệt để Đối với phương pháp nuôi tạo biểu mô niêm mạc miệng dịch treo, nguồn gốc tế bào tế bào dòng biểu mơ khẳng định nhuộm K3 dương tính bào tương tế bào lớp đáy Kết luận phù hợp với kết luận Ma D H cs (2009), Nakamura T cs (2003), Hayashida Y cs (2005) 21 4.4.3 Phương pháp nuôi mảnh biểu mô: So sánh hiệu nuôi kỹ thuật tạo dịch treo kỹ thuật nuôi mảnh biểu mô thấy rằng: tỷ lệ mọc, tốc độ mọc cấu trúc vi thể hai biểu mô tương đồng với Tỷ lệ nuôi tạo thành công biểu mô từ ba phương pháp mảnh mô, dịch treo mảnh biểu mơ bóc 76,47%, 95% 89,47%, phương pháp mảnh biểu mơ có tỉ lệ ni tạo thành công thấp dịch treo, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Như vậy, đánh giá cách toàn diện, kỹ thuật xử lý tạo mảnh biểu mơ thể có nhiều ưu điểm bật so với kỹ thuật xử lý tạo dịch treo lý do: giảm kích thước mẫu mơ cần cho nuôi cấy, rút ngắn thời gian xử lý mẫu giảm thiểu thời gian tiếp xúc tế bào nuôi cấy với enzyme trypsin-EDTA làm tăng khả sống sót tế bào ni cấy, giảm thiểu trang thiết bị phòng lab, khơng cần 3T3 lý chúng tơi cho có liên quan tới hiệu tăng sinh tế bào trì mối liên hệ tế bào-tế bào Kết nghiên cứu cho thấy nuôi cấy sử dụng nguyên bào sợi tự thân cho tỉ lệ mọc cao không sử dụng lớp (89,47% so với 81,48%) Ni cấy có sử dụng 3T3 chuột cho tỉ lệ mọc cao không sử dụng với p