Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn pseudomonas aeruginosa trong nước uống đóng bình loại 19,5 lít

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆTNAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phạm Thị Oanh Oanh ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG NƢỚC UỐNG ĐĨNG BÌNH LOẠI 19,5 LÍT LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Chuyên ngành động vật học Hà Nội – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆTNAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phạm Thị Oanh Oanh ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG NƢỚC UỐNG ĐĨNG BÌNH LOẠI 19,5 LÍT Chun ngành: Động vật học Mã số: 8420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Phạm Thị Hằng TS Lê Thị Nhi Công Hà Nội - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp với đề tài “Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn Pseudomonas aeruginosa nƣớc uống đóng bình loại 19,5 lít” cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khoa học khác Nếu nhƣ khơng nhƣ nêu tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm đề tài Ngƣời cam đoan Phạm Thị Oanh Oanh LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập, nghiên cứu Để hồn thành luận văn tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới: – TS Phạm Thị Hằng, Khoa Ký sinh trùng, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ƣơng, TS Lê Thị Nhi Công, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam trực tiếp bảo hƣớng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu để tơi hồn thiện luận văn này; – Xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Học viện Khoa học công nghệ, ngƣời truyền đạt kiến thức quý báu cho em thời gian học tập Học viện; - Xin cảm ơn ban Giám hiệu trƣờng Cao đẳng y tế Đặng Văn Ngữ, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ƣơng tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập; – Xin gửi lời cảm ơn đến bạn Đỗ Trung Hà, Trịnh Thị Tuyết, Vũ Thị Thu Trang tổ Vi sinh, khoa Ký sinh trùng, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng Côn trùng Trung ƣơng giúp đỡ tơi q trình thực đề tài nghiên cứu; – Bên cạnh tơi xin đƣợc bày tỏ cảm ơn đến giúp đỡ gia đình, bạn bè ngƣời thân ủng hộ tạo điều kiện tốt để tơi tập trung nghiên cứu hoàn thành đề tài Do mặt kiến thức thời gian hạn chế, luận văn cịn nhiều khiếm khuyết Tơi mong đƣợc đóng góp ý kiến thầy, ngƣời để luận văn hoàn thiện Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Chữ viết tắt CFU Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) MIC Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế tối thiểu) NA Nutrien agar PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PCN Pseudomonas cetrimide nalidixic acid SEM Scaning Electron Microscope (kính hiển vi điện tử quét) TCCP Tiêu chuẩn cho phép TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam CLSI CDC Clinical and Laboratory Standards Insitute (Viện Tiêu Chuẩn Lâm sàng Xét ngiệm) Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa bệnh tật DANH MỤC SƠ ĐỒ BẢNG Bảng 1.1 Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia nƣớc khoáng thiên nhiên nƣớc uống đóng chai 17 Bảng 1.2 Phân nhóm kháng sinh tiêu chuẩn đọc kết đƣờng kính vùng ức chế P aeruginosa kháng sinh đƣợc quy định theo tài liệu hƣớng dẫn CLSI Bộ Y tế 21 Bảng 2.1 Các xét nghiệm xác định P aeruginosa từ dạng khuẩn lạc mọc môi trƣờng chọn lọc PCN 33 Bảng 2.2 Yêu cầu tiêu P aeruginosa mẫu nƣớc 36 Bảng 2.3 Đọc kết phản ứng sinh hóa kít API 20NE 38 Bảng 2.4 Các kháng sinh đƣợc thử nghiệm giới hạn đƣờng kính vùng ức chế 41 Bảng 3.1 Thông tin chung mẫu nƣớc sử dụng phân tích tiêu P aeruginosa 43 Bảng 3.2 Kết xét nghiệm tiêu P aeruginosa mẫu nƣớc bình uống liền phƣơng pháp lọc màng 47 Bảng 3.3 Kết test thử sinh hóa API 20 NE số chủng vi khuẩn phân lập mẫu nghiên cứu sau 24 nuôi cấy 58 Bảng 3.4 Các mức độ nhạy cảm với kháng sinh 32 chủng P aeruginosa phân lập từ mẫu nƣớc xét nghiệm 63 Bảng 3.5 Mức độ đa kháng kháng sinh chủng P Aeruginosa phân lập mẫu nƣớc xét nghiệm 66 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 P aeruginosa dƣới kính hiển vi điện tử quét (SEM) 10 Hình 3.1 Mẫu nƣớc xét nghiệm địa bàn khu vực quận Thanh Xuân 46 Hình 3.2 Kiểm tra phát huỳnh quang khuẩn lạc P aeruginosa dƣới đèn UV 51 Hình 3.3 Vi khuẩn P aeruginosa phân lập mẫu nƣớc dƣới kính hiển vi quang học (1.000 X) 52 Hình 3.4 Số lƣợng mẫu phân tích số mẫu nhiễm vi khuẩn 53 Hình 3.5 Tỷ lệ mẫu nƣớc bị nhiễm P aeruginosa 53 Hình 3.6 Số lƣợng vi khuẩn P aeruginosa so sánh với yêu cầu tiêu P aeruginosa mẫu nƣớc 54 Hình 3.7 Kết đánh giá chất lƣợng mẫu nƣớc xét nghiệm tiêu P aeruginosa 55 Hình 3.8 Test API 20 NE xác định tính chất sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu xét nghiệm (mẫu 15, mẫu 46) 57 Hình 3.9 Test phản ứng thử oxidase (chủng phân lập từ mẫu 16) 59 Hình 3.10 Hình thái chủng vi khuẩn 16 mơi trƣờng NA 60 Hình 3.11 Hình thái chủng vi khuẩn 46 môi trƣờng NA 60 Hình 3.12 So sánh mức độ tƣơng đồng chủng 16 với chủng có họ hàng gần đƣợc công bố Genbank 61 Hình 3.13 So sánh mức độ tƣơng đồng hai chủng 16 46 với chủng có họ hàng gần đƣợc cơng bố 62 Hình 3.14 Đĩa thạch có khảm P aeruginosa đƣợc đặt khoanh giấy kháng sinh sau 20 nuôi cấy 360C ± 10C 64 Hình 3.15 Các mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng P eruginosa phân lập từ mẫu nƣớc xét nghiệm 64 Hình 3.16 Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa phân lập mẫu nƣớc xét nghiệm 65 Hình 3.17 Tỷ lệ mức độ kháng kháng sinh P.aeruginosa 66 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1.2 ĐẶC ĐIỂM SINH VẬT HỌC CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA .9 1.2.1 Hình thái, cấu tạo 1.2.2 Cấu trúc tế bào 10 1.3 ĐỘC LỰC VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA11 1.3.1 Độc lực 11 1.3.2 Khả gây bệnh Pseudomonas aeruginosa 12 1.4 TÌNH HÌNH Ơ NHIỄM PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG NƢỚC KHỐNG THIÊN NHIÊN ĐÓNG CHAI VÀ NƢỚC UỐNG ĐÓNG CHAI 14 1.4.1 Các nghiên cứu giới 14 1.4.2 Các nghiên cứu Việt Nam 16 1.5 QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI NƢỚC KHỐNG THIÊN NHIÊN VÀ NƢỚC UỐNG ĐĨNG CHAI 16 1.6 KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ KHOANH GIẤY KHUẾCH TÁN 18 1.6.1 Nguyên lý 18 1.6.2 Giải thích thuật ngữ 19 1.7 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA P AERUGINOSA 23 1.7.1 Các nghiên cứu giới 23 1.7.2 Các nghiên cứu Việt Nam 25 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU .28 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 28 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 28 2.1.3 Trang thiết bị dụng cụ 28 2.1.4 Môi trƣờng, hóa chất, thuốc thử, dung dịch 29 2.1.5 Thuốc thử, hóa chất kít thử khác 30 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .30 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 30 2.2.2 Hoạt hóa chủng chuẩn 31 2.2.3 Thu mẫu 31 2.2.4 Bảo quản vận chuyển mẫu 31 2.2.5 Lọc mẫu 32 2.2.6 Pha loãng mẫu 32 2.2.7 Ủ mẫu 32 2.2.8 Đếm khuẩn lạc 32 2.2.9 Các xét nghiệm để khẳng định kết 33 2.2.10 Phƣơng pháp xử lý phân tích số liệu 35 2.2.11 Đánh giá kết 36 2.2.12 Định danh vi khuẩn kit API 20NE 37 2.2.13 Định danh vi khuẩn giải trình tự gen 16S RNA 40 2.2.14 Kháng sinh đồ phƣơng pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán 41 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 THÔNG TIN CHUNG VỀ MẪU NƢỚC XÉT NGHIỆM P AERUGINOSA 43 3.2 KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CHỈ TIÊU P AERUGINOSA TRONG MẪU NƢỚC 46 3.1 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH BẰNG API 20NE .57 3.3 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16s RNA 59 3.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP TỪ CÁC MẪU NƢỚC UỐNG .62 3.4.1 Đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh vi khuẩn P aeruginosa phân lập đƣợc 62 3.4.2 Mức độ đa kháng kháng sinh P aeruginosa phân lập đƣợc mẫu nƣớc 65 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 4.1 KẾT LUẬN .69 4.1.1 Số lƣợng tỷ lệ nhiễm P aeruginosa mẫu nƣớc 69 4.1.2 Đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh P aeruginosa 69 4.2 KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế, 2010, Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia nước khống thiên nhiên nước uống đóng chai (QCVN 6-1:2010/BYT) Trƣơng Anh Thƣ ,2009, Đặc điểm dịch tễ học nhiễm khuẩn phổi bệnh viện khoa hồi sức tích cực, bệnh viện Bạch Mai 2008-2009, Luận án tiến sĩ, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng Trần Văn Ngọc, Phạm Thị Ngọc Thảo, Trần Thị Thanh Nga, 2017, Khảo sát đặc điểm kháng thuốc P.aeruginosa A baumanni gây viêm phổi bệnh viện, chuyên đề hô hấp, Thời Y học 03/2017, tr.64- 69 Chu Anh Tuấn, Nguyễn Văn Huệ, Lê Đức Mẫn, 2002, Căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết yếu tố bệnh lý liên quan, Tạp chí Thơng tin y dược, Bộ Y tế WHO, 2017, WHO publishes list of bacteria for which new antibiotics are urgently needed http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/P aeruginosa Engleberg NC dV, Dermondy TS Fourth edition: Lippincott Williams & Wilkins; 2007 Đoàn Thị Nguyện, 2009, Vi sinh vật, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Favero MS, Carson LA, Bond WW, Petersen NJ, 1971, Pseudomonas aeruginosa: growth in distilled water from hospitals Science, 173(999), pp 836-844 10 Eckmanns, T et al, 2008, An outbreak of hospital-acquired Pseudomonas aeruginosa infection caused by contaminated bottled water in intensive care units Clinical Microbiology Infectious 14, pp.454-458 11 Henri Leclerc, Annick Moreau, June 2002, Microbiological safety of natural mineral water, FEMS Microbiology Reviews, 26, pp 207-222 12 Nguyễn Quốc Định, Hồng Ngọc Hiển, Lê Huy Chính, Nguyễn 71 Văn Việt, 1999, Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng Pseudomonas aeruginosa số yếu tố liên quan Viện Bỏng Quốc gia (từ 6/96 12/98), Tạp chí Y học thực hành, (Số 10), tr - 11 13 Lê Đăng Hà, Nguyễn Đức Hiền, 2003, Tình hình kháng thuốc kháng sinh năm 2003 số vi khuẩn gây bệnh, Thông tin dược lâm sàng, (Số 10), tr - 14 Hồng Kim Tuyến, 2006, Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005), Thông tin Kháng thuốc vi khuẩn, Nhà xuất Y học, Hà Nội 15 Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiển, 2002, Nghiên cứu chế tạo huyết kháng trực khuẩn mủ xanh đa giá, tinh chế đánh giá hiệu điều trị chỗ chế phẩm động vật bệnh nhân bỏng Tạp chí Thơng tin Y Dược, Bộ Y tế 16 Xiaoyan Yang, Bangrong X, Caiqian L, Zhuopeng Y, Yongbiao Z, 2015, Prevalence and fluoroquinolone resistance of Pseudomonas aeruginosa in a hospital of South China, Intenational Journal of Clinical Experimetal Medecine, 8(1), pp 1386-1390 17 Nguyen Van Kinh et al BMC Public Health, 2013, Antibiotic use and resistance in emerging economies: a situation analysis for Viet Nam, 13:1158 18 Stephen Osmon et al, 2004, Hospital mortality for patients with bacteremia due to Staphylococcus aureus or Pseudomonas aeruginosa, CHEST Journal; 125, pp 607–616 19 http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa 20 Tamagnini LM 1997, Bacteriological stability and growth kinetics of Pseudomonas aeruginosa in bottled water, Journal of Applied Microbiology, 83(1), pp 91-94 21 Wisplinghoff H, Bischoff T, Tallent SM, Seifert H, Wenzel RP, Edmond MB, 2004, Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: 72 analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study Clin Infect Dis, 39(3), pp 309-317 22 Wright ML, Romano MJ, 2006, Ventilator-associated pneumonia in children Semin Pediatr Infect, 17(2), pp 58-64 23 Lévesque B Simard P Gauvin D Gingras S Dewailly E and Letarte R 1994, Comparison of the microbiological quality of water coolers and that of municipal water systems, Applied Environmental Microbiology, 60(4), pp 1174-1178 24 Varga L, 2011, Bacteriological quality of bottled natural mineral waters commercialized in Hungary, Food Control, 22, pp 591-595 25 Bharath J et al, 2003, Microbial quality of domestic and imported brands of bottled water in Trinidad, International Journal of Food Microbiology, 81(1), pp 53-62 26 Baumgartner A Grand M 2006, Bacteriological quality of drinking water from dispensers (coolers) and possible control measures, Journal of Food Protection., 69(12), pp 3043-3046 27 Matin MK Mahmood A Ramin NN Hassan A Sassan R Samieh A 2015, Pseudomonas aeruginosa and heterotrophic bacteria count in bottled waters in Iran, Iran Journal Public Health, 44(11), pp 1514-1519 28 Merfat EA.M et al, 2015, Microbiological quality of drinking water from water, dispenser machines, International Journal of Environmental Science and Development, ( 9) 29 Trần Thị Mai cs, 2005, Điều kiện vệ sinh sở sản xuất chất lƣợng nƣớc uống đóng chai thành phố Bn Mê Thuột năm 2005, Trung tâm y tế dự phòng Dak Lak 30 Nguyễn Văn Oai, 2014, Thực trạng, nguyên nhân nhiễm Pseudomonas aeruginosa nƣớc uống đóng chai giải pháp hạn chế, Bản tin Khoa học Đời sống, số 1/2014 31 Vũ Thị Hƣờng, Đặng Vũ Phƣơng Linh,2017, Tỉ lệ nhiễm vi sinh 73 vật nƣớc uống đóng chai địa bàn tỉnh Cà Mau năm 2017, Tạp chí Khoa học Nghiên cứu Sức khỏe Phát triển, T 1, S 32 Bộ Y tế, 2017, Hướng dẫn thực hành kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng Nhà xuất Y học 33 CLSI, editor, 2012, Clinical and Laboratory Standards Insitute Performance Standards for Antimicrobial Susceptebility Testing: Twentysecond Informational Supplement M100-S22, CLSI, Wayne, PA, USA 34 Nguyễn Thị Vinh, Nguyễn Đức Hiền, Đoàn Mai Phƣơng, Võ Thị Chi Mai, 2006, Báo cáo hoạt động theo dõi đề kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp Việt Nam năm 2005, Thông tin Dược lâm sàng, Số 7, tr.15 - 23 35 Brown PD Izundu A 2004, Antibiotic resistance in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in Jamaica Revista Panamericana Salud Publica., 16(2), pp 25-30 36 Pitt TL Sparrow M Warner M Stefanidou M 2003, Survey of resistance of Pseudomonas aeruginosa from UK patients with cystic fibrosis to six commonly prescribed antimicrobial agents, Journal List Thorax, v.58(9); 37 Anne MQ Karen B 2007, Carbapenemases: the versatile βlactamases, Clinical Microbiology Reviews., 20(3), pp 440-458 38 Karuniawati A Saharman YR Lestari DC 2013, Detection of carbapenemase encoding genes in Enterobacteriace, Pseudomonas aeruginosa, and Acinetobacter baumanii isolated from patients at Intensive Care Unit Cipto Mangunkusumo Hospital in 2011, Acta Medical Indonesiana., 45(2), pp 101 - 106 39 Chander A Raza MS 2013, Antimicrobial susceptibility patterns of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates at a tertiary care hospital in Kathmandu, Nepal, Asian Journal Pharmaceutical and Clinical Research, 6(3), pp 235-238 40 Somayeh MG Fereshteh E 2013, Assessment of carbapenem 74 susceptibility and multidrug-resistance in Pseudomonas aeruginosa burn isolates in Tehran, Jundishapur Journal Microbiology, 6(2), pp 162-165 41 Mahnaz S Mohammad M Jamal S 2013, Dissemination of Pseudomonas aeruginosa producing blaIMP1, blaVIM2, blaSIM1, blaSPM1 in Shiraz, Iran, Jundishapur Journal Microbiol., 6(7), pp 190-195 42 Chengyi Ding et al, 2016, Prevalence of Pseudomonas aeruginosa and antimicrobial-resistant Pseudomonas aeruginosa in patients with pneumonia in mainland China: a systematic review and meta-analysis, International Journal of Infectious Diseases, 49 (2016), pp 119-128 43 Vesela G, Yulia D, 2016, Study of the microbiological quality of Bulgarian bottled water in terms of its contamination with Pseudomonas aeruginosa, Central European Journal of Public Health 2016, 24 (4), pp 326-330 44 Bùi Khắc Hậu, Dịch tế học phân tử chủng Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc nhiễm trùng bệnh viện Hà Nội, Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ, Đại học Y Hà Nội 45 Phạm Hùng Vân nhóm nghiên cứu MIDAS, 2010, Nghiên cứu đa trung tâm tình hình đề kháng imipenem meropenem trực khuẩn Gram (-) dễ mọc-kết 16 bệnh viện Việt Nam, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 14(2), tr 280 - 286 46 Bùi Nghĩa Thịnh, 2010, Khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh vi khuẩn khoa hồi sức tích cực chống độc bệnh viện cấp cứu Trƣng Vƣơng Hội nghị khoa học kỹ thuật Bệnh viện Cấp cứu Trưng Vương năm 2010 47 Trần Huy Hoàng, 2011, Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm khuẩn bệnh viện kháng carbapenem mang gene NDN-1 bệnh viện Việt Đức - Hà Nội, 2010-2011, Luận án tiến sĩ, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng 48 Trần Thanh Nga, 2013, Tác nhân gây viêm phổi khuynh hƣớng đề kháng kháng sinh 2010 - 2012 Bệnh viện Chợ Rẫy, Hội nghị Đề kháng kháng sinh viêm phổi cộng đồng viêm phổi bệnh viện 75 49 Nguyễn Thị Vân, Trần Hải Yến, Hà Văn Quân, 2014, Nghiên cứu tình hình nhiễm Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa nhiễm khuẩn khoa hồi sức tích cực bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức Tạp chí Dược học, 54(4) 50 Vũ Ngọc Hiếu, Phạm Hồng Nhung, 2017, Mức độ kháng kháng sinh số vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm trùng da mô mềm bệnh nhân đái tháo đƣờng phân lập bệnh viện Bạch Mai, Tạp chí nghiên cứu y học, số 109 (4) – 2017 51 Nguyễn Thị Nguyệt, 2007, Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn kháng kháng sinh Pseudomonas aeruginosa nƣớc uống TP.HCM, Kỷ yếu Hội Nghị Khoa học Vệ sinh An toàn Thực phẩm lần 4, Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm - Bộ Y tế 52 Vƣơng Xuân Vân, Nguyễn Thị Nguyệt, Nguyễn Văn Trí, Phẩm Minh Thu, Nguyễn Thị Thúy, 2013, “Tìm hiểu tính đề kháng kháng sinh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa nƣớc uống năm 2012 ”, Tạp chí Y học thực hành, Số 3/2013 53 Situation analysis on antibiotic use and resistance in Vietnam, 2010, GARP –Việt Nam national working group 54 TCVN 6663-3 : 2008/ ISO 5667-3 : 2003, Chất lƣợng nƣớc lấy mẫu Phần 3: Hƣớng dẫn bảo quản xử lý mẫu 55 TCVN 6187 - 1:2009/ ISO 9308 - 1:2000, Chất lƣợng nƣớc phát đếm Escherichia coli vi khuẩn coliform Phần 1: Phƣơng pháp lọc màng 56 TCVN 8881:2011 (ISO 16266:2010) (2011), Chất lƣợng nƣớc Phát đếm Pseudomonas aeruginosa - Phƣơng pháp màng lọc 57 Trần Thị Ngọc Anh cs 2007, Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp Bệnh viện Nhi Đồng năm 2007, Bệnh viện Nhi Đồng 58 Đặng Xuân Bình, Tạ Phƣơng Thùy, 2012, Xác định tiêu vi 76 khuẩn nhiễm nƣớc uống đóng chai khu vực thành phố Thái Ngun, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, số 72 (10), tr 94-99 59 Bộ Y tế, 2002, Một số cơng trình nghiên cứu độ nhạy cảm vi khuẩn với thuốc kháng sinh (1999 - 2001), Nhà xuất Y học, Hà Nội 60 Nguyễn Thị Nam Liên, Mai Văn Tuấn, 2001, Độ nhạy cảm với kháng sinh số vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp Bệnh viện Trung ƣơng Huế năm 2001, Thông tin Kháng thuốc vi khuẩn, Nhà xuất Y học, Hà Nội 61 TCVN 6404: 2008 (ISO 7218:2007), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung hƣớng dẫn kiểm tra vi sinh vật, 85 Tr 62 Lê Quốc Thịnh, 2001, Mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập Bệnh viện Nhi đồng I thành phố Hồ Chí Minh năm 2000, Thông tin kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh, Nhà xuất Y học 63 Nguyễn Sử Minh Tuyết, Vũ Thị Châu Hải, Trƣơng Anh Dũng, Lê Thị Tuyết Nga, 2009, Khảo sát vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện bệnh viện Nhân dân Gia Định, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 13(6), tr 295-300 64 F Naze, 2010, Pseudomonas aeruginosa Outbreak Linked to Mineral Water Bottles in a Neonatal Intensive Care Unit: Fast Typing by Use of High-Resolution Melting Analysis of a Variable-Number Tandem-Repeat Locus, Journal of Clinical Mycrobiology, 48 (9), pp 3146-3152 65 ISO 16266, 2006, Water quanlity - Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa - method by membrane filtration 66 Lakum S et al, 2016, Antibiotic susceptibility pattern of Pseudomonas aeruginosa at the tertiary care center, Dhiraj Hospital, Piparia, Gujarat, International Assosciation of infant massage; 3(5): 133-137 67 Rui P.A Pereira et al, 2018, Pseudomonas-specific NGS assay, provides insight into abundance and dynamics of Pseudomonas species including P aeruginosa in a cooling tower, Frontiers in Microbiology 68 Tamil SS, Murugan S, 2011, Antimicrobial susceptibility patterns 77 of Pseudomonas aeruginosa from diabetes patients with foot ulcers, International Journal of Microbiology, Volume 2011, Article ID 605195 69 Vaez HS, Abargouei AKF, 2017, Systematic review and meta analysis of imipenem - resistant Pseudomonas aeruginosa prevalence in Iran, Journal list Germs, 7: pp 86-97 78 PHỤ LỤC Kết đọc trình tự đoạn 16s RNA 02 chủng vi khuẩn mẫu nƣớc Chủng 16 71 141 211 281 351 421 491 561 631 701 771 841 911 981 1051 1121 1191 1261 1331 1401 GCTACACATG AGGAATCTGC AAGTGGGGGA GCCTACCAAG AGACTCCTAC GTGTGAAGAA GTTTTGACGT AAGCGTTAAT GGCTCAACCT TAGCGGTGAA CTGAGGTGCG CTAGCCGTTG CCGCAAGGTT GCAACGCGAA ACTCAGACAC GCGCAACCCT AGGAAGGTGG GTACAAAGGG GCAACTCGAC GGCCTTGTAC GGGACGGTAC CAGTCGAGCG CTGGTAGTGG TCTTCGGACC GCGACGATCC GGGAGGCAGC GGTCTTCGGA TACCAACAGA CGGAATTACT GGGAACTGCA ATGCGTAGAT AAAGCGTGGG GGATCCTTGA AAAACTCAAA GAACCTTACC AGGTGCTGCA TGTCCTTAGT GGATGACGTC TTGCCAAGCC TGCGTGAAGT ACACCGCCCG CACGGA GATGAGGGAG GGGATAACGT TCACGCTATC GTAACTGGTC AGTGGGGAAT TTGTAAAGCA ATAAGCACCG GGGCGTAAAG TCCAAAACTA ATAGGAAGGA GAGCAAACAG GATCTTAGTG TGAATTGACG TGGCCTTGAC TGGCTGTCGT TACCAGCACC AAGTCATCAT GCGAGGTGGA CGGAATCGCT TCACACCATG CTTGCTCCTG CCGGAAACGG AGATGAGCCT TGAGAGGATG ATTGGACAAT CTTTAAGTTG GCTAACTTCG CGCGCGTAGG CTGAGCTAGA ACACCAGTGG GATTAGATAC GCGCAGCTAA GGGGCCCGCA ATGCTGAGAA CAGCTCGTGT TCGGGTGGGC GGCCCTTACG GCTAATCCCA AGTAATCGTG GGAGTGGGTT GATTCAGCGG GCGCTAATAC AGGTCGGATT ATCAGTCACA GGGCGAAAGC GGAGGAAGGG TGCCAGCAGC TGGTTCAGCA GTACGGTAGA CGAAGGCGAC CCTGGTAGTC CGCGATAAGT CAAGCGGTGG CTTTCCAGAG CGTGAGATGT ACTCTAAGGA GCCAGGGCTA TAAAACCGAT AATCAGAATG GCTCCAGAAG CGGACGGGTG CGCATACGTC AGCTAGTTGG CTGGAACTGA CTGATCCAGC CAGTAAGTTA CGCGGTAATA AGTTGGATGT GGGTGGTGGA CACCTGGACT CACGCCGTAA CGACCGCCTG AGCATGTGGT ATGGATTGGT TGGGTTAAGT GACTGCCGGT CACACGTGCT CGTAGTCCGG TCACGGTGAA TAGCTAGTCT AGTAATGCCT CTGAGGGAGA TGGGGTAAAG GACACGGTCC CATGCCGCGT ATACCTTGCT CGAAGGGTGC GAAATCCCCG ATTTCCTGTG GATACTGACA ACGATGTCGA GGGAGTACGG TTAATTCGAA GCCTTCGGGA CCCGTAACGA GACAAACCGG ACAATGGTCG ATCGCAGTCT TACGTTCCCG AACCGCAAGG CAGTCGAGCG CCTGGTAGTG ATCTTCGGAC GGCGACGATC CGGGAGGCAG AGGTCTTCGG TTACCAACAG TCGGAATTAC TGGGAACTGC AATGCGTAGA GAAAGCGTGG GGGATCCTTG TAAAACTCAA AGAACCTTAC CAGGTGCTGC TTGTCCTTAG GGGATGACGT GTTGCCAAGC CTGCGTGAAG CACACCGCCC C GATGAAGGGA GGGGATAACG CTCACGCTAT CGTAACTGGT CAGTGGGGAA ATTGTAAAGC AATAAGCACC TGGGCGTAAA ATCCAAAACT TATAGGAAGG GGAGCAAACA AGATCTTAGT ATGAATTGAC CTGGCCTTGA ATGGCTGTCG TTACCAGCAC CAAGTCATCA CGCGAGGTGG TCGGAATCGC GTCACACCAT GCTTGCTCCT TCCGGAAACG CAGATGAGCC CTGAGAGGAT TATTGGACAA ACTTTAAGTT GGCTAACTTC GCGCGCGTAG ACTGAGCTAG AACACCAGTG GGATTAGATA GGCGCAGCTA GGGGGCCCGC CATGCTGAGA TCAGCTCGTG CTCGGGTGGG TGGCCCTTAC AGCTAATCCC TAGTAATCGT GGGAGTGGGT GGATTCAGCG GGCGCTAATA TAGGTCGGAT GATCAGTCAC TGGGCGAAAG GGGAGGAAGG GTGCCAGCAG GTGGTTCAGC AGTACGGTAG GCGAAGGCGA CCCTGGTAGT ACGCGATAAG ACAAGCGGTG ACTTTCCAGA TCGTGAGATG CACTCTAAGG GGCCAGGGCT ATAAAACCGA GAATCAGAAT TGCTCCAGAA GCGGACGGGT CCGCATACGT TAGCTAGTTG ACTGGAACTG CCTGATCCAG GCAGTAAGTT CCGCGGTAAT AAGTTGGATG AGGGTGGTGG CCACCTGGAC CCACGCCGTA TCGACCGCCT GAGCATGTGG GATGGATTGG TTGGGTTAAG AGACTGCCGG ACACACGTGC TCGTAGTCCG GTCACGGTGA GTAGCTAGTC GAGTAATGCC CCTGAGGGAG GTGGGGTAAA AGACACGGTC CCATGCCGCG AATACCTTGC ACGAAGGGTG TGAAATCCCC AATTTCCTGT TGATACTGAC AACGATGTCG GGGGAGTACG TTTAATTCGA TGCCTTCGGG TCCCGTAACG TGACAAACCG TACAATGGTC GATCGCAGTC ATACGTTCCC TAACCGCAAG Chủng 46 71 141 211 281 351 421 491 561 631 771 841 911 981 1951 1121 1191 1261 1331 1401 1471 GCTACACATG TAGGAATCTG AAAGTGGGGG GGCCTACCAA CAGACTCCTA TGTGTGAAGA TGTTTTGACG CAAGCGTTAA GGGCTCAACC GTAGCGGTGA ACTGAGGTGC ACTAGCCGTT GCCGCAAGGT AGCAACGCGA AACTCAGACA AGCGCAACCC GAGGAAGGTG GGTACAAAGG TGCAACTCGA GGGCCTTGTA GGGACGGTAC Sử dụng giao diện tìm kiếm BLAST NCBI để so sánh trình tự 79 nucleotide nhận đƣợc với trình tự có sẵn GenBank Kết mức độ tƣơng đồng hai chủng nghiên cứu với chủng P aeruginosa GenBank đạt từ 99,86 đến 100 % (chủng 16) 99,86%; (chủng 46) So sánh trình tự nucleotide nhận đƣợc chủng 16 với chủng tƣơng đồng GenBank So sánh trình tự nucleotide nhận đƣợc chủng 46 với chủng tƣơng đồng GenBank 80 PHỤ LỤC HƢỚNG DẪN THU MẪU NƢỚC SỬ DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT NIMPE HD 04.PP/31 MỤC ĐÍCH Hƣớng dẫn cụ thể bƣớc để thu đƣợc mẫu nƣớc dùng cho mục đích xét nghiệm tiêu vi sinh ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI ÁP DỤNG 2.1.Đối tƣợng Áp dụng cho loại mẫu nƣớc 2.2.Phạm vi áp dụng Các nhân viên có liên quan đến việc thu mẫu nƣớc labo Vi sinh nấm đơn bào CHUẨN BỊ 4.1 Nhân lực Cán đƣợc đào tạo thực thành thạo kỹ thuật: 01 ngƣời 4.2 - Trang phục bảo hộ Quần áo bảo hộ lao động: Khẩu trang y tế: Găng tay y tế: 01 bộ; 01 chiếc; 01 đôi 4.3 Thiết bị - Batometer: Thu đƣợc 2000 mL nƣớc/ lần 4.4 Dụng cụ - Thùng đựng mẫu: Bằng vật liệu cách nhiệt, có quai xách dây đeo chắn Thùng cao 35 - 40 cm, dài 50 - 55 cm rộng 30 - 35 cm - Bình thu mẫu: Bằng nhựa chịu nhiệt thủy tinh chịu nhiệt, dung tích 250 – 300 mL, có nút xốy nút nhám kín - Xơ nhựa: Dung tích lít; - Mi inox có cán dài: Dung tích 300 - 500 mL; 81 - Quang chai: Thiết kế vừa với bình mẫu; Quả nặng inox: Nặng 200 – 300 g, có lỗ để buộc dây; Phễu thủy tinh vơ trùng: Đƣờng kính phễu – 10 cm; Dây thừng nilon: Chiều dài tối thiểu 20 m, đƣờng kính 0,5 cm; Băng keo: Bản cm; Giấy dán nhãn không thấm nƣớc; Bút viết kính, kéo, bơng thấm nƣớc, giấy nhơm: Vừa đủ dùng 4.5 Hóa chất - Đá xay; - Ethanol 700 4.6 Chuẩn bị bình thu mẫu - Bình thu mẫu đƣợc tách riêng phần thân bình nắp bình Thân bình đƣợc đậy kín giấy nhơm Nắp bình đƣợc bao gói kín giấy nhơm; - Tiệt trùng thân bình nắp bình; - Dán nhãn với đầy đủ thơng tin lên thân bình (theo NIMPE HD 04 PP/14); - Giữ bình kín lấy mẫu; - Bình thu mẫu sau tiệt trùng đƣợc sử dụng ngay, không để lâu ngày 5.1 - CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH Chọn vị trí thu mẫu Điểm thu mẫu phải an toàn cho ngƣời thu mẫu: Lƣu ý địa hình, bùn lỏng, cát lún, hố sâu, dòng nƣớc xiết, động vật nguy hiểm ; Điểm thu mẫu phải đại diện cho nguồn nƣớc cần phân tích; Trƣờng hợp nơi thu mẫu có địa hình phức tạp rộng lớn, phải tăng số lƣợng mẫu cần thu theo chiều ngang, chiều dọc chiều sâu để đảm bảo kết thu đƣợc đại diện 5.2 Kiểm tra hƣớng gió Xác định hƣớng gió để tránh gió làm ảnh hƣởng đến q trình thu mẫu Có thể che chắn vật liệu phù hợp để tránh gây khó khăn q trình thu mẫu làm nhiễm bẩn mẫu trình thu mẫu 82 5.3 Dọn bề mặt xung quanh vị trí cần thu mẫu Loại bỏ thành phần không mong muốn thu mẫu bề mặt nguồn nƣớc xung quanh điểm thu mẫu mà ảnh hƣởng đến q trình thu mẫu Ví dụ: Hớt bỏ cặn, bùn, váng nƣớc thải Gạt bèo, thực vật nổi… bề mặt nƣớc ao, hồ… 5.4 Ghi thơng tin mẫu lên bình thu mẫu báo cáo lấy mẫu Ghi đầy đủ thông tin mẫu lên bình thu mẫu báo cáo lấy mẫu NIMPE BM 04.PP 14/02 5.5 Thu mẫu 5.5.1 Đối với mẫu nước bề mặt: Ao, hồ, sông, suối… - Rửa tay xà phòng, sát trùng tay cồn ethanol 700; - Sử dụng tay (chú ý tránh làm nhiễm bẩn cổ bình tay) dùng quang chai kẹp để thu mẫu; - Ngay trƣớc lấy mẫu, mở nắp giấy nhôm, nắm phần đáy bình cắm thẳng miệng bình vào nƣớc đến độ sâu khoảng 30 cm Xoay bình để phần miệng bình hƣớng lên phía dịng chảy để nƣớc tràn vào bên bình Tránh nƣớc bình tiếp xúc với tay; - Trƣờng hợp nƣớc xoáy mạnh, dùng quang chai dùng kẹp thu mẫu Trƣờng hợp bình thu mẫu nhựa gây khó khăn nhấn chìm bình xuống dƣới nƣớc Buộc nặng vào cổ bình để dễ dàng thu mẫu hơn; - Số lƣợng mẫu thể tích mẫu cần lấy phụ thuộc vào tiêu vi sinh cần phân tích: + Mẫu dùng phân tích tiêu vi sinh vật thông thƣờng: Thu 02 mẫu giống nhau, mẫu đầy đến khoảng 2/3 thể tích bình (khoảng 200 mL); + Mẫu dùng phân tích vi khuẩn kị khí: Thu 02 mẫu giống nhau, mẫu đầy kín thể tích bình (250 - 300 mL); + Mẫu dùng phân tích vi khuẩn gây bệnh gặp: Tăng số lƣợng bình thu mẫu để thu đƣợc 1.000 mL mẫu; - Đậy nắp bình sau lấy mẫu; - Dán kín miệng bình băng keo 83 5.5.2 Đối với mẫu nước vòi: Nƣớc máy, nƣớc uống vòi, nƣớc bể chứa phân phối qua hệ thống ống dẫn,… - Lau vòi nƣớc, lấy hết vật gắn vịi nƣớc làm nƣớc bắn tung tóe; - Lau chất bẩn đầu vịi bơng thấm cồn 700; - Rửa tay xà phòng, sát trùng tay cồn 700; - Khử trùng vòi nƣớc (nếu kim loại) phút lửa đèn cồn; - Xả vòi chảy mạnh hết cỡ - 10 phút; - Điều chỉnh van mở vòi để lƣợng nƣớc chảy vừa đủ để lấy nƣớc vào chai mà không làm bắn tóe xung quanh; - Ngay trƣớc lấy mẫu, mở nắp giấy nhơm, hƣớng miệng bình vào vòi nƣớc chảy, thu mẫu nƣớc đến mức cần lấy; - Số lƣợng mẫu thể tích mẫu cần lấy theo nhƣ mục 5.5.1; - Đậy nắp bình sau lấy mẫu; - Dán kín miệng bình băng keo 5.5.3 Đối với mẫu nước tầng tầng đáy: Mẫu nƣớc đáy ao, hồ, sông, biển… - Sử dụng thiết bị lấy mẫu chuyên dụng Batometer để thu mẫu - Quy trình thu mẫu theo hƣớng dẫn sử dụng thiết bị: Súc rửa thiết bị, thả thiết bị đến độ sâu cần lấy, thu mẫu, kéo mẫu lên để lấy mẫu - Thu mẫu vào bình giống nhƣ cách thu mẫu nƣớc vịi mục 5.5.2 5.5.4 Đối với mẫu nước thải - Sử dụng xô để thu nƣớc dùng muôi cán dài để múc nƣớc thải - Súc rửa xô muôi cán dài lần nguồn nƣớc thải cần lấy - Rót nƣớc thải vào bình lấy mẫu qua phễu vô trùng - Thu mẫu vào bình giống nhƣ cách thu mẫu nƣớc vịi mục 5.5.2 5.5.5 Đối với mẫu nước đóng bình, chai Thu ngun tồn chai, bình 5.5.6 Bảo quản vận chuyển mẫu phòng xét nghiệm: - Xếp đứng bình lấy mẫu thùng đựng mẫu, bình cách 84 – cm, đảm bảo thùng đựng mẫu không bị hở nắp, xô lệnh hay va đập trình vận chuyển; - Chèn đá bào xen kẽ bình mẫu để đảm bảo mẫu đƣợc bảo quản – 80C suốt thời gian vận chuyển Lƣợng đá bào ngập tối thiểu 1/2 ngập tối đa 3/4 thân bình lấy mẫu - Vận chuyển phòng xét nghiệm sớm tốt, thời gian bảo quản tối đa 24 mẫu đƣợc xét nghiệm (NIMPE HD 04.PP/14) TÀI LIỆU THAM KHẢO TCVN 5992 – 1995/ ISO 5667-2, Chất lƣợng nƣớc - Lấy mẫu Hƣớng dẫn kỹ thuật lấy mẫu TCVN 5995 – 1995/ ISO 5667-5, Chất lƣợng nƣớc - Lấy mẫu hƣớng dẫn lấy mẫu nƣớc uống nƣớc dùng để chế biến thực phẩm đồ uống TCVN 5996 – 1995/ ISO 5667-6, Chất lƣợng nƣớc - Lấy mẫu Hƣớng dẫn kỹ thuật lấy mẫu sông suối TCVN 5999 – 1995/ ISO 5667-10, Chất lƣợng nƣớc - Lấy mẫu Hƣớng dẫn kỹ thuật lấy mẫu nƣớc thải TCVN 6663-3 : 2008/ ISO 5667-3 : 2003, Chất lƣợng nƣớc - Lấy mẫu - Phần 3: Hƣớng dẫn bảo quản xử lý mẫu ... ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp với đề tài ? ?Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn Pseudomonas aeruginosa nƣớc uống đóng bình loại 19,5 lít? ?? cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết... cách hợp lý, hiệu Trƣớc yêu cầu thực tiễn, thực đề tài ? ?Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn Pseudomonas aeruginosa nƣớc uống đóng bình loại 19,5 lít? ?? với đối tƣợng nghiên cứu mẫu nƣớc đƣợc thu địa bàn... Vesela cs nghiên cứu tình trạng nhiễm vi khuẩn 2500 mẫu nƣớc uống đóng chai Trong số đó, có 274 mẫu bị nhiễm khuẩn (11%) Phân tích mẫu nhiễm khuẩn ngun gây nhiễm khuẩn ƣu P aeruginosa Nhóm tác