Chủ đề 12, Ngô Duy Kỳ

Học viên: Ngô Duy Kỳ Cao học: K26 GVHD: TS Phạm Thế Hải Chủ đề: Tìm hiểu trình bày quy trình sử dụng loại vi sinh vật để sản xuất lysine Đề tài: Sản xuất L-Lysine vi khuẩn Corynebacterium glutamicum I Tổng quan Lysine sản xuất cho người thức ăn chăn ni Nó chín axit amin thiết yếu, khơng thể sinh tổng hợp phải cung cấp từ nguồn thực phẩm (Anastassiadis, 2007) Tất axit amin chứa gốc carbon, nhóm amin, nhóm carboxyl, nhóm “R”, khác axit amin (Lysine K (Lys) 2003) L-Lysine axit amin bản, nhóm amin có xu hướng chịu điện tích dương (-NH3 +) PI 9,75 (Lysine K (Lys) 2003) PI điểm đẳng điện amino acid, 9,75 L-Lysine Hình 1: Cơng thức cấu tạo L-Lysine (Univ of Maryland, 2003) Ở người L-Lysine chứng minh thành phần dinh dưỡng quan trọng, đặc biệt quan trọng da khỏe mạnh, móng tay, chí tóc, lysine cần thiết cho sản xuất collagen (Ehrlich, 2011) Cũng có chứng cho thấy việc sử dụng L-lysine ngăn chặn virus Herpes simplex xâm nhập vào chu kỳ lytic (Ehrlich, 2011), L-lysine sử dụng Học viên: Ngô Duy Kỳ liệu pháp dự phịng trì chống lại bùng phát virus Vì khơng có đường sinh tổng hợp cho L-Lysine động vật, trở thành yếu tố hạn chế tổng hợp protein phát triển động vật Sự khác biệt L-lysine sản xuất cho người sản xuất thức ăn chăn nuôi mức độ tinh sản phẩm cuối Đối với sản phẩm dùng cho người, sản phẩm từ L-lysine thường sử dụng chất bổ sung ứng dụng hóa học cao hơn; Ngược lại, lysine cho thức ăn chăn ni nằm khoảng độ tinh khiết từ 35 đến 80% (Anastassiadis, 2007) Để xác định độ tinh khiết sản phẩm cuối cùng, phương pháp xử lý sau bao gồm kĩ thuật sắc ký trao đổi ion sấy sử dụng Sử dụng phương pháp tổng hợp hữu truyền thống để tạo lysine hỗn hợp racemic kết cho D- L-lysine Mặc dù sản xuất sơ cấp thông qua đường tổng hợp thường kinh tế so với phương pháp sinh học, việc xử lý sản phẩm sau khó khăn vấn đề cần tách hai đồng phân lập thể, L-lysine D-lysine (Gorton, 1963) Vì tất đồng phân chuyển hóa L amino acid, D-Lysine sản xuất trình tổng hợp sản phẩm phế thải (Brignole McDowell, 2001) quy trình cơng nghiệp để chuyển đổi thành L-Lysine loại bỏ khỏi hỗn hợp racemic quy mơ cơng nghiệp không hiệu Để sản xuất L-lysine phương pháp sinh học mà sản phẩm thu có L-lysine phương pháp thực phải ngăn chặn xuất đồng phân D-Lysine Việc sử dụng trình lên men vi sinh giúp phân tách hai dạng hoạt động quang học (Anastassiadis, 2007), hội để xây dựng quy trình sử dụng từ năm 1960 để sản xuất L-Lysine (Toride, 2002) Trong trình lên men vi khuẩn, vi sinh vật sử dụng có khả tổng hợp sản phẩm mong muốn, axit amin, từ nguồn dinh dưỡng sẵn có, chẳng hạn nguồn carbon nitơ đơn giản Vi sinh vật Chủng vi sinh vật Corynebacterium glutamicum sử dụng công nghiệp để sản xuất L-lysine thơng qua q trình lên men hiếu khí (Anastassiadis, 2007) Hình cho thấy sinh tổng hợp L-lysine, đường dẫn từ aspartate (bắt nguồn từ oxaloacetate, chu trình Krebs trung gian) thơng qua loạt q trình biến đổi trung gian, tất cách để sản sinh L-lysine Các enzyme quan trọng thể bên Học viên: Ngô Duy Kỳ trái, điều cho thấy tác động enzyme đến biến đổi chuyển hóa để điều chỉnh biểu tất thành phần thúc đẩy sản xuất Theo Anastassiadis (2007), “Cải tiến quy trình sản xuất lượng L-lysine lớn cách sử dụng vi sinh vật nỗ lực liên tục, phát triển liên tục di truyền cổ điển đại dẫn đến phát triển chủng tốt với đặc tính thuận lợi cho sản xuất L-lysine thương mại.” Hình 2: Quá trình sinh tổng hợp L-lysine (Anastassiadis, 2007) Sinh vật chọn để thực sản xuất L-lysine Corynebacterium glutamicum Vi sinh vật vi khuẩn gram dương, không hình thành bào tử, khơng di chuyển, hiếu khí Các chủng vi khuẩn thường hình thành khuẩn lạc màu vàng nhạt, nhiên số sợi màu trắng kem xảy (Kjeldsen, 2008) Các chủng C.glutamicum phân lập từ đất, đất bị nhiễm phân chim phân chuồng (Kjeldsen, 2008) Sinh vật sử dụng rộng rãi sản xuất L-lysine có khả chuyển hóa loạt carbohydrate, rượu axit hữu carbon nguồn lượng cho tăng trưởng sản xuất axit amin Nó có khả chuyển hóa nguồn nitơ vô amoniac L-lysine sản xuất khoảng bảy mười bước từ tiền chất oxalacetate C glutamicum có trao đổi chất q trình hơ hấp, với oxy chất nhận điện tử cuối Ngồi ra, nitrat chất nhận điện tử (Kjeldsen, 2008) Công suất tối đa, tức suất tối đa theo lý thuyết, C glutamicum cho sản xuất lysine đặc tính quan trọng, cung cấp ước tính tiềm Học viên: Ngô Duy Kỳ tối ưu hóa quy trình cơng nghiệp Tính tốn cân hóa học trước xem xét đường liên quan đến sản xuất lysine mang lại suất lysine mol glucose 75% (Hollan-der 1994) Một nhìn chi tiết đạt thơng qua phân tích mạng cân xem xét tồn đường có sẵn q trình trao đổi chất trung tâm với thông tin khả đảo ngược đảo ngược phản ứng khác giả định hạn chế bổ sung đặt mạng trao đổi chất Cách tiếp cận này, đặt tên phân tích chế độ thông lượng sơ cấp (Schilling et al 1999; Schuster cộng 2002), gần áp dụng để làm sáng tỏ tiềm sản xuất methionine C glutamicum (Krömeret al 2006) Năng suất mol cực đại lý thuyết C glutamicum cho sản xuất ly-sine thu cách phân tích 82% Lịch sử sử dụng C glutamicum Vi khuẩn C glutamicum đối tượng vi sinh vật có quy trình trao đổi chất tế bào nghiên cứu 50 năm qua Sau khám phá chúng vi khuẩn tiết L-glutamate giống đột biến hữu ích cho sản xuất lên men L-glutamate quy mơ lớn sử dụng Các thí nghiệm tạo đột biến gen thực để tìm chủng vi khuẩn có suất cao Các chủng vi khuẩn phải chịu đột biến gen lần để thích nghi với qui mơ lên men Các bước lặp lặp lại nhiều lần để tạo dịng vi khuẩn có xuất cao Sản xuất qui mô lớn với C glutamicum năm 1958 kế hoạch Kyowa Hakko Nhật Trong suốt năm qua, qui trình sản xuất lysine kỹ thuật sinh học với C.glutamicum cải tiến liên tục kĩ thuật sinh học Những tối ưu nhằm sản xuất lớn lượng lysine đủ để đáp ứng nhu cầu ngày II Cải tạo chủng Corynebacterium glutamicum Cải tạo chủng C glutamicum trình làm biến đổi phần máy di truyền nhằm đáp ứng nhu cầu, mục đích sử dụng người Có nhiều phương pháp cải tạo gen vi sinh vật như: Huấn luyện thích nghi: khả thích nghi với điều kiện sống vi sinh vật cao thể chúng đơn bào Mọi tác động mơi trường tác động trực tiếp Mặt khác, thể vi sinh vật thực trình trao đổi chất, sinh sản, phát triển nhanh chu kì sống ngắn Do giai đoạn thích nghi phải xảy nhanh mạnh khoảng thời gian Học viên: Ngô Duy Kỳ ngắn so với chu kì sống chúng Khi tạo khả thích nghi giống vi sinh vật tác động môi trường phải ln trì tác động mức độ tạo tính thích nghi Thực chất tính thích nghi thường biến nên khơng di truyền, đặc điểm không bền, dễ ngưng tác động thay đổi mức độ tác động Kỹ thuật di truyền cổ điển: - Phương pháp lai tiến hành cho lai hai tế bào có đặc điểm di truyền tốt khác để tạo dòng chứa đặc điểm di truyền tốt hai tế bào ban đầu Phương pháp có giới hạn pha trộn đặc tính di truyền loài - Phương pháp gây đột biến nhờ tác nhân hóa học tác nhân vật lý phương pháp gây đột biến điểm, đột biến nằm cấu trúc nucleotide Phương pháp tạo chủng vi sinh vật có nhiều đặc tính q Nhưng tần số xảy thấp, không đinh hướng, không ổn định Do đặc điểm mà kĩ thuật di truyển cổ điển sử dụng để cải tạo C glutamicum mà thường áp dụng kĩ thuật đại Kỹ thuật di truyền đại: Kỹ thuật sử dụng polyethylenglycol (PEG): protoplast biến nạp điều kiện có PEG ion Ca2+ Tần số biến nạp khoảng 105-106 thể biến nạp/mg DNA Để đạt hiệu suất biến nạp cao, trước biến nạp DNA cần phải methyl hóa PEG khơng hữu dụng biến nạp mà hữu dụng dung hợp protoplast chủng C glutamycum sinh tổng hợp lysine Kỹ thuật điện biến nạp: dùng dịng điện có điện áp cao có khả tạo lỗ màng tế bào khiến DNA từ môi trường dễ xâm nhập vào bên tế bào Phương pháp dễ thực phổ biến Phương pháp tiếp hợp hay dùng plasmid chuyển gen vào chủng vi khuẩn C.glutamicum Quá trình tiếp hợp thực cách sử dụng màng lọc nitrocellulose Màng lọc dùng làm giá thể cho vi khuẩn Xử lý nhiệt cho chủng C glutamicum 48 -49oC phút để tăng tính hữu thụ Phương pháp cải tạo chủng C glutamicum để thu dư lysine từ aspartate Sauk hi khám phá khả C glutamicum để sản xuất acid amin, sản xuất quy mô lớn lysine bắt đầu cách sử dụng thể đột biến khuyết dưỡng acid amin Những thể đột biến sớm hiển thị khả sản xuất lysine vượt trội Trong vòng 70 giờ, chủng hệ đầu Học viên: Ngô Duy Kỳ tiên ATCC 13287 khuyết dưỡng homoserine công khai vào năm 1961 thu sản lượng 44 g/l với chuyển đổi sản lượng xấp xỉ 26% g lysine HCl/gđường Những chủng sản xuất lysine tăng đến sản lượng chuyển đổi 50% dựa lượng đường Con đường sinh tổng hợp lysine từ oxaloacetate pyruvate C.glutamicum xảy thông qua đường phân chia Nhưng đường phân chia khơng đặc trưng cho đường tổng hợp sinh học Điều chứng minh rằng, thêm vào hình thành L-lysine chế đường tổng hợp bảo đảm cung cấp đáng tin cậy tế bào với chất trung gian D-, L-diaminopimelate, đơn vị liên kết quan trọng lớp peptidoglycan Một bước kiểm sốt dịng chuyển hóa thông qua đường tổng hợp cấp độ enzyme aspartate kinase, xem enzyme điển hình đầu đường tổng hợp, enzyme kinase kiểm soát hoạt động xúc tác Hoạt động enzyme bị ức chế L-lysine với Lthreonine có mặt vượt giới hạn cho phép tế bào Do tầm quan trọng điều việc kiểm sốt dịng chuyển hóa dịng chuyển hóa đối tượng sản xuất việc kiểm sốt phản ứng ngược lấy nhờ thể đột biến tiểu đơn vị β enzyme kinase Ngoài ra, chủng với hai gen kinase thực cho kết hiển thị tăng việc tích lũy L-lysine Enzyme aspartate kinase xúc tác phản ứng trình tổng hợp L-lysine Enzyme chứng tỏ enzyme chìa khóa tổng hợp sinh học L-lysine Trong q trình kiểm tra để có chủng kháng ức chế ngược, thể đột biến kháng hỗn hợp L-lysine L-threonine lập Sự giảm tính nhạy cảm aspartate kinase phản ứng ức chế ngược bước quan trọng phát triển chủng để sản xuất L-lysine Bước thứ ba đường tổng hợp L-lysine aspartate kết hợp L-aspartate semialdehyde với pyruvate để tạo 1,2,3dihydrodipicolinate Đây phản ứng xúc tác enzyme dihydrolipicolinate synthase Các enzyme synthase đặt điểm phân nhánh để chi phối trình trao đổi chất lysine threonine cạnh tranh với enzyme homoserine dehydrogenase chúng có chất chung L-aspartate semialdehyde Học viên: Ngơ Duy Kỳ Hình 3: Con đường tổng hợp phân nhánh L-lysine C.glutamicum Tạo dòng tăng biểu gen dapA mã hóa enzyme dihydrodipicolinate synthase cho thấy enzyme DapA cung cấp mục tiêu mạnh mẽ phát triển đối tượng sản xuất L-lysine Việc biểu gen dapA cho kết tương tự việc nâng cao biểu hiên enzyme aspartate kinase Để phân tích chức enzyme DapA đường chuyển hóa tạo L-lysine, vài chủng xây dựng với cấp độ khác việc tăng biểu gen dapA Người ta thấy mức độ biểu gen dapA có liên quan đến dịng chuyển hóa theo hướng giảm homoserine dehydrogenase Các chủng với chép thứ hai gen dapA đưa vào hệ gen, gen dapA tạo dòng plasmid có số lượng thấp plasmid có số lượng cao thiết lập Số lượng gia tăng gen dapA dẫn đến tăng hoạt động enzyme DapA kết tăng việc hình thành L-lysine III Phương pháp sản xuất lysine Nhu cầu L-lysine sống lớn nên có nhiều phương pháp để sản xuất L-lysine phương pháp thủy phân, phương pháp tổng hợp hóa học, phương pháp sử dụng vi sinh vật lên men… Học viên: Ngô Duy Kỳ Phương pháp thủy phân: Sử dụng kiềm axit để thủy phân nguyên liệu chứa nhiều protein Phương pháp áp dụng có số nhược điểm là: cần thiết bị chịu kiềm axit; sản phẩm thủy phân tạo nhiều D-lysine; gây ô nhiễm môi trường kiềm axit dư Phương pháp tổng hợp hóa học: Đây phương pháp áp dụng nhiều thực tế phương pháp tạo hỗn hợp lysine chứa nhiều đồng phân D-lysine, việc tách hai đồng phân khó khăn tốn Phương pháp sử dụng vi sinh vật: tận dụng khả sinh tổng hợp acid amin vi sinh vật, người ta nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận acid amin Phương pháp cho phép thu nhận acid amin dạng “L”, lượng acid amin dạng “D” chiếm tỉ lệ thấp Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản phát triển mạnh vi sinh vật cho phép thu suất cao Giá thành sản phẩm thấp phương pháp khác Điều kiện lên men Khi sản xuất L-lysine cơng nghiệp, điều quan trọng phải có mơi trường kiểm sốt cho q trình lên men tối ưu C glutamicum phát triển tốt khoảng nhiệt độ từ 25°C đến 37°C với nhiệt độ tối ưu 30°C, thiết lập với dải pH từ 7,2 đến 7,4 (Ozcan, 2007) Ngồi ra, C glutamicum có nhu cầu ơxy cao, điều quan trọng phải có nguồn cung cấp oxy hiệu cho phát triển sản xuất lysine (Kjeldsen, 2008) Môi trường lên men C glutamicum sử dụng nhiều nguồn cacbon nitơ để sản xuất lysine Môi trường tăng trưởng sử dụng trình lên men C glutamicum kết hợp nhiều nguyên liệu khác từ chất dinh dưỡng đến vi chất dinh dưỡng bao gồm chủ yếu nước, sucrose từ củ cải đường, dịch chiết ngô Nguồn Cacbon: chọn từ củ cải đường có chi phí rẻ, hàm lượng sucrose cao lên tới 22% Nguồn Nitrogen: dịch chiết ngơ nguồn nitơ sử dụng, nguồn nitơ kinh tế cần thiết cho phát triển C glutamicum Đây nguồn nitơ có giá hợp lý mà tăng gấp đơi chất hữu hạn cho tăng trưởng C glutamicum Thành phần sử dụng nguồn cacbon, phục vụ mục đích kép q trình lên men (Alibaba, 2015) Ngồi ra, chất thủy phân protein, dịch chiết ngơ, chiết xuất từ Học viên: Ngô Duy Kỳ thịt chiết xuất từ nấm men có chứa chất nitơ thêm vào mơi trường lên men (Pythia, 2006) Bảng 1: Môi trường lên men cho sản xuất L-lysine Vi chất dinh dưỡng: Vi chất dinh dưỡng cần thiết nhiều lý Sắt quan trọng cho tham gia thành phần chuỗi vận chuyển điện tử, Magiê đồng yếu tố cho protein sửa chữa DNA, Biotin (B7) cho trình sinh tổng hợp acid béo, gluconeogenesis chuyển hóa axit amin (Aragony, 2013) Các hợp chất khác sử dụng yếu tố tăng trưởng, cofactors, đóng vai trị trao đổi ion Liên kết cộng hóa trị sử dụng để cố định enzyme Vì lý này, ion tích điện hợp chất ion Fe, Mg, Mn hợp chất khác thêm vào môi trường lên men để hỗ trợ việc huy động enzyme Học viên: Ngơ Duy Kỳ Quy trình thu nhận chế phẩm L-lysine trình lên men: Giống vi khuẩn Nhân giống cấp Nhân giống cấp Lên men Mơi trường lên men Khử trùng Acid hóa Bổ sung HCl, metabisunfit Cô đặc chân không Phối trộn Ép thành viên Sấy L-lysine Hình 4: Quy trình sản xuất chế phẩm L-lysine Trong quy mô công nghiệp, trình lên men thực thùng lên men có sục khí cánh khuấy có kích thước lớn Giống ni cấy bình flask chuyển sang thiết bị nhân giống cấp Khi tế bào phát triển đến mức độ thích hợp, giống cấp chuyển sang nhân giống cấp sau cung cấp cho q trình lên men Các bước nhân giống quan trọng, để đảm bảo cho hiệu suất trình lên men cao thời gian ngắn nhất, việc tái sản xuất tốt Chất lượng số lượng giống ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng suất trình lên men Vì vậy, trình nhân giống phải đảm bảo điều kiện thích hợp để đạt trạng thái tối ưu Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men là: nồng độ oxi, 10 Học viên: Ngô Duy Kỳ nhiệt độ, hàm lượng chất dinh dưỡng bổ sung, pH… Các thơng ảnh hưởng khác tùy thuộc vào thiết bị lên men, quy mộ hoạt động Thu nhận tinh sản phẩm cơng đoạn quan trọng, ảnh hưởng lớn đến hiệu trình lên men chi phí sản xuất Trong nhiều năm qua, tinh thể L-lysine HCl sản xuất qua nhiều bước khác lên men, thu nhận, tinh sạch, kết tinh làm khô Để thu nhận L-lysine tinh khiết dạng kết tinh, dịch sau lên men phải tiến hành xử lý qua số bước để làm - Tiến hành lọc ly tâm dịch lên men để loại bỏ sinh khối, cặn thành phần không tan - Dịch sau li tâm hấp phụ cột nhựa trao đổi ion cationit Sau rửa cột tiến hành nhả hấp phụ dung dịch ammoniac 0,5-5% - Đun nóng dịch L-lysine thu để đuổi ammoniac Sau dùng dung dịch HCl để hạ pH dung dịch - Tiến hành cô dịch nồi cô chân không để nồng độ L-lysine đạt 30-50% L-lysine tác dụng với HCl để tạo monochlohydrate lysine - Làm lạnh dịch tới nhiệt độ 10-12oC, xuất tinh thể Tiến hành ly tâm để thu nhận tinh thể, dịch sau ly tâm cô đặc thêm tận dụng dịch lysine cô đặc đem tái kết tinh - Tinh thể thu đem sấy chân khơng bảo quản điều kiện thích hợp Trong số trường hợp không cần L-lysine mức độ tinh khiết cao làm thức ăn cho gia súc, dịch sau lên men làm khô trực tiếp mà không cần đến bước tinh 11 Học viên: Ngô Duy Kỳ ... giờ, chủng hệ đầu Học viên: Ngô Duy Kỳ tiên ATCC 13287 khuyết dưỡng homoserine công khai vào năm 1961 thu sản lượng 44 g/l với chuyển đổi sản lượng xấp xỉ 26% g lysine HCl/gđường Những chủng... kép q trình lên men (Alibaba, 2015) Ngồi ra, chất thủy phân protein, dịch chiết ngô, chiết xuất từ Học viên: Ngô Duy Kỳ thịt chiết xuất từ nấm men có chứa chất nitơ thêm vào môi trường lên men (Pythia,... biến đổi trung gian, tất cách để sản sinh L-lysine Các enzyme quan trọng thể bên Học viên: Ngô Duy Kỳ trái, điều cho thấy tác động enzyme đến biến đổi chuyển hóa để điều chỉnh biểu tất thành