Calvin Cycle Mutants of Photoheterotrophic Purple Nonsulfur Bacteria Fail To Grow Due to an Electron Imbalance Rather than Toxic Metabolite Accumulation

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HỒ CHÍ MINH CAO HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT K26 MÔN HỌC: BIẾN DƯỠNG NĂNG LƯỢNG VÀ VẬT CHẤT Ở VI SINH VẬT Bài báo số 1: Calvin Cycle Mutants of Photoheterotrophic Purple Nonsulfur Bacteria Fail To Grow Due to an Electron Imbalance Rather than Toxic Metabolite Accumulation Các đột biến chu trình Calvin Vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh sinh trưởng quang dị dưỡng không tăng trưởng cân điện tử mà khơng tích lũy chất chuyển hóa gây độc Tác giả: GVHD: Trần Linh Thước Gina C.Gordon, James B McKinlay HVTH – Tổ 1a Lưu Quốc Bảo Trần Lê Phương Duy NỘI DUNG CHÍNH GIỚI THIỆU CƠ SỞ KHOA HỌC – CƠ SỞ THỰC TIỄN MỤC TIÊU VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ KẾT LUẬN – ĐỀ XUẤT THU HOẠCH Photoheterotrophic Purple Nonsulfur Bacteria Vi khuẩn quang dị dưỡng không lưu huỳnh Vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh thuộc nhóm Proteobacteria thường tìm thấy khu vực bùn lầy nước đọng Chúng sinh trưởng cách sử dụng ánh sáng để thu lượng sử dụng hợp chất hữu khác nước cho electron CO2 làm nguồn Carbon Chu trình Calvin Mơ hình Hơ hấp dị dưỡng dẫn đến việc giảm lượng Trong đó: - ATP tổng hợp lại từ quang phosphoryl hóa - Sự lượng (NAD(P) +) → cân điện tử → Loại bỏ gen mã hóa RubisCo ngăn sinh trưởng quang dị dưỡng (Muller, 1933) Mô hình Hillmer (1933) (1977) Tăng trưởng quang dị Tăng trưởng quang dị Tăng trưởng quang dị dưỡng butyrate với dưỡng butyrate bổ dưỡng butyrate cần có hệ thống cố định CO2 P, Gest H Richardson DJ cộng (1988) Muller cộng chu trình cố định đạm sung chất nhận eletron tạo H2 (không cần CO2) dimethyl sulfoxide (DMSO) Mơ hình Wang cộng (2011): tích tụ RuBP từ chu trình Calvin dẫn đến ngăn sinh trưởng Thí nghiệm 1: thể đột biến ∆RubisCO → sinh trưởng Thí nghiệm 2: thể đột biến ∆RubisCO ∆PRK → số cá thể khôi phục tốc độ tăng trưởng ban đầu Mục tiêu Kiểm chứng lại mơ hình thay Wang D cộng (2011) Sự biến đổi C phân tích cân trao đổi chất • Chu trình Calvin tạo lượng khử dư thừa → Duy trì cân electron suy trì để hỗ trợ trao đổi chất hoạt động sống khác Yếu tố khơi phục tăng trưởng • Loại bỏ gen PRK ngăn tăng trưởng Rp.sphaeroides Rb.Capsulatus Việc thêm chất nhận electron DMSO hay sản sinh H2 để khôi phục tăng trưởng Môi trường nuôi cấy • Mơi trường thí nghiệm chứa gluatamate nguồn Nito nhất, có khả kích thích sản sinh H2 thông qua enzyme nitrogenase Sản sinh H2 đột biến nifA* • Thể đột biến gen nifA* thay gen cố định nito NH4+ → khả thi có hình thành H2 Mục tiêu Thí nghiệm thể đột biến ∆RubisCO ∆PRK để kiểm tra mối tương quan cân electron với tích tụ RuBP Củng cố quan sát Wang D cộng cá đột biến ∆RubisCO gây tích tụ RuBP ngăn cản tăng trưởng Nhận định lại mơ hình ban đầu với cân electron cần thiết chi tăng trưởng thiếu chu trình Calvin Vật liệu phương pháp Các chủng điều kiện sinh trưởng Các chủng Rs rubrum có nguồn gốc từ chủng UR2 cung cấp Gary Roberts, Đại học Wisconsin-Madison Các chủng Rp palustris có nguồn gốc từ chủng CGA009 làm khả hoạt động enzyme hydrogenase Vật liệu phương pháp Nuôi cấy chủng Rs rubrum Cấy trải môi trường SMN Agar, bổ sung 10% DMSO Nuôi môi trường hiếu khí, tối, 300C Thêm 5ml mơi trường SMN vào khuẩn lạc đơn Ủ lắc 300C Thêm 10ml vào ống kiểm tra kỵ khí Môi trường bổ sung thêm DMSO gây kỵ khí khí Ar Ủ 300C đèn 60W Vật liệu phương pháp Rp palustris Nuôi cấy chủng Rp palustris (NH4)2SO4 nguồn Nito Muối furamate, malate hay succinate nguồn Carbon với hàm lượng 10mM E.Coli nuôi môi trường LB agar hay LB lỏng Gentamycin kanamycin thêm 100µg/ml Rp palustris, 10µg/ml cho Rs rubrum, 10µg/ml 30µg/ml tương ứng cho E.coli Vật liệu phương pháp RubisCO (cbbLS cbbM) PRK (cbbP) (~1kb upstream Xây dựng chủng Rp palustris PCR Overlap extension PCR ∆cbbLS, ∆cbbM, ∆cbbP ∆cbbLS∆cbbM dowmstream) Tạo dòng với pUC19 pGEM pJQ∆cbbLS Tái tạo dòng E.Coli S17 vector pJQ200SK pUC∆cbbLS, pGEM∆cbbP E.Coli NEB10β Vật liệu phương pháp Xây dựng chủng Rp palustris Kmr cassette (pPS858_Km2) Gắn vào vị trí KpnI Kmr PCR ∆cbbP:: Kmr pJQ∆cbbP:: Kmr Tái tạo E.Coli S17 dòng Chuyển vào Rp palustris vector phương pháp tiếp hợp pJQ200SK pBBP∆cbbP:: Tái tạo dòng Kmr pBBPgdg Tạo dòng pGEM∆cbbP:: Kmr với pGEM Vật liệu phương pháp Kỹ thuật phân tích Khảo sát mật độ tế bào Mật độ tế bào khảo sát bước sóng 660 nm (OD660) Các tỷ lệ xác định mức