Nghiên cứu một số thành phần alkaloid của cây xuyên tiêu (zanthoxylum nitidum) mọc ở việt nam

Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU .7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .9 1.1 Một vài nét thực vật Chi Zanthoxylum Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) 1.1.1 Chi Zanthoxylum .9 1.1.2 Thành phần hoá học số loài thuộc chi Zanthoxylum 1.1.3 Cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) 12 1.2 Tình hình nghiên cứu Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) 13 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị dùng nghiên cứu 22 2.2.1 Hóa chất dụng cụ .22 2.2.2 Thiết bị dùng nghiên cứu .23 2.3 Phương pháp xử lý mẫu: 23 2.4 Phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất: 24 2.4.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 24 2.4.2 Sắc ký cột (CC) 24 2.5 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập 24 2.5.1 Phổ khối lượng (MS) .25 2.5.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .25 HVTH: Nguyễn Đức Duy Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân 2.6 Điểm nóng chảy (Mp) .26 2.7 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào .26 2.7.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 26 2.7.2 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) 26 2.8 Phương pháp HPLC .28 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 29 3.1 Xử lý mẫu thực vật điều chế cặn chiết từ mẫu thực vật 29 3.2 Phân lập hợp chất từ cặn chiết 30 3.3 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập 32 3.3.1 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất (ZN1) .32 3.3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất (ZN/A/7) 33 3.3.3 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất (ZN/A/11) 33 3.4 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập 34 3.5 Xác định hàm lượng hoạt chất nitidine phận Xuyên tiêu phương pháp HPLC 34 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Cấu trúc hóa học hợp chất (ZN1) 37 4.2 Cấu trúc hóa học hợp chất (ZN/A/7) 42 4.3 Cấu trúc hóa học hợp chất (ZN/A/11) 46 4.4 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập 52 4.5 Hàm lượng hoạt chất nitidine phận lá, quả, cành, thân rễ Xuyên tiêu .53 KẾT LUẬN .55 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC HVTH: Nguyễn Đức Duy Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ESI – MS: Electrospray ionization Mass Spectroscopy H NMR (1H -Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng proton - 1H 13 C NMR (13C - Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - 13C HSQC: Heteronuclear single - Quantum Coherence HMBC: Heteronuclear multiple - Bond Correlation DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer TLC (Thin layer chromatography):Sắc ký lớp mỏng CC: (Column chromatography) Sắc ký cột UV-Vis: Ultraviolet-Visible: phổ tử ngoại khả kiến δ(ppm): Độ chuyển dịch hóa học (parts per million) J(Hz): Hằng số tương tác (Hertz) s: singlet d: doublet dd: double doublet t: triplet MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu IC50 (The half maximal Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50% MBC (Minimum Bactericidal Concentration): Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu cao TBUT: Tế bào ung thư SRB: Sulforhodamine B HVTH: Nguyễn Đức Duy Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Ảnh mẫu Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) 22 Hình 3.1 Sơ đồ điều chế cặn chiết từ Xuyên tiêu 29 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất 1, từ cặn chiết n-hexan thân cành Xuyên tiêu Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất từ phần cặn chiết nước thân cành Xuyên tiêu 31 32 Hình 3.4 a) Phổ UV-Vis nitidine; b) Sắc ký đồ HPLC nitidine 34 Hình 3.5 Đường chuẩn định lượng nitidine 35 Hình 4.1 Phổ 1H-NMR hợp chất ZN1 37 Hình 4.2 Phổ 13C-NMR hợp chất ZN1 38 Hình 4.3 Phổ DEPT hợp chất ZN1 38 Hình 4.4 Phổ HSQC hợp chất ZN1 39 Hình 4.5 Phổ HMBC hợp chất ZN1 39 Hình 4.6 Phổ khối lượng ESI-MS hợp chất ZN1 40 Hình 4.7 Cấu trúc hóa học hợp chất nitidine 41 Hình 4.8 Phổ 1H-NMR hợp chất ZN/A/7 42 Hình 4.9 Phổ 13C-NMR hợp chất ZN/A/7 43 Hình 4.10 Phổ DEPT hợp chất ZN/A/7 43 Hình 4.11 Phổ HSQC hợp chất ZN/A/7 44 Hình 4.12 Phổ HMBC hợp chất ZN/A/7 44 Hình 4.13 Phổ ESI-MS hợp chất ZN/A/7 45 Hình 4.14 Cấu trúc hóa học hợp chất dihydrochelerythrin 46 Hình 4.15 Phổ 1H-NMR hợp chất ZN/A/11 47 Hình 4.16 Phổ 13C-NMR hợp chất ZN/A/11 48 HVTH: Nguyễn Đức Duy Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hình 4.17 Phổ DEPT hợp chất ZN/A/11 48 Hình 4.18 Phổ HSQC hợp chất ZN/A/11 49 Hình 4.19 Phổ HMBC hợp chất ZN/A/11 50 Hình 4.20 Cấu trúc hóa học hợp chất 6-acetonyldihydrochelerythrine 52 Hình 4.21 Sắc kí đồ HPLC cặn chiết metanol tổng từ (a), (b), cành (c), thân (d) rễ (e) HVTH: Nguyễn Đức Duy 54 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Độ lệch chuẩn nitidine 35 Bảng 3.2: Độ xác phương pháp phân tích nitidine 36 Bảng 4.1 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR hợp chất ZN1 số liệu tham khảo hợp chất nitidine Bảng 4.2 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR hợp chất ZN/A/7 số liệu tham khảo hợp chất dihydrochelerythrin Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR hợp chất ZN/A/11 số liệu tham khảo hợp chất 6-acetonyldihydrochelerythrine 40 45 50 Bảng 4.4 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập 52 Bảng 4.5 Hàm lượng nitidine có phận lá, quả, cành, thân rễ Xuyên tiêu 54 HVTH: Nguyễn Đức Duy Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân MỞ ĐẦU Nước ta có diện tích khoảng 330.000 km2 nằm vùng nhiệt đới gió mùa cận xích đạo nên nhiệt độ hàng năm cao (khoảng từ 22 – 34 oC) Lượng mưa hàng năm lớn tạo cho nước ta hệ thực vật đa dạng phong phú Theo số liệu thống kê gần hệ thực vật Việt Nam có khoảng 12.000 loài, trong làm thuốc chiếm khoảng 26-30 % [6, 7] Đây nguồn tài nguyên thiên nhiên quý báu đất nước Cùng với phát triển khoa học, người ta phát hợp chất có nhiều hoạt tính đặc biệt loại đưa vào ứng dụng cách có hiệu nhiều lĩnh vực công nghiệp dược phẩm, hương liệu mỹ phẩm, thực phẩm Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học phân loại hóa học thuốc tinh dầu nhằm mục đích tốt cho công tác điều tra tài nguyên thiên nhiên, để từ có kế hoạch sử dụng, bảo tồn phát triển chúng cách có hiệu Cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.) thuộc họ Cam (Rutaceae) Trong y học dân gian, có tác dụng tán hàn, giải độc tiêu thũng, giảm đau, trục thấp, ôn trung, trợ hỏa, sát trùng thường sử dụng làm thuốc giúp tiêu hóa, chữa đau nhức khớp xương, viêm mủ da, viêm da, uốn ván, ho, viêm họng, sốt, sốt rét kinh niên, đau nhức khớp xương, phong thấp, đau thần kinh, rắn độc cắn, giun sán; dùng dạng thuốc sắc dùng Các nghiên cứu giới cho thấy Zanthoxylum nitidum có thành phần hóa học chủ yếu hợp chất alkaloid lignan; có số hợp chất khác có khung coumarin, terpenoid steroid Nhiều hợp chất thu từ cho thấy có hoạt tính sinh học đáng ý kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng viêm giảm đau, chống co thắt, chống sốt rét…, bật khả gây độc tế bào, chống ung thư Tuy nhiên, Việt Nam, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Xuyên tiêu có ít, thấy có kết công bố thành phần hóa học tinh dầu công bố việc phân lập hai hợp chất nitidine, episesamin từ vỏ thân Xuyên tiêu Thanh Hóa Do đó, việc nghiên cứu để tìm hiểu rõ thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài dược liệu Việt Nam nhằm tìm kiếm thành phần có hoạt tính tốt để định hướng ứng dụng y, dược cần thiết HVTH: Nguyễn Đức Duy Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân Do có ứng dụng quý nên định chọn đề tài “Nghiên cứu số thành phần alkaloid Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) mọc Việt Nam” từ góp phần xác định thành phần hóa học tìm nguồn nguyên liệu cho ngành hóa dược Nhiệm vụ nghiên cứu: - Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất alkaloid từ Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) mọc Việt Nam - Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào hợp chất alkaloid phân lập - Xây dựng phương pháp HPLC định lượng hoạt chất alkaloid có hàm lượng cao Xuyên tiêu Đối tượng nghiên cứu: Thân cành Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) thuộc họ Cam (Rutaceae) Việt Nam HVTH: Nguyễn Đức Duy Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét thực vật Chi Zanthoxylum Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) 1.1.1 Chi Zanthoxylum Chi Zanthoxylum thuộc họ Cam (Rutaceae), giới có khoảng 549 loài phân bố nước vùng ôn đới ấm áp hay cận nhiệt đới [19] Các thuộc chi Zanthoxylum thường có dạng bụi thân gỗ Ở Việt Nam, chi Zanthoxylum có khoảng 13 loài, phân bố vùng ven rừng độ cao 1000-1500m khắp nước [2, 6] Zanthoxylum avicennae ( Lamk.) DC.( muồng truổng, sẻn lai) Zanthoxylum usitatum Pierre ex Laness (xuông, moong tu) Zanthoxylum armatum DC (, sẻn gai, đắng cay) Zanthoxylum myriacanthum Wall (hoàng mộc nhiều gai, sẻn to) Zanthoxylum cucullipetalum Guill (hoàng mộc cánh bầu) Zanthoxylum anthyllidifodium DC (sẻn Đà Nẵng) Zanthoxylum laetum Drake (hoàng mộc sai) Zanthoxylum scandens Blume (hoàng mộc leo, đắng cay, thục tiêu) Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC (xuyên tiêu, hoàng lực, hoàng liệt, hạt sẻn, hoa tiêu, ba tiêu) 10 Zanthoxylum rhetsa (Roxb.) DC (sẻn hôi, hoàng mộc hôi, cóc hôi,vàng me, muống tử) 11 Zanthoxylum scabrum Guill (dây khắc dung, rau sâng) 12 Zanthoxylum evodiaefolium Guill (hoàng mộc phi,đắng cay lá) 13 Zanthoxylum acanthopodium DC (sẻn, sẻn gai) 1.1.2 Thành phần hoá học số loài thuộc chi Zanthoxylum Chi Zanthoxylum đa dạng phong phú mặt hoá học đặc biệt alkaloid, chất thơm, chất béo, steroid, lignan cumarin Các loài thuộc chi Zanthoxylum nguồn cung cấp hợp chất benzophenanthridine [29] aporphin alkaloid Cacbazol, canthinon acridon alkaloid tìm thấy số loài Zanthoxylum HVTH: Nguyễn Đức Duy Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân Chi Zanthoxylum có chứa tinh dầu, tinh dầu thường chứa hợp chất nhóm tecpenoid chủ yếu Tinh dầu nhiều loài Zanthoxylum (Z alatum, Z acanthopozium ) có hàm lượng linalol cao (18,0 – 88,0 %) Các hợp chất benzophenanthridine nitidine chelerythrine, furoquinoline, skimmianine aporphine, berberine, magnoflorine phân lập từ rễ vỏ thân Zanthoxylum bouetense Z dinklagei [49] Các alkaloid có số loài thuộc chi Zanthoxylum: 3- Methylcacbazole (1) Glycozoline (2) Nitidine chloride (3) Chelerythrine chloride (4) Skimmianine (5) Fagaronine chloride (6) Cathin-6-one (7) HVTH: Nguyễn Đức Duy Berberin chloride (8) 10 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hình 4.18 Phổ HSQC hợp chất ZN/A/11 Phổ HMBC ZN/A/11 cho thấy tương tác qua lại nhóm carbon C6 (δC 54,2 ppm), C-6a (δC 127,4 ppm), C (δC 206,4 ppm, C=O) C(δC 30 ppm, CH3) với hydro nhóm metylen (δH 2,24 ppm) Điều khẳng định nhóm metylen đính vào vị trí C-6 C (C=O) Mặt khác, phổ HMBC cho thấy tương tác qua lại nhóm carbon C (δC 47,0 ppm, CH2) (δC 206,4 ppm, C=O) với hydro nhóm metyl (δH 2,24 ppm) Điều chứng tỏ nhóm liên kết với C-6 nhóm CH2COCH3 HVTH: Nguyễn Đức Duy 49 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hình 4.19 Phổ HMBC hợp chất ZN/A/11 Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR hợp chất ZN/A/11 số liệu tham khảo hợp chất 6-acetonyldihydrochelerythrine C ZN/A/11 Tài liệu [16] Tài liệu [57] (DMSO-d6) (CDCl3) (DMSO-d6) Ha,b, ppm (J, Ca,c, Hz) ppm 7,3 (1H, s) 13C- 1H-NMR 104,2 CH 7,08 (1H, s) 104,2 7,29 (1H, s) 104,3 - 147,2 C - 147,5 - 147,2 - 147,8 C - 148,1 - 147,9 7,32 (1H, s) 99,5 CH 7,51 (1H, s) 100,5 7,62 (1H, s) 99,8 4a - 126,5 C 127,2 - 126,9 4b - 138,5 C 139,2 - 140,1 4,94 (1H, dd) 54,2 CH 5,03 (1H, dd) 54,8 5,15 (1H, d) 58,4 6a - 127,4 C - 128,1 - 126,5 - 144,9 C - 145,4 - 145,7 HVTH: Nguyễn Đức Duy 50 NMR 1H-NMR 13C- DEPT NMR Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật - 151,9 GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân C - 152,0 7,10 (1H, s) 112,0 (1H,d,J=8,5Hz) CH 6,94 (1H, s) (1H,d,J=8,7Hz) 111,4 10 7,66 119,0 (1H,d,J=8,5Hz) CH 7,53 (1H,d,J=8,7Hz) 118,7 7,13 (1H, s) (1H,d,J=8,4Hz) 7,68 (1H,d,J=8,4Hz) 152,0 112,0 119,1 10a - 123,8 C - 124,7 - 124,2 10b - 122,9 C - 123,2 - 123,4 11 7,82 119,8 (1H,d,J=8,5Hz) CH 7,7 (1H,d,J=8,7Hz) 119,7 12 7,57 123,7 (1H,d,J=8,5Hz) CH 7,74 (1H,d,J=8,7Hz) 123,7 7,80 (1H,d,J=8,4Hz) 7,51 (1H,d,J=8,4Hz) 120,0 123,7 12a - 130,6 C - 130,9 - 130,5 OCH2O 6,12 (2H, s) 101,2 CH2 6,02 (2H, s) 101,0 6,13 101,2 NCH3 2,5 (3H, s) 42,5 CH3 2,63 (3H, s) 47,2 2,6 42,3 OCH3-7 3,86 (3H, s) 55,7 CH3 3,91 (3H, s) 55,7 3,82 55,7 OCH3-8 3,87 (3H, s) 60,5 CH3 3,94 (3H, s) 60,9 3,89 60,5 CH2 (CH2COCH3) 2,24 (2H, s) 47,0 CH2 2,25 (2H, s) 46,7 - - C (C=O) - 206,4 C - 207 - - CH3 (CH2COCH3) 2,07 (3H, s) 30,0 CH3 2,05 (3H, s) 31,0 - - a Đo DMSO-d6, b500 MHz, c125 MHz Từ kết đây, hợp chất ZN/A/11 xác định 6acetonyldihydrochelerythrine có cấu trúc Hình 4.20 HVTH: Nguyễn Đức Duy 51 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hình 4.20 Cấu trúc hóa học hợp chất 6-acetonyldihydrochelerythrine 4.4 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập Các hợp chất phân lập được thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư thử nghiệm tế bào ung thư biểu mô người KB, tế bào ung thư phổi người LU-1, tế bào ung thư vú người MCF7, tế bào ung thư gan người HepG2 tế bào ung thư tuyến tiền liệt người LNCaP Kết đưa Bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập TT Tên chất thử Dòng tế bào, IC50 (µg/ml) KB LU-1 MCF-7 Hep-G2 LNCaP ZN1 (Nitidine) 0,27 ± 0,01 0,25 ± 0,02 0,27 ± 0,02 0,29 ± 0,01 0,26 ± 0,02 ZN/A/7 (Dihydrochelerythrine) 54,21 ± 1,98 72,87 ± 3,05 90,52 ± 4,65 80,73 ± 5,19 73,47 ± 5,72 ZN/A/11 (6acetoyldihydrochelerythr ine) 39,54 ± 1,48 39,96 ± 1,10 47,11 ± 6,84 39,88 ± 4,41 34,10 ± 0,02 0,41 ± 0,02 0,31 ± 0,02 0,38 ± 0,05 0,35 ± 0,04 0,36 ± 0,04 Ellipticine Kết thu cho thấy, hợp chất nitidine có khả ức chế mạnh dòng tế bào ung thư, mạnh chất đối chứng ellipticine, với giá trị IC50 nằm khoảng 0,25 - 0,29 µg/ml Hai hợp chất dihydrochelerythrine 6acetoyldihydrochelerythrine có hoạt tính yếu Các kết xác với r2 ≥ 0,99 Kết phù hợp với nghiên cứu công bố trước hoạt tính nitidine HVTH: Nguyễn Đức Duy 52 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân [23] Như vậy, hợp chất nitidine có tiềm việc tiếp tục nghiên cứu theo hướng tạo chế phẩm chống ung thư 4.5 Hàm lượng hoạt chất nitidine phận lá, quả, cành, thân rễ Xuyên tiêu Kết thử hoạt tính gây độc tế bào cho thấy nitidine có khả ức chế mạnh dòng tế bào ung thư nên có tiềm phát triển thành chất chống ung thư Để tiến tới việc chiết xuất hoạt chất nitidine từ nguồn nguyên liệu đạt hiệu nhất, tiến hành định lượng nitidine mẫu cặn chiết tổng metanol từ phận khác Xuyên tiêu (lá, quả, cành, thân rễ) phương pháp HPLC Cặn chiết tổng metanol phận lá, quả, cành, thân rễ Xuyên tiêu xử lý bơm vào hệ máy HPLC Dựa vào đường chuẩn sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính để đánh giá hàm lượng nitidine có mẫu nghiên cứu Sắc ký đồ thể hàm lượng nitidine có cặn chiết tổng metanol đưa Hình 4.21 Bảng 4.5 a) b) c) d) HVTH: Nguyễn Đức Duy 53 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân e) Hình 4.21 Sắc kí đồ HPLC cặn chiết metanol tổng từ (a), (b), cành (c), thân (d) rễ (e) Tín hiệu phát detector DAD bước sóng 273 nm Bảng 4.5 Hàm lượng nitidine có phận lá, quả, cành, thân rễ Xuyên tiêu Hàm lượng nitidine Hàm lượng so với cặn chiết (mg/g) nguyên liệu mẫu khô (%) Lá 0 Quả 4,37 0,012 Cành 5,65 0,054 Thân 17,56 0,17 Rễ 18,47 0,21 Bộ phân Kết thu cho thấy nitidine có hàm lượng cao rễ (0,21%), tiếp thân (0,17 %), cành (0,054 %), có mặt với hàm lượng thấp (0,054 %) Do vậy, việc khai thác chiết xuất hoạt chất nitidine từ phận thân Xuyên tiêu cho hiệu cao HVTH: Nguyễn Đức Duy 54 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân KẾT LUẬN 1) Từ thân cành Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum), phương pháp chiết tách, thu cặn chiết từ dịch có độ phân cực khác nhau: cặn n-hexan, cặn etyl acetat, cặn nước 2) Bằng phương pháp sắc ký kết hợp, từ cặn chiết n-hexan cặn chiết nước Xuyên tiêu, phân lập hợp chất alkaloid sạch, ký hiệu ZN1, ZN/A/7, ZN/A/11 3) Dựa phương pháp phổ đại, xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập được, hợp chất: nitidine (ZN1), dihydrochelerythrine (ZN/A/7) 6-acetonyldihydrochelerytherine (ZN/A/11) 4) Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào 03 hợp chất alkaloid phân lập Kết cho thấy hợp chất nitidine có khả ức chế mạnh dòng tế bào ung thư (mạnh chất đối chứng ellipticine) với giá trị IC50 nằm khoảng từ 0,25 đến 0,29 µg/ml; hai hợp chất dihydrochelerythrine 6acetoyldihydrochelerythrine có hoạt tính yếu 5) Đã xây dựng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng hoạt chất nitidine phận lá, quả, cành, thân rễ Kết cho thấy nitidine có mặt với hàm lượng cao rễ (0,21 %), sau thân (0,17 %) Phương pháp HPLC nhanh, dùng để định lượng nitidine mẫu thực vật với độ xác cao, độ lặp lại tốt, độ lệch chuẩn tương đối độ thu hồi lớn (> 90 %) khoảng 1–100 μg/ml, với giới hạn định lượng μg/ml HVTH: Nguyễn Đức Duy 55 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Nguyễn Thị Hồng Vân, Trần Thị Tuyên, Đinh Thị Thu Thủy, Nguyễn Đức Duy, Phạm Viết Cường, Nguyễn Thị Vân Anh, Vũ Đình Hoàng, Nguyễn Ngọc Thành, Nguyễn Thị Nhài, Cẩm Thị Ính, Phạm Thị Minh Diệp, Phạm Quốc Long, (2015), Quantitative analysis of nitidine in Zanthoxylum nitidum by highperformance liquid chromatography with fluorescence detection, Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập 53, số 4B, tr 67-73 HVTH: Nguyễn Đức Duy 56 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân TÀI LIỆU THAM KHẢO VIỆT NAM Đỗ huy Bích tác giả (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Võ Văn Chi (1999) Từ điển thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Nguyễn Xuân Dũng, Trịnh Hằng Nga, Pierre A Leclercq (1992) Một số kết nghiên cứu Zanthoxylum nitidum, Tạp chí Dược học, 4, tr 21 Lê Văn Hạc, Đỗ Thị Ninh, Ngô Xuân Lương (2008), Phân lập xác định cấu trúc phân tử số hợp chất từ vỏ thân Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum DC.) Thanh Hóa, Tạp chí Hóa học Ứng dụng, 6(78), tr 40-43 Lê Văn Hạc, Lê Thanh Tùng, Ngô Xuân Lương, Nguyễn Xuân Dũng (2005) Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học xuyên tiêu Zanthoxylum nitidum Thanh Hóa, Tạp chí Dược học, 5, tr 7-9 Phạm Hoàng Hộ (1992), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất trẻ Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Ngô Xuân Lương, Lê Văn Hạc, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Đình Thắng, Lê Hòang Tùng (2003), Volatile constituents of Zanthoxylum nitidum DC leaves from Northwestern Thanh Hoa Province, Vietnam, The Tenth Asian Chemical Congress, 21-24/10/2003, Hanoi, Vietnam NƯỚC NGOÀI Akl MR., Ayoub NM., Abuasal BS., Kaddoumi A., Sylvester PW (2013), Sesamin synergistically potentiates the anticancer effects of γ-tocotrienol in mammary cancer cell lines, Fitoterapia., 84, pp 347-359 10 Chan SL., Lee MC., Tan KO., Yang LK., Lee AS., Flotow H., Fu NY., HVTH: Nguyễn Đức Duy 57 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân Butler MS., Soejarto DD., Buss AD., Yu VC (2003), Identification of chelerythrine as an inhibitor of BclXL Function, J Biol Chem., 278(23), pp 20453-20456 11 Chen J., Wang J., Lin L., He L., Wu Y., Zhang L., Yi Z., Chen Y., Pang X., Liu M (2012), Inhibition of STAT3 signaling pathway by nitidine chloride suppressed the angiogenesis and growth of human gastric cancer, Mol Cancer Ther., 11(2), pp 277-287 12 Chen JJ., Fang HY., indolopyridoquinazoline, Duh CY., Chen benzo[c]phenanthridines IS (2005), and New cytotoxic constituents from Zanthoxylum integrifoliolum, Planta Med., 71(5), pp 470-475 13 Chmura SJ., Dolan ME., Cha A., Mauceri HJ., Kufe DW., Weichselbaum RR (2000), In vitro and in vivo activity of protein kinase C inhibitor chelerythrine chloride induces tumor cell toxicity and growth delay in vivo, Clin Cancer Res., 6(2), pp 737-742 14 Chou HC., Chen JJ., Duh CY., Huang TF., Chen IS (2005), Cytotoxic and anti-platelet aggregation constituents from the root wood of Melicope semecarpifolia, Planta Med., 71(11), pp 1078-1081 15 Colombo ML., Bugatti C., Mossa A., Pescalli N., Piazzoni L., Pezzoni G., Menta E., Spinelli S., Johnson F., Gupta RC., Dasaradhi L (2001), Cytotoxicity evaluation of natural coptisine and synthesis of coptisine from berberine, Farmaco., 56(5-7), pp 403-409 16 F.J Mart´ınez-Mart´ınez, I.I Padilla-Mart´ınez, B Hern´andez-Carlos, R.M P´erez-Guti´errez, and E.V Garc´ıa-B´aez, (2002), X-ray diffraction and total 1H and 13C NMR assignment of (RS)-5,6-dihydro-7,8dimethoxy-5-methyl-6-(2-oxopropyl)(2,3-methylenedioxyphenyl)-[c]phenanthridine ((RS)-6-acetonyldihydrochelerythrine, Journal of Chemical Crystallography, Vol.32, Nos.3–4, pp 63-68 17 Fang Z., Tang Y., Jiao W., Xing Z., Guo Z., Wang W., Shi B., Xu Z., Liu Z (2013), Nitidine chloride inhibits renal cancer cell metastasis via suppressing AKT signaling pathway, Food Chem Toxicol., 60, pp 246- HVTH: Nguyễn Đức Duy 58 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân 251 18 Fang Z., Tang Y., Jiao W., Xing Z., Guo Z., Wang W., Xu Z., Liu Z (2014), Nitidine chloride induces apoptosis and inhibits tumor cell proliferation via suppressing ERK signaling pathway in renal cancer, Food Chem Toxicol., pii: S0278-6915(14)00063-5 doi: 10.1016/j.fct.2014.01.049 19 Global Biodiversity Information Facility: Biodiversity occurrence data, In: GBIF Data Portal March 20, 2010, Available from: http://data.gbif.org/species/ 20 Hori H., Takayanagi T., Kamada Y., Shimoyoshi S., Ono Y., Kitagawa Y., Shibata H., Nagao M., Fujii W., Sakakibara Y (2011), Genotoxicity evaluation of sesamin and episesamin, Mutat Res., 719(1-2), pp 21-28 21 Hu J., Zhang WD., Liu RH., Zhang C., Shen YH., Li HL., Liang MJ., Xu XK (2006), Benzophenanthridine alkaloids from Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC, and their analgesic and anti-inflammatory activities, Chem Biodivers., 3(9), pp 990-995 22 Hu J., Zhang WD., Liu RH., Zhang C., Shen YH., Xu XK., Liang MJ., Li HL (2006), Chemical constituents in root of Zanthoxylum nitidum, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi., 31(20), pp 1689-1691 23 Iwasaki H., Okabe T., Takara K., Toda T., Shimatani M., Oku H (2010), Tumor selective cytotoxicity of benzo[c]phenanthridine derivatives from Toddalia asiatica Lam., Cancer Chemother Pharmacol., 65(4), pp 719726 24 Jin CM., Lee JJ., Yang YJ., Kim YM., Kim YK., Ryu SY., Lee MK (2007), Liriodenine inhibits dopamine biosynthesis and L-DOPA-induced dopamine content in PC12 cells, Arch Pharm Res., 30(8), pp 984-990 25 Ju Y., Still CC., Sacalis JN., Li J., Ho CT (2001), Cytotoxic coumarins and lignans from extracts of the northern prickly ash (Zanthoxylum americanum), Phytother Res., 15(5), pp 441-443 26 Kang M., Ou H., Wang R., Liu W., Tang A (2014), The effect of nitidine chloride on the proliferation and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma HVTH: Nguyễn Đức Duy 59 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân cells, J BUON., 19(1), pp 130-136 27 Khamis S., Bibby MC., Brown JE., Cooper PA., Scowen I., Wright CW (2004), Phytochemistry and preliminary biological evaluation of Cyathostemma argenteum, a malaysian plant used traditionally for the treatment of breast cancer, Phytother Res., 18(7), pp 507-510 28 Kim SA., Kwon Y., Kim JH., Muller MT., Chung IK (1998), Induction of topoisomerase II-mediated DNA cleavage by a protoberberine alkaloid, berberrubine, Biochemistry, 37(46), pp 16316-16324 29 Krane B.D., Fagbule M., Shamma M and Gozler B (1984) The Benzophenanthridine Alkaloids, J of Nat Pod 47: pp - 43 30 Kumar S., Deepak P., Kumar S., Gautam PK., Acharya A (2013), A benzophenanthridine alkaloid, chelerythrine induces apoptosis in vitro in a Dalton's lymphoma, J Cancer Res Ther., 9(4), pp 693-700 31 Liang M., Zhang W., Hu J., Liu R., Zhang C (2006), Simultaneous analysis of alkaloids from Zanthoxylum nitidum by high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray tandem mass spectrometry, J Pharm Biomed Anal., 42(2), pp 178-183 32 Liao J., Xu T., Zheng JX., Lin JM., Cai QY., Yu DB., Peng J (2013), Nitidine chloride inhibits hepatocellular carcinoma cell growth in vivo through the suppression of the JAK1/STAT3 signaling pathway, Int J Mol Med., 32(1), pp 79-84 33 Lin CC., Ng LT., Hsu FF., Shieh DE., Chiang LC (2004), Cytotoxic effects of Coptis chinensis and Epimedium sagittatum extracts and their major constituents (berberine,coptisine and icariin) on hepatoma and leukaemia cell growth, Clin Exp Pharmacol Physiol., 31(1-2), pp 65-69 34 M.T Martin, L.H Rasoanaivo, A Raharisololalao (2005), Phenanthridine alkaloids from Zanthoxylum madagascariense, Fitoterapia 76, p 590–593 35 Mukhija M., Lal Dhar K., Nath Kalia A (2014), Bioactive lignans from Zanthoxylum alatum Roxb stem bark with cytotoxic potential, J Ethnopharmacol., 152(1), pp 106-112 HVTH: Nguyễn Đức Duy 60 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 36 GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân Nakanishi T., Suzuki M (1999), Synthesis and cytotoxic activities of a new benzo[c]phenanthridine alkaloid, 7-hydroxynitidine, and some 9oxygenated benzo[c]phenanthridine derivatives, Org Lett., 1(7), pp 985988 37 Niu Y., Bai J., Kamm RD., Wang Y., Wang C (2014), Validating antimetastatic effects of natural products in an engineered microfluidic platform mimicking tumor microenvironment, Mol Pharm 38 Pan X., Han H., Wang L., Yang L., Li R., Li Z., Liu J., Zhao Q., Qian M., Liu M., Du B (2011), Nitidine chloride inhibits breast cancer cells migration and invasion by suppressing c-Src/FAK associated signaling pathway, Cancer Lett., 313(2), p 181-191 39 Prado S., Michel S., Tillequin F., Koch M., Pfeiffer B., Pierré A., Léonce S., Colson P., Baldeyrou B., Lansiaux A., Bailly C (2004), Synthesis and cytotoxic activity of benzo[c][1,7] and [1,8]phenanthrolines analogues of nitidine and fagaronine, Bioorg Med Chem., 12(14), pp 3943-3953 40 Radek Marek, Jarom´ır Touˇsek, Jiˇr´ıDost´al, Jiˇr´ıSlav´ık, Roger Dommisse and Vladim´ır Sklen´aˇr (1999) 1H and 13C NMR studyof quaternary benzo[c]phenanthridinealkaloids Magn Reson Chem.37, pp 781–787 41 Ralph R Weichselbaum, Donald W Kufe, Steven J Chmura, Mary E Dola (2002), Administering in combination with chemotherapeutic agents that directly damage DNA; extremely cytotoxic, Patent US 6426351 B1 42 Serafim TL., Matos JA., Sardão VA., Pereira GC., Branco AF., Pereira SL., Parke D., Perkins EL., Moreno AJ., Holy J., Oliveira PJ (2008), Sanguinarine cytotoxicity on mouse melanoma K1735-M2 cells nuclear vs mitochondrial effects, Biochem Pharmacol., 76(11), pp 1459-1475 43 Sethi VS (1976), Inhibition of mammalian and oncornavirus nucleic acid polymerase activities by alkoxybenzophenanthridine alkaloids, Cancer Res., 36(7 PT 1), pp 2390-2395 44 Sethi VS (1977), Base specificity in the inhibition of oncornavirus reverse transcriptase and cellular nucleic acid polymerases by antitumor drugs, HVTH: Nguyễn Đức Duy 61 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân Ann N Y Acad Sci., 284, pp 508-524 45 Shemon AN., Sluyter R., Conigrave AD., Wiley JS (2004), Chelerythrine and other benzophenanthridine alkaloids block the human P2X7receptor, Br J Pharmacol., 142(6), pp 1015-1019 46 Slaninová I., Táborská E., Bochoráková H., Slanina J (2001), Interaction of benzo[c]phenanthridine and protoberberine alkaloids with animal and yeast cells, Cell Biol Toxicol., 17(1), pp 51-63 47 Still PC., Yi B., González-Cestari TF., Pan L., Pavlovicz RE., Chai HB., Ninh TN., Li C., Soejarto DD., McKay DB., Kinghorn AD (2013), Alkaloids from Microcos paniculata with cytotoxic and nicotinic receptor antagonistic activities, J Nat Prod., 76(2), pp 243-249 48 Sun JB., Qu W., Guan FQ., Li LZ., Liang JY (2014), A new quinoline alkaloid from the roots of Dictamnus angustifolius, Chin J Nat Med., 12(3), pp 222-224 49 Vaquette J., Cavi A et Waterman P.G (1978) Alcaloides des ecorces de racines et de tiges de Zanthoxylum bouetense (Pierre ex letouzey) Waterm Plantes medicinales et phytotherapie, Tome xi(3), pp 235 - 239 50 Varamini P., Javidnia K., Soltani M., Mehdipour AR., Ghaderi A (2009), Cytotoxic activity and cell cycle analysis of quinoline alkaloids isolated from Haplophyllum canaliculatum Boiss, Planta Med., 75(14), pp 15091516 51 Vitaliy O Kaminskyy, Maxim D Lootsik, Rostyslav S Stoika (2006), Correlation of the cytotoxic activity of four different alkaloids from Chelidonium majus (greater celandine) with their DNA intercalating properties and ability to induce breaks in the DNA of NK/Ly murine lymphoma cells, Central European Journal of Biology, 1(1), pp 2-15 52 Vrba J., Dolezel P., Vicar J., Ulrichová J (2009), Cytotoxic activity of sanguinarine and dihydrosanguinarine in human promyelocytic leukemia HL-60 cells, Toxicology in Vitro, 23(4), pp 580-588 Waechter AI., Cavé A., Hocquemiller R., Bories C., Muñoz V., Fournet A (1999), Antiprotozoal activity of aporphine alkaloids isolated from 53 HVTH: Nguyễn Đức Duy 62 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS TS Vũ Đình Hoàng TS Nguyễn Thị Hồng Vân Unonopsis buchtienii (Annonaceae), Phytother Res., 13(2), pp 175-177 54 Wall ME., Wani MC., Taylor H (1987), Plant antitumor agents, 27 Isolation, structure, and structure activity relationships of alkaloids from Fagara macrophylla, J Nat Prod., 50(6), pp 1095-1099 55 Wan KF., Chan SL., Sukumaran SK., Lee MC., Yu VC (2008), Chelerythrine induces apoptosis through a Bax/Bak-independent mitochondrial mechanism, J Biol Chem., 283(13), pp 8423-8433 56 Xu Q., Li ZX., Ye ZM (2011), Nitidine chloride-induced apoptosis of human osteosarcoma cells and its mechanism, Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao., 31(2), pp 361-364 57 XuanLuo,LilianaPedro,VladimirMilic,SilvaMulhovo,AidaDuarte,NoéliaDu arte,Maria-JoséU.Ferreira (2012), Antibacterial Benzofuran Neolignans and Benzophenanthridine Alkaloids from the Roots of Zanthoxylumcapense, Planta Med ; 78 , pp 148–153 58 Yang CH., Cheng MJ., Chiang MY., Kuo YH., Wang CJ., Chen IS (2008), Dihydrobenzo[c]phenanthridine alkaloids from stem bark of Zanthoxylum nitidum, J Nat Prod., 71(4), pp 669-673 59 Yang CH., Cheng MJ., Lee SJ., Yang CW., Chang HS., Chen IS (2009), Secondary metabolites and cytotoxic activities from the stem bark of Zanthoxylum nitidum, Chem Biodivers., 6(6), pp 846-857 60 Yang G., Chen D (2008), Alkaloids from the roots of Zanthoxylum nitidum and their antiviral and antifungal effects, Chem Biodivers., 5(9), pp 1718-1722 61 Chang-Ping Jia, Fang Feng (2014), Optimization of the separation and determination of nitidine and chelerythrine in Zanthoxylum nitidum by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection, J of Chromatographic Science 52, pp 164-168 HVTH: Nguyễn Đức Duy 63 ... đề tài Nghiên cứu số thành phần alkaloid Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) mọc Việt Nam từ góp phần xác định thành phần hóa học tìm nguồn nguyên liệu cho ngành hóa dược Nhiệm vụ nghiên cứu: -... nghiên cứu Xuyên tiêu (Zanthoxylum Nitidum) 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới Các nghiên cứu thành phần hóa học Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) giới cho thấy có thành phần chủ yếu hợp chất alkaloid. .. thấy dược liệu Xuyên tiêu có tiềm để tìm kiếm phát triển thành phần có tác dụng phòng điều trị ung thư 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Ở Việt Nam, Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) sử dụng