Nghiên cứu một số thành phần alkaloid của cây xuyên tiêu (zanthoxylum nitidum) mọc ở việt nam

Nhiều hợp chất thu được từ cây này đã cho thấy có những hoạt tính sinh học đáng chú ý như kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng viêm giảm đau, chống co thắt, chống sốt rét…, trong đ

HVTH: Nguyễn Đức Duy 1

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN 3

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ 4

MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 9

1.1 Một vài nét về thực vật Chi Zanthoxylum và cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) 9

1.1.1 Chi Zanthoxylum 9

1.1.2 Thành phần hoá học một số loài thuộc chi Zanthoxylum 9

1.1.3 Cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) 12

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) 13

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Hóa chất, dụng cụ và các thiết bị dùng trong nghiên cứu 22

2.2.1 Hóa chất và dụng cụ 22

2.2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp xử lý mẫu: 23

2.4 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất: 24

2.4.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 24

2.4.2 Sắc ký cột (CC) 24

2.5 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 24

2.5.1 Phổ khối lượng (MS) 25

2.5.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 25

HVTH: Nguyễn Đức Duy 2

2.6 Điểm nóng chảy (Mp) 26

2.7 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 26

2.7.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 26

2.7.2 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) 26

2.8 Phương pháp HPLC 28

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 29

3.1 Xử lý mẫu thực vật và điều chế các cặn chiết từ mẫu thực vật 29

3.2 Phân lập các hợp chất từ cặn chiết 30

3.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 32

3.3.1 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất 1 (ZN1) 32

3.3.2 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất 2 (ZN/A/7) 33

3.3.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất 3 (ZN/A/11) 33

3.4 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được 34

3.5 Xác định hàm lượng hoạt chất nitidine trong các bộ phận của cây Xuyên tiêu bằng phương pháp HPLC 34

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (ZN1) 37

4.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (ZN/A/7) 42

4.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 (ZN/A/11) 46

4.4 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập được 52

4.5 Hàm lượng của hoạt chất nitidine trong các bộ phận lá, quả, cành, thân và rễ cây Xuyên tiêu 53

KẾT LUẬN 55

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC

HVTH: Nguyễn Đức Duy 3

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

ESI – MS: Electrospray ionization Mass Spectroscopy

1H NMR (1H -Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng proton - 1H

13C NMR (13C - Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - 13C

HSQC: Heteronuclear single - Quantum Coherence

HMBC: Heteronuclear multiple - Bond Correlation

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

TLC (Thin layer chromatography):Sắc ký lớp mỏng

CC: (Column chromatography) Sắc ký cột

UV-Vis: Ultraviolet-Visible: phổ tử ngoại và khả kiến

δ(ppm): Độ chuyển dịch hóa học (parts per million)

MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu

IC50 (The half maximal Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50%

MBC (Minimum Bactericidal Concentration): Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao

TBUT: Tế bào ung thư

SRB: Sulforhodamine B

HVTH: Nguyễn Đức Duy 4

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2 Ảnh mẫu cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) 22

Hình 3.1 Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ cây Xuyên tiêu 29

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất 1, 2 và 3 từ cặn chiết n-hexan của thân

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất 1 từ phần cặn chiết nước của thân và cành

Hình 3.4 a) Phổ UV-Vis của nitidine; b) Sắc ký đồ HPLC của nitidine 34

Hình 4.6 Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất ZN1 40

Hình 4.7 Cấu trúc hóa học của hợp chất nitidine 41

Hình 4.14 Cấu trúc hóa học của hợp chất dihydrochelerythrin 46

Hình 4.15 Phổ 1H-NMR của hợp chất ZN/A/11 47

Hình 4.16 Phổ 13C-NMR của hợp chất ZN/A/11 48

HVTH: Nguyễn Đức Duy 5

Hình 4.20 Cấu trúc hóa học của hợp chất 6-acetonyldihydrochelerythrine 52

Hình 4.21 Sắc kí đồ HPLC của các cặn chiết metanol tổng từ lá (a), quả

HVTH: Nguyễn Đức Duy 6

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.2: Độ chính xác của phương pháp phân tích nitidine 36

Bảng 4.1 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất ZN1 và số liệu tham

Bảng 4.2 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất ZN/A/7 và số liệu tham

Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất ZN/A/11 và số liệu tham

khảo của hợp chất 6-acetonyldihydrochelerythrine 50

Bảng 4.4 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập được 52

Bảng 4.5 Hàm lượng nitidine có trong các bộ phận lá, quả, cành, thân và

HVTH: Nguyễn Đức Duy 7

MỞ ĐẦU

Nước ta có diện tích khoảng 330.000 km2 nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa

cận xích đạo nên nhiệt độ hàng năm khá cao (khoảng từ 22 – 34 oC) Lượng mưa

hàng năm lớn tạo cho nước ta một hệ thực vật đa dạng và phong phú Theo số liệu

thống kê gần đây hệ thực vật Việt Nam có khoảng 12.000 loài, trong đó trong đó

cây làm thuốc chiếm khoảng 26-30 % [6, 7] Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên

rất quý báu của đất nước

Cùng với sự phát triển của khoa học, hiện nay người ta đã phát hiện ra những

hợp chất có nhiều hoạt tính đặc biệt trong các loại cây và đã được đưa vào ứng dụng

một cách có hiệu quả trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp dược phẩm, hương liệu

mỹ phẩm, thực phẩm Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học cũng như phân

loại bằng hóa học các cây thuốc và các cây tinh dầu là nhằm mục đích tốt cho công

tác điều tra tài nguyên thiên nhiên, để từ đó có kế hoạch sử dụng, bảo tồn và phát

triển chúng một cách có hiệu quả nhất

Cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.) thuộc họ Cam

(Rutaceae) Trong y học dân gian, cây có tác dụng tán hàn, giải độc tiêu thũng, giảm

đau, trục thấp, ôn trung, trợ hỏa, sát trùng và thường được sử dụng làm thuốc giúp

sự tiêu hóa, chữa đau nhức khớp xương, viêm mủ da, viêm da, uốn ván, ho, viêm

họng, sốt, sốt rét kinh niên, đau nhức khớp xương, phong thấp, đau thần kinh, rắn

độc cắn, giun sán; có thể dùng dưới dạng thuốc sắc hoặc dùng ngoài Các nghiên

cứu trên thế giới cho thấy cây Zanthoxylum nitidum có thành phần hóa học chủ yếu

là các hợp chất alkaloid và lignan; ngoài ra còn có một số hợp chất khác có khung

coumarin, terpenoid và steroid Nhiều hợp chất thu được từ cây này đã cho thấy có

những hoạt tính sinh học đáng chú ý như kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut,

kháng viêm giảm đau, chống co thắt, chống sốt rét…, trong đó nổi bật nhất là khả

năng gây độc tế bào, chống ung thư

Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt

tính sinh học của cây Xuyên tiêu có rất ít, mới chỉ thấy có một kết quả công bố về

thành phần hóa học tinh dầu lá và một công bố về việc phân lập hai hợp chất

nitidine, episesamin từ vỏ thân cây Xuyên tiêu ở Thanh Hóa Do đó, việc nghiên

cứu để tìm hiểu rõ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài dược liệu

này ở Việt Nam nhằm tìm kiếm các thành phần có hoạt tính tốt để định hướng ứng

dụng trong y, dược là rất cần thiết

HVTH: Nguyễn Đức Duy 8

Do có những ứng dụng quý giá như vậy nên chúng tôi quyết định chọn đề tài

“Nghiên cứu một số thành phần alkaloid của cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum

nitidum) mọc ở Việt Nam” từ đó góp phần xác định thành phần hóa học và tìm ra

nguồn nguyên liệu cho ngành hóa dược

1 Nhiệm vụ nghiên cứu:

- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất alkaloid từ cây Xuyên tiêu

(Zanthoxylum nitidum) mọc ở Việt Nam

- Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất alkaloid phân lập được

- Xây dựng phương pháp HPLC định lượng hoạt chất alkaloid có hàm lượng cao

nhất trong cây Xuyên tiêu

2 Đối tượng nghiên cứu:

Thân và cành cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) thuộc họ Cam (Rutaceae) ở

Việt Nam

Chi Zanthoxylum thuộc họ Cam (Rutaceae), trên thế giới có khoảng 549 loài

phân bố ở các nước vùng ôn đới ấm áp hay cận nhiệt đới [19] Các cây thuộc chi

Zanthoxylum thường có dạng cây bụi hoặc cây thân gỗ

Ở Việt Nam, chi Zanthoxylum có khoảng 13 loài, phân bố ở các vùng ven rừng

độ cao 1000-1500m ở khắp cả nước [2, 6]

1 Zanthoxylum avicennae ( Lamk.) DC.( muồng truổng, sẻn lai)

2 Zanthoxylum usitatum Pierre ex Laness (xuông, moong tu)

3 Zanthoxylum armatum DC (, sẻn gai, đắng cay)

4 Zanthoxylum myriacanthum Wall (hoàng mộc nhiều gai, sẻn lá to)

5 Zanthoxylum cucullipetalum Guill (hoàng mộc cánh bầu)

6 Zanthoxylum anthyllidifodium DC (sẻn Đà Nẵng)

7 Zanthoxylum laetum Drake (hoàng mộc sai)

8 Zanthoxylum scandens Blume (hoàng mộc leo, đắng cay, thục tiêu)

9 Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC (xuyên tiêu, hoàng lực, hoàng liệt, hạt sẻn,

hoa tiêu, ba tiêu)

10 Zanthoxylum rhetsa (Roxb.) DC (sẻn hôi, hoàng mộc hôi, cóc hôi,vàng me,

muống tử)

11 Zanthoxylum scabrum Guill (dây khắc dung, rau sâng)

12 Zanthoxylum evodiaefolium Guill (hoàng mộc phi,đắng cay 3 lá)

13 Zanthoxylum acanthopodium DC (sẻn, sẻn gai)

1.1.2 Thành phần hoá học một số loài thuộc chi Zanthoxylum

Chi Zanthoxylum rất đa dạng và phong phú về mặt hoá học đặc biệt là các

alkaloid, chất thơm, chất béo, steroid, lignan và cumarin

Các loài thuộc chi Zanthoxylum là nguồn cung cấp các hợp chất

benzophenanthridine [29] và aporphin alkaloid Cacbazol, canthinon và acridon

alkaloid cũng được tìm thấy ở một số loài Zanthoxylum

HVTH: Nguyễn Đức Duy 10

Chi Zanthoxylum có chứa tinh dầu, trong tinh dầu thường chứa các hợp chất

nhóm tecpenoid là chủ yếu Tinh dầu của nhiều loài Zanthoxylum (Z alatum, Z

acanthopozium ) có hàm lượng linalol khá cao (18,0 – 88,0 %)

Các hợp chất benzophenanthridine như nitidine và chelerythrine, các

furoquinoline, skimmianine và các aporphine, berberine, magnoflorine đã được

phân lập từ rễ và vỏ thân của Zanthoxylum bouetense và Z dinklagei [49]

Các alkaloid có trong một số loài thuộc chi Zanthoxylum:

Xanthotoxin (17) R1 = H, R2 = OCH3

Imperatorin (18) R1 = H, R2 = OCH2 - CH=C(CH3)2

Xanthotoxol (19) R1 = H, R2 = OH

Umbelliferone (21) R2 = OH, R1 = H

HVTH: Nguyễn Đức Duy 12

Scoparone (22) R1=R2= OCH3

Scopoletin (23) R1= OH, R2 = OCH3

Các hợp chất có tính chất chữa bệnh ở một số loài Zanthoxylum:

Các hợp chất có trong tinh dầu của một số loài Zanthoxylum:

Farnesal (27) α-Farnesene (28) β-Farnesene (29)

Farnesol (30) Metyleugenol (31) Nerolidol (32)

1.1.3 Cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum)

Cây Xuyên tiêu (hay còn gọi là cây hạt sẻn, sưng, hoàng lực) có tên khoa học

là Zanthoxylum nitidum DC thuộc họ Cam (Rutaceae) Đây là loại cây nhỏ leo, ưa

sáng và chịu hạn tốt, thường mọc trong các quần hệ cây bụi ở đồi, nương rẫy bỏ

hoang hoặc ven rừng thứ sinh, có nhiều cành, dài 1-2 m, có thể dài tới 15 m Đường

kính thân có thể tới 15 cm, có gai quặp Cành hình trụ, nhẵn, mầu nâu đen, có gai

ngắn rải rác, dẹt, quay về phía dưới Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, dài 18-20 cm,

gồm 5-7 lá chét mọc đối, hình trái xoan, dài 6-11 cm, rộng 3,5-5,5 cm, gốc tròn, đầu

có mũi nhọn, 2 mặt đều có gai ở gân, mặt trên mầu lục sẫm, mặt dưới nhạt, gân lá

hằn rõ, cuống lá dài có gai Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chùm, hay chùm xim đơn

HVTH: Nguyễn Đức Duy 13

riêng lẻ, hoa đơn tính, mầu trắng, thơm; hoa đực có nhị dài hơn cánh hoa, chỉ nhị

mảnh; hoa cái có bầu hình cầu gồm 4-5 lá noãn, hơi ngắn hơn cánh hoa Quả có 1-5

mảnh vỏ, thường là 3 tụ lại ở quanh trục, mặt ngoài nhăn nheo, mặt trong nhẵn Khi

chín mầu đỏ nhạt, mỗi mảnh vỏ đựng 1 hạt rắn, mầu đen bóng [1, 2, 7]

Ở nước ta, cây mọc hoang ở khắp các nơi, nhiều nhất tại các tỉnh miền núi

như Phú Thọ, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Tuyên Quang,

Cao Bằng, Hà Tĩnh, Nghệ An, Hòa Bình, Hà Tây [2,7]

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum Nitidum)

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về thành phần hóa học cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum)

trên thế giới cho thấy cây này có thành phần chủ yếu là các hợp chất alkaloid và lignan;

ngoài ra còn có một số hợp chất khác có khung coumarin, terpenoid và steroid Nhiều

hợp chất thu được từ cây này đã cho thấy có những hoạt tính sinh học đáng chú ý như

kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng viêm giảm đau, chống co thắt, chống sốt

rét…, trong đó nổi bật nhất là khả năng gây độc tế bào, chống ung thư

Lớp hoạt chất chính có trong cây Zanthoxylum nitidum là các alkaloid, bao

gồm 5 loại khung là benzophenanthridine alkaloid, quinolon, furoquinoline,

aporphine và pyrimidine; trong đó các benzophenanthridine alkaloid chiếm hàm

lượng chính Bằng các phương pháp tách chiết, 21 hợp chất benzophenanthridine

alkaloid đã được tìm thấy có trong cây Zanthoxylum nitidum, gồm có nitidine (1),

chelerythrine (2), 8-methoxynorchelerythrine (3), norchelerythrine (4), decarine (5),

oxynitidine (6), oxychelerythrine (7), oxyavicine (8), sanguinarine (9),

dihydrochelerythrine (10), 6-acetonyldihydrochelerythrine (11),

5,6-dihydro-6-methoxynitidine (12), (R)-[(R)-1-hydroxyethyl]dihydrochelerythrine (13),

8-methoxychelerythrin (14), 8-hydroxydihydrochelerythrine (15),

epizanthocadinanine A (16), zanthocadinanines A (17), zanthocadinanines B (18),

epi-zanthocadinanine B (19), zanthomuurolanine (20) và epi-zanthomuurolanine

(21) [21, 22, 31, 58, 50, 60]

HVTH: Nguyễn Đức Duy 14

HVTH: Nguyễn Đức Duy 15

Hầu hết các hợp chất benzophenanthridine alkaloid này đều có hoạt tính gây

độc tế bào, chống ung thư rất tốt, điển hình như các hợp chất nitidine, chelerythrine,

sanguinarine,

1.2.1.1 Hợp chất nitidine

Ngay từ năm 1976, hợp chất nitidine (1) (hay nitidine chloride) đã được công

bố trên tạp chí Cancer Research về khả năng ức chế sự sao chép ngược của RNA

virut gây ung thư và hoạt tính chống bạch cầu, gợi ý về khả năng chống ung thư của

hợp chất này [43] Sau đó, nhiều nghiên cứu khác đã cho thấy nitidine có khả năng

chống bệnh bạch cầu [54], gây độc đối với tế bào ung thư cổ tử cung HeLa S3, tế

bào bạch cầu chuột L1210, tế bào ung thư phổi người A549, tế bào u xương ác tính

ở người MG-63 [36, 39, 56], ngăn chặn quá trình di căn và xâm lấn in vivo của ung

thư vú, ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư thận [11, 17, 18, 32, 38] Nghiên cứu

gần đây nhất (2014) đã cho thấy nitidine có khả năng chống di căn ung thư hầu,

thực quản, chống sốt rét [26, 37] Điều đáng quý ở đây là nitidine đã được chứng

minh không gây đột biến gen và có tác dụng gây độc chọn lọc đối với các tế bào

ung thư so với tế bào lành tính Năm 1977, ngay sau công bố về khả năng ức chế

hoạt tính sao chép ngược của RNA virut gây ung thư và hoạt tính chống bệnh bạch

cầu, gợi ý về khả năng chống ung thư của nitidine (vào năm 1976), nhà nghiên cứu

HVTH: Nguyễn Đức Duy 16

Sethi V.S đã ngay lập tức tiến hành đánh giá về khả năng gây đột biến gen của hợp

chất benzophenanthridine alkaloid này do có sự khá tương đồng về cấu trúc hóa học

với chất gây ung thư 5-methylchrysene Thật may mắn, kết quả cho thấy nitidine

không gây đột biến gen Nghiên cứu sâu hơn về mối liên quan hoạt tính - cấu trúc

của các hợp chất này, tác giả đã đưa ra nhận định: chính sự có mặt của nguyên tử

nitơ bậc 4 và của các nhóm methoxy trong cấu trúc của nitidine đã khiến cho hợp

chất này có hoạt tính gây độc tế bào mà không gây đột biến gen như chất gây ung

thư 5-methylchrysene [44]

Mặt khác, trong một chương trình nghiên cứu nhằm tìm kiếm các chất chống

ung thư ít gây tác dụng phụ, các nhà nghiên cứu Nhật Bản nhận thấy nitidine có tác

dụng gây độc in vitro chọn lọc đối với các tế bào ung thư so với các tế bào lành

tính, đối với cả các dòng tế bào ở người và ở chuột Khi nghiên cứu in vivo trên mô

hình khối u ghép ngoại lai dưới da, nitidine có khả năng ức chế rất tốt sự sinh

trưởng của khối u phổi ác tính ở chuột và ở người mà không gây tác dụng phụ

(không ảnh hưởng đối với các chỉ số huyết thanh và không gây độc đối với gan)

Khi nghiên cứu về mối liên hệ hoạt tính – cấu trúc, các tác giả nhận thấy rằng hợp

chất dihydronitidine cũng có tác dụng gây độc chọn lọc đối với các tế bào ung thư

giống như hợp chất nitidine trong khi demethylnitidine thì không Từ đó, các tác giả

đưa ra nhận định: chính sự có mặt của nhóm thế methoxy ở vị trí C-8 của khung

benzophenanthridine quyết định đặc tính này Nghiên cứu này đã đưa ra bằng chứng

in vivo đầu tiên về khả năng chống ung thư ít gây tác dụng phụ của hợp chất

alkaloid tự nhiên nitidine [23]

HVTH: Nguyễn Đức Duy 17

1.2.1.2 Hợp chất chelerythirine

Hợp chất chelerythirine (2) có cấu trúc tương tự như của nitidine, chỉ khác về

vị trí của hai nhóm thế methoxy (thế ở C-8, C-9 đối với nitidine và thế ở C-7, C-8

đối với chelerythrine), cũng có khả năng gây độc tế bào in vitro và ức chế khối u in

vivo rất hiệu quả Hợp chất benzophenanthridine alkaloid này có khả năng gây độc

in vitro đối với 9 dòng tế bào ung thư ở người và ức chế sự tăng trưởng của ung thư

vảy da in vivo Theo các tác giả, sở dĩ chelerythrine có khả năng gây độc đối với

nhiều dòng tế bào ung thư vì hợp chất này có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme

protein kinaza C (PKC) Enzyme PKC tham gia điều chỉnh quá trình tăng sinh, quá

trình biệt hóa và khả năng sống sót của tế bào Do đó, chất có khả năng ức chế PKC

sẽ gây ra cái chết theo chương trình trong hầu hết các dòng tế bào ở động vật có vú

và có khả năng chống ung thư [13] Một số cơ chế gây độc tế bào khác của

chelerythrine cũng đã được công bố như: ức chế protein Bcl-xL [10, 55], ức chế thụ

thể P2X7 [45], ức chế sự biểu hiện của các protein bảo vệ tế bào ung thư như HSF1

và hsp70 [30] Ngoài ra, chelerythrine gây độc đối với các tế bào ung thư hạch ở

chuột NK/Ly thông qua khả năng làm phá vỡ cấu trúc DNA tế bào [51], và đã được

đăng ký patent về tác dụng ức chế hiệu quả khối u rắn và gây độc tế bào mạnh khi

kết hợp với các tác nhân hóa trị liệu khác do khả năng phá hủy trực tiếp đến cấu trúc

DNA của tế bào ung thư [41]

1.2.1.3 Hợp chất 8-methoxy norchelerythrine

Hợp chất 8-methoxynorchelerythrine (3) có hoạt tính gây độc tế bào đối với 8

dòng tế bào ung thư A-549, BGC-823, HCT15, HeLa, HepG2, MCF-7, SGC-7901

và SK-MEL-2 với các giá trị IC50 nằm trong khoảng 7,5 – 10,3 µg/ml [30] Các hợp

chất norchelerythrine (4), oxynitidine (6), oxychelerythrine (7) đều có hoạt tính ức

chế mạnh đối với dòng tế bào bạch cầu chuột P-388 và tế bào ung thư tuyến đại trực

tràng ở người HT-29 với các giá trị IC50 < 4 µg/ml [12, 14]

1.2.1.4 Hợp chất sanguinarine

Hợp chất sanguinarine (9) cũng đã được chứng minh có khả năng chống ung

thư in vitro và in vivo tốt: ức chế mạnh sự tăng sinh của tế bào ung thư cổ tử cung

HeLa với giá trị IC50 là 0,8 µg/ml [46], gây hoại tử và cái chết theo chương trình đối

với dòng tế bào bạch cầu ở người HL-60 [52], gây ra cái chết theo chương trình đối

với tế bào khối u thần kinh nội tiết thông qua khả năng kích hoạt caspase-3 [46],

kìm hãm chu trình tế bào và gây ra cái chết theo chương trình đối với tế bào ung thư

HVTH: Nguyễn Đức Duy 18

tuyến tiền liệt [52], ức chế khối u melanin ác tính [42] Đặc biệt, một nghiên cứu

của Burgeiro A và công sự đã chứng minh sanguinarine có khả năng gây ra cái chết

rất nhanh đối với các tế bào ác tính thông qua khả năng kích hoạt caspase-3 và sinh

ra các ROS (reactive oxygen species)

1.2.1.5 Một số hợp chất alkaloid khác

Một số hợp chất alkaloid có khung khác như skimmianine (22),

gamma-fagarine (23), dictamnine (24), 5-methoxydictamnine (25), berberrubine (26),

coptisine (27) có khung furoquinoline; flindersin (28),

4-methoxy-1-methyl-2-quinolone (29) có khung 4-methoxy-1-methyl-2-quinolone và các hợp chất liriodenine (30),

N-acetyldehydroanonaine (31), N-acetylanonaine (32) có khung aporphin cũng đã

được tìm thấy có trong cây Zanthoxylum nitidum [1, 2, 6, 19, 58, 59]

HVTH: Nguyễn Đức Duy 19

Hợp chất skimmianine (22) có khả năng gây độc tế bào in vitro rất mạnh đối

với các dòng tế bào P-388 và HT-29 (các giá trị IC50 < 4 µg/ml) [12], gây độc tế bào

mạnh đối với các dòng tế bào RAJI, Jurkat (các giá trị IC50 tương ứng là 15,6 và

11,5 µg/ml) và có tác dụng gây độc trung bình đối với các dòng tế bào MCF-7,

KG-1a, HEP-2, HL-60 và HL-60/MX1 [50]

Hợp chất gamma-fagarine (23) cũng có khả năng gây độc tế bào mạnh đối với

các dòng tế bào P-388 và HT-29 với các giá trị IC50 đều nhỏ hơn 4 µg/ml [12] Hợp

chất dictamnine (24), skimmianine (22) và gamma-fagarine (23) đều có khả năng

gây độc tế bào yếu đối với dòng tế bào ung thư vú ở người MCF7 [48]

Hai hợp chất berberrubine (26) và coptisine (27) đều là những hợp chất tiền

berberine và đã được biết có khả năng gây độc tế bào, chống ung thư rất tốt thông

qua khả năng gây độc đối với enzyme topoisomeraza II [28], ức chế mạnh sự tăng

sinh của các dòng tế bào ung thư gan (HepG2, Hep3B, SK-Hep1, PLC/PRF/5) và

bạch cầu (K562, U937, P3H1 Raji) với các giá trị IC50 nằm trong các khoảng 1,4 –

15,2 µg/ml và 0,6 – 14,1 µg/ml, tương ứng [33] Coptisine còn ức chế mạnh dòng tế

bào HeLa với giá trị IC50 là 2,6 µg/ml [51], gây độc đối với các dòng tế bào LoVo,

HT 29, L-1210, thậm chí hợp chất này có hoạt tính đối với cả dòng tế bào ung thư

ruột kết đã kháng doxorubicin (Dx) ở người là LoVo/Dx [15]

Flindersin (28) là hợp chất alkaloid khung furoquinoline đã được chứng minh có

hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với dòng tế bào RAJI (IC50 14,9 µg/ml), có hiệu quả

trung bình đối với các dòng tế bào MCF-7, KG-1, HEP-2, HL-60 và HL-60/MX1,

trong đó HL-60/MX1 là dòng tế bào bạch cầu kháng đa thuốc ở người [50]

Một hợp chất alkaloid khác có khung aporphin được biết đến như là một chất

có tiềm năng chống ung thư cũng đã được tìm thấy có trong loài Zanthoxylum

nitidum là liriodenine (30) Theo các nghiên cứu, liriodenine có hoạt tính đối với

nhiều dòng tế bào ung thư như HL-60, HT-29, PC-12, A549, MCF-7, Vero, KB,

A-549, HCT-8, P-388 và L-1210 [24, 27, 47, 53]

HVTH: Nguyễn Đức Duy 20

1.2.1.6 Các hợp chất lignan

Bên cạnh lớp chất chính alkaloid, các hợp chất lignan cũng đã được tìm thấy

trong loài Zanthoxylum nitidum, như: sesamin, episesamin,

piperitol-3,3-dimethylallyl ether, xanthoxylol-3,3-piperitol-3,3-dimethylallyl ether, savinin,

2,3-bis(3,4-methylenedioxybenzyl)but-2-en-4-olide [59]

Hợp chất sesamin có hoạt tính làm giảm khả năng sống sót của các dòng tế

bào u nguyên bào thần kinh (SH-SY5Y), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi

(A549), ung thư tuyến tụy (MIA-PaCa), tế bào bạch cầu (HL-60) thông qua thử

nghiệm MTT [25, 35] Gần đây (2013), tác giả Akl M.R và cộng sự đã chứng minh

sesamin có tác dụng chống sự tăng sinh của các dòng tế bào ung thư tuyến vú ở

chuột (+SA) và ở người (MCF-7, MDA-MB-231) Đặc biệt, khi kết hợp với

γ-tocotrienol, sesamin thể hiện khả năng ức chế hiệp đồng sự sinh trưởng của các

dòng tế bào ung thư tuyến vú +SA, MCF-7, MDA-MB-231 mà ít hoặc không gây

ảnh hưởng đối với các dòng tế bào biểu mô tuyến vú lành tính (CL-S1 ở chuột và

MCF-10A ở người) [9] Hợp chất episesamin là dạng đồng phân lập thể của

HVTH: Nguyễn Đức Duy 21

sesamin Một nghiên cứu của Hori H và các cộng sự Nhật Bản đã tiến hành đánh

giá khả năng gây độc gen in vitro và in vivo của cả hai hợp chất này thông qua các

thử nghiệm sau: thử nghiệm Ames (thử nghiệm đột biến ngược vi khuẩn), thử

nghiệm sai nhiễm sắc thể trong tế bào phổi nuôi cấy của chuột đồng Trung Quốc

(CHL/IU), mô hình thử nghiệm vi nhân tủy xương (MN) trong Crlj:CD1 (ICR)

chuột và thử nghiệm comet bằng cách sử dụng gan của chuột Sprague-Dawley

(SD) Kết quả cho thấy, sesamin và episesamin không gây ảnh hưởng đối với ADN

in vivo và không gây độc gen, ngay cả khi thử cho uống với mức liều 2,0 g/kg thể

trọng chuột [20]

Ngoài ra, bằng các phương pháp HPLC, một số hợp chất có khung khác như

terpenoid (alpha-cadinol, anticopalol, spathulenol), coumarin (aesculetin dimethyl

ether, 5, 6, 7-trimethoxycoumarin), phenolic (syringic acid, 4-hydroxybenzoic acid)

cũng đã được tìm thấy có trong loài Zanthoxylum nitidum [22, 59]

Như vậy, có thể thấy rằng, cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) đã thu hút

sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới, đặc biệt trong thời

gian gần đây Các nghiên cứu trên đã cho thấy loài dược liệu này chứa thành phần

hóa học khá phong phú, bao gồm nhiều lớp chất như alkaloid, lignan, coumarin,

terpenoid; trong đó alkaloid là thành phần chính trong cây Nhiều hợp chất trong số

đó đã được chứng minh có hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư rất tốt thông qua

nhiều cơ chế tác dụng khác nhau Điều này cho thấy cây dược liệu Xuyên tiêu rất có

tiềm năng để tìm kiếm và phát triển các thành phần có tác dụng trong phòng và điều

trị ung thư

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, mặc dù cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) được sử dụng từ

lâu trong dân gian để chữa bệnh và ở một số nơi được sử dụng làm gia vị (quả) hoặc

rau ăn (lá non) nhưng các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính

sinh học của cây thuốc này còn rất ít Cho đến nay mới chỉ thấy có công bố về thành

phần hóa học tinh dầu quả xuyên tiêu của nhóm tác giả Nguyễn Xuân Dũng [3] và

việc phân lập một số hợp chất stigmasterol, dihydrokaempferol, nitidine và

epi-sesamin từ vỏ xuyên tiêu Thanh Hóa của nhóm tác giả Ngô Xuân Lương [4, 5]

Nhìn chung, các nghiên cứu về cây thuốc này ở Việt Nam còn rất ít, mới chỉ thấy có

các nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học mà chưa có các nghiên cứu định hướng

sử dụng các thành phần có hoạt tính cao để làm thuốc chữa bệnh

HVTH: Nguyễn Đức Duy 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là thân và cành cây Xuyên tiêu được thu hái tại Na

Hang, Tuyên Quang vào tháng 2 năm 2015 Tên cây được xác định bởi nhà thực vật

học TS Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hóa học các

Hợp chất thiên nhiên

Hình 2 Ảnh mẫu cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum)

2.2 Hóa chất, dụng cụ và các thiết bị dùng trong nghiên cứu

- Dung môi, metanol, cồn, n-hexan, etyl acetat, cloroform, aceton

- Silica gel cỡ hạt 40-60 µm và 23-40 µm (Merk)

- Silica gel pha đảo (YMC C18)

- Thuốc thử H2SO4 10 %, dragendorff

- Máy siêu âm: Elma, S60H

- Bản mỏng: TLC Silica gel 60 F254, Merck

- Bơm hút chân không

- Phễu chiết 2000 ml

- Cân kỹ thuật Precisa XT 620M

- Cân phân tích Precisa XT 220A

- Đèn tử ngoại

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker Avance AM500FT-NMR (Viện

Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam)

- Máy đo phổ khối: ESI-MS: AGILENT 1100LC-MSD (Viện Hóa học- Viện

Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam)

- Máy đo phổ hồng ngoại: 670-FTIR NICOLET-NEXUS (Viện Hóa học- Viện

Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam)

- Máy đo điểm nóng chảy: Stuart SMP3

2.3 Phương pháp xử lý mẫu

Mẫu thân và cành cây sau khi thu hái về được chặt nhỏ, sấy đến khô ở nhiệt độ

60 oC rồi được xay thành bột Bột dược liệu (5 kg) được ngâm chiết với dung môi

metanol trong bình chiết siêu âm ở nhiệt độ 50 oC, lặp lại 3 lần (2 ngày/lần) Gộp

dịch chiết lại và cô quay dưới áp suất giảm để thu hồi dung môi, thu được cao tổng

metanol (màu nâu vàng, 180 g) Hòa tan cao tổng metanol này trong 1000 ml nước

cất rồi chiết phân bố lại lần lượt trong các dung môi n-hexan và etyl acetat, sau khi

cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexan (cặn A)

và etyl acetat (cặn B) tương ứng Phần dịch nước còn lại được lọc và sau đó sắc ký

trên cột Diaion Hp-20 với hệ dung môi metanol:nước thu được các cặn C và D

tương ứng

HVTH: Nguyễn Đức Duy 24

2.4 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp

chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để

khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột pha đảo

2.4.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) [29]

Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích trong đó

chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ

theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển mỗi thành phần chuyển dịch

với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị

trí khác nhau Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn

DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715), RP18 F254s (Merck) Dung môi triển khai sắc ký

là hỗn hợp của một số trong số các dung môi thường dùng như n-hexan, cloroform,

etyl acetat, aceton, metanol và nước Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước

sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % trong cồn

hoặc thuốc thử dragendorff; thuốc thử được được phun đều lên bản mỏng, sấy khô

rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

2.4.2 Sắc ký cột (CC) [29]

Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố định được nhồi

trong các ống hình trụ được gọi là cột Nhờ vậy mà có thể triển khai dung môi liên

tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh

Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà sự tách trong cột sẽ xảy

ra theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân bố) Kích

thước cột và cỡ hạt silica gel phụ thuộc vào bản chất của hỗn hợp cần tách

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường, silica gel

pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) và

0,015-0,040 mm Silica gel pha đảo YMC (30-50 m, Fujisilisa Chemical Ltd.)

Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem Ind Co., Ltd.)

2.5 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết

hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại

HVTH: Nguyễn Đức Duy 25

2.5.1 Phổ khối lượng (MS)

Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lượng rất bé chất thử,

phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dương Các mảnh ion này nhờ bộ phận

phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác nhau tương ứng với lượng khối của

mỗi ion

Phổ khối lượng được ghi trên máy Agilent 1200 HPLC-MSD (Electrospray

ionization source-ESI hoặc Atmospheric pressure chemical ionization-APCI) của

Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam

2.5.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu

nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai

chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất kể cả cấu

trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ

proton và phổ carbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C)

dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn

bằng độ chuyển dịch hóa học

Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hoá học của các proton

được xác định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá

học của phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy

chúng được biểu diễn bằng một độ chuyển dịch hoá học khác nhau Dựa vào độ

chuyển dịch hoá học, diện tích pic cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với

nhau mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất

Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu phổ vạch carbon Mỗi nguyên tử carbon ở

một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo cho phổ 13

C-NMR cũng được tính bằng ppm với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0

ppm đến 240 ppm)

Phổ DEPT: Phổ này cho các tín hiệu phổ phân loại các bậc carbon khác nhau

Trên phổ DEPT 135 không cho tín hiệu của carbon bậc 4, tín hiệu của CH và CH3

nằm về một phía, còn tín hiệu của CH2 nằm về phía đối diện Trên phổ DEPT 90 chỉ

có duy nhất tín hiệu phổ của CH Kết hợp phổ 13C-NMR và phổ DEPT sẽ cho ta

biết chính xác số carbon bậc 1, 2, 3, 4

HVTH: Nguyễn Đức Duy 26

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR

Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan)

2.6 Điểm nóng chảy (M p )

Đối với chất rắn kết tinh thì điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan trọng,

nó là tiêu chuẩn để đo mức độ tinh khiết của hợp chất Nếu điểm chảy của hai loại

tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chênh lệch không quá 0,5 oC thì sản phẩm kết

tinh có thể đã tinh khiết Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp rất xa so

với điểm chảy lý thuyết thì chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết và phải tinh

chế, kết tinh lại

Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hoá học

các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.7 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

2.7.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

- Các dòng tế bào ung thư: bao gồm 5 dòng tế bào ung thư (tế bào ung thư

biểu mô thực quản (KB), tế bào ung thư vú (MCF-7), tế bào ung thư phổi LU-1, tế

bào ung thư gan Hep-G2, tế bào ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP)) do GS TS J M

Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan,

Italia cung cấp

- Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường

nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM

HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum –

FBS (GIBCO)

- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2

ở điều kiện 37 oC, 5 % CO2

2.7.2 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm

sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở

điều kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks

(1991) Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật

độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào

HVTH: Nguyễn Đức Duy 27

được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với

lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein

càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể

như sau:

- Chất thử (10 l) pha trong DMSO-d6 10% được đưa vào các giếng của khay

96 giếng để có nồng độ nồng độ 100g/ml, 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml; 0,16

g/ml

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để

điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi

trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 2 ngày

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180 l) sẽ được

sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế

bào bằng Trichloracetic acid – TCA

- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng

bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC Đổ bỏ SRB

và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô trong không khí

ở nhiệt độ phòng

- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã

bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử

dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của

chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm Khả năng sống sót của tế

bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100

% sống sót =

OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)

% ức chế = 100 % - % sống sót

- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Ellipticine

(Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các

nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml

HVTH: Nguyễn Đức Duy 28

DMSO-d6 10 % luôn được sử dụng như đối chứng âm Giá trị IC50 (nồng độ

ức chế 50% sự phát triển của tế bào) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính

TableCurve Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân

đoạn hóa học) hoặc IC50  4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt

tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT

2.8 Phương pháp HPLC [61]

Máy sắc ký lỏng LC Agilent 1200 Series (USA) Sử dụng hoá chất dùng cho

phân tích HPLC (Merck, Đức) Cột sắc ký Zorbax Eclipse X-C18 (4,6 x150mm,

5μm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent Lượng mẫu bơm 5 l, sử dụng hệ thống

bơm mẫu tự động có điều nhiệt, bơm và rửa kim sau khi nạp mẫu vào cột Detector

DAD hấp thụ cực đại ở bước sóng 273 nm Nhiệt độ cột 35 oC Tốc độ dòng 0,3

ml/phút Hệ dung môi gradient Acetonitrile (kênh A)/H2O (kênh B): chạy gradient

kênh A từ 50 % - 80 %, kênh B từ 50 % - 20 %

HVTH: Nguyễn Đức Duy 29

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 Xử lý mẫu thực vật và điều chế các cặn chiết từ mẫu thực vật

Thân và cành cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) sau khi thu hái về được

rửa sạch và chặt nhỏ, sau đó sấy đến khô ở nhiệt độ 60 oC rồi nghiền thành bột Bột

mẫu khô sau đó được ngâm chiết để điều chế các cặn chiết theo sơ đồ trong Hình

3.1

-Hòa trong nước cất

-Chiết lại bằng n-hexan

-Cất loại dung môi dưới áp suất giảm

-Chiết tiếp bằng etyl axetat -Cất loại dung môi dưới áp suất giảm

-SKC, diaion, MeOH:nước -Cất loại dung môi dưới áp suất giảm

(cặn B, 67 g)

Cặn rắn C (6 g)

Nước lọc

Cặn D (7 g)

Hình 3.1 Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ cây Xuyên tiêu

HVTH: Nguyễn Đức Duy 30

3.2 Phân lập các hợp chất từ cặn chiết

Cặn A (80 g) được được tẩm khô với silica gel (Merck, 0,063-0,2 mm) rồi

được tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (Merck,

0,063-0,2 mm) với hệ dung môi rửa giải n-hexan:etyl acetat (100 % n-hexan, 40:1, 20:1,

15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 100 % Ethyl acetat và 100 % MeOH) thu được 12 phân đoạn

(ký hiệu từ ZN/A/1 đến ZN/A/12)

Phân đoạn ZN/A/3 (1,2 g) được tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ là silica

gel pha thường (Merck, 0,04-0,06 mm) và rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan:etyl

acetat (40:1, v/v) thu được 10 phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ ZN/A/3/1 đến ZN/A/3/10)

Phân đoạn nhỏ ZN/A/3/5 được sắc ký trên cột silica gel pha thường (Merck,

0,04-0,06 mm), rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan:etyl acetat (30:1, v/v), thu được

ZN/A/11 (chất rắn màu trắng, 7 mg)

Phân đoạn ZN/A/4 (2 g) được sắc ký trên cột silica gel pha thường (Merck,

0,04-0,06 mm) và rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan:aceton (20:1, v/v) thu được 9

phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ ZN/A/4/1 đến ZN/A/4/9) Tiếp tục tiến hành sắc ký phân

đoạn ZN/A/4/7 trên cột silica gel pha thường (Merck, 0,04-0,06 mm) và rửa giải bởi

hệ dung môi n-hexan:aceton (15:1, v/v); chất rắn màu trắng thu được sau đó được

kết tinh lại trong hệ dung môi CHCl3:MeOH (1:1, v;v), thu được chất ZN/A/7 (tinh

thể hình hoa màu trắng, 0,05 g)

Phân đoạn ZN/A/12 (0,5 g) được sắc ký trên cột silica gel pha thường với hệ

dung môi CHCl3:MeOH (7:1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ ZN/A/12/1

đến ZN/A/12/5 Phân đoạn ZN/A/12/5 (0,02 g) có dạng bột màu vàng nhạt, sau khi

được tinh chế trên cột silica gel pha đảo YMC C-18 với hệ dung môi rửa giải

MeOH:H2O (3:1, v/v) thu được chất ZN1 (chất rắn màu ngà vàng, 0,005 g) Chất ZN1

này sau đó cũng được tìm thấy và phân lập được lượng chất nhiều hơn từ cặn D

Cặn D (7 g) được sau khi tiến hành rửa giải qua cột Diaion HP-20 với hệ dung

môi MeOH-nước (0, 25, 50, 75, 100 % MeOH), thu được 5 phân đoạn kí hiệu từ

ZN/D/1 đến XT/D/5 Phân đoạn ZN/D/5 được sắc ký trên cột silica gel pha thường

với hệ dung môi CHCl3:MeOH (7:1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ

ZN/D/5-1 đến ZN/D/5-5 Phân đoạn ZN/D/5-3 được sắc ký trên cột silica gel pha

đảo YMC C-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O (3:1, v/v) thu được chất ZN1

(chất rắn màu ngà vàng, 0,1 g)

ZN/A/12/5)

CC, YMC

C-18, MeOH:H 2 O (30:1, v:v)

CC, SiO 2, n-hexan-EtOAc (100% n-hexan,

40:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 100%

EtOAc và 100% MeOH; v:v), thu được 12 phân đoạn (ký hiệu ZN/A/1 - ZN/A/12)

Cặn A (80 g)

Phân đoạn ZN/A/4 (2 g)

Hợp chất 3

(ZN/A/11)

(0,007 g)

Hợp chất 2 (ZN/A/7)

(0,05 g)

Phân đoạn ZN/A/12 (0,5 mg)

Phân đoạn ZN/A/12/5 (0,02 g)

Hợp chất 1 (ZN1)

(0,005 g)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất 1, 2 và 3 từ cặn chiết n-hexan của thân và

cành cây Xuyên tiêu