TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6603:2000 ISO 10095:1992 CÀ PHÊ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAPHÊIN - PHƯƠNG PHÁP DÙNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP Coffee - Determination of caffeine content - Method using high - performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 6603:2000 hồn tồn tương đương với ISO 10095:1992; TCVN 6603:2000 Ban kỹ thuật TCVN/TC/F16 Cà phê sản phẩm cà phê biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ Môi trường ban hành CÀ PHÊ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAPHÊIN - PHƯƠNG PHÁP DÙNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP Coffee - Determination of caffeine content - Method using high - performance liquid chromatography Phạm vi lĩnh vực áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để xác định hàm lượng caphêin cà phê nhân cà phê rang khử caphêin, bột chiết cà phê thường cà phê khử caphêin Chú thích - Phương pháp chuẩn để xác định hàm lượng caphêin phương pháp đo phổ hấp thụ cực tím TCVN 6604:2000 (ISO 4052:1983) Cà phê - Xác định hàm lượng caphein (phương pháp chuẩn) Tiêu chuẩn trích dẫn TCVN 6536:1999 (ISO 1447:1978) Cà phê nhân - Xác định độ ẩm (phương pháp thông thường) TCVN 5567:1991 (ISO 3726:1983) Càphê tan - Xác định khối lượng hao hụt 70 oC áp suất thấp ISO 6673:1983 Càphê nhân - Xác định khối lượng hao hụt 105 oC Nguyên tắc Chiết caphêin từ phần mẫu thử nước 90 oC với có mặt magiê oxit Lọc sau tinh chế phần chất lỏng vi cột silic đioxyt cải biến nhóm phenyl Sắc ký lỏng cao áp để xác định hàm lượng caphêin phát tia tử ngoại Thuốc thử Nếu khơng có qui định khác, dùng thuốc thử thuộc loại phân tích, nước cất nước khử khống nước có độ tinh khiết tương đương 4.1 Metanol, loại dùng cho HPLC 4.2 Dung dịch amoniac (0,3 mol/l) metanol, hỗn hợp tỷ lệ 90 + 10 theo thể tích 4.3 Dung môi rửa giải, dùng cho cột tinh chế, hỗn hợp metanol/ nước/ axit axêtic tỷ lệ 75 + 25 + theo thể tích 4.4 Pha động, hỗn hợp metanol/ nước, tỷ lệ 30 + 70 theo thể tích Cho 600 ml metanol (4.1) vào bình định mức dung tích lít cho nước vào đến vạch Trộn kỹ sau lọc hỗn hợp qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.7) Chú thích - Bằng cách điều chỉnh nồng độ metanol thay đổi thời gian lưu giữ caphêin cho đạt chia tách tối ưu HPLC 4.5 Etanol/ nước, dung dịch tỷ lệ + theo thể tích 4.6 Oxit magie 4.7 Caphêin, dung dịch gốc, tương ứng với 0,5 g caphêin lít Cân, xác tới 0,1 mg, 125 mg caphêin cho vào bình thủy tinh màu hổ phách thể tích 250 ml hỗn hợp etanol/ nước Cho thêm etanol / nước (4.5) đủ đến nửa bình Hịa tan hết caphêin sau thêm đến vạch Dung dịch bảo quản tháng tủ lạnh 4.8 Caphêin, dung dịch chuẩn 4.8.1 Dung dịch chuẩn A, tương ứng với 0,010 g caphêin lít, để dùng cho sản phẩm loại caphêin Để cho dung dịch gốc (4,7) ấm lên đến nhiệt độ phòng Dùng pipet (5.12) lấy ml dung dịch gốc cho vào bình thể tích 100 ml vạch Cho nước đầy đến vạch trộn Pha dung dịch ngày sử dụng 4.8.2 Dung dịch chuẩn B, tương ướng với 0,05 g caphêin lít, để dùng cho sản phẩm thông thường Để cho dung dịch gốc (4,7) ấm lên đến nhiệt độ phòng Dùng pipet (5.12) lấy ml dung dịch gốc cho vào bình định mức dung tích 100 ml Cho nước đầy đến vạch trộn Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị thí nghiệm thơng thường đặc biệt dụng cụ sau: 5.1 Máy sắc ký lỏng cao áp, có trang bị detector cực tím, cho phép đo vùng bước sóng từ 254 nm đến 280 nm, có trang bị máy ghi Bước sóng gần với 280 nm tốt pic hấp thụ cực đại caphêin 272 nm 5.2 Cột sắc ký để chạy HPLC, loại C18, tốt nhồi hạt hình cầu rỗng có đủ 5000 đĩa lý thuyết Số đĩa lý thuyết N cột tính sau theo hình dạng pic thu bơm dung dịch caphêin chuẩn tinh khiết (4.8) t N = 5,54 w , t thời gian lưu giữ pic; w0,5 độ rộng pic đường cao pic 5.3 Cột tinh chế, để chạy sắc ký pha ngược, dung tích ml, nhồi silica cải biên nhóm phenyl, kích thước trung bình hạt 40 µm 5.4 Máy xay cà phê, thích hợp để xay hạt cà phê rang 5.5 Máy nghiền cà phê có bánh vỏ làm mát máy nghiền phân tích có lưỡi cắt vỏ làm mát, loại máy nghiền khác thích hợp để nghiền hạt cà phê nhân 5.6 Bộ rây thí nghiệm, đan lưới kim loại kích thước mắt rây 630 µm 5.7 Bộ lọc, kích thước lỗ 0,45 µm 5.8 Nồi cách thủy, có khả điều chỉnh nhiệt độ 90 oC ± oC khuấy liên tục 5.9 Cân phân tích, cân xác tới 0,000 g 5.10 Chai, dung tích 250 ml có nắp vặn xốy 5.11 Bình định mức vạch, dung tích 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml lít 5.12 Pipet, dung tích 2,0 ml; 5,0 ml 10,0 ml Lấy mẫu Việc lấy mẫu cà phê nhân đóng bao tiến hành theo TCVN 6539:1999 (ISO 4072:1982) Việc lấy mẫu cà phê tan đựng thùng có lớp lót tiến hành theo TCVN 6605:2000 (ISO 6670:1983) Chuẩn bị mẫu thử Nếu cần thiết phải nghiền mẫu dụng cụ thích hợp qui định 5.4 5.5 mẫu lọt qua rây (5.6) Cách tiến hành 8.1 Xác định hàm lượng chất khơ Tính hàm lượng chất khơ từ hàm lượng nước xác định phần mẫu thử (điều 7) theo: - TCVN 6536:1999 (ISO 1447) ISO 6673 cà phê nhân; - ISO 3727 cà phê tan, hoặc; - theo tiêu chuẩn khác áp dụng cho cà phê cho sản phẩm khác chế biến từ cà phê 8.2 Phần mẫu thử 8.2.1 Cà phê nhân rang thông thường loại caphêin Cân lấy g mẫu thử (điều 7) xác tới 0,0001g 8.2.2 Bột cà phê chiết thông thường loại caphêin Cân lấy 0,5 g mẫu thử (điều 7) xác tới 0,0001g 8.3 Chiết chất caphêin 8.3.1 Cho phần mẫu thử (8.2.1) (8.2.2) vào chai dung tích 250 ml (5.10) Thêm g ± 0,5 g oxit magie (4.6) 100 g nước Cân chai chất đựng bên trong, xác tới 0,1 g 8.3.2 Đóng nắp chai trộn kỹ chất chai Đặt chai chứa chất vào nồi cách thủy (5.8) đun nóng đến 90 oC đồng thời khuấy liên tục vòng 20 phút Để nguội chai chất chứa bên cân lại xác đến 0,1 g Khối lượng chai nguội chất đựng bên phải khối lượng xác định 8.3.1 8.3.3 Nếu khối lượng lần cân khác nhau, thực chiết khác (8.3.1 8.3.2) sử dụng phần mẫu thử khác 8.3.4 Để cho dung dịch tĩnh Lọc dung dịch qua lọc (5.7) 8.4 Tinh chế dung dịch Trước lần chiết tách dung dịch, hoạt hóa cột tinh chế (5.3) 8.4.1 Chuẩn bị cột tinh chế Lắp cột tinh chế vẽ hình Hình - Chuẩn bị cột tinh chế Mở van khóa rửa cột ml metanol (4.1), điều chỉnh van khóa metanol chảy giọt Khi cịn lại khoảng mm đến mm metanol phía bề mặt silica đóng van Cho thêm ml nước, mở van mm đến mm nước phía bề mặt silica lại đóng van Khơng cột bị khơ, không, phải tiến hành chuẩn bị lại 8.4.2 Hấp thụ caphêin Dùng pipet để đưa vào cột, hoặc: a) 2,0 ml dung dịch lọc thu 8.3.3 trường hợp cà phê thường cà phê chiết, b) 10,0 ml dung dịch lọc thu 8.3.4 trường hợp cà phê khử caphêin cà phê chiết khử caphêin Điều chỉnh van dung dịch chảy giọt Khi bề mặt dung dịch hạ thấp xuống bề mặt silica đóng van 8.4.3 Khử thành phần khơng cần thiết Mở van khóa cho 2,5 ml hỗn hợp dung dịch amoniac/metanol (4.2) Đóng van bề mặt hỗn hợp hạ thấp sát bề mặt silica Cho thêm tiếp 2,5 ml hỗn hợp (4.2) để hỗn hợp chảy hết khỏi cột Thổi khoảng 20 ml khơng khí qua cột để khử tối đa hỗn hợp (4.2) Chú thích - Ở giai đoạn quy trình cột bị khơ 8.4.4 Rửa giải caphêin Đặt bình định mức dung tích 10 ml vạch (5.11) phía cột Mở van cho 7,5 ml dung môi rửa giải (4.3), điều chỉnh van dung môi chảy giọt Để cho dung môi rửa giải chảy hết vào bình Cho nước vào đến vạch trộn kỹ Chú thích - Cột tinh chế tái sinh metanol qui định 8.4.1 Có thể sử dụng đến 10 lần cho mục đích tinh chế 8.5 Phân tích HPLC 8.5.1 Hiệu chỉnh thiết bị Bật máy sắc ký (5.1) hiệu chỉnh máy sau: - Tốc độ dòng chảy pha động (4.4): từ 0,5 ml/ phút đến 1,5 ml/ phút tùy theo loại cột dùng (xem 5.2) - Nhiệt độ cột (5.2): 40 oC Chú thích - Có thể tăng pic tách cách tăng nhiệt độ cột khơng q 60 oC 8.5.2 Phân tích Khi tốc độ dòng chảy pha động (4.4) nhiệt độ ổn định, bơm vào cột 10 µl dung dịch mẫu thử thu 8.4.4 sau bơm thể tích dung dịch caphêin chuẩn (4.8.1 4.8.2) Chú thích - Trong qui trình bình thường, định luật Beer tuân thủ với nồng độ chất caphêin tới 0,0250g/ l Mức có cao so với nồng độ caphêin áp dụng phương pháp thử Tuy nhiên, điều sai lệch thiết bị, phải xây dựng đường hiệu chuẩn nồng độ caphêin Tính biểu thị kết Hàm lượng caphêin mẫu biểu thị gam 100 g chất khô sau: 9.1 Đối với cà phê nhân sống rang bột cà phê tan: Ax 10 × 100 100 × c1 × × × 100 Ac × m0 × 1000 RS Ax diện tích pic caphêin thu với dung dịch mẫu thử; Ac diện tích pic caphêin thu với dung dịch chuẩn; c1 nồng độ dung dịch caphêin chuẩn (8.4.2), tính gam lit; m0 khối lượng phần mẫu thử, tính gam; RS hàm lượng chất khơ mẫu, tính phần trăm theo khối lượng (xem 8.1) 9.2 Đối với cà phê nhân sống rang bột cà phê khử caphêin: Ax 10 × 100 100 × c2 × × × 100 Ac 10 × m0 × 1000 RS c2 nồng độ dung dịch caphêin chuẩn (8.4.1), tính gam lít; 10 Độ xác 10.1 Các kết thử liên phịng thí nghiệm Một thử nghiệm liên phịng thí nghiệm tiến hành năm 1987 ISO/TC 34/SC 15 cà phê, gồm 18 phịng thí nghiệm tham gia Các giá trị độ tái lập độ lặp lại thu bảng Phương án lấy mẫu quy trình thử tuân thủ phương án liên thí nghiệm phù hợp với phân công ISO 5725 Bảng - Độ lặp lại độ tái lập Mẫu Hạt cà phê nhân rang Hạt cà phê nhân rang loại bỏ chất caphêin Cà phê tan Cà phê tan loại bỏ caphêin Hàm lượng caphêin g/ 100g cà phê Độ lặp lại g caphêin/ 100 g cà phê Độ tái lập g caphêin/ 100 g cà phê ≈2 0,07 0,34 ≈1 0,04 0,12 < 0,1 0,01 0,02 ≈4 0,09 0,36 < 0,3 0,02 0,03 10.2 Độ lặp lại Sự khác tuyệt đối hai kết thử độc lập, riêng rẽ thu áp dụng phương pháp, mẫu thử, phịng thí nhgiệm, kỹ thuật viên thực hiện, dùng loại dụng cụ khoảng ngắn thời gian phải không vượt giá trị nêu bảng 10.3 Độ tái lập Sự khác tuyệt đối hai kết thử riêng rẽ thu áp dụng phương pháp, mẫu thử, thực phịng thí nghiệm khác nhau, kỹ thuật viên khác dùng dụng cụ khác thực phải không vượt giá trị nêu bảng 11 Báo cáo kết Báo cáo kết phải phương pháp sử dụng kết thu Cũng phải đề cập đến tất chi tiết thao tác không qui định tiêu chuẩn này, tùy ý lựa chọn, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết Báo cáo kết bao gồm tất thông tin cần thiết việc nhận biết hoàn toàn mẫu thử PHỤ LỤC A (Tài liệu tham khảo) THƯ MỤC TCVN 6539:1999 (ISO 4072:1982), Cà phê nhân đóng bao - Lấy mẫu ISO 5725:1986, Độ xác phương pháp thử - Xác định độ lặp lại độ tái lập cho phương pháp thử chuẩn liên phòng thí nghiệm 3 TCVN 6605:2000 (ISO 6670:1983), Cà phê tan đựng thùng có lót - Lấy mẫu ... Việc lấy mẫu cà phê nhân đóng bao tiến hành theo TCVN 6539:1999 (ISO 4072:1982) Việc lấy mẫu cà phê tan đựng thùng có lớp lót tiến hành theo TCVN 6605:2000 (ISO 6670:1983) Chuẩn bị mẫu thử Nếu... MỤC TCVN 6539:1999 (ISO 4072:1982), Cà phê nhân đóng bao - Lấy mẫu ISO 5725:1986, Độ xác phương pháp thử - Xác định độ lặp lại độ tái lập cho phương pháp thử chuẩn liên phịng thí nghiệm 3 TCVN. .. lượng chất khơ Tính hàm lượng chất khơ từ hàm lượng nước xác định phần mẫu thử (điều 7) theo: - TCVN 6536:1999 (ISO 1447) ISO 6673 cà phê nhân; - ISO 3727 cà phê tan, hoặc; - theo tiêu chuẩn khác