CNE_CT2_N04_ Comparative study of antitumor effects of bromelain and papain in human cholangiocarcinoma cell lines

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG  Bài tiểu luận mơn: CƠNG NGHỆ ENZYME Bài báo: Comparative study of antitumor effects of bromelain and papain in human cholangiocarcinoma cell lines GVHD: Th.s Đào Thị Mỹ Linh Nhóm: 04 Tp.HCM, tháng 04 năm 2016 Cơng Nghệ Enzyme Nhóm: 04 Mục lục DANH SÁCH NHĨM KẾ HOẠCH LÀM VIỆC Tổng quan Giới thiệu 3 Vật liệu phương pháp 4 Kết .7 Kết luận 12 Tài liệu tham khảo .16 Cơng Nghệ Enzyme Nhóm: 04 DANH SÁCH NHÓM STT HỌ TÊN MSSV LỚP Hồ Thị Thu Sinh 2008130155 04DHSH2 Phạm Thị Thùy Trang 2008130127 04DHSH2 Nguyễn Thị Thanh Tuyên 2008130117 04DHSH2 KẾ HOẠCH LÀM VIỆC Thời gian 7-13/03/2016 Cơng việc Tìm báo nộp Ghi Đã hồn thành Phân cơng phần dịch  Tổng quan, vật liệu 14-27/03/2016 phương pháp: Tuyên Đã hoàn thành  Kết quả: Sinh  Giới thiệu, Kết luận: Trang 28/03-03/04/2016 Tổng hợp chỉnh sửa Đã hồn thành Cơng Nghệ Enzyme Nhóm: 04 Nghiên cứu so sánh tác dụng chống khối u bromelain papain dòng tế bào ung thư đường mật người  Tác giả: Alena Müller, Samarpita Barat, XI Chen, Khac Cuong Bui, Przemyslaw Bozko, Nisar P Malek And Ruben R Plentz (Department of Internal Medicine I, Medical university Hospital, D-72076 Tübingen, Germany)  Xuất bản: 03/2016, INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY Tổng quan Ung thư đường mật (CC) toàn giới khối u đường mật ác tính phổ biến với triệu chứng khó nhận thấy cần phương pháp điều trị mới.Các hợp chất chiết xuất từ thực vật bromelain papain, thuộc loại cysteine protease từ dứa đu đủ, biết có khả chống ưng thư Vì vậy, nghiên cứu lần nghiên cứu tác dụng chống ung thư bromelain papain dòng tế bào CC gan Ảnh hưởng bromelain papain đến tăng trưởng tế bào CC, khả di căn, xâm lăng tính mềm dẻo biểu mơ phân tích tăng sinh tế bào, khả làm lành vết thương, di thí nghiệm apoptosis western blot Bromelain papain làm giảm phát triển, xâm nhập di cư tế bào CC Cả hai tín hiệu ức chế NFκB/AMPK protein truyền tín hiệu p-AKT, p-ERK, p-STAT3 Ngoài ra, MMP tượng chuyển dạng trung mô – biểu mô khác phần tìm thấy tế bào Apoptosis cảm ứng sau điều trị bromelain papain Điều thú vị là, bromelain cho thấy ức chế hiệu tổng thể CC so với papain siRNA qua trung gian NFκB tế bào CC cho thấy bromelain papain có tác dụng gây độc tế bào dòng tế bào CC bromelain phần papain làm giảm tốc độ tăng trưởng khối u tín hiệu NFκB/AMPK Đặc biệt bromelain phát triển mở hiểu biết cho việc điều trị tế bào ưng thư dòng CC Giới thiệu Ung thư đường mật (CC) khối u gan phát sinh từ tế bào biểu mơ ngồi gan hệ thống đường mật Tỷ lệ mắc tử vong CC gia tăng toàn giới đại diện thứ hai hầu hết ung thư phổ biến gan mật Phẫu thuật liệu pháp chữa bệnh, CC thường chẩn đoán giai đoạn hình thành khối u cao Hiện nay, kết hợp gemcitabine cisplatin tiêu chuẩn hóa trị cho bệnh nhân trải qua giai đoạn điều trị Phương pháp điều trị kháng u cần thiết để cải thiện sống người điều trị ung thư Cơng Nghệ Enzyme Nhóm: 04 Bromelain tách chiết từ dứa (Ananas comosus) chứa hỗn hợp bao gồm protease non- protease Bromelain bán cửa hàng thực phẩm sức khỏe chất bổ sung dinh dưỡng để tăng cường tiêu hóa, chữa lành vết thương tác nhân chống viêm Bromelain thử nghiệm nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng khác chứng minh chất chiết từ thực vật có chống ung thư hoạt động chống viêm Tuy nhiên, chế phân tử xác chưa hiểu đầy đủ Papain protease sulfhydryl từ nhựa đu đủ (Carica papaya) với hoạt động tiêu hóa vượt trội so với Pancreatin, men tụy Papain có nồng độ cao hoa quả, thân, lá, vỏ hạt Các hợp chất có tác động lên loài sâu bọ ăn thực vật, hỗ trợ làm lành vết thương nước ép đu đủ chín cho thấy tác dụng chống oxy hóa Papain thành phần biết thành phần loại thuốc thảo dược khác nhau, có thơng tin phân tử mục tiêu hiệu chống ung thư Nghiên cứu mang tính đột phá cho hai hợp chất liệu pháp chống ung thư cho CC Sử dụng mơ hình nhân giống dịng tế bào CC, chúng tơi điều tra lần hoạt động kháng u hai loại enzyme bromelain papain tế bào CC Vật liệu phương pháp Nuôi cấy tế bào Dòng tế bào CC người (TFK-1, SZ-1) cung cấp Nisar Malek Dịng tế bào ni cấy môi trường RPMI-1640 + Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Đức) bổ sung 10% FCS (BIOCHROM, Berlin, Đức) Penicillin/streptomycin (Invitrogen) 100 U/ml 37C 5% CO2 Hóa chất chuẩn bị thí nghiệm invitro Bromelain (Sigma-Aldrich, Đức 25 mg, 100 mM) Dung dịch chuẩn bị cách hòa tan chúng dimethyl sulfoxide, DMSO (Applichem, Darmstadt, Đức) Dung dịch papain (Sigma-Aldrich, 100 mM) chuẩn bị cách hòa tan chúng nước cất Các tế bào xử lý DMSO hay bromelain (150 200 µM) papain (25, 40 100 µM) nồng độ khác (100 mM) phân tích sau 24, 48 96 Thí nghiệm tăng sinh Để đo lường hiệu bromelain papain đến tăng sinh tế bào, tế bào cấy nồng độ 2.000 tế bào/ml 96 đĩa để qua đêm Các tế bào xử lý DMSO, bromelain (150 200 µM) papain (25, 40 100 µM) cho thời điểm khác (1 - ngày) Tại thời điểm tương ứng, 10 µl thuốc thử WST-1 (Roche Diagnostics, Mannheim, Đức) thêm vào mẫu ủ 37C Độ hấp thụ đo bước sóng 492 nm với bước sóng tham khảo 650 nm Thí nghiệm xâm nhập tế bào Các tế bào (2.5x105 tế bào/2 ml) cấy mơi trường có huyết vào mẫu mẫu BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chamber (BD Biosciences, Bedford, Anh) Các tế bào xử lý đồng thời Cơng Nghệ Enzyme Nhóm: 04 với bromelain (150 200 µM) papain (25, 40 100 µM) DMSO Các chèn đặt vào Companion BD Falcon TC có chứa 10% FCS ủ 48 lồng ấp nuôi cấy mơ ẩm, 37C, 5% khí CO2 Sau đó, tế bào xâm nhập cố định với 100% methanol nhuộm với 1% toluidine màu xanh 1% borax Các tế bào sau đếm kính hiển vi (leica DM 5000 B, leica, wetzlar, Đức) Việc tính tốn tế bào xâm nhập thực theo công thức BD: số Invasion = % 𝑇ế 𝑏à𝑜 𝐼𝑛𝑣𝑎𝑠𝑖𝑜𝑛 𝑡ℎử 𝑛𝑔ℎ𝑖ệ𝑚 % 𝑇ế 𝑏à𝑜 𝐼𝑛𝑣𝑎𝑠𝑖𝑜𝑛 𝑘𝑖ể𝑚 𝑠𝑜á𝑡 Thí nghiệm Migration Các tế bào cấy đĩa để đạt 80% confluency Ban đầu, tế bào bị chết 24 h môi trường có chứa 2% FCS Sau SZ-1 TFK-1 tiếp tục ủ 48 h môi trường thiếu DMSO, nồng độ khác bromelain (150 200 µM) papain (25, 40 100 µM) Sau đầu tinh cho lần xử lý sau Sau đó, tế bào rửa PBS chụp ảnh kính hiển vi leica DMI 6000 B (leica, wetzlar, Đức) Các tế bào ủ thêm 24 h sau hình ảnh chụp khu vực bị thương Các tế bào Migration tính theo cơng thức sau: số Migration = 𝑐ℎ𝑖ề𝑢 𝑟ộ𝑛𝑔 𝑣ế𝑡 𝑡ℎươ𝑛𝑔 0ℎ − 𝑐ℎ𝑖ề𝑢 𝑟ộ𝑛𝑔 𝑣ế𝑡 𝑡ℎươ𝑛𝑔 𝑙ú𝑐 24ℎ ∗ 100 𝑐ℎ𝑖ề𝑢 𝑟ộ𝑛𝑔 𝑐ủ𝑎 𝑣ế𝑡 𝑡ℎươ𝑛𝑔 𝑡ạ𝑖 𝑡ℎờ𝑖 đ𝑖ể𝑚 ℎ Tách chiết protein lai western blot SZ-1 TFK-1 tế bào nuôi cấy với bromelain xử lý papain cho bước lai miễn dịch thu nhận rửa với dung dịch đệm phosphate lạnh (PBS) Sau đó, tế bào thu nhận ly giải đệm lysis chứa 20 mM Tris, 150 mM NaCl, mM EDTA, mM EGTA, 1% Triton X-100 protease chất ức chế phosphatase (Protease Inhibitor Tablets Cocktail, Roche, Mannheim, Đức) Nồng độ protein chiết xuất xác định cách sử dụng kit protein DC (Bio-Rad, München, Đức) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sự hấp thụ đo 650-750 nm sử dụng đầu đọc microplate (Titertek-Berthold, Pforzheim, Đức) Đối với phương pháp lai miễn dịch tế bào lysates bổ sung thêm protein nồng độ 30 mg giếng Gel điện di (12% gel acrylamide) thực (Bio-Rad, München, Đức) Các màng bị chặn sử dụng 5% sữa khô (Applichem) 30 phút nhiệt độ phịng, sau họ dị với kháng thể chống lại E-cadherin (1:1,000, Cell Signaling Technology, 24E10), N-cadherin (2:10,000; Millipore, EPR1792Y), actin (2:10,000; Sigma, AC74), Akt (1:1,000; Cell Signaling Technology, 4691), p-akt (Ser473) (1:1,000; Cell Signaling Technology, 9271s), STAT3 (1:1,000; Cell Signaling Technology, 9132), pStat3 (Tyr705) (1:1,000; Cell Signaling Technology, 9131s), Rac-1 (1:000; Cytoskeleton, Inc., ARC03-A), PARP (1:1,000; Cell Signaling Technology, 9542), p44/p42 MAPK (Erk1/2) (1:1,000; Cell Signaling Technology, 4685s), phosphop44/p42 MaPK (erk1/2) (1:1,000; Cell Signaling Technology, 9101), AMPKα (D5A2) Cơng Nghệ Enzyme Nhóm: 04 (1:500, Cell Signaling Technology, 5831S), phospho-aMPKα (1:500, Cell Signaling Technology, 2535S), NFκB p65 (1:1,000; abcam, ab16502) RNA (siRNA) NFκB Các tế bào SZ-1 TFK-1 cấy nồng độ 1x10 tế bào/ml giếng Sau 24 h, tế bào phiên mã với kiểm soát siRNA-A (Santa Cruz Công nghệ sinh học, CA, USA) 5, 10 20 nM NFκB siRNA (Santa Cruz Công nghệ sinh học, sc-29.410) sử dụng thuốc thử hiperfect transfection (Qiagen, Đức) 48 h Thí nghiệm nghiên cứu thực với nồng độ khác oligonucleotide siRNA thời điểm khác Hiệu nhuộm thuốc thử đánh giá dựa kỹ thuật phân tích western blot NFκB Apoptosis Để xác định trình apoptosis, tế bào SZ-1 TFK-1 cấy (1x104/ml) giếng xử lý tiếp điều kiện mơ tả thí nghiệm WST-1 Sau xử lý xong, tế bào huyền phù thu nhận tế bào bám dính xử lý trypsin, rửa hai lần với PBS lạnh Các tế bào lơ lửng 1ml kết tụ lại dung dịch đệm 1X nhuộm màu với Annexin V-FITC PI theo hướng dẫn nhà sản xuất sử dụng Annexin V Apoptosis Detection Kit II (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) Các tín hiệu phát sử dụng dịng lSRFortessa cytometer (Becton-Dickinson, Mỹ) phân tích phần mềm FlowJo Version 8.7 (Tree Inc., Ashland, OR, USA) Phân tích thống kê Tất thí nghiệm lặp lại lần Các kết phân tích phần mềm GraphPad prism phiên 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) SPSS phiên 11.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) Các kiểm tra bao gồm phân tích phương sai ANOVA t-test sinh viên kết hợp với kiểm tra Bonferroni kiểm tra t-test riêng Sự khác biệt coi có ý nghĩa thống kê P-giá trị