Chế tạo microcantilever và ứng dụng trong phát hiện DNA chỉ thị ung thư gan

NGUYỄN DUY KHANH CHẾ TẠO MICROCANTILEVER VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN DNA CHỈ THỊ UNG THƯ GAN LUẬN VĂN THẠC SĨ Thành phố Hồ Chí Minh - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO NGUYỄN DUY KHANH CHẾ TẠO MICROCANTILEVER VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN DNA CHỈ THỊ UNG THƯ GAN Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô (Chuyên ngành đào tạo thí điểm) LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TỐNG DUY HIỂN Thành phố Hồ Chí Minh - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả có được trong luận văn này hoàn toàn là do tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện, không sao chép từ bất cứ tài liệu nào khác. Tất cả các tài liệu tham khảo, công trình khoa học, sách, bài báo quốc tế… đều được trính dẫn cụ thể, rõ ràng. Tác giả xin chịu mọi trách nhiệm về luận văn tốt nghiệp này. Nguyễn Duy Khanh ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Tống Duy Hiển đã tận tình hướng dẫn và truyền cảm hứng nghiên cứu khoa học cho tôi. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp của tôi trong nhóm Bionanosensors rói riêng và ở PTN Công nghệ nano nói chung. Tôi đã học hỏi được rất nhiều thứ từ đồng nghiệp, không chỉ đơn thuần là kiến thức, nghiên cứu thuần túy mà là cả thái độ, sự cần cù chăm chỉ và sáng tạo trong nghiên cứu khoa học. Xin cảm ơn anh Toán và các đồng nghiệp tại Viện ITIMS (ĐHBKHN) đã giúp đỡ tôi trong việc so mask và tạo mặt nạ mặt sau của wafer. Nếu không có sự giúp đỡ này thì nhóm nghiên cứu chúng tôi không thể chế tạo thành công microcantilever tại Việt Nam trong điều kiện hiện nay. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô đã dạy tôi trong khóa học cao học này. Các thầy cô đến từ nhiều nơi khác nhau, từ trong Nam ra ngoài Bắc và đa số các thầy cô đều là những giảng viên cao cấp trong các trường đại học/viện nghiên cứu hàng đầu ở Việt Nam. Được tiếp xúc, học hỏi từ nhiều thầy cô đến từ nhiều nơi trên đất nước không chỉ giúp tôi có được kiến thức mà còn cho tôi có được cái nhìn rộng mở, đa dạng hơn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, đặc biệt là Bố của tôi. Bố đã truyền cho tôi tinh thần, nghị lực và sức chiến đấu của một người lính cụ Hồ. Con đường tôi đi, dấu chân tôi bước luôn có gia đình, bè bạn, người thân theo dõi, sát cánh và chia sẻ cùng tôi. Một lần nữa, xin cảm ơn tất cả mọi người! Nguyễn Duy Khanh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU x MỞ ĐẦU xi CHƯƠNG I 1 TỔNG QUAN 1 1.1. Microcantilever 1 1.1.1. Tổng quan về microcantilever 1 1.1.2. Nguyên lý hoạt động của microcantilever 2 1.1.2.1. Mô hình độ uốn tĩnh 2 1.1.2.2. Mô hình động 3 1.1.3. Yếu tố chất lượng (Quality Factor – QF) 7 1.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 9 1.1.5. Giới hạn phát hiện và tín hiện trên nhiễu 9 1.1.5.1. Giới hạn phát hiện 9 1.1.5.2. Tín hiện trên nhiễu 10 1.1.6. Chế tạo microcantilever 11 1.1.7. Ứng dụng của microcantilever 12 1.2. DNA chỉ thị ung thư gan 14 1.2.1. Tổng quan về DNA 14 1.2.2. Trình tự DNA và quá trình nhân đôi 16 1.2.3. Đặc tính hóa lý của DNA 16 1.2.4. Ung thư gan 17 1.2.4.1. Ung thư là gì? 17 1.2.4.2. Ung thư gan là gì ? 18 1.2.4.3. Những yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư gan 19 CHƯƠNG II 21 iv QUY TRÌNH VÀ THIẾT BỊ CHẾ TẠO MICROCANTILEVER 21 2.1. Quy trình chế tạo Microcantilever 21 2.1.1. Sơ đồ khối của quy trình chế tạo 21 2.1.2. Wafer cho chế tạo Microcantilever 22 2.1.3. Ăn mòn lớp SiN mặt trước để tạo hình thanh dao động 24 2.1.4. Ăn mòn lớp SiN mặt sau 25 2.1.5. Ăn mòn lớp SiO 2 mặt sau 27 2.1.6. Ăn mòn lớp Si 380 µm 28 2.1.7. Ăn mòn lớp SiO 2 hi sinh để thu được cantilever 29 2.2. Các thiết bị chính cho việc chế tạo và đo đạc 30 2.2.1. Máy quang khắc Suss MJB4 30 2.2.2. Hệ ăn mòn DRIE (Deep Reactive Ions Etching) SAMCO RIE – 200iP 32 2.2.3. Máy đo chiều dày cơ Dektak 150 38 2.2.4. Hệ đo tần số và độ lệch SCALA 38 CHƯƠNG III 41 QUY TRÌNH BIẾN ĐỔI BỀ MẶT ĐỂ GẮN KẾT DNA CHỈ THỊ UNG THƯ GAN 41 3.1. Tạo đơn lớp phân tử Cysteamine lên thanh dao động phủ vàng 41 3.2. Gắn phân tử GAD lên phân tử Cysteamine 42 3.3. Cố định đơn chuỗi DNA (DNA receptor) lên phân tử Cysteamine 43 3.4. Lai hóa DNA đích (DNA target) vào đơn chuỗi DNA 43 CHƯƠNG IV 46 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 4.1. Kết quả chế tạo thanh dao động SiN 46 4.1.1. Hình ảnh của chip cantilever đã chế tạo 46 4.1.2. Tần số và chỉ số chất lương (quality factor-QF) của thanh dao động đã chế tạo 51 4.2. Kết quả thực nghiệm sử dụng microcantilevers phát hiện DNA 55 4.2.1. Tần số và QF của chip cantilever 55 v 4.2.2. Độ dịch chuyển tần số trước và sau khi gắn kết Cysteamine lên thanh dao động 57 4.2.3. Độ lệch của thanh dao động trước và sau khi gắn kết Cysteamine và ứng suất của đơn lớp Cysteamine 58 4.2.4. Thời gian lai hóa DNA 60 4.2.5. Mối quan hệ giữa nồng độ DNA target và sự thay đổi tần số của thanh dao động 61 CHƯƠNG V 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU 64 5.1. Kết luận 64 5.2. Định hướng nghiên cứu 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT CVD Chemical Vapour Deposition DNA Deoxyribonucleic acid DRIE Deep reactive ion etching FWHM Full width half maximum GAD Glutaraldehyde HF Hydrogen Fluoride LPCVD Low Pressure Chemical Vapour Deposition MEMS Microelectromechanical systems NEMS Nanoelectromechanical systems PSD Position Senstive Detector PVD Physical Vapour Deposition QF Quality Factor RF Radio frequency RIE Reactive ion etching SOI Silicon on insulator vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. a) Cantilever đơn tinh thể silic với chiều dày 340 nm b) Cantilever đơn tinh thể silic với chiều dày 57 nm Hình 1.2. a) Cantilever chịu tải trọng ở cuối thanh b) Cantilever bị tải trọng đều toàn thanh Hình 1.3. Ví dụ về độ lệch của thanh với hai ứng suất khác nhau Hình 1.4. Tần số cộng hưởng của nanocantilevers: Tần số cộng hưởng giảm dần theo sự tăng khối lượng của các chất hay virut gắn kết trên thanh. Bản quyền của American Institute of Physics (2004). Hình 1.5. Ví dụ về một phổ tần số cộng hưởng và cách xác định yếu tố chất lượng Q. Hình 1.6. Mối quan hệ giữa: a, khối lượng của thanh dao động với Q b, độ dày của thanh dao động với Q. Hình 1.7. Minh họa thử nghiệm lai hóa. Bản quyền của American Association for the Advancement of Science. Hình 1.8. Cấu trúc của DNA và các thành phần cấu tạo nên nó. Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình chế tạo microSiN Cantilever. Hình 2.2. Wafer Si với các lớp màng mỏng chuẩn bị cho việc chế tạo tiếp theo. Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn thời gian đưa khí vào buồng cho việc ăn mòn. Hình 2.4. Minh họa mặt cắt wafer sau khi ăn mòn lớp SiN mặt trên để tạo hình thanh dao động. Hình 2.5. Mô hình quang khắc sử dụng mask 2 để ăn mòn mặt dưới Hình 2.6. Cấu trúc chip cantilever sau khi đã tạo mask bảo vệ mặt dưới lớp gồm Al và PR. Hình 2.7. Cấu trúc chip cantilever sau khi đã ăn mòn lớp SiN ở mặt dưới. Hình 2.8. Cấu trúc chip cantilever sau khi đã ăn mòn lớp SiO 2 . Hình 2.9. Cấu trúc của chip cantilever sau khi ăn mòn hết lớp Si từ mặt sau của đế. Hình 2.10. Cấu trúc của chip chứa cantilever sau khi đã ăn mòn hết lớp hi sinh SiO 2 viii Hình 2.11. Thiết bị quang khắc Suss MJB4 tại LNT. Hình 2.12. Ba kiểu tiếp xúc cơ bản trong hệ quang khắc. Hình 2.13. Mô hình thể hiện quá trình thụ động hóa bằng C 4 F 8 và khắc bằng SF 6 trong hệ DRIE Hình 2.14. Hệ khắc khô DRIE SAMCO 200iP tại LNT. Hình 2.15. Giao diện máy tính với màn hình cảm ứng, jog dial, set switch, nút tắt khẩn cấp và công tắc nguồn chính. Hình 2.16. Màn hình chính chỉ ra toàn bộ sơ đồ khối và tình trạng của hệ ở thời điểm hiện tại. Hình 2.17. Màn hình Mode, có 3 mục chính là: login Menu, Auto Sequence và Operation. Thông thường thì mode hoạt động là “Auto”. Hình 2.18. Màn hình hiển thị thay đổi, nơi người dùng có thể thay đổi công thức, các bước chạy. Hình 2.19. Thiết bị Dektak 150 tại LNT. Hình 2.20. Mô hình hệ scala đo tần số và độ lệch của microcantilever. Hình 2.21. Hệ SCALA tại LNT. Hình 3.1. Cantilever khi đã gắn đơn lớp phân tử Cysteamine. Hình 3.2. Cantilever khi đã gắn GAD lên. Hình 3.3. Cantilever khi đã cố định DNA receptor. Hình 3.4. Cantilever khi đã lai hóa DNA target. Hình 3.5. Sơ đồ mô tả quy trình biến đổi bề mặt Au và lai hóa DNA. Hình 4.1. Ảnh chụp wafer sau khi đã ăn mòn lớp SiN mặt trên, hình ảnh của các thanh dao động đã hiện lên. Hình 4.2. Ảnh chụp toàn bộ wafer sau khi đã đã ăn mòn lớp SiN mặt trên. Hinh 4.3. Ảnh mặt sau wafer sau khi đã ăn mòn lớp SiN. Hình 4.4. Ảnh chụp toàn bộ mặt dưới wafer sau khi đã ăn mòn hết lớp SiN. Hình 4.5. Ảnh chụp chip SiN Cantilever 100 nm với 9 cantilever a) chụp từ mặt dưới chip và b) chụp từ mặt trên chip Hình 4.6. Chụp trên nguyên wafer, chip chưa được tách ra, SiN Cantilever dày 1 µm, rộng 100 µm dài 500 µm, khoảng cách giữa cách thanh 1 µm. [...]... trọng trong quá trình tiêu hóa Gan được xem là nhà máy hóa chất của cơ thể vì nó đảm trách cũng như điều hòa rất nhiều các phản ứng sinh hóa mà các phản ứng này chỉ xảy ra ở một số tổ chức đặc biệt của cơ thể Ung thư gan Ung thư gan là loại ung thư xuất phát từ gan Ung thư gan nguyên phát thư ng được chuẩn đoán chiếm hàng thứ 5 trên toàn cầu và nguyên nhân ứng hàng thứ 2 gây ra cái chết của bệnh ung thư. .. microcantilever cho việc phát hiện các biomarker chỉ thị ung thư gan 1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Microcantilever 1.1.1 Tổng quan về microcantilever Microcantilever là một trong những thiết bị cảm biến cơ học đang được tập trung nghiên cứu gần đây Loại cảm biến này được ứng dụng để phát hiện các chất sinh học và hóa học Độ nhạy của microcantilever phụ thuộc vào kích thư c và vật liệu chế tạo Tần số và yếu tố chất... hạn, ung thư vú lan tới gan thì vẫn gọi là ung thư vú như nơi nó hình thành ban đầu chứ không phải là ung thư gan Tương tự như vậy, ung thư tiền liệt tuyến lan tới xương là ung thư tiền liệt tuyến di căn chứ không phải là ung thư xương Các loại ung thư khác nhau có thể phải điều trị khác nhau Chẳng hạn, ung thư phổi và ung thư vú là những bệnh rất khác nhau Chúng phát triển với tốc độ khác nhau và phản... 1,65 ag Trong nghiên cứu này, tác giả và nhóm nghiên cứu sẽ trình bày kết quả chế tạo microcantilever lần đầu tiên tại Việt Nam Sau chế tạo thành công, microcantilever sử dụng 2 chất là Cysteamine và Glutaraldehyde (GAD) để cố định đơn chuỗi DNA và lai hóa DNA bổ sung với nó Cặp DNA này có tên P53 chỉ thị tín hiệu ung thư gan Nghiên cứu thành công công đề tài này cũng là cơ sở để ứng dụng microcantilever. .. điều trị Trong khi ung thư có thể ảnh hưởng tới mọi người ở tất cả độ tuổi, và một vài loại ung thư thường gặp ở trẻ em thì các nguy cơ phát triển bệnh ung thư nhìn chung tăng theo độ tuổi Vào năm 2007, ung thư gây ra khoảng 13% cái chết trên toàn thế giới (7.9 triệu người) Tỉ lệ này tăng cao ở những người già và những thay đổi về hoàn cảnh sống ở các nước đang phát triển [31] 1.2.4.2 Ung thư gan là... các tế bào chết đi hoặc chữa lành những vết thư ng Ung thư bắt đầu khi các tế bào trong một phần nào đó của cơ thể bắt đầu phát triển ngoài tầm kiểm soát Có rất nhiều loại ung thư nhưng tất cả đều xuất phát do sử phát triển mất kiểm soát của các tế bào bất thư ng Sự phát triển của tế bào ung thư là khác thư ng so với những tế bào bình thư ng Thay vì chết đi, các tế bào ung thư vẫn phát triển và sinh ra... ra tế bào bất thư ng mới Các tế bào ung thư cũng vẫn có thể xâm lấn vào các mô khác mà đôi khi các tế bào bình thư ng không thể làm được Sự phát triển ngoài tầm kiểm soát và xâm lấn vào các mô khác là nguyên nhân gây ra tế bào ung thư Các tế bào trở thành tế bào ung thư do sự hư hại đối với DNA DNA nằm trong mỗi tế bào và chỉ đạo toàn bộ hoạt động của nó Trong một tế bào bình thư ng, khi DNA bị hư hỏng,... tính [30] Ung thư có thể phát hiện bằng nhiều cách bao gồm sự có mặt của các dấu hiệu và triệu chứng, xét nghiệm sàng lọc hay chuẩn đoán hình ảnh Sử dụng kính hiển vi để quan sát một mẫu mô có thể phát hiện và chuẩn đoán được ung thư Ung thư thường được điều trị bằng hóa trị liệu, xạ trị và phẫu thuật Cơ hội sống sót của bệnh nhân ung thư phụ thuộc lớn vào loại, vị trí của ung thư và sự lan rộng của bệnh... thư Ung thư gan là những khối u ác tính phát triển trên bề mặt hoặc bên trong gan Chúng được hình thành từ bản thân của gan hay từ cấu trúc bên trong gan gồm mạch máu hay ống mật Các khối u gan được phát hiện trên thiết bị chuẩn đoán hình ảnh hay biểu hiện theo triệu chứng như một khối bụng, đau bụng, vàng da, buồn nôn hoặc rối loạn chức năng gan Nguyên nhân dẫn đến ung thư gan là nhiễm virut viêm gan. .. cantilever của nhóm chế tạo có thể phát hiện được khối lượng xuống tới 10-19 g/𝜇m2 Microcantilever có lớp áp điện có thể phát hiện được độ nhạy nồng độ xuống tới 10 pg/ml Bằng việc sử dụng polysilicon nanocantilever hoạt động trong chân không, B.Ilic và Y.Yang có thể phát hiện được khối lượng 1,5 fg các đơn virut Đặc biệt, sử dụng SiN Cantilever để phát hiện DNA, nhóm của B.Ilic và Y.Yang phát hiện được khối