Báo cáo thực hành quá trình thiết bị & công nghệ bài thực hành thu nhận protein tổng số và tinh sạch bằng sắc ký cột

Mục tiêu: Tinh sạch enzyme catalase có trong dịch chiết của gan lợn bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion.. - Xác định hàm lượng protein tổng số trong dịch chiết và hoạt tính enzyme cat

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

BÁO CÁO THỰC HÀNH QUÁ TRÌNH THIẾT BỊ & CÔNG NGHỆ

Bài thực hành:

THU NHẬN PROTEIN TỔNG SỐ VÀ

TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ CỘT

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Hồng Loan

TS Ngô Thị Trang

Ca thực hành : Ngày 05/11/2024

Nhóm thực hành : Nhóm 1 (Thu nhận protein tổng số từ gan bò) Thành viên nhóm : Lê Hoàng Đạt-21001883

Phạm Thị Nhung-23000819 Ngô Quỳnh Anh-23000705

Hà Nội, 2022

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, chúng em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến các thầy cô dạy môn Quá trình thiết bị và công nghệ đã cho phép và tạo điều kiện để chúng em thực hiện bài thực hành này Đồng thời, chúng em chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hồng Loan

và cô Ngô Thị Trang, người trực tiếp hướng dẫn và hỗ trợ chúng em trong quá trình thực hiện bài thực hành

Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến phòng thí nghiệm – trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã cung cấp nguyên, vật liệu và địa điểm tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ chúng em trong thời gian hoàn thành bài thí nghiệm này

NỘI DUNG BÁO CÁO

I Mục tiêu:

Tinh sạch enzyme catalase có trong dịch chiết của gan lợn bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion

- Xác định hàm lượng protein tổng số trong dịch chiết và hoạt tính enzyme catalase bằng quang phổ kế

- Kiểm tra độ tinh sạch của enzyme catalase bằng điện di trên gel

polyacrylamide có SDS-PAGE

- Nhận xét và đánh giá hiệu quả của quá trình tinh sạch

II Cơ sở lý thuyết:

1 Nội dung:

- Thu nhận protein tổng số từ dịch chiết gan lợn

- Xác định hàm lượng protein tổng số trong dịch chiết bằng quang phổ kế đo ở bước sóng 280 nm

- Xác định hoạt tính catalase bằng quang phổ kế

- Tinh sạch catalase từ dịch chiết gan bò bằng sắc ký trao đổi aninon

Q-sepharose

- Kiểm tra độ tinh sạch của các phân đoạn bằng điên di trên gel SDS-PAGE

2 Lí thuyết - Nguyên tắc:

Catalase là enzyme có tính chống oxy hoá rất mạnh, giúp xúc tác cho sự phân

huỷ hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxy (O2) Đây là một loại enzyme rất quan trọng trong việc bảo vệ các tế bào khỏi bị hư hại bởi quá trình oxy hoá Một phân tử catalase có thể chuyển đổi hàng triệu phân tử H2O2 mỗi giây:

Catalase là enzyme phổ biến tìm thấy ở gần như tất cả các sinh vật sống tiếp xúc với oxy Trong đó có thể tìm thấy ở thực vật (cây phèn đen, táo, ), vi khuẩn, hay ở gan của nhiều loài động vật (bò, chó, dê, ) Enzyme này được ứng dụng trong việc chống lão hoá, điều trị tóc bạc, Ngoài ra được thiết kế để được sử dụng trong một số quy trình thực phẩm, ví dụ như sản xuất pho mát, tẩy trắng váng sữa, chế biến trứng, làm chất tẩy trắng trong chất nhũ hóa có chứa este axit béo, trong thịt

ba chỉ, thịt bò, cá trích và trà hòa tan, và loại bỏ 𝑆𝑂2 trong tinh bột chế biến và giấm rượu Ở Việt Nam, bò là gia súc khá phổ biến và có vai trò quan trọng trong nông nghiệp; các nghiên cứu cũng cho thấy lượng catalase có nhiều trong gan của

động vật Vì vậy, nghiên cứu này sẽ được tiến hành tách chiết catalase từ gan bò và xác định một số tính chất của

Enzyme thực phẩm catalase được thu nhận từ gan lợn

● Xác định hàm lượng protein tổng số trong dịch chiết bằng quang phổ kế đo

ở bước sóng 280nm.

- Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 280 nm của các protein Tại bước sóng này, các amino acid có vòng thơm sẽ hấp thụ cực đại

(do các amino acid có vòng thơm sẽ hấp thụ cực đại tại bước sóng này)

- Từ giá trị OD ở bước sóng 280 nm của các mẫu, sử dụng protein albumin huyết thanh bò làm chuẩn với hệ số A280 = 0,66 tương ứng 1 mg/ml để tính ra hàm lượng protein trong mẫu

● Xác định hoạt độ catalase của các phân đoạn tinh sạch bằng quang phổ kế

- Cho catalase phân giải H2O2, H2O2hấp thụ cực đại, đặc hiệu tại bước sóng 240nm, khi có hoạt tính của catalase sẽ cho độ hấp thụ giảm dần tại bước sóng này

- Một đơn vị hoạt độ catalase được định nghĩa là lượng enzyme phân giải được 1µmol H2O2 trên phút tại 25℃, với lượng H2O2 ban đầu là 3,05µmol

- Hoạt độ riêng của catalase được tính theo công thức:

U/ml enzyme = [∆(A 240(0 p)− A 240(3 p))]∗độ pha loãngcủa mẫu∗3 ,05

A 240(S) ∗3∗0,001

U/mg =

U

ml enzyme Nồng độ protein(mg ml )

● Tinh sạch catalase trong dịch chiết gan lợn bằng sắc ký trao đổi anion Q-sepharose.

- Sắc kí cột được chia làm 3 loại:

+ Sắc kí trao đổi ion

+ Sắc kí lọc gel

+ Sắc kí ái lực

- Trong bài thực hành này, ta sử dụng sắc kí trao đổi ion, các giá thể là hạt gel Sắc kí trao đổi ion thuộc nhóm sắc kí hấp phụ , chất cần tách ở dạng tương tác tĩnh điện thuận nghịch với pha cố định có tích điện

+ Khi hạt gel tích điện âm trên bề mặt thì đây là sắc kí trao đổi cation

+ Khi hạt gel tích điện âm trên bề mặt thì là sắc kí trao đổi anion

+ Protein tích điện âm khi pH>pI

+ Protein tích điện dương khi pH<pI

+ Với catalse, pH=7,8 và pI=6 Do đó, catalase mang điện tích âm ⇒Sử dụng sắc kí trao đổi anion

- Các bước chính của quá trình sắc ký:

+ Nhồi cột (cho gel lên cột)

+ Cân bằng cột (=10 lần thể tích cột)

+ Gắn mẫu lên cột

+ Rửa cột (từ 8-20 lần thể tích đệm)

+ Phản hấp thụ (sử dụng NaCl tăng dần nồng độ để thu các phân đoạn) + Kiểm tra độ tinh sạch trên SDS-PAGE

Phương pháp sắc kí cột có độ tinh sạch không cao, rơi vào khoảng 60-70%

● Kiểm tra độ tinh sạch của catalase bằng điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE).

- Kỹ thuật điện di đứng trên gel poly-acrylamide có sử dụng sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) phân tách protein dựa trên khối lượng phân tử và tốc độ

di chuyển khác nhau của chúng qua gel poly-acrylamide, dưới tác dụng của điện trường một chiều

- Kỹ thuật SDS-PAGE cho phép các protein phân tách dựa trên chiều dài mạch polypeptide và sử dụng sodium dodecyl sulfate (SDS) để protein chuyển về cấu trúc bậc 1 và tích điện âm cho protein

- SDS được thêm vào trong thành phần gel để duy trì trạng thái biến tính của protein trong suốt quá trình điện di (bề mặt phân tử tích điện âm, phá vỡ cấu trúc bậc cao của protein, các cầu nối S-S)

III Quy trình và kết quả:

1 Thu nhận protein tổng số từ dịch chiết gan lợn.

Nguyên liệu:

- Gan lợn: 1 g

- Đệm Tris-HCl 20mM, pH 8,0 có 50 mM NaCl (Đệm A) (khoảng 200ml) Các bước tiến hành:

- Bước 1: Cân 1.0344g gan bò rồi nghiền trong cối sứ trong quá trình nghiền thêm từ từ N2 lỏng vào cho đến khi mẫu mịn Hòa 8ml đệm A vào mẫu nghiền Thu được huyền phù không có cặn là mẫu đạt

Nguyên lý: nghiền mẫu gan sau khi làm lạnh bằng N 2 nhằm phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa protein enzyme và chuyển chúng vào dung dịch từ đó chiết rút được các protein enzyme.

- Bước 2: Ly tâm 13.000 vòng/phút, 4℃ trong 5 phút sau đó thu dịch chiết

(tổng thể tích thu được là 8ml) Hút 200µL dung dịch thu được để đo quang

phổ

Nguyên lý: sau khi phá vỡ cấu trúc của tế bào tiến hành chiết xuất protein

enzyme bằng ly tâm tách tế bào và dịch trong để thu được dịch trong có chứa các protein enzyme cần nghiên cứu.

- Bước 3: Thu tủa bằng ly tâm  ở 4oC trong 30 phút sau đó bổ sung đệm A2X vào để hòa tan tủa Ly tâm lại và hút toàn bộ dịch nổi vào ống falcon mới

Ta được dịch chiết trong 7ml protein tổng số Hòa 7ml dịch chiết trong đó với

7ml nước cất ta sẽ thu được 14ml tất cả (vì lúc thực hiện lấy nhầm đệm A2X

thay vì A1X nên phải pha loãng với nước cất để thu được lượng protein mong muốn)

Nguyên lý: ở điểm đẳng điện, protein dễ bị kết tủa Dựa vào tính chất này, ta

có thể thêm vào dung dịch protein enzyme các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính để protein đạt được điểm đẳng điện

- Bước 4: Hút từ dịch chiết tổng số 200 µL dung dịch để đo quang phổ

(mẫu DC) Phần dịch còn lại được sử dụng để tinh sạch ở phần tiếp theo.

2 Tinh sạch catalase từ dịch chiết gan lợn bằng sắc ký trao đổi anion Q-sepharose

Nguyên liệu, thiết bị:

- Dịch chiết từ gan lợn (bước 1)

- Gel Q-sepharose 5 ml

Các bước tiến hành:

- Bước 1: Nhồi 5ml gel Q sepharose lên cột (Không được để gel bị khô)

- Bước 2: Cân bằng cột bằng 10-15 lần thể tích đệm A so với cột, 5ml gel cần 50ml đệm A, tốc độ 40-60 ml/h

- Bước 3: Gắn mẫu lên cột với tốc độ 20-30 ml/h, tải của gel 20 mg protein/ml gel

- Bước 4: Rửa cột bằng đệm A (thể tích tối thiểu 10 lần so với thể tích cột) với tốc độ 30-50ml/h Rửa cho đến khi OD 280 < 0,05

- Bước 5: Rửa chiết protein gắn trên cột bằng theo phương thức gradient với đệm A có NaCl từ 50 mM đến 800 mM cho 50 ống eppendorf (Sử dụng nồng

độ muối từ thấp đến cao để phân biệt được các protein với mức âm điện khác nhau và loại bỏ được các protein không mong muốn)

Quy trình xử lý gel Q-sepharose:

- Bước 1: Rửa bằng NaCl 2M (3 lần thể tích cột) khoảng 10 - 15 phút nhằm loại

bỏ các protein tích điện có trong dịch hòa tủa được gắn lên gel

- Bước 2: Rửa gel bằng NaOH 1M trong 1-2 giờ nhằm loại bỏ protein kỵ nước, lipoprotein hay biến tính

- Bước 3: Rửa cột với cồn 70% hoặc isopropanol 30% trong thời gian khoảng

1-2 giờ nhằm loại bỏ hết các protein kỵ nước, lipoprotein, chất béo

3 Xác định hàm lượng protein tổng số trong dịch chiết bằng quang phổ kế đo

ở bước sóng 280nm:

Nguyên liệu, thiết bị:

- Các mẫu dịch chiết (DC), lên cột (LC) và các sản phẩm của sắc kí cột

- Máy đo quang phổ, cuvet 600 µL

Các bước tiến hành:

Bước 1: Đo mẫu blank sử dụng đệm A (600µl dung dịch)

Bước 2: Đo các mẫu mẫu dịch chiết (DC), lên cột (FT) và các sản phẩm của sắc kí cột

+ Với mẫu dịch chiết (DC): Pha loãng 50 lần từ mẫu ban đầu (20µl mẫu

DC với 980µl đệm) Sau đó pha loãng tiếp 100 lần (250µl mẫu DC đã pha loãng trên với 750µl đệm)

+ Với mẫu lên cột (FT): Pha loãng 10 lần (100µl mẫu LC với 900µl đệm)

+ Với các mẫu lấy từ sắc ký cột khác: Mỗi mẫu lấy 600µl để đo và không cần pha loãng

+ Trước khi đo mẫu từ cột sắc ký thì phải đo kiểm tra các mẫu rửa cột trước.(OD 280 <0,05)

Chú ý:

- Pha protein ở nồng độ thích hợp để số đọc A280 nằm trong khoảng 0,1-1,0

- Mỗi lần đo rửa lại cuvet bằng cồn, nước để tránh nhiễm của mẫu đo cũ Kết quả:

4 Xác định hoạt tính catalase bằng quang phổ kế:

Nguyên liệu:

- Đệm kaliphosphate 50 mM pH 7,0 (Đệm K)

- Cơ chất H202 30%

- Máy đo quang phổ

- Cuvet 600µL

- Pipette (1000, 200, 20 µL), đầu típ tương ứng và các vật tư tiêu hao khác

Thao tác đo như sau:

- Bước 1: Blank bằng dung dịch đệm 𝐾3𝑃𝑂4

- Bước 2: Đo hoạt tính thông qua phản ứng:

Tổng thể tích phản ứng là 600µl, thể tích và nồng độ cuối cùng của các chất được tiến hành như sau:

+ Dùng pipet hút 580µl của 𝐻2𝑂2 0,036% (w/v) pha trong đệm kaliphosphate 50

mM pH 7,0 vào cuvet

+ Đặt cuvet vào máy quang phổ và đo tại bước sóng 240 nm đến khi số đọc ổn định (nồng độ 𝐻2𝑂2 phù hợp cho xác định hoạt tính catalase sẽ có số đọc tại A240 nm trong khoảng 0,52 đến 0,55; ghi lại số đọc)

+ Bổ sung 10µl mẫu có hoạt tính của catalase, đảo nhanh và đo ngay lập tức số đọc của máy quang phổ tại 240 nm tại hai thời điểm 0 phút và 3 phút Nồng độ enzyme phù hợp sẽ cho Δ A240 (A240 nm 0 phút - A240 nm 3 phút) dao động khoảng 0,05

Kết quả:

Nhận xét:

- Hoạt tính của enzyme giảm dần, dẫn đến việc không phân giải được H2O2 (A240 tại thời điểm 0 phút và 3 phút là như nhau), vì thế thí nghiệm đo hoạt tính dừng lại

- Nồng độ Protein của E17 là cao nhất (2,374 mg/ml) và nồng độ protein của các giai đoạn lên cột sau có xu hướng giảm dần

- Nồng độ NaCl trong đệm A sử dụng để rửa chiết protein gắn trên cột có giá trị

từ 50mM đến 600mM (Sử dụng nồng độ muối từ thấp đến cao để phân biệt được các protein với mức âm điện khác nhau và loại bỏ được các protein không mong

muốn) Điều đó ứng với giá trị nồng độ NaCl tại DC bằng 50mM và giá trị tại E17 ứng với 600mM Thông qua đó ta tính được giá trị nồng độ NaCl gần đúng tại điểm có hàm lượng catalase cao nhất E17 (Coi thể tích mỗi phân đoạn E có giá trị chính xác bằng nhau)

5 Kiểm tra độ tinh sạch của các phân đoạn bằng điện di trên gel SDS-PAGE:

Nguyên liệu, thiết bị:

- Polyacrylamide 30%

- Tris-HCl pH 8,8 và pH 6,8

- APS 10%

- SDS 10%

- TEMED

- Đệm chạy điện di SDS

- CBB 0,5 %

- Đệm mẫu

- Marker

- Các mẫu dịch chiết gan lợn, các phân đoạn không gắn cột, các phân đoạn gắn cột

Các bước tiến hành

- Bước 1: Đổ bản gel SDS-PAGE 10% gồm 2 lớp: gel cô và gel tách với thành phần như sau:

- Bước 2: Sử dụng 5X loading dye protein SSB nên mix dye với mẫu theo tỉ lệ (mẫu: dye = 4:1) Ở ống DC, thêm 20µl dung dịch đệm

- Bước 3: Để các ống eppendorf chứa hỗn hợp mẫu và dye đã chuẩn bị ở trên vào phao Biến tính ở 95oC trong 5 phút trên nồi nước sôi rồi làm lạnh ngay trên đá

- Bước 4: Tra 20µ mỗi mẫu theo thứ tự: marker, dịch chiết gan lợn, các phân đoạn không gắn cột (FT và W), các phân đoạn gắn cột Ladder được sử dụng là loại GangNam-STAIN™ Prestained Protein Ladder

- Bước 5: Chạy điện di 100V trong 15 phút trong đệm Tris-glycine pH~8,8 chứa SDS 1% Sau đó tăng lên 150V trong 1 tiếng 30 phút đến khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) chạy đến cuối bản gel thì dừng lại

- Bước 6: Nhuộm bản gel với dung dịch CBB 0,5% pha trong hỗn hợp

methanol:acetic:nước với tỉ lệ thể tích là 3:6:1 qua đêm trên máy lắc

- Bước 7: Rửa gel bằng đệm rửa gel cho đến khi bản gel có nền sáng để bản gel sạch và nhìn rõ hơn

Kết

quả:

Nhận xét:

- Thông qua kết quả điện di ta có thể thấy ở mẫu DC, LT, FT và các mẫu phân đoạn E còn chứa khá nhiều các băng khác nhau (do độ tinh sạch chưa cao, còn lẫn một số các protein khác, )

- Trong dịch chiết DC thấy dải băng điện di lên rất đậm, nhiều loại protein có trong đó và nồng độ protein cao

- Băng catalase có khối lượng khoảng ~63kDa, elution trong mẫu điện di của các phân đoạn ta thấy rõ ở mẫu E17, E19, E21, E23 (đậm nhất ở E17) và nhạt dần cho đến E49 thì gần như là không còn thấy băng catalase nữa Xét tại phân đoạn E17 có băng catalase đậm nhất ta cũng thấy kết quả điện di lên nhiều băng phụ, điều này cho thấy kết quả tinh sạch catalase chưa cao

- Ở các giai đoạn elution về sau ta thấy các băng protein không phải là catalase

mờ dần và ít đi là do khi ta sử dựng nồng độ muối từ cao đến thấp đã giúp ta phân biệt được các protein với mức âm điện khác nhau và loại bỏ được các protein không mong muốn

IV Kết luận

Catalase được tinh sạch từ gan lợn bằng phương pháp kết tủa chọn lọc, sắc ký cột trao đổi anion Q - sepharose Catalase sau tinh sạch có một băng protein kích thước khoảng 63 kDa trên gel SDS-PAGE

Đỉnh hàm lượng protein nằm ở mẫu E17, tương đối phù hợp với đỉnh E17 của đỉnh hoạt tính Kết quả điện di cũng cho băng catalase ở mẫu E17 đậm nhất Các phân đoạn từ E17 đến E23 thu được protein đích nhiều hơn so với các phân đoạn khác, nồng độ protein và hoạt tính cũng cho kết quả cao

Hoạt độ enzyme tinh sạch cao nhất thu được là 78,622 u/mg so với hoạt độ riêng catalase (của cùng mẫu) là 117,172 u/mg vẫn còn thấp Điều này xảy ra có thể

do hiệu suất tinh sạch thấp, lẫn nhiều protein khác của tế bào