Một trong các lý do phương pháp mới này chưa được phát triển ứng dụng là do ngại về tính độc của sản phẩm phân hủy, xuất phát từ lo sợ trước tác động của tia X, tia gamma, chùm tia điện
TỔNG QUAN
Tổng quan về 1-naphthol và các naphthoquinone
1-Naphthol là một loại phenol, tức là hợp chất thơm có nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với nhân thơm Phenol ban đầu được dùng để chỉ hợp chất C6H5OH, nhưng về sau được mở rộng để chỉ họ các chất có cấu trúc tương tự.
Các hợp chất phenol có thể chứa một hoặc nhiều vòng thơm Khi có nhiều vòng thơm ngưng tụ, như naphthalen, phenol tương ứng sẽ được gọi là naphthol.
- Công thức phân tử là C10H 8 O - Công thức cấu tạo:
Hình I-1: công thức cấu tạo 1-naphthol
I.1.1.1 Các tính chất của 1-naphthol - Tính chất vật lý: tinh thể trắng, dưới tác dụng của ánh sáng chuyển sang màu hồng rồi sẫm lại, hơi có mùi phenol Tan ít trong nước, dễ tan trong rượu, ete, benzene, chloroform và dung dịch kiềm
Khối lượng phân tử : 144,173 g/mol
Áp suất bay hơi 1,3 hPa (94 0 C)
- Tính chất hóa học: do sự phân cực liên kết C-O và O-H trong phân tử 1-naphthol khác trong ancol Trong đó sự phân cực liên kết O-H mạnh hơn trong ancol làm cho H dễ tách ra 1-naphthol thể hiện tính axit mạnh hơn ancol
Ngoài ra mật độ điện tử ở nhân benzen tăng lên, nhân benzen trở nên hoạt hóa để tham gia phản ứng thế ái điện tử 1-Naphthol mang tính chất đặc trưng của phenol là tính axit yếu, có khả năng phản ứng được với cả NaOH Bên cạnh đó phenol còn tham gia phản ứng ester hóa, phản ứng thế ái điện tử vào nhân thơm
1-naphthol không bền trong nước tự nhiên, thời gian bán hủy chỉ vài ngày [5]
Trong môi trường nước biển thì thời gian bán hủy của 1-naphthol chỉ sau 2giờ
I.1.1.2 Cách tổng hợp thuốc trừ sâu carbaryl từ 1-naphthol [13]
Carbaryl được biết đến đầu tiên vào năm 1956 và là thuốc trừ sâu carbamate đầu tiên được thương mại hóa thành công cho nông nghiệp và sử dụng trong gia đình Carbaryl được tổng hợp trực tiếp từ 1-naphthol và methyl isocyanate hoặc bằng phản ứng với naphthyl chloroformate (được hình thành từ phản ứng của 1- naphthol và carbonylchloride) với methylamine như Hình I-2
Hình I-2 Phản ứng tổng hợp carbaryl từ 1-naphthol
I.1.1.3 Độc tính của 1-naphthol - Hít phải: gây kích ứng đường hô hấp Các triệu chứng có thể gặp phải là ho, khó thở Hít phải liều lớn có thể dẫn tới tử vong
- Da: gây kích ứng, đỏ, rát và đau đớn Có thể hấp thụ qua da song song với các triệu chứng tiêu hóa gây tổn thương thận Tại chỗ tiếp xúc có thể gây lột da
- Mắt : gây ra kích ứng, mẩn đỏ, đau, tổn thương giác mạc
- Độc hại với môi trường nước hơn cả carbaryl 1-naphthol gây độc cho giun, tảo và các loài cá [5]
I.1.2 Các naphthoquinone I.1.2.1 Tổng quan về 1,2-Naphthoquinone
Hình I-3 Công thức cấu tạo 1,2-Naphthoquinone hay ortho naphthoquinone - Công thức phân tử C10H 6 O 2
- Phân tử gam: 158,15g/mol - Tồn tại ở dạng tinh thể màu vàng nâu
Trong đó đôi xeton (quinine) là một chất chuyển hóa trong phản ứng của Naphthalen và được tìm thấy trong dầu diesel thải hạt Sự tích tụ của chất chuyển hóa độc hại này ở chuột từ Naphthalen đã được cho thấy là gây ra thiệt hại mắt, bao gồm sự hình thành đục thủy tinh thể
Hình I-4 Công thức cấu tạo 1,4-naphthoquinone
1,4-Naphthoquinone hay para naphthoquinone, đồng phân với 1,2- naphthoquinone, tồn tại ở dạng tinh thể màu vàng và có mùi tương tự như benzoquinone Chất này hòa tan trong nước lạnh được, tan rất ít trong ete dầu khí, và tự do hòa tan trong dung môi hữu cơ phân cực nhất Bởi vì sự ổn định của vòng thơm, dẫn xuất 1,4-naphthoquinone được biết là có tính chống vi khuẩn và chống khối u
Naphthoquinone có trong cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhieentrong cơ thể người ví dụ là vitamin K
- Nhiệt độ nóng chảy : 126 0 C - Nhiệt độ sôi : 1000C
- Độ tan trong nước : 0.09g/l I.1.2.3 Tổng quan về 2-Hydroxy-1,4-Naphthoquinone
Hình I-5 Công thức cấu tạo 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone
- Công thức phân tử : C 10 H 6 O 3 - Phân tử gam : 174,15g/mol - Nhiệt độ nóng chảy : 195-196 0 C - Dạng tồn tại là thể màu vàng nghệ - Độ tan : 2g/l
2-hydroxy-1,4-naphthoquinone hay còn được gọi là Lawsone được tìm thấy trong cây lá móng, quả óc chó Người ta đã sử dụng dịch chiết xuất từ lá móng có chứa lawsone như thuốc màu tóc và da Tuy vậy chất này có thể gây ra các bệnh về gan, thận
Ngoài ta, 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone được cho là chất trung gian hữu ích trong việc sản xuất thuốc chống ung thư và thuốc nhuộm
I.1.2.4 Tổng quan về 5-Hydroxy-1,4-Naphthoquinone
Hình I-6 Công thức cấu tạo 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone
- Nhiệt độ nóng chảy : 162-163 0 C - Dạng tồn tại là tinh thể màu vàng cam
- Chất này được biết đến như là chất ức chế tăng trưởng, một chất ức chế hô hấp làm mất nhạy cảm của các nhà máy năng lượng cần thiết cho hoạt động trao đổi chất
- Đây là đồng phân của 2-hydroxy-1,4-Naphthoquinone, còn có tên gọi khác là juglone Đôi khi nó được dùng làm thuốc diệt cỏ, làm chất nhuộm màu cho vải hay các loại mực Trong tự nhiên juglone được tìm thấy trong tất cả các phần của cây óc chó và nhiều nhất trong quả Juglone cũng có thể thu được từ quá trình oxy hóa của 5,8-dihydroxy-1-tetralone với oxit bạc (Ag2O), mangan dioxit (MnO2), hoặc 2,3- dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquione (DDQ).
Các phương pháp nghiên cứu định danh chất
I.2.1 Phương pháp phổ hồng ngoại IR [14]
Phổ hồng ngoại (IR) là kỹ thuật phổ biến trong hóa học hữu cơ và vô cơ Ứng dụng phổ biến của phổ IR bao gồm xác định cấu trúc phân tử, xác định nhóm chức và phân biệt các hợp chất hữu cơ khác nhau Phổ hồng ngoại cung cấp thông tin về các dao động liên kết, giúp xác định cấu trúc và thành phần của phân tử.
- Xác định các hợp chất dựa vào độ trùng lập phổ của chất khảo sát với phổ chuẩn
- Xác định các nhóm chức trong hợp chất khảo sát
- Xác định các cấu tử phản ứng và nghiên cứu động học của phản ứng
- Xác định định hướng phân tử trong film polymer
- Dò tìm các tạp chất hoặc chất bổ sung có mặt trong lượng khoảng 1% và trong vài trường hợp thấp tới 0.01%
- Xác định các hợp chất polymer, nhựa và keo - Phân tích cấu trúc một số thuốc trừ sâu và copolymer
Nguyên lý hoạt động: đo sự hấp thu của các tần số IR khác nhau bởi vị trí một mẫu trong đường đi của chùm IR Các nhóm chức khác nhau sẽ hấp thụ các tần số đặc trưng của bức xạ IR.Từ vị trí của peak xuất hiện so sánh với chuẩn suy ra nhóm chức đặc trưng của chất chưa biết
I.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thu UV-VIS [15]
Bức xạ từ nguồn đi vào thiết bị tán sắc, lọc ra bức xạ đơn sắc và đi qua cuvet chứa mẫu Sau khi bức xạ bị hấp thu một phần bởi dung dịch trong cuvet thì đi ra ngoài và tới đầu dò như Hình I-7
Hình I-7 Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ hấp thu Khi phân tử hấp thu bức xạ tử ngoại hoặc khả kiến thì những electron hóa trị của nó bị kích thích và chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích, phổ thu được gọi là phổ tử ngoại-khả kiến ( Ultraviolet and visible Spectra) hay còn được gọi là phổ electron Đây là phương pháp được ứng dụng sớm nhất và rộng rãi nhất trong nghiên cứu cấu trúc các hợp chất vô cơ, hữu cơ, phức chất và trong thực tế sản xuất Các ứng dụng chính của quang phổ hấp thu UV-VIS như sau:
- Kiểm tra độ tinh khiết: vết của tạp chất trong hợp chất hữu cơ tinh khiết được phát hiện dễ dàng khi nó có cường độ hấp thu đủ lớn
- Nhận biết chất và nghiên cứu cấu trúc: so sánh phổ hấp thu với phổ hấp thu của hợp chất thiên nhiên hoặc phổ của mẫu chuẩn có thể cho kết luận về một sản phẩm tổng hợp, dù là các hợp chất có màu như carotenoit, antocxianin, porphirin…hay không màu như các alkane, alkene, …
- Nghiên cứu sự hỗ biến: nhiều hợp chất có thể tồn tại ở hai hay nhiều dạng khác nhau nằm trong một cân bằng động gọi là sự hỗ biến với mỗi dạng cấu tạo được gọi là một dạng hỗ biến Phổ UV-VIS cho phép phân biệt khá dễ dàng các dạng hỗ biến của chất
I.2.3 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [15]
Dựa vào sự khảo sát tương tác của nguyên tử hay phân tử vật chất với từ trường Một hợp chất muốn cho tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân khi đặt trong từ trường thì hợp chất đó phải chứa các hạt nhân có từ tính Phương pháp cộng hưởng từ sử dụng 13 C được viết tắt là 13 C NMR Phương pháp cộng hưởng từ sử dụng proton được viết tắt là PMN hay 1 H NMR
Phổ NMR được ứng dụng trong các lĩnh vực:
- Nghiên cứu các hợp chất hữu cơ: qui trình đồng nhất và xác định cấu trúc, phân tích định lượng, nghiên cứu động học,…
- Nghiên cứu các hợp chất vô cơ: sử dụng phổ cộng hưởng từ của các hạt nhân khác như 19 F, 31 P, 11 B, 17 O, 15 N, 59 Co
- Nghiên cứu các phân tử sinh học: phổ 3D-NMR cho phép phân tích xác định cấu trúc phân tử sinh học thường có độ phức tạp rất cao
Hình I-8 Sơ đồ hệ thống khối phổ I.2.4.1 Tổng quan về phương pháp khối phổ
Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử chất đó sau khi chuyển chất nghiên cứu thành trạng thái hơi rồi thành ion bằng phương pháp thích hợp Phân tích bằng phương pháp khối phổ tiến hành qua các giai đoạn sau:
- Nạp mẫu và làm bay hơi mẫu: mẫu được đốt nóng tới 200 0 C-300 0 C ở áp suất thấp
- Ion hóa mẫu: sau khi hóa hơi, mẫu được phóng vào buồng ion hóa và được ion hóa bởi các tác nhân ion hóa khác nhau Hai tác nhân ion hóa phổ biến nhất là ion hóa bằng va chạm điện tử hoặc ion hóa bằng trường điện
Ion hóa bằng trường điện: được thực hiện bằng cách sử dụng các bộ phát trường là cỏc “ mũi nhọn” đặc biệt dưới dạng cỏc dõy dẫn rất mảnh ( 2.5àm ) hay các lưỡi nhọn tương tự lưỡi dao cạo Khi áp đặt điện áp, các mũi nhọn sẽ cho trường điện có gradient 107-1010 V/cm Dưới ảnh hưởng của trường điện mạnh này các điện tử sẽ bị bứt khỏi phân tử chất nghiên cứu do hiệu ứng đường hầm Như vậy trong phương pháp ion hóa này các ion phân tử được tạo thành vẫn ở trạng thái cơ bản ( không tồn tại ở trạng thái kích thích) và do đó các vạch phổ sẽ rất mảnh
Ion hóa điện tử làm nóng catốt bằng volfam hoặc reni trong buồng ion hóa phát ra các electron bay về anot với tốc độ lớn tạo thành chùm electron Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi va đập với chùm electron, bị ion hóa và di chuyển về các bản điện cực trái dấu tương ứng để tới khối phân tách ion.
- Phân tách các ion: các ion phân tử và ion mảnh đi vào bộ phận phân tách và được tách ra thành các tiểu phân có khối lượng khác nhau Để đảm bảo chuyển động tự do của các ion, ở các buồng ion hóa cũng như ở khối phân tách phải tạo chân không cao khoảng 10 -6 -10 -7 mmHg Buồng phân tách có vai trò rất quan trọng trong máy khối phổ
Phân tách bằng từ: sau khi ra khỏi buồng ion hóa, các ion sẽ chịu từ trường H Các ion sẽ chuyển động theo quỹ đạo tròn bán kính r phụ thuộc vào hiệu điện thế V giữa hai bản gia tốc, khối lượng m của ion, điện tích z của ion và cường độ của từ trường H như sau:
= H r 2V Với giá trị xác định của H và V, chỉ có các hạt có tỷ số m/z thỏa mãn phương trình mới đi qua khe để đến bộ thu tín hiệu
Phân tách hai lần: phân tách bằng tĩnh điện trước rồi phân tách bằng từ trường sau Với cách này có thể đo được khối lượng phân tử chính xác đến một phần triệu đơn vị C với lượng mẫu vô cùng bé (vài ng hoặc có khi vài pg)
Hình I-9 Thiết bị phân tích khối phổ tứ cực
Tổng quan về phương pháp chiếu xạ gamma
I.3.1 Giới thiệu về phương pháp chiếu xạ [21] Đặc điểm chung của công nghệ bức xạ là trong công nghệ này, quá trình hóa học, hóa lý, hóa sinh được thực hiện dưới tác động của bức xạ
I.3.1.1 Đặc trưng của bức xạ:
Bức xạ ion hóa năng lượng cao là các dạng bức xạ có đủ năng lượng để ion hóa vật chất, gây ra các biến đổi ở mức nguyên tử và phân tử Trong số các loại bức xạ ion hóa, bức xạ gamma và electron là hai loại được sử dụng phổ biến nhất Bức xạ, nói chung, là dạng năng lượng được phát ra khi vật chất vận động và biến đổi, tồn tại dưới dạng sóng, hạt hoặc sóng hạt.
Hình I-15 Sơ đồ phân rã với các chuyển mức chính của nguồn gamma Co-60 Tia gamma thường phát ra bởi những hạt nhân kích thích ngay sau quá trình phân rã bêta của hạt nhân mẹ
Bản chất của quá trình phát xạ gamma là do hạt nhân ở vào trạng thái kích thích Để giải phóng năng lượng đó, nó phân rã β-, đồng thời phát xạ các tia gamma đặc trưng Khi đó điện tích hạt nhân giảm đi 1
I.3.1.3 Phân loại bức xạ theo năng lượng và bức sóng – Định nghĩa liều, suất liều
Bảng I-1 Phân loại bức xạ theo năng lượng và bước sóng
Dạng bức xạ Năng lượng điển hình Bức sóng điển hình, m Sóng radio
Bức xạ nhiệt Tia hồng ngoại Ánh sáng, tia tử ngoại Tia X
10 3 -10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 10 -9 10 -10 10 -11 10 -12 10 -13 10 -14 Định nghĩa về liều và suất liều:
- Liều hấp thu D của một chất có khối lượng dm được xác định bằng tỷ số giữa năng lượng dE được chất hấp thụ và khối lượng của chất đó Đơn vị của liều hấp thụ là Gray, viết tắt là Gy β - y2 y1: 1,173MeV (100%) y2: 1,332 MeV (100%)
1Gy = 1Jkg -1 - Suất liều hấp thụ: được coi là liều hấp thụ trong một đơn vị thời gian Đơn vị của suất liều hấp thụ là Gys -1 - 1 Gy.s -1 = 1 J.s -1 kg -1 = 1 W.kg -1 I.3.2 Đặc điểm tương tác của bức xạ với vật chất [22]
Tương tác của bức xạ với vật chất mang tính chất tác động qua lại:
- Vật chất làm suy giảm cường độ và năng lượng của bức xạ - Bức xạ làm thay đổi cấu trúc của vật chất, gây ra các biến đổi vật lý, hóa học, sinh học,… và các biến đổi này phụ thuộc rất mạnh vào năng lượng và dạng bức xạ
Bức xạ ion hóa là những dạng bức xạ có năng lượng đủ lớn có thể làm bứt các electron ra khỏi quỹ đạo thường trực của chúng trong nguyên tử
Các tia gamma là một loại bức xạ có khả năng thâm nhập cao qua vật chất Chúng tương tác với hạt nhân, electron và toàn bộ nguyên tử, dẫn đến sự suy giảm năng lượng Nguồn bức xạ gamma phổ biến bao gồm 60 Co và 137 Cs, đồng thời có thể lấy từ lò phản ứng hạt nhân.
I.3.3 Ưu điểm của công nghệ chiếu xạ - Tốc độ của các quy trình hóa chiếu xạ hầu như không phụ thuộc vào nhiệt độ, nhiều quy trình thực hiện ở nhiệt độ thấp
- Không cần tới các chất khơi mào và xúc tác
- Dễ điều khiển ( thông qua liều hấp thụ hoặc thời gian chiếu xạ) - Thân thiện với môi trường: giảm lượng hóa chất dùng, không tạo ra chất độc, chất lây nhiễm
- Sản lượng cao ( do chiếu xạ có thể thực hiện ở tốc độ lớn)
Tổng quan kết quả nghiên cứu phân hủy 1-naphthol trong nước do bức xạ
I.4.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài - Richard và các cộng sự chiếu dung dịch 1-naphthol (0,1 mM, pH 6,5) với tia cực tím, bước sóng 313 nm [6] Kết quả cho thấy 1-naphthol bị phân hủy rất nhanh bởi quang hóa và là cách phân hủy chủ yếu trong những điều kiện tự nhiên Ngoài ra, sử dụng 1-naphthol nồng độ 0,1 mM đã chiếu xạ để phân tích sản phẩm phân hủy bằng
HPLC-UV với cột pha đảo C18, pha động sử dụng là 60% MeOH và 40% nước được axit hóa với 0,3% axit formic, tốc độ dòng 1 ml/phút
Hiệu suất lượng tử của quang hóa của 1-napthol trong dung dịch nước là (1.4±0.2)x10 -2 và giá trị này không phụ thuộc vào nồng độ 1-naphthol, có thể được sử dụng để ước tính thời kỳ bán hủy của 1-naphthol trong môi trường nước với nồng độ rất thấp Bên cạnh đó, kết quả xác định sản phẩm phân hủy của 1-naphthol gồm có 1,2-naphthoquinone; 6-hydroxy-1,4-naphthoquinone; 2-hydroxy-1,4- naphthoquinone; 1,4-naphthoquinone và 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone Nghiên cứu phân tích này cho thấy 1-naphthol chủ yếu chuyển hóa thành các dẫn xuất naphthoquinone
I.4.2 Các nghiên cứu trong nước - Ngô Mạnh Thắng và các cộng sự tại trường đại học Bách Khoa TP.HCM đã nghiên cứu chiếu xạ 1-naphthol nồng độ từ 1 ppm đến 20 ppm trong dung dịch axit sulfuric và axit hydrochlodric ở các liều chiếu xạ từ 0,3 kGy đến 3,0 kGy với nguồn chiếu xạ 60 Co ở nhiệt độ 28 0 C, suất liều 6,20 kGy/giờ [8] Sử dụng thiết bị phân tích HPLC/UV Agilent 1100, thực hiện với cột pha đảo Gemini C-18 (5àm, 250mm x 4.6mm, Phenomenex), đầu dò UV được cài đặt ở 212nm, pha động acetonitrile/nước = 40/60 (v/v) tốc độ dòng 1ml/phút
Kết quả thu được là tốc độ phân hủy 1-naphthol có thể được mô tả bởi phương trình động học giả bậc nhất Một mối liên quan thực nghiệm giữa hằng số phản ứng quan sát được và nồng độ 1-naphthol ban đầu, dự đoán được các liều hấp thụ để xử lý hiệu quả 1-naphthol đã bị phân hủy gần như hoàn toàn ở liều chiếu 3,0 kGy và hiệu suất phân hủy 1-naphthol tăng khi nồng độ ban đầu giảm Ngoài ra, tìm thấy ba sản phẩm phân hủy có độ phân cực cao hơn so với 1-naphthol [8].
Hạn chế của các công trình nghiên cứu trước đây
Các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước chỉ dừng lại ở phân tích HPLC/UV, dựa vào thời gian lưu và phổ hấp thu đặc trưng để dự đoán các sản phẩm tạo ra trong quá trình phân hủy 1-naphthol Điều này đưa đến một hạn chế là có thể có những chất có cùng thời gian lưu với các sản phẩm hình thành trong quá trình phân hủy dẫn tới sai sót trong kết luận sản phẩm Ngoài ra, trong các nghiên cứu này thì giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng vẫn còn rất cao Do đó, sẽ không thể tính được chính xác hiệu suất phân hủy của 1-naphthol ở nồng độ thấp và không xác định được các sản phẩm hình thành sau quá trình chiếu xạ
Theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 5946:2005) qui định giới hạn phenol được phép trong nước sinh hoạt là 0.001mg/l ( ~1ppm) Nước thải từ các nhà máy vào môi trường là 0.1mg/l (~100ppm) Ngoài ra, đối với các hợp chất đa vòng thơm giới hạn cho phộp trong nước biển xa bờ là 0.3àg/l Với giới hạn thấp này thỡ cỏc phương pháp bằng sắc ký lỏng thường khó có thể phân tích chính xác được
Để xác định chắc chắn các sản phẩm phân hủy, cần thực hiện thêm phân tích bằng sắc ký ghép khối phổ Phương pháp này dựa vào các yếu tố thời gian lưu, ion mẹ và các ion con, giúp xác định hợp chất với độ tin cậy cao nhất so với các phương pháp đã áp dụng trước đó.
1-naphthol đã được nghiên cứu sự phân hủy bằng ánh sáng trắng, UV, Ozone Các phương pháp này đều thuộc nhóm các phương pháp oxy hóa nâng cao tạo thành do sự hình thành gốc tự do hydroxyl *OH Tuy nhiên, hiệu suất tạo thành gốc tự do *OH của các phương pháp trên không cao bằng so với chiếu xạ Do đó, luận văn được thực hiện để nghiên cứu sự phân hủy của 1-naphthol dưới tác động của chiếu xạ ( thuộc nhóm các phương pháp oxy hóa nâng cao ) để tăng cường sự phân hủy 1-naphthol do *OH gây ra.
THỰC NGHIỆM
Hóa chất - Thiết bị - dụng cụ
2-Hydroxy-1,4-Naphthoquinone, 97% (C 10 H 6 O 3 , Sigma-Aldrich, Mỹ)
5-Hydroxy-1,4-Naphthoquinone, 97% (C 10 H 6 O 3 , Sigma-Aldrich, Mỹ)
Nước cất 2 lần, khử ion, lọc qua giấy lọc 0.45àm
Máy LC/MS/MS Agilent series 1200, Triple Quad 6430
Ống nghiệm có nắp kích thước 16 mm (i.d.) x 160 mm (Isolap)
Cân 5 số lẻ KERN ABT 220-50M
Cột sắc ký Luna 5u C18(2) 100Å, 150 x 2,0 mm
Giấy nhôm bọc thực phẩm
Bình định mức: 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml (Đức)
Thực nghiệm phân tích
II.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Dung dịch 1-naphthol gốc 100 ppm: Cân 0,01000g 1-naphthol tinh khiết, dùng khoảng 50 ml nước cất chuyển hết lượng chuẩn này vào bình định mức 100 ml, đánh siêu âm 20 phút, định mức bằng nước cất rồi đánh siêu âm trong 3 phút, chuyển qua bình chứa nâu và bọc giấy nhôm Bảo quản trong tủ lạnh từ 0-4 0 C
Các dung dịch chuẩn khác nồng độ 100 ppm: cân 0,0100g mỗi chất, cho vào các bình định mức 100 ml riêng biệt, dùng 4 ml Acetonitrile để hòa tan chuẩn Lắc đều để chuẩn tan hết vào dung môi Sau khi chuẩn tan hết cho nước cất 2 lần đã khử ion vào định mức lên 100 ml Ta sẽ có dung dịch mỗi chuẩn gốc có nồng độ 100 ppm trong ACN 4% Cho vào chai nâu và bảo quản trong tủ lạnh từ 0-4 0 C
Nồng độ của mỗi chuẩn thích hợp để khảo sát điều kiện phân tích là 1 ppm
Thể tớch tiờm mẫu được cố định ở tất cả cỏc thớ nghiệm là 5àl
II.2.2 Nghiên cứu các điều kiện phân tích thích hợp
Hình II-1 Hệ thống thiết bị LC/MS/MS Thiết bị LC/MS/MS gồm hai bộ phận chính là phần LC model Binary series 1200 nối ghép với đầu dò MS/MS Triple Quad 6430 như hình II-1, sử dụng buồng ion hóa phun điện tử ESI
Thiết bị sử dụng phần mềm chạy máy Agilent MassHunter Workstation Data Acquisition Phần mềm tính toán định tính kết quả phân tích Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.04.00, phần mềm tính toán định lượng kết quả phân tích Agilent MassHunter Quantitative Analysis B.04.00
II.2.2.1 Nghiên cứu xác định chế độ chạy và khối lượng ion mẹ
- Chọn chế độ MS2 Scan cho tứ cực (còn được gọi là chế độ full scan) Khối lượng quét đi từ 100 đến 200 amu
- Xác định chế độ phân tích ion: tiến hành scan lần lượt ở chế độ positive và chế độ negative Chọn chế độ scan thích hợp đối với chất cần phân tích Lưu ý rằng khối lượng của ion mẹ thu được (m/z) có thể lệch ±1, ±2 so với khối lượng phân tử do sự tạo thành ion
- Từ kết quả scan xác định ion mẹ của chất bằng cách dùng công cụ Walk Chromatography dò tìm dọc theo peak sắc ký Khi đi dọc theo peak sắc ký sẽ có nhiều ion tồn tại trong đó, chọn ion có diện tích lớn và có tỷ lệ m/z thích hợp với chất cần phân tích
II.2.2.2 Nghiên cứu xác định ion con - Chạy chế độ Product Ion với ion mẹ vừa tìm được Với chế độ Product Ion sẽ chọn các mức năng lượng va chạm hoặc điện thế phân mảnh để tạo thành các ion có diện tích tín hiệu lớn nhất
Từ đồ thị sắc ký thu được, sử dụng công cụ Walk Chromatography, chọn ra ion con có diện tích tín hiệu lớn nhất, tương ứng với chiều cao cao nhất trên đồ thị Tiêu chí lựa chọn ion con là ion phải được hình thành ổn định trong suốt quá trình phân tích.
II.2.2.3 Nghiên cứu xác định các thông số phân tích phù hợp Khi nghiên cứu các thông số phân tích phù hợp sẽ chủ yếu sử dụng chức năng phân tích tiêm dòng (Flow Injection Analysis) để có thể so sánh tìm ra các thông số khảo sát trong cùng một sắc ký đồ bằng các segment (các đoạn thời gian ngắn với các thông số khác nhau) Đây là chế độ mà chất phân tích sẽ được tiêm liên tục trong khoảng thời gian rất ngắn, từ dòng chất phân tích liên tục đó sẽ cho ra các sắc ký đồ liên tiếp nhau trong cùng một lần chạy Các sắc ký đồ này sẽ có độ cao peak khác nhau cho thấy các thông số thích hợp đối với từng ion Do vậy, với chế độ tiêm dòng sẽ thích hợp cho việc tìm thông số khảo sát
Xác định năng lượng va chạm (Collision Energy):
Cài đặt chế độ tiêm với phương pháp Flow Injection Analysis (FIA) theo bảng sau:
Bảng II-1 Cài đặt chế độ tiêm dòng Line Function
1 REMOTE Startpulse 2 REPEAT 7 times 3 DRAW def.amount from sample, def.speed, def.offset
Line 1: bắt đầu thực hiện chế độ phân tích dòng Line 2: quy trình này sẽ lặp lại 7 lần
Line 3: hút mẫu với lượng mặc định, tốc độ mặc định và độ lệch về thời gian mặc định ( những thông số mặc định này sẽ được cài đặt ở bên ngoài)
Line 4: tiêm mẫu Line 5: đi qua van Line 6: chờ 0.32 phút để bắt đầu lần tiêm tiếp theo ( thời gian này được cài đặt tùy thuộc vào tốc độ cũng như thành phần pha động )
Line 7: kết thúc quá trình sau khi đã lặp lại.
Với QQQ-MS cài đặt tương ứng:
# Start time Scan Type Div Valve Delta
Cột # cho biết số thứ tự của segment từ 1 đến 7 Cột start time biểu thị thời gian bắt đầu quá trình tiêm dòng, dao động từ 0 phút đến 3,5 phút Sự chênh lệch thời gian này từ 0,5 phút đến 0,6 phút là do chất chuẩn được tiêm thành dòng nên cần chia khoảng thời gian này phù hợp để đỉnh sắc ký xuất hiện cân đối trên đồ sắc ký.
- Cột Scan Type cho biết dạng thực hiện của đầu dò MRM (Multiple Reaction Monitoring) là dạng phổ biến nhất khi MS1 thực hiện chức năng dò tìm ion mẹ và MS2 thực hiện chức năng dò tìm hai ion con tương ứng
- Cột Delta EMV(+), Delta EMV(-) là điện thế khuếch đại của đầu dò Điện thế càng cao thì độ khuếch đại sẽ càng được gia tăng
- Cột Stored giúp xác nhận dữ liệu nào sẽ được lưu trữ lại và dữ liệu nào sẽ bỏ qua
Trong đó 7 lần đo ở Bảng II-1 sẽ trùng với số segment trong Bảng II-2 do số lần tiêm lặp lại của chất phân tích phải bằng với số segment tương ứng Thời gian chờ tiêm cách nhau là 0,32 phút và quá trình sẽ được lặp lại 7 lần ứng với 7 peak tùy thuộc vào thông số cài đặt cho mỗi segment
Các thông số cho mỗi segment:
Bảng II-3 mô tả cho 1 segment như sau: với mỗi segment sẽ tương ứng với một Collision Energy (CE) Segment thứ 1 sẽ tương ứng với CE^V, tưng tự như vậy cho segment 2, 3, 4, 5, 6, 7 lần lượng là 10eV, 15eV, 20eV, 25eV, 30eV, 35 eV (tùy từng chất), cố định giá trị của các thông số còn lại như Fragmentor, điện thế cappilary Sau khi xác định được khoảng CE cho peak rõ nhất thì tiếp tục khảo sát trong khoảng đó Sau đó sẽ chọn CE thích hợp Lần lượt tiến hành đối với các ion, chọn ra năng lượng va chạm phù hợp với từng ion của chất cần phân tích
Thực nghiệm chiếu xạ và xác định sản phẩm xạ phân 1-naphthol
Hình II-2 Thiết bị chiếu xạ Chiếu xạ với thiết bị 60 Co Gamma Chamber 5000 (BRIT, Ấn Độ) tại Phòng công nghệ Bức xạ Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt: thể tích buồng chiếu 4 lít, đường kính buồng chứa mẫu 13 cm, suất liều 3,6030 kGy/giờ, hoạt độ 3000 Ci, nhiệt độ buồng chiếu xạ 30 0 C
Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Từ dung dịch chuẩn gốc 1-naphthol 100 ppm, pha các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 100 ppb, 300 ppb, 500 ppb, 1 ppm, 2 ppm, 5ppm và dãy nồng độ cao 7,5 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 30 ppm
Mỗi dung dịch chuẩn lấy 10 ml cho vào ống nghiệm có nắp và bịt kín Mỗi nồng độ thực hiện lặp lại 3 lần để xác định giá trị trung bình
Thực hiện chiếu xạ tại các liều 0,1 kGy, 0,3 kGy, 0,5 kGy, 1,0 kGy, 2,0 kGy đối với dãy các nồng độ thấp và các liều 0,5 kGy, 1,0 kGy, 2,0 kGy với dãy các nồng độ cao trên
Các mẫu sau khi được chiếu xạ sẽ được bảo quản trong điều kiện chắn sáng và chuyển về phòng thí nghiệm trong ngày Sau đó sẽ được giữ trong tủ lạnh với nhiệt độ môi trường bảo quản 0 0 C-4 0 C trong suốt quá trình thực hiện luận văn
II.3.1 Nghiên cứu hiệu suất và tốc độ phân hủy của 1-naphthol Từ nồng độ 1-naphthol sau chiếu xạ nhận được kết hợp với nồng độ ban đầu trước khi chiếu xạ xác định hiệu suất phân hủy và tốc độ phân hủy của 1-naphthol
Với các dung dịch 1-naphthol ở nồng độ cao (15ppm, 20ppm, 30ppm) ở liều chiếu 0.5kGy và 1.0kGy sẽ được pha loãng theo tỷ lệ 1:5 hoặc 1:10 trước khi phân tích để nồng độ nhận được sau phân tích có thể tính toán dựa vào đường chuẩn đã lập Với liều chiếu 2.0kGy thì không cần pha loãng vì 1-naphthol đã bị phân hủy rất nhiều
II.3.2 Nghiên cứu định tính và định lượng các sản phẩm phân hủy II.3.2.1 Nghiên cứu định tính
Chọn dung dịch 1-naphthol nồng độ 30ppm sau chiếu xạ với liều 2.0kGy để tiến hành scan để xác định định tính các sản phẩm phân hủy có thể có trong dung dịch Chọn dung dịch này vì nó có nồng độ 1-naphthol ban đầu cao nhất do đó (có thể)sẽ dễ quan sát được sản phẩm tạo thành hơn so với các dung dịch khác đồng thời nồng độ 1-naphthol khi chiếu xạ liều cao sẽ bị giảm nhiều do đó sẽ không làm dơ đầu dò
Full scan dung dịch 1-naphthol 30ppm không chiếu xạ và 1-naphthol 30ppm chiếu xạ liều 2.0kGy sau 1 tháng lưu trữ trong điều kiện được bọc kín và bảo quản ở nhiệt độ 0 0 C-4 0 C để xem xét sự thay đổi của dung dịch theo thời gian
Thực hiện đồng thời full scan chuẩn 2-hydroxy và 5-hydroxy-1,4- naphthoquinone ở nồng độ 2ppm và 10ppm xem có sự chuyển đổi qua lại giữa các chuẩn trong thời gian lưu trữ (~ 1 tháng)
Ngày ra, để khảo sát sự thay đổi theo thời gian trong dung dịch 1-naphthol sau chiếu xạ ở nồng độ thấp tiến hành full scan dung dịch 1-naphthol 5ppm chiếu xạ liều 0.3kGy để xác định định tính lại các sản phẩm có thể có
II.3.2.1 Nghiên cứu định lượng Dung dịch sau khi chiếu xạ sẽ được tiến hành xác định định lượng sản phẩm phân hủy ở các nồng độ khác nhau với các liều chiếu xạ khác nhau bằng thiết bị sắc ký lỏng ghép khối phổ với phương pháp chạy đã nghiên cứu Với các mẫu phân tích vượt ra ngoài đường chuẩn sẽ được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:5 hoặc 1:10 để có thể định lượng được bằng đường chuẩn tương ứng.
Xử lý kết quả thực nghiệm
Nồng độ 1-naphthol còn lại sau quá trình phân hủy và nồng độ các sản phẩm tạo thành sẽ được tính toán bằng phần mềm Agilent MassHunter Quantitative Analysis B.04.00 nhau sau: lập đường chuẩn, từ đường chuẩn xác định nồng độ của các chất có trong mẫu phân tích Với phần mềm này sẽ giúp cho việc tính toán được nhanh hơn, đồng thời kết quả chính xác hơn khi tính toán bằng tay
II.4.1 Nồng độ trung bình Nồng độ trung bình của từng chất trong các dung dịch chiếu xạ được tính như sau:
C tb – Nồng độ trung bình của chất ( ppb ) C i – Nồng độ của chất trong từng dung dịch 1-naphthol chiếu xạ ban đầu (ppb) n – số lần lặp lại của thí nghiệm (n=3)
II.4.2 Hiệu suất phân hủy
R% - hiệu suất phân hủy C 0 – nồng độ ban đầu trước khi chiếu xạ (ppb) C D – nồng độ sau khi chiếu xạ (ppb)
II.4.3 Độ lệch chuẩn RSD
RSD% - độ lệch chuẩn tương đối (%) N – số thí nghiệm lặp lại (N=3) Ci – nồng độ tương ứng trong từng thí nghiệm C – nồng độ trung bình
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả tối ưu hóa các thông số vận hành đầu dò MS/MS
III.1.1 Kết quả xác định chế độ đo mẫu – positive hay negative (Phụ lục 1) Như đã nêu vắn tắt ở phần tổng quan lý thuyết, đầu dò MS trong thiết bị LC/MS/MS có thể vận hành theo chế độ positive (ghi nhận ion dương) hay negative (ghi nhận ion âm), tùy thuộc vào phân tử khảo sát sẽ bị ion hóa như thế nào Thông thường, khi phân tử M bị ion hóa thành ion dương sẽ có dạng (hình thức) ion mẹ là (M+H) + Trường hợp ngược lại ion mẹ có dạng (M–H) - Như vậy, tùy theo khảo sát các mẫu chuẩn với chế độ chạy máy positive hay negative mà chúng tôi dò tìm ion mẹ có các tỷ lệ m/z tương ứng và kết quả ghi nhận tập hợp trong Bảng III-1 Các kết quả đo FIA và phổ khối tương ứng được trình bày trong Phụ lục P-1
Bảng III-1: Kết quả xác định chế độ đo ion ứng với các chất khảo sát
5-hydroxy-1,4- naphthoquinone Công thức cấu tạo
Bảng III-1 cho thấy cần phân tích 1,2-naphthoquinone với đầu dò MS vận hành ở chế độ positive (tìm và ghi nhận ion dương), các chất còn lại với chế độ vận hành đầu dò MS negative Kết quả này có thể giải thích trên cơ sở công thức cấu tạo của các chất khảo sát Bảng III-1 cho thấy 1-naphthol, 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone và 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone đều có chứa nhóm hydroxyl phân cực mạnh với nguyên tử hydro khá linh động, dễ dàng bị bứt ra như một proton để tạo thành ion âm Do đó ion sơ khởi (precursor ion) hình thành thu được sẽ ở dạng (M-H) - có khối lượng nhỏ hơn 1 so với khối lượng phân tử Phân tử 1,2-naphthoquinone không có nguyên tử hydro nào có tính linh động Mặt khác lại chứa nhóm C=O phân cực, nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl này còn dư cặp điện tử tự do nên dễ dàng nhận thêm proton tạo thành ion dương ở dạng (M+H) + Kết quả khảo sát ban đầu cho thấy có thể phân tích 1,4-naphthoquinone tương tự với chế độ vận hành đầu dò MS positive và m/z = 159 Tuy nhiên, sau khi đầu dò MS phải bảo dưỡng bởi công ty cung cấp thiết bị, kết quả scan 1,4-naphthoquinone ở chế độ positive cũng không ổn định, khả năng do 1,4-naphthoquinone sử dụng đã bị biến đổi Do thời gian sử dụng máy và hoàn tất luận văn có hạn, chúng tôi không thể đi sâu tìm hiểu nguyên nhân của vấn đề này
- Chọn chế độ negative để phân tích các chất 1-naphthol, 2-hydroxy-1,4- naphthoquinone và 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone
- Chọn chế độ positive để phân tích 1,2-naphthoquinone
- Chọn khối lượng ion sơ khởi của các chất như trong bảng III-1
III.1.2 Kết quả xác định điều kiện hình thành ion sản phẩm (product ions) của các chất
Ion sơ khởi thông qua va chạm sẽ bị vỡ, phân mảnh thành các ion sản phẩm đặc trưng cho cấu trúc của ion sơ khởi tương ứng Điện thế phân mảnh cũng góp phần làm quá trình này có tính chọn lọc Các ion sản phẩm sau đó được đưa vào phổ khối thứ 2 để ghi nhận, định lượng Bảng III-2 tập hợp các giá trị năng lượng va chạm và điện thế phân mảnh thành các ion sản phẩm ứng với các chất khảo sát Kết quả đo tín hiệu các ion sản phẩm tương ứng với các mức năng lượng va chạm (CE) và điện thế phân mảnh (Fragmentor) được trình bày trong phụ lục P-2
Tương quan giữa năng lượng va chạm (CE) và mức độ phân mảnh ion sơ khởi được nghiên cứu Với ion sơ khởi m/z = 143, CE = 20 eV tạo nên mảnh ion sản phẩm m/z = 114,8 có diện tích peak nhỏ hơn diện tích peak tương ứng của ion sơ khởi Diện tích peak đạt giá trị tối đa tại CE = 27 eV cho mảnh m/z = 114,8 và 30 eV cho mảnh m/z = 41,0.
Chênh lệch khối lượng giữa mảnh ion sản phẩm m/z = 114,8 và ion sơ khởi m/z = 143,0 là 28 đ.v C Thể hiện một nhân thơm trong ion sơ khởi đã bị mở vòng, tách ra mảnh C2H 4 hoặc CO Tuy nhiên, chưa có đủ cơ sở để kết luận về thành phần và nhất là cấu trúc của mảnh m/z = 114,8 Tương tự, chưa thể kết luận về thành phần và cấu trúc của mảnh m/z = 41,0 Nếu mảnh này chỉ có nguồn gốc từ ion sơ khởi C10H 7 O - , chúng tôi cho rằng khả năng hình thành các tổ hợp nguyên tử ứng với khối lượng ~ 41.0 như C 2 HO, C 3 H 5 đều thấp do cấu trúc của chúng rất không bền
Tuy nhiên, kết quả khảo sát 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone với CE = 30 eV, cùng thành phần pha động, chỉ khác Fragmentor (nhỏ hơn, 100 V thay vì 120 V như trường hợp 1-naphthol), lại không ghi nhận được ion sản phẩm có m/z ~ 41,0
Bảng III-2 Kết quả xác định năng lượng va chạm và điện thế phân mảnh
Các chất khảo sát theo negative mode và 1 chất theo positive mode đều tách ra ion sản phẩm khối lượng 28 đ.v.C Năng lượng cần thiết để tách mảnh này của 3 chất 1,2-naphthoquionone, 2-hydroxy- và 5-hydroxy-1,4- naphthoquinone đều thấp hơn 1-naphthol, chứng tỏ nhân thơm của 3 chất này kém bền hơn 1-naphthol Ion sản phẩm tiếp theo của 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone mất 44 đ.v.C, có thể do tách CO2 vì nhân thơm còn 2 nguyên tử oxy Trường hợp 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone mất thêm 28 đ.v.C do vòng bị mở là vòng ban đầu chỉ chứa nhóm –OH 1,2-naphthoquinone dùng positive mode, ion sơ khởi có nhóm hydroxyl và carbonyl gắn trên cùng một nhân thơm nên nhân này kém bền, bị mở lần lượt 2 mảnh 28 đ.v.C.
Bảng III-3 Kết quả xác định ion sản phẩm của các chất
Tên Ion sơ khởi Ion sản phẩm
Chọn năng lượng va chạm và điện thế phân mảnh của các ion sản phẩm như trong bảng III-3 Ngoài ra, trường hợp 1-naphthol chọn thêm ion 143.0 để định lượng mặc dù đây là ion sơ khởi vì ion tín hiệu của nó có độ nhạy cao hơn hẳn so với hai ion sản phẩm đã nêu
III.2 Kết quả khảo sát vận hành sắc ký LC/MS/MS
Các kết quả trình bày dưới đây thu được với các thông số vận hành đầu dò như đã tối ưu hóa ở mục III.1, nếu không có ghi chú khác.
Kết quả tối ưu hóa vận hành sắc ký LC/MS/MS
Do đặc thù của đầu dò MS/MS, pha động lỏng mang theo các thành phần của mẫu cần được phân tán thành các hạt sương kích thước nhỏ bởi nebulizer, sau đó hóa hơi và ion hóa các phân tử trước khi vào đầu dò, nên tốc độ dòng khi vận hành LC/MS/MS thường thấp hơn hẳn so với khi kết nối LC với các đầu dò khác như DAD Tốc độ dòng pha động vận hành LC/MS/MS thường giữ ở mức 0.3 ml/phút như khuyến cáo của bên cung cấp thiết bị Để giảm thời gian phân tích, cột sắc ký thường ngắn hơn Trường hợp cá biệt cần nâng tốc độ dòng pha động lên cao để giảm thời gian phân tích mẫu thì cần dùng thiết bị tách dòng sau cột, đảm bảo dòng vào đầu dò MS/MS không quá lớn
Do thiết bị sử dụng không có bộ tách dòng, em chỉ thăm dò nâng tốc độ dòng pha động lên 0.4 ml/phút song thấy không rút ngắn được đáng kể thời gian phân tích Do đó trong suốt thời gian sau này, hệ thống LC/MS/MS sử dụng tốc độ dòng cố định 0.3 ml/phút Đây là tốc độ dòng pha động phổ biến cho các thiết bị LC/MS/MS, thường gặp trong các tài liệu tham khảo Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích H2O/ACN trong pha động tới peak của 1- naphthol thể hiện trên Hình III-1 Phù hợp với thay đổi moment lưỡng cực và độ nhớt của pha động khi tăng tỷ lệ nước lên, thời gian lưu của 1-naphthol tăng lên, chân peak và bề rộng một nửa của peak tăng lên, còn chiều cao và diện tích của peak giảm xuống Các kết quả định tính này cũng đã được các luận văn, báo cáo trước đây ghi nhận khi dùng HPLC/UV Tín hiệu của mảnh ion con có m/z = 41,0 chỉ ghi nhận được ở vị trí peak của 1-naphthol (các mảnh m/z = 143,0 và 114,8), khẳng định mảnh ion này thực sự bắt nguồn từ 1-naphthol
Hình III-1: Ảnh hưởng tỷ lệ H 2 O/ACN trong pha động tới peak của 1-naphthol
Dòng 0.3 ml/phút, nhiệt độ cột 30 o C Đối chiếu với mục tiêu chính của luận văn – định danh sản phẩm phân hủy 1-naphthol, Hình III-1 cho thấy tỷ lệ H2O/ACN = 40/60 hoàn toàn không phù hợp do thời gian lưu của 1-naphthol quá ngắn, khó có thể tách được các peak sản phẩm phân hủy ra trước 1-naphthol và do đó khó định danh Tỷ lệ H2O/ACN = 60/40 cho khoảng thời gian trước peak của 1-naphthol tới ~ 8,7 phút, đủ để có thể phân biệt rõ các peak sản phẩm phân hủy Tuy nhiên, số liệu trong Bảng III-4 cho thấy khi tăng thành phần nước trong pha động từ 40% lên 60%, độ thu hồi mẫu giảm thêm từ ~ 30% đến ~ 40%, làm giảm độ nhạy của phương pháp khi khảo sát các mẫu có nồng độ 1-naphthol thấp
Bảng III-4: Diện tích các peak mảnh ion con theo tỷ lệ pha động H2O/AcN Tỷ lệ H 2 O: ACN Diện tích các ion của 1-naphthol ion 1, m/z 41.0 ion 2, m/z 114.8 ion 3, m/z 143.0
50:50 1657 (87.12%) 4926 (87.22%) 72561 (86.31%) 60:40 1365 (71.77%) 3550 (62.85%) 51947 (61.79%) Để khắc phục tình trạng này, các hệ thống LC/MS/MS thường vận hành với thành phần pha động thay đổi theo một chương trình định trước cho mỗi lần đo – dùng gradient thành phần dòng pha động Sau một loạt các thí nghiệm thăm dò, chúng tôi quyết định dùng gradient dòng pha động như mô tả trong Bảng III-5
Bảng III-5 Gradient thành phần dòng pha động (tốc độ dòng 0,3 ml/phút)
Trong 1,5 phút đầu, duy trì thành phần nước cao tới 60% để đảm bảo tách được peak của 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone đủ xa khỏi peak của nền mẫu (nếu có) Với thành phần pha động này, peak của 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone khởi đầu từ thời điểm ~ 0,9 phút và kết thúc ở thời điểm ~ 1,5 phút Trong 0,5 phút tiếp theo, thành phần ACN trong pha động tăng tuyến tính từ 40% lên 80% và duy trì cố định tới phút thứ 6 Điều kiện này đảm bảo cho 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone và 1-naphthol lần lượt được rửa giải ra khỏi cột với độ phân giải tới đường nền, tỷ lệ ACN/H 2 O đủ cao để đảm bảo độ nhạy của phương pháp với 2 chất đó Như vậy, thời gian phân tích mỗi mẫu là 9 phút Để đảm bảo độ lặp lại điều kiện đo, nhất là với 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone, chúng tôi cài đặt thêm thời gian sau đo (post- run time) 4 phút Tổng thời gian sử dụng máy cho mỗi lần đo là 13 phút, không quá dài làm tăng chi phí sử dụng máy
III.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ buồng cột Nhiệt độ cột ảnh hưởng đến quá trình tách chất trong cột, qua đó ảnh hưởng tới thời gian lưu, diện tích peak và độ phân giải các peak trên sắc ký đồ Có thể dự đoán rằng khi tăng nhiệt độ cột, độ nhớt của pha động giảm, qua đó làm giảm áp suất trong cột, tốc độ tương tác giữa các thành phần trong mẫu với pha tĩnh trong cột tăng lên Hệ quả là thời gian lưu giảm, diện tích peak tăng, và như vậy độ phân giải các peak có thể giảm
0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0 r e t e n t i o n t i m e , m i n in te n si ty , cp m
Hình III-2: Sắc ký đồ của hỗn hợp 2-hydroxy- và 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (100 ppb và 1000 ppb) và 1-naphthol (100 ppb) ở nhiệt độ 30 0 C và 40 0 C
Gradient thành phần pha động như Bảng III-5 Tốc độ dòng 0.3 ml/phút
Kết quả trên Hình III-2 ủng hộ dự báo về sự tăng diện tích các peak khi tăng nhiệt độ cột Tuy nhiên, Bảng III-6 chỉ ra rằng việc nâng nhiệt độ cột từ 30 đến 40 độ C không ảnh hưởng đáng kể đến diện tích các peak tương ứng.
Bảng III-6 Ảnh hưởng nhiệt độ cột tới kết quả đo
Diện tích peak các ion sản phẩm với m/z
Tiếp tục nâng nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến độ phân giải của 2 peak liền kề ứng với 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone và 1-naphthol Vì vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ buồng cột 30 o C cho các phân tích tiếp theo
1,2-naphthoquinone được phân tích ở chế độ dương, do đó không thể phân tích đồng thời với 3 chất khác trong mẫu hỗn hợp Để hỗ trợ phân tích 1,2-naphthoquinone dưới dạng cation phân tử, thành phần nước trong pha động được thay thế bằng dung dịch axit formic 0,1%.
Thành phần % axetonitril và gradient thành phần này trong pha động giống như trong Bảng III-5 Các sắc ký đồ thu được thể hiện trong phần Phụ lục 3, hình P3-1.
Các thông số thích hợp cho nguồn ion hóa điện tử ESI
Các thông số được lựa chọn dựa trên tốc độ, tỷ lệ và bản chất pha động cũng như dung môi pha mẫu Tuy nhiên, bài viết không đề cập đến ảnh hưởng của các thông số này mà sử dụng các giá trị khuyến nghị trong tài liệu.
- Nhiệt độ khí nitơ làm khô: 325 0 C - Tốc độ khí làm khô : 8 lít/phút - Áp suất phun : 40 psi - Điện thế Capillary : (+) 4000V, (-) 3500V
Đường chuẩn, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Các Hình III-3 đến III-6 trình bày các sắc ký đồ mẫu chuẩn của từng chất khảo sát với các điều kiện vận hành LC/MS/MS đã tối ưu nêu trên.
Hình III-3: Các sắc ký đồ mẫu chuẩn 1-naphthol (10 ppb – 5 ppm)
Hình III-4: Các sắc ký đồ mẫu chuẩn 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (100ppb –
Hình III-5: Các sắc ký đồ mẫu chuẩn 1,2-naphthoquinone (100 ppb – 2000 ppb)
Hình III-6: Các sắc ký đồ mẫu chuẩn 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone (1 ppb–1000 ppb)
Có thể thấy rằng thời gian lưu của từng chất khảo sát cơ bản không phụ thuộc vào nồng độ chất đó và có độ lặp lại trong ngày khá tốt, dao động không quá 0.05 phút Như Hình III-2 đã chỉ ra, khi mẫu chứa cả 3 chuẩn 2-hydroxy-1,4- naphthoquinone, 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, và 1-naphthol, thời gian lưu của mỗi chất cơ bản trùng lặp với giá trị tương ứng trên các Hình III-6, III-4 và III-3
Tuy nhiên, thời gian lưu của các chất này khi đo ở các ngày khác nhau thể hiện sai lệch đáng kể
Hình III-7 tập hợp các đường chuẩn phân tích 4 chất khảo sát, thu được thừ diện tích peak trên các sắc ký đồ Hình III-3 đến III-6 Các đường chuẩn thu được đều có dạng tuyến tính trong vùng nồng độ khảo sát với hệ số tin cậy cao Do đó có thể thay thế các tỷ số nồng độ bằng tỷ số các diện tích peak tương ứng
Nong do, ppb Duong chuan 5-hydroxy-1,4-Naphthoquinone y = 0.674x + 210.6 R 2 = 0.993
Nong do, ppb y = 0.794x + 16.15 R 2 = 0.998 Duong chuan 1,2-Naphthoquinone
Hình III-7: Các đường chuẩn phân tích 4 chất khảo sát
Bảng III-7 tập hợp kết quả xác định LOD và LOQ cho 4 chất khảo sát Có thể thấy với điều kiện vận hành LC/MS/MS đã lựa chọn trong luận văn này, LOD và LOQ của 1-naphthol đã được cải thiện đáng kể So sánh với kết quả LOQ ~ 0,1 ppm = 100 ppb 1-naphthol của các luận văn trước với HPLC/UV, kết quả tính LOQ
= 0.13 ppb 1-naphthol trong luận văn này là bước cải thiện đáng kể Như Hình III-2 chỉ ra, với cùng nồng độ 100 ppb trong mẫu, cường độ mũi peak của 1-naphthol cao hơn hẳn so với của 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone Tuy cường độ mũi peak của 2- hydroxy- và 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone gần bằng nhau nhưng nồng độ 5- hydroxy-1,4-naphthoquinone lại cao gấp 10 lần Kết quả LOD, LOQ của 5- hydroxy-1,4-naphthoquinone trong Bảng III-7 cũng thể hiện điều này Như vậy, thực tế độ nhạy của phương pháp tăng theo thứ tự 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone <
Bảng III-7 Kết quả xác định LOD và LOQ
Tên LOD (ppb) LOQ (ppb)
Kết quả chiếu xạ phân hủy 1-naphthol
III.5.1 Hiệu suất và tốc độ phân hủy Hình III-8 thể hiện hiệu suât phân hủy 1-naphthol theo liều bức xạ gamma hấp thu bởi mẫu và theo nồng độ ban đầu của 1-naphthol Các hiệu suất thu được tái khẳng định khả năng sử dụng chiếu xạ phân hủy dư lượng 1-naphthol trong nước, tái khẳng định xu hướng tăng hiệu suất phân hủy khi nồng độ ban đầu của 1- naphthol trong mẫu giảm, như đã trình bày trong tài liệu tham khảo Tương tự, Hình III-9 tái khẳng định tốc độ phân hủy 1-npahthol tuân theo phương trình động học phản ứng bậc 1 biểu kiến, với hằng số tốc độ biểu kiến phụ thuộc vào nồng độ 1- naphthol ban đầu Điểm mới trong luận văn này là khảo sát được chiếu xạ các dung dịch 1-naphthol loãng hơn truớc nhiều, tới 100 ppb Điểm mới nữa là suất liều chiếu của nguồn trong luận văn này 3.6020 kGy/h thấp hơn trong tài liệu tham khảo 6.02 kGy/h Với nồng độ 1-naphthol ban đầu ≤ 1 ppm, dư lượng này phân hủy xuống dưới ngưỡng định lượng của phương pháp, ~ 0.13 ppb, chỉ với liều hấp thu 100 Gy
5 ppm 2 ppm 1 ppm 0.7 ppm 0.3 ppm 0.1 ppm
Hình III-8: Hiệu suất phân hủy 1-naphthol theo nồng độ ban đầu và liều hấp thu
Hình III-9 Tốc độ phân hủy 1-naphthol do chiếu xạ III.5.2 Sản phẩm phân hủy
Ngoài hai chế độ đo theo ion dương hoặc ion âm, LC/MS/MS còn hỗ trợ đo tìm kiếm các ion có m/z xác định từ trước (full scan) bằng đầu dò khối phổ (MS) thứ nhất, hoặc chỉ đo những ion sản phẩm đặt trước (MRM) để tăng độ nhạy Trong đó, full scan dùng để định tính và thực hiện được cả positive và negative mode MRM dùng để định lượng, mỗi lần đo mẫu chỉ thực hiện cho một loại ion dương hoặc âm Do đó, khi định lượng sau chiếu xạ, mỗi mẫu phải phân tích hai lần: negative mode để xác định chất đồng vị phóng xạ và positive mode để xác định chất phân tích.
700ppb 1ppm 2ppm 5ppm ln (C /C 0 )
0 5 10 15 20 25 30 35 lượng 1-naphthol, 2-hydroxy- và 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone; positive mode để định lượng 1,2-naphthoquinone
III.5.2.1 Kết quả phân tích định tính Hình III-10 thể hiện kết quả scan dung dịch 1-naphthol có nồng độ ban đầu 30 ppm ngay sau chiếu xạ liều 2.0 kGy
Hình III-10: Kết quả full scan dung dịch 1-naphthol 30ppm sau chiếu xạ 2.0 kGy Màu đỏ - m/z = 143.0; màu xanh – m/z = 173.0; màu tím – m/z = 159.0
Trên sắc ký đồ Hình III-10 ghi nhận được 5 peak thể hiện các ion có tỷ lệ m/z như sau:
- m/z = 173.0 tại hai thời gian lưu là ~ 1 phút và ~ 3 phút
- m/z = 159.0 tại hai thời gian lưu là ~ 2 phút và ~ 2.5 phút
- m/z = 143.0 tại thời gian lưu ~ 6.5 phút
So sánh với sắc ký đồ scan mẫu chứa từng chuẩn riêng biệt – Hình III-3 đến III-6 – có thể nhận thấy sự trùng hợp thời gian lưu ~ 6.5 phút và m/z = 143.0 của 1- naphthol, thời gian lưu ~ 1.0 phút và m/z = 173.0 của 2-hydroxy-1,4- naphthoquinone, thời gian lưu ~ 2.0 phút và m/z = 159.0 của 1,2-naphthoquinone
Trên sắc ký đồ không xuất hiện peak của 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone ở thời gian lưu ~ 5.4 phút do giới hạn phát hiện chất này cao hơn hẳn so với các chất còn lại – Bảng III-7
Sắc ký đồ Hình III-10 cho thấy 2 peak không xác định có giá trị m/z lần lượt là 159,0 và 173,0 Dựa vào giá trị m/z và so sánh với tài liệu tham khảo, chúng tôi giả thiết peak có m/z = 159,0 ứng với 1,4-naphthoquinone và peak có m/z = 173,0 ứng với 6-hydroxy-1,4-naphthoquinone Tuy nhiên, do thiếu mẫu chuẩn, nên việc kết luận định danh và định lượng chưa có đủ cơ sở Để kiểm chứng, các mẫu được lưu trữ trong tủ lạnh khoảng 1 tháng và đo lại, so sánh với mẫu không chiếu xạ Kết quả cho thấy peak 1-naphthol bị dịch chuyển sang vùng thời gian lưu ngắn hơn, độ lặp lại kết quả đo rất tốt Đáng chú ý, 2 peak m/z = 159,0 xích lại gần nhau, che phủ lẫn nhau thành một peak kép Peak 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone ở thời gian lưu ~ 1,0 phút không xuất hiện, trong khi peak ở thời gian lưu ~ 3,0 phút vẫn còn rất rõ nét Vì vậy, chúng tôi tiến hành scan lại mẫu chuẩn 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone để kiểm chứng khả năng nó tự chuyển hóa thành đồng phân khác kém phân cực hơn.
0 1x10 6 2x10 6 3x10 6 4x10 6 5x10 6 6x10 6 7x10 6 m/z = 173.0 2.0 kGy m/z = 143.0 2.0 kGy m/z = 143.0 non-irradiated retention time, min.
0.0 5.0x10 4 1.0x10 5 1.5x10 5 2.0x10 5 2.5x10 5 3.0x10 5 3.5x10 5 4.0x10 5 m/z = 159.0 2.0 kGy m/z = 173.0 2.0 kGy m/z = 143.0 2.0 kGy m/z = 143.0 non-irradiated retention time, min.
Hình III-11: So sánh sắc ký đồ full scan của mẫu 30 ppm 1-naphthol không chiếu xạ và có chiếu 2.0 kGy (đo ~ 1 tháng sau chiếu xạ, lưu mẫu ở ~ 4 o C)
Bảng III-8: Kết quả đo kiểm chứng dung dịch 30 ppm 1-naphthol không chiếu xạ chiếu xạ 2 kGy
Thời gian lưu Diện tích peak Thời gian luu Diện tích peak
Kết quả thể hiện trên Hình III-12 cũng cho thấy không còn peak với m/z 173.0 và thời gian lưu ~ 1.0 phút nữa Khả năng peak với thời gian lưu ~ 3.0 phút vẫn thể hiện 2-hydroxy- hay một đồng phân nào khác của hydroxy-1,4 naphthoquinone vẫn còn chưa rõ
Hình III-12: Kết quả scan lại mẫu dung dịch 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone, 1ppm
Hình III-13: Kết quả scan lại mẫu dung dịch 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone,
Màu đỏ – 2 ppm; màu xanh – 5 ppm; m/z = 173
Dung dịch 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone với nồng độ 2 ppm và 5 ppm được kiểm tra lại để xác minh Kết quả thu được từ Hình III-13 chứng minh sự chuyển hóa 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (thời gian lưu ~ 5,2 phút) thành đồng phân hydroxyl-1,4-naphthoquinone khác (thời gian lưu ~ 2,9 phút).
Hình III-14: Sắc ký đồ scan mẫu 5 ppm 1-naphthol sau chiếu xạ 0.3 kGy
Pha động cố định thành phần axetonitril 40%
Scan lại mẫu với thành phần pha động cố định 40% axetonitril cũng cho kết quả tương tự Hình III-14
III.5.2.2 Kết quả phân tích định lượng Kết quả xác định hàm lượng 1,2-naphthoquinone trong các mẫu chiếu xạ tập trung trong Bảng III-9 và Hình III-15
Bảng III-9: Hàm lượng 1,2-naphthoquinone thu được:
Hàm lượng 1,2-naphthoquinone thu được theo liều chiếu xạ, ppb
100 200 300 400 500 600 700 retention time, min. in te n s it y , c p m
30 ppm, 2,0 kGy 20 ppm, 1,0 kGy 15 ppm, 1,0 kGy 7.5 ppm, 0.5 kGy
Hình III-15: Sắc ký đồ thể hiện sản phẩm 1,2-naphthoquinone (trái) và nồng độ sản phẩm này (phải) theo nồng độ 1-naphthol ban đầu và liều hấp thụ Với nồng độ ban đầu của 1-naphthol không quá 20 ppm, biến thiên nồng độ 1,2-naphthoquinone theo liều hấp thu có dạng đặc trưng của sản phẩm trung gian
Trường hợp nồng độ 1-naphthol ban đầu 30 ppm, sản phẩm 1,2-naphthoquinone chưa đạt cực trị ở liều hấp thu 2.0 kGy Tuy nhiên, có khả năng lúc này peak không chỉ thể hiện sản phẩm 1,2-naphthoquinone mà bao trùm cả sản phẩm 1,4- naphthoquinone
Kết quả xác định hàm lượng 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone trong các mẫu chiếu xạ tập trung trong Bảng III-10 và Hình III-16
Bảng III-10: Hàm lượng 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone trong các mẫu chiếu xạ
Hàm lượng 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone thu được theo liều chiếu xạ, ppb
Hình III-16: Hàm lượng 5-OH-1,4-naphthoquinone trong các mẫu chiếu xạ Biến thiên nồng độ 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone theo liều hấp thu có dạng đặc trưng của sản phẩm trung gian Nồng độ sản phẩm này đạt giá trị cực đại ở liều hấp thu ~ 0.3 – 1.0 kGy, tùy theo nồng độ 1-naphthol ban đầu Ngay cả giá trị cực đại nồng độ 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone cũng thấp hơn nhiều so với 1,2- naphthoquinone
Kết quả xác định hàm lượng 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone trong các mẫu chiếu xạ tập trung trong Bảng III-11 và Hình III-17 Tương tự như 2 sản phẩm trên, biến thiên nồng độ 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone theo liều hấp thu có dạng đặc trưng của sản phẩm trung gian Nồng độ sản phẩm này đạt giá trị cực đại ở liều hấp thu 0.5 – 1.0 kGy, tùy theo nồng độ 1-naphthol ban đầu Giá trị cực đại nồng độ 2- hydroxy-1,4-naphthoquinone còn thấp hơn nhiều so với 5-hydroxy-1,4- naphthoquinone
Các kết quả trên có thể giải thích được do trong các dung dịch chiếu xạ, gốc tự do *OH tấn công vào phân tử 1-naphthol, lấy đi nguyên tử hydro từ nhóm chức –OH và tạo thành gốc phenyl C4H 9 O*, kết quả là nguyên tử C2 ở nhân thơm này ít nhiều tích điện dương, dễ dàng tiếp nhận / bứt nhóm –OH từ một phân tử nước bao quanh rồi chuyển hóa thành 1,2-naphthoquinone Quá trình hình thành 1,4- naphthoquinone do gốc gắn kết nhóm –OH vào vị trí C4 diễn ra chậm hơn (mật độ điện tử ở vị trí này cao hơn)
Bảng III-11: Hàm lượng 2-hydroxy-1,2-naphthoquinone trong các mẫu chiếu xạ
Hàm lượng 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone thu được theo liều chiếu xạ, ppb Liều chiếu xạ
0kGy 0.3kGy 0.5kGy 1.0kGy 2.0kGy
Hình III-17: Hàm lượng 2-hydroxy-1,4-napthoquinone theo liều chiếu xạ Các dẫn xuất hydroxyl hình thành do tác dụng của gốc *OH vào phân tử naphthoquinone Khi đó, nhân thơm với 2 nhóm =O có cấu trúc bền vững hơn, có rào cản không gian lớn hơn bởi các orbital của nguyên tử oxy ở vị trí C1 Do đó gắn kết nhóm –OH vào vị trí C5 có xác xuất cao hơn so với vị trí C2 Kết quả là nồng độ các sản phẩm trung gian sẽ giảm theo thứ tự: 1,2-NAPQ > 1,4-NAPQ > 5-HO-1,4-NAPQ > 2-HO-1,4-NAPQ.