luận án tiến sĩ nghiên cứu chiết tách tinh chế lutein zeaxanthin và bào chế chế phẩm dạng nhũ tương kích thước nano từ cánh hoa cúc vạn thọ tagetes erecta l

KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa thåi gian đÁn hiåu suÃt thąy phân lutein este trong cao chiÁt .... KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa tỷ lå dung môi đÁn quá trình kÁt tinh l¿i lutein 90 BÁn

BÞ GIÁO DþC VÀ ÀO T¾O T¾P OÀN HÓA CH¾T VIÞT NAM

VIÞN HÓA HÞC CÔNG NGHIÞP VIÞT NAM ***************

NGUYÞN THÞ MINH NGUYÞT

NGHIÊN CþU CHI¾T TÁCH, TINH CH¾ LUTEIN, ZEAXANTHIN VÀ BÀO CH¾ CH¾ PH¾M D¾NG NHi T¯¡NG KÍCH TH¯ÞC NANO Tþ CÁNH HOA CÚC V¾N

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TẬP ĐOÀN HÓA CHẤT VIỆT NAM

***************

T¯¡NG KÍCH TH¯àC NANO TỪ CÁNH HOA CÚC VẠN THà (TAGETES ERECTA L.)

LâI CAM ĐOAN

Đß tài: <Nghiên cću chiÁt tách, bào chÁ và đặc tính cąa nano lutein, zeaxanthin tĉ cây Cúc v¿n thã= nằm trong khuôn khå các h°ãng nghiên cću cąa Phòng thí nghiåm trãng điám Công nghå lãc, hóa dÅu Tôi xin cam đoan đß tài là mát công trình nghiên cću đác lÁp, không có sď sao chép cąa ng°åi khác Các sá liåu nghiên cću khoa hãc và kÁt quÁ nghiên cću cąa luÁn án là trung thďc Các tài liåu tham khÁo đã đ°āc ghi rõ nguãn trích d¿n

Hà Nội, ngày 02 tháng 07 năm 2023

LâI CÀM ¡N

Tôi xin bày tß lòng biÁt ¢n sâu sÃc đÁn GS TS Vj Thá Thu Hà và PGS TS Nguyãn Thanh Bình - hai ng°åi ThÅy đã đánh h°ãng khoa hãc và tÁn tình h°ãng d¿n tôi thďc hiån luÁn án ThÅy, Cô là ng°åi đã d¿y cho tôi sď nghiêm túc trong khoa hãc, luôn tin t°çng và đáng viên, khích lå tôi hoàn thành luÁn án!

Tôi cjng xin bày tß lòng biÁt ¢n trân trãng tãi Viån Hóa hãc Công nghiåp Viåt Nam, phòng Thí nghiåm Trãng điám Công nghå lãc, hóa dÅu đã nhiåt tình giúp đÿ, t¿o mãi đißu kiån tát nhÃt cho tôi hoàn thành luÁn án!

Tôi xin chân thành cÁm ¢n Ban chą nhiåm ch°¢ng trình Hóa D°āc (dď án Hoàn thiån quy trình công nghå chiÁt xuÃt, tinh chÁ các ho¿t chÃt lutein, zeaxanthin tĉ cây Cúc v¿n thã) cąa Bá Công th°¢ng đã hß trā kinh phí thďc hiån luÁn án!

Tôi xin chân thành cÁm ¢n tr°ång Đ¿i hãc Hàng hÁi Viåt Nam, Viån Môi tr°ång – Tr°ång Đ¿i hãc Hàng hÁi Viåt Nam đã quan tâm và giúp đÿ tôi trong quá trình hãc tÁp và nghiên cću

Cuái cùng, tôi xin cÁm ¢n nhčng ng°åi thân trong gia đình và b¿n bè đã luôn ç bên, giúp đÿ, đáng viên và t¿o mãi đißu kiån thuÁn lāi đá tôi hoàn thành luÁn án!

Hà Nội, ngày 02 tháng 07 năm 2023

MĀC LĀC

LäI CAM ĐOAN i

LäI CÀM ¡N ii

MĂC LĂC i

DANH MĂC CÁC CHČ VIÀT TÂT v

DANH MĂC BÀNG vii

DANH MĂC HÌNH x

Mæ ĐÄU 1

CH¯¡NG 1: TäNG QUAN 3

1.1 LUTEIN VÀ ZEAXANTHIN 3

1.1.1 Nguãn gác lutein trong tď nhiên 5

1.1.2 Ho¿t tính cąa lutein 5

1.1.3 Ćng dăng cąa lutein 9

1.2 CHI CÚC V¾N THâ 10

1.3 MàT Sà PH¯¡NG PHÁP CHIÀT TÁCH VÀ TINH CHÀ LUTEIN 12

1.3.1 Tißn xċ lý nguyên liåu hoa Cúc v¿n thã 13

1.3.2 Các ph°¢ng pháp chiÁt tách lutein este 14

1.3.3 Các ph°¢ng pháp làm giàu cao chiÁt chća lutein este 17

1.3.4 Các ph°¢ng pháp thąy phân lutein este 17

1.3.5 Ph°¢ng pháp tinh chÁ lutein 19

1.3.6 KÁt tinh l¿i zeaxanthin 20

1.4 PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÍCH LUTEIN VÀ ZEAXANTHIN 21

1.5 MàT Sà BIäN PHÁP CÀI THIäN SINH KHÀ DĂNG CĄA LUTEIN DÙNG Đ¯äNG

1.5.5 ¯u điám và nh°āc điám cąa các hå phân tán 28

1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CĆU æ VIäT NAM 30

1.7 MàT Sà KÀT LUÀN RÚT RA TĈ TäNG QUAN TÀI LIäU 32

CH¯¡NG 2: THĎC NGHIäM 34

2.1 NGUYÊN LIäU, HÓA CHÂT, DĂNG CĂ VÀ THIÀT Bà 34

2.1.1 Nguyên liåu, hóa chÃt 34

2.1.2 Dăng că và thiÁt bá 35

2.2 PH¯¡NG PHÁP THĎC NGHIäM 37

2.2.1 S¢ chÁ - bÁo quÁn nguyên liåu 37

2.2.2 Xác đánh hàm l°āng lutein tång trong bát hoa Cúc v¿n thã 38

2.2.3 Tißn xċ lý nguyên liåu hoa Cúc v¿n thã 38

2.2.4 ChiÁt tách cao chiÁt giàu lutein tĉ nguyên liåu cánh hoa Cúc v¿n thã 39

2.2.5 Làm giàu cao chiÁt 40

2.2.6 Thąy phân cao chiÁt và tinh chÁ tinh thá lutein 41

2.2.7 Đißu chÁ chÃt chuÇn lutein và zeaxanthin phân tích HPLC 43

2.2.8 Xác đánh đißu kiån bÁo quÁn và đá ån đánh cąa lutein 45

2.2.9 Thu hãi và tái sċ dăng các nguãn thÁi trong quá trình chiÁt tách lutein 45 2.3 PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU ĐàC TÍNH CÂP VÀ ĐàC TÍNH BÁN TR¯äNG DIâN

2.4.3 Ph°¢ng pháp qui ho¿ch thďc nghiåm và tái °u hóa 50

2.5 CÁC PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÍCH HÀM L¯ĀNG LUTEIN, ZEAXANTHIN 50

2.5.1 UV-Vis 50

2.5.2 SÃc ký lßng 51

2.5.3 Các ph°¢ng pháp phân tích khác 52

CH¯¡NG 3: KÀT QUÀ VÀ THÀO LUÀN 54

3.1 LĎA CHâN NGUYÊN LIäU VÀ PH¯¡NG PHÁP S¡ CHÀ, BÀO QUÀN 54

3.1.1 Đánh giá chÃt l°āng và lďa chãn nguyên liåu 54

3.1.2 Ph¢i m¿u trong bóng râm 55

3.1.3 SÃy CVT t°¢i bằng các ph°¢ng pháp khác 56

3.2 CHIÀT TÁCH VÀ TINH CHÀ LUTEIN VÀ ZEAXANTHIN Đ¾T TIÊU CHUÆN D¯ĀC ĐIàN 59

3.2.1 Tißn xċ lý nguyên liåu bát hoa Cúc v¿n thã khô 59

3.2.2 ChiÁt tách cao chiÁt giàu lutein este tĉ nguyên liåu hoa Cúc v¿n thã 64

3.2.3 Làm giàu cao chiÁt bằng ph°¢ng pháp chiÁt lßng-lßng 70

3.2.4 Thąy phân cao chiÁt giàu lutein este 76

3.2.5 Tinh chÁ lutein 88

3.2.6 Phân lÁp lutein và zeaxanthin làm chÃt chuÇn phân tích 95

3.2.7 Ph°¢ng pháp bÁo quÁn sÁn phÇm lutein và zeaxanthin 108

3.3 KIàM NGHIäM Đà äN ĐàNH VÀ ĐàC TÍNH CĄA SÀN PHÆM 109

3.3.1 Đá ån đánh cąa sÁn phÇm lutein 109

3.3.2 Thċ nghiåm đác tính cÃp, đác tính bán tr°ång diãn cąa sÁn phÇm lutein 110

3.4 BÀO CHÀ NHi T¯¡NG NANO LUTEIN 118

3.4.1 Lďa chãn thông sá đá thiÁt kÁ thí nghiåm 118

3.4.2 ThiÁt kÁ thí nghiåm 123

3.4.3 Phân tích quy luÁt tác đáng 125

3.4.4 Lďa chãn công thćc bào chÁ nhj t°¢ng nano tái °u 128

3.4.5 Mát sá tính chÃt hóa - lý cąa hå vi nhj t°¢ng lutein 129

3.5 TÁI SĊ DĂNG CÁC NGUâN THÀI TRONG QUÁ TRÌNH CHIÀT TÁCH LUTEIN TĈ HOA CÚC V¾N THâ 130

3.5.1 Thu hãi và tái sċ dăng tác nhân tißn xċ lý 130

3.5.2 Xċ lý bã chiÁt 131

KÀT LUÀN 134

NHČNG ĐÓNG GÓP MâI CĄA LUÀN ÁN 136

DANH MĂC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HâC ĐÃ CÔNG Bà 137

TÀI LIäU THAM KHÀO 138

PHĂ LĂC 153

DANH MĀC CÁC CHĀ VI¾T TÂT Chā vi¿t

tÃt

Ti¿ng Anh

Ti¿ng Viát

phÇm

HPLC

High performance liquid

HSQC

Heteronuclear quantum coherence

single-Kỹ thuÁt HSQC cąa phå cáng h°çng tĉ h¿t nhân hai chißu HMBC

Heteronuclear quantum coherence

multiple-Kỹ thuÁt HMBC cąa phå cáng h°çng tĉ h¿t nhân hai chißu LC-MS

Liquid chromatography-mass

MS/MS

LC-Liquid chromatography-tandem

ánh sáng nhìn thÃy

DANH MĀC BÀNG

BÁng 1.1 Công thćc phân tċ và tính chÃt vÁt lý cąa lutein và zeaxanthin 4

BÁng 1.2 Hàm l°āng lutein trong mát sá loài thďc vÁt 5

BÁng 1.3 Hiåu quÁ cąa lutein đái vãi bånh tiáu đ°ång và các bånh khác 7

BÁng 1.4 Ho¿t tính kháng viêm cąa lutein 8

BÁng 1.5 Hiåu quÁ kháng virus cąa lutein 8

BÁng 1.6 Tác dăng bÁo vå cąa lutein vß bånh tim m¿ch 8

BÁng 1 7 Các ph°¢ng pháp phân tích lutein, zeaxanthin 21

BÁng 1 8 Ph°¢ng pháp phân tích lutein, zeaxanthin theo d°āc đián Mĩ USP 40 23

BÁng 1 9 Mát sá ph°¢ng pháp bào chÁ nano tinh thá 24

BÁng 1 10 ¯u, nh°āc điám cąa các hå phân tán 29

BÁng 1.11 Tiêu chuÇn cąa d°āc đián Mĩ đái vãi nguyên liåu lutein 32

BÁng 2.1 Danh măc nguyên vÁt liåu, hóa chÃt sċ dăng trong luÁn án 34

BÁng 2.2 Danh măc dăng că, thiÁt bá sċ dăng trong luÁn án 35

BÁng 2.3 BÁng ngo¿i suy lißu t°¢ng đ°¢ng giča các loài 47

BÁng 2.4 Đißu kiån sÃc kí phân tích lutein, zeaxanthin theo HPLC 51

BÁng 3.1 Hàm l°āng lutein tång cąa các nguãn nguyên liåu 54

BÁng 3.2 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa thåi gian ph¢i m¿u trong bóng râm đÁn chÃt l°āng CVT 55

BÁng 3.3 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa nhiåt đá sÃy đÁn chÃt l°āng CVT 56

BÁng 3.4 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa thåi gian sÃy đÁn chÃt l°āng CVT 57

BÁng 3.5 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa nãng đá tác nhântãi quá trình xċ lý bát CVT khô 59 BÁng 3.6 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa nhiåt đá tãi quá trình tißn xċ lý bát CVT khô 60

BÁng 3.7 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa thåi gian tãi quá trình xċ lý bát CVT 62

BÁng 3.8 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa tác nhân tißn xċ lý tãi quá trình chiÁt lutein este tĉ bát CVT 63

BÁng 3.9 KÁt quÁ chiÁt bát CVT vãi dung môi chiÁt khác nhau 64

BÁng 3.10 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa tỷ lå dung môi etyl axetat/ nguyên liåu đÁn quá trình chiÁt bát CVT 65

BÁng 3.11 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa nhiåt đá đÁn quá trình chiÁt bát CVT 66

BÁng 3.12 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa thåi gian đÁn quá trình chiÁt bát CVT 67

BÁng 3.13 KÁt quÁ chiÁt bát CVT phă thuác vào sá lÅn chiÁt 68

BÁng 3.14 Ành h°çng cąa tác đá khuÃy đÁn hiåu quÁ chiÁt 69

BÁng 3.15 KÁt quÁ đánh giá các đißu kiån tái °u cąa quá trình chiÁt lutein este tĉ bát CVT 70

BÁng 3.16 KÁt quÁ đánh giá các đißu kiån tái °u cąa quá trình chiÁt lutein tĉ l°āng lãn bát CVT 70

BÁng 3.17 KÁt quÁ khÁo sát sď Ánh h°çng cąa tỷ lå EtOH/H2O vào khÁ năng hòa tan cao chiÁt tång 71

BÁng 3.18 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa tỷ lå dung môi n-hexan/dung dách cao chiÁt đÁn hiåu suÃt làm giàu cao chiÁt 72

BÁng 3.19 KÁt quÁ chiÁt lßng - lßng n-hexan ç các nhiåt đá khác nhau 73

BÁng 3.20 KÁt quÁ chiÁt lßng-lßng n-hexan ç các thåi gian chiÁt khác nhau 74

BÁng 3.21 KÁt quÁ chiÁt lßng - lßng n-hexan phă thuác vào sá lÅn chiÁt 75

BÁng 3.22 KÁt quÁ đánh giá đá ån đánh cąa ph°¢ng pháp làm giàu cao chiÁt 76

BÁng 3.23 KÁt quÁ khÁo sát sď Ánh h°çng cąa tỷ lå cao chiÁt/etanol đÁn hiåu suÃt thąy phân 78 BÁng 3.24 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa tỷ lå KOH/cao chiÁt đÁn hiåu suÃt thąy phân cao chiÁt 80

BÁng 3.25 KÁt quÁ thąy phân cao chiÁt ç các nhiåt đá khác nhau 81

BÁng 3.26 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa thåi gian đÁn hiåu suÃt thąy phân lutein este trong cao chiÁt 84

BÁng 3.27 KÁt quÁ đánh giá các đißu kiån tái °u cąa quá trình thąy phân cao chiÁt 87

BÁng 3.28 KÁt quÁ khÁo sát đá hòa tan cąa lutein trong dung môi 88

BÁng 3.29 KÁt quÁ lďa chãn ph°¢ng pháp kÁt tinh khác nhau 89

BÁng 3.30 KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa tỷ lå dung môi đÁn quá trình kÁt tinh l¿i lutein 90 BÁng 3.31 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa tỷ lå hå dung môi/ lutein thô đÁn quá trình kÁt tinh l¿i 90

BÁng 3.32 KÁt quÁ kÁt tinh l¿i lutein trong đißu kiån tái °u 91

BÁng 3.33 KÁt quÁ HPLC cąa m¿u M1-1 và M1-tång 93

BÁng 3.34 KÁt quÁ so sánh chÃt chuÇn lutein tinh chÁ và m¿u đái chćng 102

BÁng 3.35 KÁt quÁ LC-MS/MS cąa chÃt chuÇn lutein tinh chÁ 103

BÁng 3.36 KÁt quÁ khÁo sát Ánh h°çng cąa đißu kiån bÁo quÁn đÁn chÃt l°āng lutein 108

BÁng 3.37 KÁt quÁ kiám nghiåm đá ån đánh cąa lutein 109

BÁng 3.39 KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa lutein đÁn trãng l°āng chuát 111

BÁng 3.40 KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa lutein đÁn sá l°āng hãng cÅu 111

BÁng 3.41 KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa lutein đÁn hàm l°āng huyÁt sÃc tá 112

BÁng 3.42 KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa lutein đÁn hematocrit 112

BÁng 3.43 KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa thuác thċ đÁn sá l°āng b¿ch cÅu 113

BÁng 3.44 KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa lutein đÁn sá l°āng tiáu cÅu 113

BÁng 3.45 KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa thuác thċ đÁn ho¿t đá AST, ALT 114

BÁng 3.46 KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa thuác thċ đÁn nãng đá albumin và cholesterol toàn phÅn 115

BÁng 3.47 KÁt quÁ nghiên cću Ánh h°çng cąa lutein đÁn nãng đá creatinin 115

BÁng 3.48 KÁt quÁ xác đánh Ánh h°çng cąa chÃt ho¿t đáng bß mặt °a dÅu đÁn kích th°ãc tiáu phân trung bình cąa nhj t°¢ng 118

BÁng 3.49 KÁt quÁ xác đánh Ánh h°çng cąa chÃt ho¿t đáng bß mặt °a n°ãc đÁn kích th°ãc tiáu phân trung bình cąa nhj t°¢ng 119

BÁng 3 50 Tr¿ng thái cąa pha dÅu khi thay đåi nãng đá lutein 119

BÁng 3 51 Tr¿ng thái cąa hå nhj t°¢ng lutein khi thay đåi tỷ lå tween 80 120

BÁng 3 52 Tr¿ng thái cąa hå nhj t°¢ng lutein khi thay đåi hàm l°āng span 60 121

BÁng 3 53 Tr¿ng thái cąa hå nhj t°¢ng lutein khi thay đåi hàm l°āng pectin 123

BÁng 3 54 Công thćc nhj t°¢ng nano 124

BÁng 3 55 BiÁn đÅu vào 124

BÁng 3 56 Ma trÁn thí nghiåm và biÁn phă thuác 125

BÁng 3 57 Mćc đá Ánh h°çng và đá tin cÁy cąa các yÁu tá tái °u 126

BÁng 3 58 KÁt quÁ đÅu ra công thćc tái °u 128

BÁng 3 59 Đánh giá công thćc tái °u 128

BÁng 3 60 Mát sá tính chÃt hóa - lý cąa hå vi nhj t°¢ng lutein 129

BÁng 3 61 KÁt quÁ khÁo sát sá lÅn tái sċ dăng tác nhân tißn xć lý 130

BÁng 3 62 KÁt quÁ xċ lý bã chiÁt làm phân bón 131

BÁng 3 63 KÁt quÁ khÁo sát hàm l°āng H2S và NH3 phát sinh trong quá trình ą phân bón 132

Hình 2.1 S¢ đã lďa chãn ph°¢ng pháp s¢ chÁ cánh hoa CVT t°¢i 37

Hình 2.2 S¢ đã nghiên cću Ánh h°çng cąa tißn xċ lý bát CVT khô 38

Hình 2.3 S¢ đã nghiên cću khÁo sát lďa chãn dung môi và các đißu kiån chiÁt 39

Hình 2.4 S¢ đã nghiên cću quá trình làm giàu cao chiÁt 40

Hình 2.5 S¢ đã nghiên cću thąy phân cao chiÁt thô và tinh chÁ tinh thá lutein tĉ cao chiÁt thô 42

Hình 2.6 S¢ đã s¢ chÁ, tißn xċ lý, chiÁt tách, tinh chÁ lutein 43

Hình 2.7 S¢ đã nghiên cću phân lÁp đißu chÁ chÃt chuÇn lutein và zeaxanthin 44

Hình 2.8 S¢ đã nghiên cću thu hãi và tái sċ dăng tác nhân tißn xċ lý 45

Hình 2.9 S¢ đã nghiên cću bào chÁ nhj t°¢ng nano lutein 49

Hình 3.1 Ành h°çng cąa thåi gian ph¢i m¿u trong bóng râm đÁn chÃt l°āng CVT 55

Hình 3.2 Ành h°çng cąa nhiåt đá sÃy đÁn chÃt l°āng CVT 56

Hình 3.3 Ành h°çng cąa thåi gian sÃy đÁn chÃt l°āng CVT 58

Hình 3.4 Ành h°çng cąa nhiåt đá tãi quá trình tißn xċ lý bát CVT khô 61

Hình 3.5 Ành h°çng cąa thåi gian tãi quá trình xċ lý bát CVT 62

Hình 3.6 Ành h°çng cąa dung môi đÁn hiåu suÃt chiÁt 64

Hình 3.7 Ành h°çng cąa tß lå dung môi/nguyên liåu đÁn hiåu suÃt chiÁt 65

Hình 3.8 Ành h°çng cąa nhiåt đá đÁn quá trình chiÁt bát CVT 66

Hình 3.9 Ành h°çng cąa thåi gian đÁn quá trình chiÁt bát CVT 67

Hình 3.10 Ành h°çng cąa sá lÅn chiÁt đÁn quá trình chiÁt bát CVT 68

Hình 3.11 Ành h°çng cąa tác đá khuÃy đÁn hiåu quÁ chiÁt 68

Hình 3.12 Ành h°çng tỷ lå dung môi n-hexan/dung dách cao chiÁt tãi quá trình làm giàu cao chiÁt 72

Hình 3.13 Ành h°çng cąa nhiåt đá tãi quá trình làm giàu cao chiÁt 73

Hình 3.16 SÃc ký đã HPLC cąa cao chiÁt sau khi thąy phân 77

Hình 3.17 SÃc ký đã lutein đái chćng 77

Hình 3.18 SÃc ký đã UV-Vis lutein 77

Hình 3.19 Ành h°çng cąa tỷ lå cao chiÁt/etanol đÁn hiåu suÃt thąy phân 79

Hình 3.20 Ành h°çng cąa tỷ lå KOH/cao chiÁt đÁn hiåu suÃt thąy phân cao chiÁt 80

Hình 3.21 Ành h°çng cąa nhiåt đá tãi quá trình thąy phân cao chiÁt 81

Hình 3.22 SÃc ký đã HPLC cąa các m¿u cao chiÁt sau khi thąy phân ç các nhiåt đá khác nhau 83 Hình 3.23 Ành h°çng cąa thåi gian đÁn hiåu suÃt thąy phân lutein este trong cao chiÁt 84

Hình 3.24 SÃc ký đã HPLC cąa các m¿u cao chiÁt sau khi thąy phân ç các khoÁng thåi gian khác nhau 86

Hình 3.25 Dách lãc các m¿u thu hãi sau lãc lÅn 1 92

Hình 3.26 SÃc ký đã HPLC cąa m¿u tinh thá lutein sau kÁt tinh 92

Hình 3.27 SÃc ký đã HPLC sÁn phÇm lutein sau thąy phân 93

Hình 3.28 KÁt quÁ HPLC sÁn phÇm lutein tinh chÁ 93

Hình 3.29 Quy trình hoàn thiån chiÁt tách và tinh chÁ lutein và zeaxanthin đ¿t tiêu chuÇn d°āc đián Mĩ tĉ cánh hoa CVT 94

Hình 3.30 KÁt quÁ sÃc ký bÁn mßng sċ dăng các hå dung môi khác nhau 96

Hình 3.31 Hình Ánh chÃt chuÇn lutein đã đißu chÁ 97

Hình 3.32 SÃc ký đã UV-Vis cąa lutein 97

Hình 3.33 Phå 1H-NMR cąa lutein 98

Hình 3.34 Phå 13C-NMR cąa lutein 98

Hình 3.35 Phå HSQC và phå HMBC cąa lutein 99

Hình 3.36 CÃu trúc hóa hãc cąa lutein 100

Hình 3.37 SÃc ký đã HPLC cąa dung môi 100

Hình 3.38 SÃc ký đã HPLC cąa phân đo¿n LZ5-11 101

Hình 3.39 SÃc ký đã HPLC cąa chÃt chuÇn lutein đái chćng 101

Hình 3.40 SÃc ký đã HPLC cąa chÃt chuÇn lutein tinh chÁ 101

Hình 3.41 SÃc ký đã LC-MS cąa chÃt chuÇn lutein tinh chÁ 102

Hình 3.42 Hình Ánh chÃt chuÇn zeaxanthin đã tinh chÁ 103

Hình 3.43 CÃu trúc hóa hãc cąa zeaxanthin 103

Hình 3.44 Phå 1H-NMR cąa zeaxanthin 104

Hình 3.45 Phå 13C-NMR cąa zeaxanthin 104

Hình 3.46 Phå HSQC và phå HMBC cąa zeaxanthin 105

Hình 3.47 SÃc ký đã HPLC cąa phân đo¿n zeaxanthin LZ14-15 105

Hình 3.48 SÃc ký đã HPLC cąa phân đo¿n zeaxanthin Z14.3 106

Hình 3.49 SÃc ký đã HPLC cąa phân đo¿n zeaxanthin ZD2 106

Hình 3.50 SÃc ký đã HPLC cąa chÃt chuÇn zeaxanthin tinh chÁ 106

Hình 3.51 SÃc ký đã LC-MS cąa chÃt chuÇn zeaxanthin tinh chÁ 107

Hình 3.52 Ành h°çng cąa đißu kiån bÁo quÁn đÁn chÃt l°āng lutein 108

Hình 3.53 KÁt quÁ kiám nghiåm đá ån đánh cąa lutein 109

Hình 3 54 Hình Ánh đ¿i thá gan, lách, thÁn chuát thí nghiåm 116

Hình 3 55 Hình Ánh vi thá gan, lách, thÁn chuát nghiên cću 117

Hình 3 56 Biáu diãn đ°ång đãng mćc cąa các yÁu tá 127

Hình 3 57 Các sÁn phÇm vi nhj t°¢ng lutein 129

Mä ĐÀU

Lutein (C40H56O2) và zeaxanthin (C40H56O2) là mát trong nhčng chÃt màu tď nhiên (mã sá: E161b) đã đ°āc Căc quÁn lý Thďc phÇm và D°āc phÇm (FDA) ç Canada, Úc, New Zealand và Bá Y tÁ Viåt Nam công nhÁn là an toàn và cho phép sċ dăng trong công nghiåp thďc phÇm, mĩ phÇm, d°āc phÇm Đây là mát lo¿i sÃc tá carotenoit có màu vàng - cam th°ång có trong nhißu loài thďc vÁt, đặc biåt là có trong cánh hoa Cúc v¿n thã (Tagetes erecta L.) vãi hàm l°āng khá lãn

Lutein là ho¿t chÃt có ho¿t tính bÁo vå mÃt và da khßi tác h¿i cąa bćc x¿ khÁ kiÁn có năng l°āng cao, ngăn ngĉa mát sá bånh vß mÃt ç ng°åi cao tuåi (thoái hóa điám vàng, đăc thąy tinh thá), giÁm nguy c¢ mÃc chćng x¢ vča đáng m¿ch và mát sá bånh ung th°, cÁi thiån khÁ năng nhÁn thćc, năng lďc ngôn ngč và trí nhã ç ng°åi cao tuåi Do ánh sáng tÁp trung chą yÁu ç điám vàng nên đây là n¢i dã bá tån th°¢ng nhÃt Lutein và zeaxanthin, vãi chćc năng cháng oxy hóa, đã giúp bÁo vå sď toàn vẹn cąa điám vàng ç mÃt Thoái hóa điám vàng là bånh gây mù lòa và không đißu trá đ°āc, nh°ng có thá phòng bånh hiåu quÁ bằng mát chÁ đá dinh d°ÿng giàu lutein và zeaxanthin C¢ thá con ng°åi không thá tď tång hāp đ°āc lutein và zeaxanthin, do đó viåc bå sung các sÁn phÇm chća lutein và zeaxanthin là cÅn thiÁt

Lutein và zeaxanthin cjng có nhißu trong vi tÁo; trong nhißu lo¿i thďc phÇm nh° lá đinh lăng, quÁ gÃc, cÁi xoăn, rau bina, nh°ng hÅu hÁt các sÁn phÇm lutein và zeaxanthin trên thÁ giãi đßu đ°āc chiÁt xuÃt tĉ nguãn nguyên liåu cánh hoa Cúc v¿n thã

(Tageles erecta L.) Xu h°ãng thÁ giãi cjng nh° t¿i Viåt Nam đang tìm kiÁm và sċ dăng các hāp chÃt phòng ngĉa và chča trá các bånh có nguãn gác thiên nhiên Lutein và zeaxanthin chiÁt tách tĉ cánh hoa Cúc v¿n thã (Tageles erecta L.) là sÁn phÇm hāp chÃt

thiên nhiên có ho¿t tính sinh hãc và d°āc lý cao

Mặc dù lutein và zeaxanthin có d°āc tính cao nh°ng kích th°ãc phân tċ lãn và khó tan trong n°ãc nên khó hÃp thă khi đ°a hai chÃt này vào trong c¢ thá Mát giÁi pháp khÃc phăc nh°āc điám đó là giÁm kích th°ãc phân tċ các ho¿t chÃt đÁn kích cÿ nano đá tăng khÁ năng hÃp thă cjng nh° tăng ho¿t tính sinh hãc cąa lutein và zeaxanthin

Viåc nghiên cću tách chiÁt và tinh chÁ lutein và zeaxanthin ç Viåt Nam cho măc đích d°āc dăng ch°a đ°āc quan tâm nghiên cću Nguãn nguyên liåu ho¿t chÃt này chą

yÁu là do nhÁp khÇu tĉ các n°ãc khác GÅn đây, có mát sá công trình nghiên cću trián khai liên quan tãi viåc chiÁt xuÃt cao chiÁt giàu lutein và zeaxanthin tĉ hoa Cúc v¿n thã ç Viåt Nam đá bào chÁ thďc phÇm chćc năng Tuy nhiên, ch°a có công trình nào liên quan tãi viåc sÁn xuÃt chÁ phÇm lutein và zeaxanthin đ¿t tiêu chuÇn d°āc đián Mĩ tĉ hoa Cúc v¿n thã H°ãng nghiên cću t¿o hå phân tán nano cąa lutein và zeaxanthin v¿n còn mãi

Măc tiêu cąa luÁn án là nghiên cću chiÁt tách, tinh chÁ lutein và zeaxanthin tĉ cây Cúc v¿n thã mát cách có hå tháng đá thu đ°āc sÁn phÇm đ¿t tiêu chuÇn d°āc đián Mĩ và bào chÁ ra hå phân tán kích th°ãc nano cąa lutein, zeaxanthin nhằm đánh h°ãng cho các h°ãng ćng dăng trong d°āc phÇm ç Viåt Nam Hy vãng kÁt quÁ nghiên cću đ¿t đ°āc trong luÁn án s¿ là c¢ sç cho nhčng nghiên cću sâu h¢n, ráng h¢n cąa nhčng đß

tài liên quan đÁn ćng dăng cąa lutein và zeaxanthin

Nái dung nghiên cću cąa luÁn án là: (1) lďa chãn nguyên liåu và ph°¢ng pháp s¢ chÁ, bÁo quÁn nguyên liåu Cúc v¿n thã; (2) tinh chÁ đ°āc lutein đ¿t tiêu chuÇn d°āc đián Mĩ đá nâng cao giá trá khoa hãc cjng nh° giá trá thďc tiãn cąa sÁn phÇm lutein; (3) phân lÁp đ°āc lutein và zeaxanthin có đá tinh khiÁt cao nhằm chą đáng chÃt chuÇn phân tích trong các phòng thí nghiåm, khÃc phăc tình tr¿ng khan hiÁm chÃt chuÇn lutein, zeaxanthin t¿i Viåt Nam; (4) đánh giá đác tính cÃp, đác tính bán tr°ång diãn và đá ån đánh cąa lutein; (5) bào chÁ đ°āc lutein <tan= có tính ån đánh cao nhằm tăng sinh khÁ dăng cąa lutein qua đ°ång uáng.

CH¯¡NG 1: TàNG QUAN 1.1 LUTEIN VÀ ZEAXANTHIN

Lutein có công thćc phân tċ C40H56O2 là mát lo¿i ho¿t chÃt carotenoit, cÃu trúc m¿ch cacbon C40 gãm 8 đ¢n vá isoprene chća 2 vòng 6 c¿nh ç mßi đÅu phân tċ và m¿ch chính polyen gãm nhißu nái đôi liên hāp, t¿o ra nhißu đãng phân khác nhau, đãng thåi vãi 2 nhóm ho¿t đáng hidroxyl gÃn ç 2 đÅu t¿o tính năng oxy hóa cho phân tċ (hình 1.1) Lutein trong tď nhiên th°ång tãn t¿i ç cÃu

hình all-trans [1] Lutein là sÁn phÇm sau khi thąy phân cao chiÁt cánh hoa Cúc v¿n thã

(Tagetes erecta L.) [2, 3] Cao chiÁt sau khi thąy phân chća khoÁng 80,0 % carotenoit,

trong đó có h¢n 74,0 % lutein và ít h¢n 8,5% zeaxanthin (hình 1.1), mát đãng phân th°ång đi cùng vãi lutein [4, 5] BÁng 1.1 trình bày công thćc phân tċ, tên gãi, các tính chÃt vÁt lý c¢ bÁn cąa lutein và đãng phân zeaxanthin

Zeaxanthin

Hình 1.1 C¿u trúc căa lutein và zeaxanthin

Lutein và zeaxanthin là hai đãng phân, chß khác nhau ç vá trí cąa mát liên kÁt đôi và cÃu hình tuyåt đái cąa mát nhóm hydroxyl Trong quá trình chiÁt tách, tinh chÁ, hai hāp chÃt này luôn đi cùng vãi nhau Lutein và zeaxanthin có cùng vai trò sinh hãc nên d¿ng hßn hāp này không làm giÁm ho¿t tính cąa sÁn phÇm Hàm l°āng ho¿t chÃt cąa sÁn phÇm đ°āc hiáu là hàm l°āng tång cąa hai hāp chÃt Trên thďc tÁ, hßn hāp này có thá đ°āc gãi tên theo ho¿t chÃt chiÁm tỷ lå lãn là lutein hoặc gãi là lutein và zeaxanthin Trong khuôn khå cąa luÁn án, thuÁt ngč lutein đ°āc sċ dăng thay cho hßn hāp lutein và zeaxanthin

BÁng 1.1 Công thąc phân tÿ và tính ch¿t vÁt lý căa lutein và zeaxanthin Lutein

Công thćc phân tċ C40H56O2Khái l°āng phân tċ 568,87 g/mol

Khái l°āng phân tċ 568,87 (g/mol)

(1R,1'R)-4,4'-[(1E,3E,5E,7E,9E,11E,13E,15E,17E)-octadecanonaen-1,18-diyl]bis(3,5,5-trimethyl-3-cyclohexen-1-ol)

Phân tċ lutein có 10 nái đôi liên hāp nên hÃp thă m¿nh tia tċ ngo¿i và ánh sáng xanh (hÃp thă cďc đ¿i ç 445 nm và 473 nm), do đó lutein ç d¿ng bát có màu đß cam và ç d¿ng dung dách có màu vàng cam So vãi zeaxanthin (có 11 nái đôi liên hāp), các cďc đ¿i hÃp thă (¼ ąa lutein thÃp h¢n khoÁng 4 - 6 nm [4, 6]

Lutein rÃt nh¿y vãi axit và chÃt oxy hóa nh°ng l¿i bßn včng vãi kißm Vãi cÃu trúc phân tċ chća chußi polyen liên hāp và nhóm hydroxyl ç hai đÅu phân tċ, lutein dã bá oxy hóa bçi oxy không khí, phÁn ćng vãi các tác nhân axit, bá phân hąy bçi ánh sáng, bá đãng phân hóa tĉ d¿ng all-trans thành d¿ng cis d°ãi tác dăng cąa nhiåt, d¿n đÁn sď giÁm ho¿t tính cąa lutein [7, 8, 9] Vì vÁy, trong quá trình tiÁn hành nghiên cću, lutein phÁi đ°āc h¿n chÁ tiÁp xúc vãi ánh sáng, nhiåt đá cao, & đá tránh làm phân hąy lutein Trong các mô đáng - thďc vÁt lutein có khÁ năng liên kÁt vãi các axit béo, lipit, lipoprotein t¿o thành các cÃu trúc bßn včng h¢n so vãi d¿ng lutein tď do

1.1.1 Ngußn gác lutein trong tă nhiên

BÁng 1.2 Hàm l°ÿng lutein trong mßt sá loài thăc vÁt

Nhißu nhà nghiên cću đã cá gÃng thiÁt lÁp c¢ sç dč liåu cąa carotenoit bao gãm lutein trong các lo¿i rau, trái cây Nhčng dč liåu này giúp ích cho viåc °ãc tính các chÁ

đá ăn uáng chća lutein, cung cÃp c¢ sç cho các nghiên cću dách tã hãc vß mái liên hå giča l°āng lutein và nguy c¢ các bånh mãn tính [18-22] Mát sá nguãn lutein đ°āc đ°a ra trong bÁng 1.2 Hàm l°āng lutein khác nhau tùy thuác vào tĉng loài, bá phÁn thu ho¿ch, môi tr°ång cây phát trián, đißu kiån bÁo quÁn và ph°¢ng pháp xċ lý, nghiên cću [23-28]

1.1.2 Ho¿t tính căa lutein

1.1.2.1 Ho¿t tính của lutein đối với chức năng của mắt

Lutein và zeaxanthin là hai carotenoit duy nhÃt có trong võng m¿c cąa mÃt, còn các carotenoit khác thì chß có chća trong huyÁt t°¢ng và trong các tå chćc khác cąa c¢ thá Lutein và zeaxanthin có vai trò t¿o nên màu vàng cąa điám vàng võng m¿c, là n¢i thu nhÁn các tín hiåu ánh sáng và giúp chúng ta nhìn thÃy đ°āc mãi vÁt thá [42] Mát sá thċ nghiåm in vitro, trên mô hình đáng vÁt, thċ nghiåm lâm sàng hoặc các nghiên cću

dách tã hãc đã đ°āc tiÁn hành đá đánh giá hiåu quÁ tißm năng bÁo vå cąa lutein cháng l¿i tån th°¢ng thÅn kinh võng m¿c, thoái hóa điám vàng liên quan đÁn tuåi, đăc thąy tinh thá v.v& [43-47] Ho¿t tính nåi bÁt nhÃt cąa lutein là khÁ năng bÁo vå mÃt khßi thoái hóa điám vàng liên quan đÁn tuåi tác và tác đáng cąa tia UV Hiåu quÁ cąa viåc bå sung lutein và zeaxanthin đã đ°āc chćng minh lâm sàng cho thÃy lutein và zeaxanthin đóng vai trò làm bá lãc ánh sáng có b°ãc sóng ngÃn, ngăn ngĉa và làm giÁm các gác tď do trong tÁ bào biáu mô sÃc tá võng m¿c và vành m¿ch, do đó có lāi cho chćc năng thá giác Các nghiên cću chß ra rằng bå sung 10 mg lutein và 2 mg zeaxanthin (không có β-

caroten) hàng ngày trong thåi gian 5 năm có thá giÁm 10-25% nguy c¢ tiÁn trián bånh thoái hóa điám vàng [48, 49]

1.1.2.2 Ho¿t tính chống oxy hóa và bắt giữ gốc tự do

Mát sá nghiên cću in vitro [49-52] đã xác nhÁn rằng lutein là mát chÃt bÃt gič gác

tď do hiåu quÁ tĉ hidro peoxit (H2O2), anion supeoxit và các gác tď do khác, chẳng h¿n nh° gác tď do hidroxyl, gác tď do lipit, gác tď do 1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl, cation và 2,2-azinobis-3 etylbenzothiazoline-6-sulfonic Lutein cjng đ°āc xác đánh là mát tác nhân bÁo vå quan trãng cung cÃp khÁ năng cháng oxy hóa, ngăn ngĉa sď tån th°¢ng màng tÁ bào, ćc chÁ ho¿t đáng cąa peoxit hóa lipit và phÁn ćng Fenton [30] KhÁ năng quét gác tď do cąa lutein phă thuác vào nãng đá lutein [52] Nãng đá lutein ćc chÁ hiåu quÁ 50% (IC50) lÅn l°āt có giá trá là 7,54; 3,54 mg/mL đái vãi các gác tď do 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl; 2,2-azobis-3-etylbenzothiazolin-6-sulphonic Lutein có thá quét gác peoxinitrit, gác nit¢ dioxit và có thá bÁo vå DNA, protein và lipoprotein

1.1.2.3 Ho¿t tính chống ung thư

Thċ nghiåm in vitro [52] cho thÃy lutein có ho¿t tính ćc chÁ tÁ bào ung th° gan ng°åi Hep3B trong giai đo¿n G (0)/G (1) cąa chu kỳ tÁ bào và gây ho¿i tċ tÁ bào hoặc apoptosis Thċ nghiåm trên mô hình chuát Wistar cho thÃy lutein có khÁ năng ćc chÁ

ung th° gan gây ra bçi dietyl nitro amin Lutein chiÁt tách tĉ vi tÁo Chlorella vulgaris [53] thá hiån ho¿t tính kháng tÁ bào ung th° ruát kÁt HCT116 vãi giá trá IC50 là 40,31±4,43 mg/mL Thċ nghiåm trên mô hình chuát đang đißu trá dimetyl hidrazin đã chćng minh lutein có khÁ năng cháng l¿i ung th° ruát kÁt thông qua đißu tiÁt các ho¿t đáng tăng sinh cąa K-ras, protein kinaza B và protein β-catenin trong các khái u Các kÁt quÁ thċ nghiåm lâm sàng gāi ý rằng mát chÁ đá ăn uáng giàu lutein cùng vãi carotenoit khác có thá làm giÁm nguy c¢ cąa nhißu lo¿i ung th° nh° ung th° tuyÁn tißn liåt, ung th° buãng trćng biáu mô, ung th° nái m¿c tċ cung và ung th° cå tċ cung hoặc ung th° vú [54-59]

1.1.2.4 Các ho¿t tính khác

BÁng 1.3 đÁn bÁng 1.6 giãi thiåu tóm tÃt các chćc năng sinh hãc đã đ°āc chćng minh khác cąa lutein nh°: đißu trá bånh tiáu đ°ång và các bånh liên quan; cháng viêm và kháng sinh; bÁo vå tim m¿ch

BÁng 1.3 Hiáu quÁ căa lutein đái vái bánh tiểu đ°ãng và các bánh khác

[60] Streptozotocin gây tiáu

Ngăn chặn áp lďc oxy hóa, ćc chÁ ho¿t tính cąa

Bånh nhân không tăng sinh võng m¿c tiáu đ°ång

CÁi thiån thá lďc, tăng đá nh¿y cÁm t°¢ng phÁn,

Streptozotocin gây ra tiáu đ°ång C57BL/6 chuát

Ngăn chặn sď oxy hóa căc bá trong võng m¿c bånh nhân đái tháo đ°ång

Ngăn chặn suy giÁm đá dày cąa plexiform bên trong lãp h¿t nhân và sá l°āng tÁ bào h¿ch

[63]

BÁng 1.4 Ho¿t tính kháng viêm căa lutein

Lipopolysacarit (LPS) - kích thích dòng tÁ bào đ¿i thďc bào chuát RAW 264,7

GiÁm biáu hiån cąa các enzym tång hāp

oxit nit¢ ç cÁ mćc đá mRNA và protein [64] LPS - liên quan đÁn đ¿i thďc

bào

Ćc chÁ sď ho¿t hóa cąa NF-kB và tăng ho¿t

Đãng d¿ng că thá cąa polymeaza DNA đáng vÁt có vú

Ćc chÁ polymeaza DNA β và ¼ cąa đáng

Ćc chÁ sď bài tiÁt cąa HBsAg, ćc chÁ ho¿t

đáng cąa HBV, ćc chÁ sao chép HBV [68] Mát nhóm gãm 279 c° dân

Hawaii

GiÁm nguy c¢ nhiãm virus u nhú ç ng°åi

BÁng 1.6 Tác dāng bÁo vá căa lutein về bánh tim m¿ch

Nhóm 63257 đàn ông và phă

Đáng m¿ch chą cąa lān Guinea

Ngăn ngĉa tích tă cholesterol, giÁm oxy

hóa LDL và các cytokine viêm nhiãm [71]

1.1.3 Ąng dāng căa lutein

1.1.3.1 Trong dược phẩm

Lutein có tác dăng cháng oxy hóa, hÃp thă gác tď do và tia tċ ngo¿i, làm giÁm nguy c¢ x¢ vča đáng m¿ch, giúp duy trì sćc khße tim m¿ch, ngăn ngĉa ung th° [72] Lutein là carotenoit chą yÁu ç điám vàng, giúp cÁi thiån khÁ năng truyßn tin qua khe kÁt nái trong võng m¿c, cÅn thiÁt cho quá trình xċ lý hình Ánh và sď phát trián cąa thÅn kinh thá giác [73] Lutein chiÁm đÁn 66 – 77 % l°āng carotenoit hình thành não bá cąa ng°åi, có chćc năng quan trãng trong viåc phát trián và kích thích khÁ năng hãc hßi, sď hình thành cÁm xúc và ghi nhã cąa trẻ em, cÁi thiån tình tr¿ng suy giÁm chćc năng nhÁn thćc ç ng°åi cao tuåi [74] Lutein đã đ°āc đ°a vào sča cho bé, thuác bå cho ng°åi cao tuåi

Lutein có tác dăng làm giÁm nguy c¢ mÃc bånh tim m¿ch, ngăn ngĉa mát sá d¿ng ung th° (nh° ung th° vú, cå tċ cung, &) do khÁ năng cháng oxy hoá khá tát Phă nč có nãng đá lutein trong máu ç mćc cao thì khÁ năng ung th° vú giÁm 88 % [75]

Lutein là chÃt ćc chÁ sď tÃc ngh¿n m¿ch máu, viêm khãp, giÁm đau viêm x°¢ng khãp và tàn tÁt ç 16 triåu ng°åi Mỹ [76] Viån Y hãc Quác gia Hoa Kỳ đã phát hiån ra nhčng ng°åi có nãng đá lutein trong máu cao (khoÁng 70%) ít có khÁ năng bá viêm khãp đÅu gái và các mô liên kÁt khác

Lutein làm giÁm các rái lo¿n mÃt nh° thoái hóa điám vàng, đăc thąy tinh thá, bånh võng m¿c, æ ng°åi, lutein tÁp trung ç điám vàng cąa mÃt, da, vú và mô cå tċ cung Lutein đ°āc coi là mát vi chÃt dinh d°ÿng cÅn thiÁt cho thá lďc bình th°ång [77, 78] và đ°āc sċ dăng chą yÁu trong các sÁn phÇm chăm sóc mÃt nhằm giÁm måt mßi thá giác, giÁm tỷ lå mÃc các bånh vß mÃt

1.1.3.2 Trong thực phẩm

Lutein đ°āc phép sċ dăng làm chÃt màu trong chÁ biÁn thďc phÇm (mã sá E161b) Lutein ç d¿ng chÁ phÇm hòa tan trong n°ãc đ°āc sċ dăng đá nhuám vß ngoài cho giò chÁ, các bán thành phÇm tĉ thát gà, sča chua, bánh n°ãng, kẹo, n°ãc giÁi khát, n°ãc ép trái cây, ngj các điám tâm, các sÁn phÇm tĉ sča, trćng, thďc phÇm cho trẻ s¢ sinh và trẻ mãi biÁt đi, chÃt béo, dÅu, n°ãc thát, n°ãc sát và súp hßn hāp [79] Theo quy đánh cąa EU, Canada, Úc, New Zealand, & lutein có thá đ°āc sċ dăng vãi mćc 0,5 - 2 mg/ngày [80]

1.2.3.3 Trong mỹ phẩm

Lutein đ°āc sċ dăng đá cháng nÁp nhăn và bÁo vå da khßi tác h¿i cąa tia cďc tím Lutein và lutein este dã dàng thâm nhÁp vào da và cho hiåu quÁ cháng nÃng tát [81] Mát sá chÁ phÇm kem cháng nÃng công thćc thÁo d°āc chća lutein este chiÁt suÃt tĉ

Tagetes erecta L đã đ°āc sÁn xuÃt [82]

1.1.3.4 Trong chăn nuôi

Lutein đ°āc dùng đá làm chÃt phă gia trong chÁ biÁn thćc ăn nuôi cá cÁnh, thćc ăn cho gia súc và gia cÅm đá t¿o màu vàng cho da gà và lòng đß trćng, &

băi, gieo h¿t hay nhân giáng bằng chãi; ngãn cây trãng bằng chãi mÅm th°ång nhß, không cao và mau ra hoa Cây CVT không kén đÃt trãng, thích hāp nhÃt là đÃt thát nhẹ, nh°ng nÁu là đÃt cát pha, đÃt sét pha, đÃt có l¿n sßi đá, v.v& cây hoa này v¿n sáng đ°āc Đißu đòi hßi là đÃt phÁi cao ráo, đą Çm và không úng n°ãc ĐÃt nhiãm phèn và nhiãm mặn cjng không trãng đ°āc CVT

Trên thÁ giãi, CVT chia ra làm ba loài nguyên và loài lai sau đây [83]:

Marigold) Tên khoa hãc là Tagetes erecta L., tiÁng Anh gãi là African Marigold Đây

th°ång là giáng v¿n thã cây cao nhÃt và hoa cjng to nhÃt Đáng ká nhÃt hiån nay là loài hoa kép, to, nç tròn xoe không chãi gãi là Ánh Nguyåt (Moonlight), cây cao chĉng 40 cm và mãc dày khít nhau Trå hoa sãm nh° là các giáng v¿n thã lai Cây làm bãn cÁnh hay cÃt cành cÃm hoa rÃt đẹp

Cúc v¿n thã Châu Phi cjng có hoa kép to và cây cao khoÁng 50-70 cm, h¿t đem gieo th°ång cho nhißu hoa màu sÃc khác nhau, l¿n lán tĉ cam đÁn vàng, vàng kim, vàng chanh, vàng b¢ Tên gãi chung là Gold-n Vanilla, th°ång đ°āc trãng trong chÁu cÁnh hay bãn hoa đá trang trí Các loài khác cąa giáng này đáng ká ra là Tuåi Vàng (Golden Age), cây cao h¢n 75 cm và Doublon, cây cao đÁn 1,50 m và hoa rÃt to, có đ°ång kính 12,5 cm

Loài Cúc v¿n thọ Pháp [84] Tên khoa hãc là Tagetes patula L., tiÁng Anh gãi

là French Marigold Loài này th°ång hÃp d¿n h¢n loài cúc ç châu Phi, hoa cjng nhß h¢n Hoa có đą màu, đą kiáu, dân chúng Âu Mĩ th°ång trãng giáng hoa đ¢n, mát lãp cánh hoa dài, có cãi Giáng Oai Vå (Majestic) cao khoÁng 30 cm, hoa vàng đ¢n, cánh sãc nâu hay sãc màu gõ đß, cãi vàng Loài Janie cao chĉng 20 cm hoa có ba màu đ°āc °a thích là vàng, đß lċa và vàng kim, nh°ng cjng còn có màu gß đß, màu cam đÁm, màu quýt tißu đß son, hay l¿n lán nhißu màu Loài lùn Naughty Marietta, chß cao 25 cm, hoa đ¢n, cánh bên trong điám vÁt nâu Loài MÃt Cãp (Tiger eyes), cao 30-35 cm là mát V¿n thã l¿ vì l¿ cánh đ¢n đß huyÁt ç vißn bìa ngoài hoa, còn bên trong nç nh° là Cúc vàng cam Loài Nč Hoàng (Queen series) hoa nç tďa hoa trà mi, hÁi đ°ång, cây lùn 25-30 cm, v.v Cùng nh° mãi loài CVT Pháp khác, ç nhčng vùng có khí hÁu nóng, cây có thá cao h¢n 60 cm nh° giáng Kỳ Hoa Sãc Đß (Striped Marvel) thân cao 75 cm, hoa màu sãc đß

Loài Cúc v¿n thọ lá nhỏ Tên khoa hãc là Tagetes tenuifolia Hoa đ¢n cánh, có

cãi và nhß 1-2 cm Loài hay trãng ç Âu Mĩ là StafireMix, lá th¢m mùi chanh b°çi, nhÃt là khi tråi nóng nďc

Loài lai Loài lai Antigua Yellow là loài CVT vàng t°¢i, hoa kép to có đ°ång kính 7-8cm, ç n°ãc ta đ°āc trãng ç làng hoa Gò vÃp Cây mãc khít và cao 30-50 cm Loài lai Inca Hybrid hoa kép có đ°ång kính 10-13 cm, cây cao 50-70 cm cháu nhiåt đá đÁn 39-40 ºC Giáng tam nhiãm lai triploid, thuác nhóm F1 là giáng phái hāp cây lùn cąa V¿n thã Pháp và hoa kép to cąa V¿n thã Châu Phi, cháu đ°āc l¿nh và nóng

Hiån nay, có hai lo¿i CVT đ°āc trãng phå biÁn ç n°ãc ta là CVT Pháp, hay CVT

lùn (Tagetes patula L.) và CVT châu Phi (cjng có tên th°ång gãi là CVT cao; tên khoa hãc là Tagetes erecta L.) CVT Pháp th°ång gãi là CVT có cuáng hoa màu vàng s¿m,

giáng hoa NhÁt, cánh hoa vĉa có màu vàng th¿m l¿i vĉa có màu vàng nh¿t CVT châu Phi, hoa vàng nghå và vàng hoàng yÁn (Tagetes erecta L.) Bên c¿nh viåc ch¢i hoa và trang trí, cây CVT còn đ°āc sċ dăng nh° mát d°āc phÇm chča bånh Lá và hoa đ°āc dùng trong đißu trá các bånh vß đ°ång tiêu hóa, kích thích tuÅn hoàn máu

CVT là loài thďc vÁt rÃt thích hāp vãi các vùng có khí hÁu nhiåt đãi và hiån đang đ°āc trãng nhißu ç Peru, Ân Đá, Mexico, Trung Quác, Thái Lan, đá cung cÃp nguyên liåu cho công nghiåp tách chiÁt, tinh chÁ lutein [83] CVT cjng sinh tr°çng rÃt tát và có thá đ°āc trãng quanh năm ç nhißu đáa ph°¢ng cąa n°ãc ta

Cánh hoa CVT châu Phi (Tagetes erecta L.) là nguãn nguyên liåu lutein tď nhiên lý t°çng cho viåc thu nhÁn lutein este do chća hàm l°āng carotenoit khá cao (khoÁng 1,6 % trãng l°āng khô) và gÅn nh° tinh khiÁt (trên 95 % carotenoit là lutein este, còn l¿i là d¿ng đãng phân zeaxanthin este [85] Ngoài thành phÅn chính là lutein este, zeaxanthin este, hoa CVT còn chća mát l°āng nhß h¢n antheraxanthin, flavoxanthin, cryptoxanthin, β-caroten và khoÁng 11 lo¿i carotenoit khác [86] Do vÁy, cÅn phÁi lo¿i bß các t¿p chÃt trong cánh hoa CVT đá thu đ°āc lutein

1.3 MÞT SÞ PH¯ƠNG PHÁP CHI¾T TÁCH VÀ TINH CH¾ LUTEIN

Thành phÅn chính trong cao chiÁt CVT (oleoresin) là lutein este Lutein este là mát d¿n xuÃt cąa lutein, có mát hoặc nhißu chußi axit béo liên kÁt vãi lutein thông qua các nhóm hidroxyl ç hai đÅu cąa lutein Các este béo trong CVT chą yÁu là lutein

h¢n 80 % là carotenoit tång sá, trong đó lutein chiÁm 70 -78 %, zeaxanthin (2-9 %) và mát sá carotenoit khác Các công bá khoa hãc cjng cho thÃy, cao chiÁt chća sáp (14 %) và axit béo (1 %) [85] nên cÅn phÁi lo¿i các t¿p chÃt này trong quá trình chiÁt tách và tinh chÁ lutein

Hình 1 3 C¿u t¿o phân tÿ căa lutein este [85]

Lutein d°ãi d¿ng este bßn, khi vào c¢ thá con ng°åi chß bá thąy phân mát phÅn thành d¿ng tď do rãi mãi đ°āc hÃp thă vào huyÁt thanh Vì vÁy, đá t¿o ra nhčng chÁ phÇm lutein bå sung cho con ng°åi, sau khi thu đ°āc oleoresin cÅn thąy phân lutein este đá thu đ°āc lutein tď do [87] Nh° vÁy, nguyên tÃc chung đißu chÁ lutein tď do tĉ hoa

CVT (Tagetes erecta L.) là: sơ chế, bÁo quÁn nguyên liệu hoa CVT → tiền xử lý nguyên liệu hoa CVT → chiết xuất cao chiết giàu lutein este bằng (hệ) dung môi thích hợp → thủy phân cao chiết để chuyển lutein este thành lutein tự do → kết tinh, tinh chế → xử lý bÁo quÁn → tinh thể lutein có độ tinh khiết cao

1.3.1 Tiền xÿ lý nguyên liáu hoa Cúc v¿n thá

Tißn xċ lý CVT nhằm măc đích tăng hiåu quÁ chiÁt lutein este, giÁm thåi gian và sá lÅn chiÁt Các tác nhân đ°āc sċ dăng trong quá trình xċ lý th°ång là dung dách kißm loãng hoặc dung dách axit loãng CÁ hai lo¿i tác nhân này đßu có tác dăng bẻ g¿y m¿ch dài cąa xenlulo và lignin có trong bát hoa CVT Đißu này d¿n tãi quá trình chiÁt lutein este sau đó đ°āc diãn ra dã dàng h¢n

Sujith và cáng sď [88] nghiên cću tißn xċ lý hoa CVT t°¢i vãi dung dách NaOH 0,5% (0,125 M, pH 8,5) trong 48 giå t¿i nhiåt đá phòng Tỷ lå cánh hoa/dung dách ngâm 1/1

Bolanos và cáng sď [89] dùng enzym th°¢ng m¿i nãng đá 0,05 (±0,01 %, w/v) và endo-1,4-β-D-glucanaza đá tißn xċ lý CVT Enzym đ°āc trán vãi cánh hoa khô tỷ lå

1:12 (w/v) và gič nhiåt đá khoÁng 28 °C Bát hoa sau khi đ°āc xċ lý vãi enzym đ°āc chiÁt bằng n-hexan vãi tỷ lå 1/6 (w/v) ç nhiåt đá 35 °C trong 15 phút KÁt quÁ cho thÃy

chß mÃt 4 phút chiÁt, 96 % xanthophyll đ°āc thu hãi, trong khi nÁu không xċ lý enzym phÁi mÃt 10 phút và hàm l°āng cao chiÁt cao nhÃt chß 29,3 (±0,1) g

Halagur và cáng sď [90] tißn xċ lý cánh hoa CVT t°¢i bằng NaOH (0,5 %, pH 8,5), axit citric (1 %, pH = 4) và visco enzym (0,2 %, pH = 4,5) Tỷ lå hoa/dung dách tißn xċ lý là 1/1, w/w KÁt quÁ viåc tißn xċ lý m¿u cho thÃy, đá Çm cąa m¿u giÁm tĉ 19 % đái vãi các m¿u không xċ lý, xuáng 6,25; 5,04 và 3,83 % t°¢ng ćng đái vãi các m¿u xċ lý bằng NaOH, axit citric và enzym, d¿n tãi thåi gian sÃy m¿u cjng giÁm tĉ 25h xuáng còn 10h đái vãi các m¿u tißn xċ lý Hiåu quÁ chiÁt màu và khái l°āng cao chiÁt

tăng đáng ká

Ph°¢ng pháp xċ lý nguyên liåu bằng enzym cho hiåu quÁ khá cao nh°ng ph°¢ng pháp xċ lý phćc t¿p, vß ph°¢ng diån kinh tÁ, chi phí tán kém Các ph°¢ng pháp tißn xċ lý đ¢n giÁn h¢n (nh° ą t°¢i, xċ lý bằng kißm, axit), mặc dù cho hiåu suÃt sÁn phÇm thÃp h¢n, nh°ng xét vß khía c¿nh thďc tiãn, có thá áp dăng hiåu quÁ h¢n Do vÁy, ba lo¿i tác nhân tißn xċ lý là NaOH, H2SO4 và axit citric đ°āc khÁo sát, đánh giá trong luÁn án này

1.3.2 Các ph°¢ng pháp chi¿t tách lutein este

1.3.2.1 Chiết bằng dung môi thông thường

Levy [91] ngâm bát hoa CVT khô trong dung môi hexan (8/ l, L/kg) ç nhiåt đá phòng Tách lÃy dách chiÁt, cô đuåi dung môi đá thu cao chiÁt chća lutein este Thêm isopropanol vào cao chiÁt ç nhiåt đá phòng đá lo¿i bß các t¿p chÃt không thuác nhóm xanthophyll SÁn phÇm sau đó đ°āc cô quay chân không đá lo¿i bß isopropanol KÁt quÁ

thu đ°āc cao chiÁt chća 69% lutein este trong đó tỷ lå đãng phân trans-lutein/cis-lutein

là 90/10

Boonnoun và cáng sď [92] chiÁt bát cánh hoa CVT vãi quy trình nh° sau: 100 g bát hoa CVT khô đ°āc chiÁt vãi 500 mL n-hexan trong bình 1 L, trong 4 giå ç 40 °C Sau khi chiÁt, hßn hāp đ°āc đá yên 20 phút cho kÁt tąa lÃng xuáng Keo tąa đ°āc lo¿i bß, thành phÅn carotenoit trong dách n-hexan đ°āc cô quay chân không ç 40 °C Cao

chiÁt đ°āc làm khô triåt đá bằng sÃy chân không t¿i 30°C trong 8 giå, bÁo quÁn cao chiÁt ç -20 °C

Nhóm nghiên cću cąa Vechpanich & Shotipruk [93] chiÁt 10 mẻ bát hoa CVT,

mßi mẻ 100 g nguyên liåu Vãi mßi mẻ, sċ dăng 500 mL n-hexan chiÁt ç 40 °C trong 4

chiÁt tiÁp tăc đ°āc làm khô 2 giå trong tą hút chân không (30 °C) KÁt quÁ mßi 100 g bát hoa CVT thu đ°āc 10 g cao chiÁt khô

Wang và các cáng sď [94] chiÁt 24 kg bát hoa CVT 4 lÅn vãi n-hexan theo tỷ lå 1:4 (w/v) Gom dách chiÁt, thu hãi dung môi bằng cô quay chân không ç 40 °C KÁt quÁ đ°āc 772 g cao chiÁt, chiÁm 3,2 % nguyên liåu

Sáng chÁ US 8425948 B2 [95] đ°a ra mát ph°¢ng pháp chiÁt lutein este kÁt hāp vãi thąy phân cao chiÁt Bát hoa CVT (100 g) đ°āc đãng nhÃt trong hßn hāp 1000 mL tetrahidrofuran (THF) và 250 mL etanol chća KOH 10 % ç nhiåt đá phòng Đá pH bằng 12 đ°āc duy trì trong suát quá trình chiÁt Sau khoÁng 2 giå, lutein este bá thąy phân hoàn toàn, hßn hāp phÁn ćng đ°āc lãc lÃy cặn rÃn, sau đó hoàn tan trong 1000 mL THF Dách hòa tan đ°āc lãc bß cặn và thu dách lãc, dung môi cąa dách lãc đ°āc lo¿i bß bằng cô quay chân không ç 40 °C Cao chiÁt khô đ°āc hòa vào 700 mL n°ãc và cãn thďc phÇm (tỷ lå 1/1, v/v) trong vòng 10 phút Ly tâm và rċa cặn rÃn 2 lÅn đÁn khi pH bằng 7 ChÃt rÃn đ°āc tiÁp tăc rċa bằng 100 mL etanol, ly tâm, làm khô bằng ph°¢ng pháp sÃy chân không t¿i nhiåt đá phòng KÁt quÁ thu đ°āc 2 g tinh thá lutein màu vàng, vãi hàm l°āng lutein khoÁng 70 %

Hojnik và các đãng sď [96] chiÁt bát CVT khô (< 0,315 mm, đá Çm 5,15 % w/w) trong bình 3 cå vãi dung môi n-hexan; nhiåt đá 40 °C; tỷ lå dung môi/nguyên liåu 5 L/kg; tỷ lå dung dách KOH/nguyên liåu 3,75 L/kg và nãng đá KOH trong etanol là 5 % (w/v) KÁt quÁ, 80 % tång lutein trong nguyên liåu ban đÅu đ°āc chiÁt chß trong thåi gian 4 phút

Ruen-ngam và các đãng sď [97] đã chiÁt lutein este trong vi tÁo Chlorella

sorokiniana MB-1 (hàm l°āng lutein tång khoÁng 5,21 mg/g) Theo đó, THF cho hiåu suÃt thu hãi lutein 87,0 % (20 phút) và 99,5 % (40 phút) t¿i 850 mbar ç 25 °C Dung môi etanol cho hiåu suÃt thu hãi 86,2 % lutein este ç 450 mbar, 35 °C trong 40 phút Lutein sau khi chiÁt đ°āc ån đánh trong dÅu olive hoặc dÅu h°ãng d°¢ng vãi chu kỳ bán hąy 53,1 và 63,8 ngày

Sáng chÁ US 8425984 B2 cąa Sethuraman [98] chiÁt tách zeaxanthin tĉ quÁ câu kỷ tċ nh° sau: 455,5 g quÁ câu kỷ tċ đ°āc cho vào trong n°ãc (1000 mL), ngâm qua đêm t¿i nhiåt đá phòng Dách chiÁt tách bằng ph°¢ng pháp g¿n lãc Sau đó đãng nhÃt vãi hßn hāp dung môi chća 2000 mL THF và 250 mL etanol KOH 10 % Dung dách đ°āc duy trì ç pH 12 Sau 2 giå, zeaxanthin este bá thąy phân hoàn toàn ChÃt rÃn đ°āc rċa vãi THF 500 mL Dung môi đ°āc bay h¢i d°ãi áp suÃt giÁm ç 40 °C Cặn sau đó

đ°āc hòa vào 100 mL hßn hāp n°ãc/etanol (tỷ lå 1/1, v/v) trong 10 phút TiÁp theo là ly tâm đá lo¿i bß phÅn dung môi, thu lÃy chÃt rÃn Rċa chÃt rÃn 2 lÅn cho đÁn khi pH bằng 7 Rċa lÅn cuái bằng 30 mL etanol, thu đ°āc tinh thá zeaxanthin (0,48 g, 75 %)

1.3.2.2 Chiết siêu tới h¿n

Các nghiên cću ćng dăng ph°¢ng pháp chiÁt kỹ thuÁt cao cjng đ°āc chú trãng trong nghiên cću chiÁt tách lutein Đián hình là sċ dăng ph°¢ng pháp chiÁt siêu tãi h¿n chiÁt lutein este có đá tinh khiÁt cao

Sujith và các đãng sď [88] chß ra rằng chiÁt siêu tãi h¿n lutein este tĉ bát hoa CVT cho hiåu quÁ tát h¢n rÃt nhißu so vãi cách chiÁt bằng dung môi thông th°ång Thąy phân lutein este cho thÃy hàm l°āng carotenoit đ¿t 88 % và lutein đ¿t 90,7 % Quá trình thąy phân lutein este sċ dăng xúc tác lipaza ç 50°C; pH = 7; nãng đá enzym xúc tác 0,33 Enzym mÃt ho¿t tính khoÁng 25 % sau 8 lÅn sċ dăng t¿i 50 °C trong khoÁng 12 ngày Lutein este đ°āc chiÁt tách tĉ vi tÁo Chlorella vulgaris [97] nh° sau: 10 gam hßn

hāp dung môi và tÁo (35/65, w/w) đ°āc cho vào xylanh 50 mL cąa hå tháng chiÁt siêu tãi h¿n Tác đá dòng dung môi 3 mL/phút Áp suÃt tái °u 40 MPa và duy trì nhiåt đá ç 40 °C Dung môi là sď kÁt hāp giča CO2 siêu tãi h¿n và etanol Hiåu suÃt thu hãi lutein cao nhÃt 52,9 ± 0,02 % và đá chãn lãc 43,1 ± 0,02 %

Lutein este đ°āc chiÁt tĉ Chlorella pyrenoidose [99] bằng ph°¢ng pháp chiÁt

CO2 tãi h¿n kÁt hāp vãi siêu âm ç 27 °C; áp suÃt 21 MPa; dung môi CO2 1,5 mL/g etanol, năng l°āng siêu âm 1000 W KÁt quÁ thu đ°āc hàm l°āng lutein este cao nhÃt là 124,01 mg/100 g nguyên liåu

Trong các công bá trên, chiÁt lutein este bằng ph°¢ng pháp siêu tãi h¿n cho hiåu quÁ chiÁt cao h¢n chiÁt bằng dung môi thông th°ång, nhiåt đá chiÁt thÃp, làm giÁm khÁ năng phân hąy cąa lutein este Tuy nhiên, chiÁt siêu tãi h¿n khó áp dăng cho quy mô lãn h¢n, ngoài phòng thí nghiåm Vì lí do đó, ph°¢ng pháp sċ dăng dung môi thông th°ång đ°āc lďa chãn đá chiÁt lutein este tĉ hoa CVT

n-Hexan và THF là hai dung môi đ°āc các tác giÁ sċ dăng nhißu nhÃt đá chiÁt lutein este, tuy nhiên THF đác và hiåu quÁ chiÁt bằng n-hexan ch°a cao Nhằm tìm kiÁm

dung môi ít đác h¿i và cho hiåu quÁ chiÁt cao đá chiÁt tách lutein este, các dung môi khác nh° metanol, etanol, axeton, n-hexan, etyl axetat đ°āc khÁo sát trong luÁn án này

1.3.3 Các ph°¢ng pháp làm giàu cao chi¿t chąa lutein este

Măc đích cąa quá trình làm giàu cao chiÁt là lo¿i bß các t¿p chÃt nh° chÃt béo, dÅu, muái, epoxit, sáp, & đá thu đ°āc cao chiÁt giàu lutein este

1.3.3.1 Làm giàu bằng nước

Nhóm nghiên cću cąa Suijth [88] làm giàu cao chiÁt bằng n°ãc nh° sau: 18,36 kg cao chiÁt hàm l°āng carotenoit 40,02 g/kg cao chiÁt đ°āc đãng nhÃt vãi 92 L n°ãc ç nhiåt đá 45 °C trong 15 phút Hßn hāp đ°āc đá lÃng và lãc bằng lãc hút chân không Cao chiÁt không tan đ°āc chuyán vào bình chća, lặp l¿i quá trình rċa vãi 92 L n°ãc ç cùng đißu kiån nhiåt đá đá lo¿i bß thành phÅn t¿p tan trong n°ãc Cặn lãc vãi đá Çm khoÁng 8 % đ°āc thêm vào 36 L etanol Hßn hāp đ°āc khuÃy trong khoÁng 10 - 15 phút, sau đó đá lÃng G¿n lãc thu lÃy dách etanol Quá trình trên lặp l¿i 3 lÅn, thu đ°āc 5,24 kg oleoresin vãi hàm l°āng carotenoit tång 124,39 g/kg (12,44 % carotenoit), că thá chća 79,83% trans-lutein, 4,02% trans-zeaxanthin, 0,23% β-carotene, 0,56%

cryptoxanthin, 15,36% cis-isome và epoxit, phân tích bằng HPLC

1.3.3.2 Làm giàu bằng etanol

Kuman và các cáng sď [100] làm giàu cao chiÁt vãi dung môi là etanol Các t¿p chÃt tan trong etanol đ°āc lo¿i bß đá làm giàu cao chiÁt chća lutein este Theo đó, 2,0 kg cao chiÁt hàm l°āng carotenoit 51,28 g/kg ç b°ãc trên đ°āc đãng nhÃt vãi 2L etanol ç nhiåt đá phòng trong 10 phút Hßn hāp đ°āc đá lÃng và tách lãp G¿n lãc, thu lÃy phÅn cao chiÁt không tan Lặp l¿i quá trình thêm 2 lÅn vãi 2L etanol mßi lÅn KÁt quÁ thu đ°āc 0,672 kg cao chiÁt vãi hàm l°āng carotenoit 142,8 g/kg tång (14,28 % carotenoit), că thá chća 73,22 % trans-lutein, 4,90 % trans -zeaxanthin, 1,62 % β-carotene, 0,79 %

cryptoxanthin và 19,38 % cis-isome và epoxit, phân tích bằng HPLC)

Etanol và n°ãc là nhčng dung môi đ°āc các tác giÁ sċ dăng đá làm giàu cao chiÁt Tuy nhiên, etanol và n°ãc đßu là các dung môi phân cďc, trong khi đó, cao chiÁt chą yÁu chća lutein este là hāp chÃt ít phân cďc và các phÅn t¿p chÃt khác nh°: chÃt béo, dÅu, muái, epoxit, sáp, nên nÁu chß dùng mát dung môi đá làm giàu cao chiÁt thì hiåu quÁ làm giàu không cao bằng sċ dăng hå nhißu dung môi và thďc hiån ph°¢ng pháp chiÁt lßng-lßng

1.3.4 Các ph°¢ng pháp thăy phân lutein este

Quá trình thąy phân lutein este tĉ cao chiÁt hoa CVT có thá thďc hiån bằng ph°¢ng pháp hóa hãc hoặc sinh hãc Ph°¢ng pháp hóa hãc sċ dăng tác nhân kißm m¿nh (th°ång

là KOH) trong ancol hču c¢ (th°ång là iso propanol hoặc etanol) đá cÃt đćt liên kÁt este giča các nhóm –OH trong phân tċ lutein vãi các axit béo Ph°¢ng pháp hóa hãc th°ång phÁi tiÁn hành ç nhiåt đá cao nên có thá gây ra sď phân hąy lutein tď do Do đó, mát sá tác giÁ nghiên cću sċ dăng ph°¢ng pháp sinh hãc, trong đó sċ dăng enzym lipaza đá thąy phân lutein este ç nhiåt đá phòng nhằm h¿n chÁ sď phân hąy ho¿t chÃt Tuy nhiên, ph°¢ng pháp này hiån nay ít đ°āc áp dăng ráng rãi do tính ćng dăng không cao [90] Sau đây là mát sá công bá thąy phân lutein este tiêu biáu:

Wang và các cáng sď [94] nghiên cću thąy phân cao chiÁt bằng KOH vãi các b°ãc nh° sau: 772 g cao chiÁt đ°āc hòa tan trong isopropanol (1:1.5, w/v) thêm KOH 15 % (5:3, v/v), khuÃy ç 70 °C trong 6 giå trong môi tr°ång N2 SÁn phÇm thąy phân đ°āc phân tán trong n°ãc (1:3, v/v) và chiÁt lßng - lßng vãi etyl axetat 3 lÅn Gom dách chiÁt etyl axetat đ°āc làm khan vãi Na2SO4 khan sau đó cô quay chân không Cao chiÁt (263,4

g) tái hòa tan trong n-hexan (1:4, w/v) trong bình tam giác, khuÃy ç 40 °C trong thåi

gian 1 giå, sau đó toàn bá bình đ°āc đặt trong thiÁt bá đá (1 giå), cuái cùng đặt hå trong tą l¿nh t¿i 4 °C trong 20 phút đá lo¿i bß axit béo và chlorophyll Quá trình đ°āc lặp l¿i 3 lÅn SÁn phÇm cuái cùng đ°āc cô quay chân không ç 40 °C, qua đêm thu đ°āc 170,2 g lutein khô

Swaminathan và cáng sď [95] tiÁn hành thąy phân cao chiÁt bằng cách cho 1 g cao chiÁt hoa CVT hòa tan trong 2 mL etanol t¿i 75 °C Thêm tĉ tĉ vào hßn hāp mát l°āng dung dách KOH 45 % Hßn hāp đ°āc khuÃy trong 1 phút Sau mßi giå l¿i khuÃy mát lÅn Sau phÁn ćng, hßn hāp phÁn ćng đ°āc h¿ nhiåt đá xuáng 65 °C pH đ°āc đißu chßnh vß 7,0 bằng axit HCl Thêm vào hßn hāp phÁn ćng 50 mL etyl axetat, siêu âm 30 ± 5 °C, trong 15 phút Hßn hāp đá lÃng và tách hai pha Thu lÃy pha trên là pha etyl axetat có màu vàng, giàu lutein tď do Pha d°ãi là xà phòng, n°ãc và muái Thu hãi toàn bá lutein bằng cách chiÁt mát lÅn nča vãi 50 mL etyl axetat kÁt hāp vãi siêu âm SÁn phÇm đ°āc đ°a đi phân tích HPLC KÁt quÁ cho thÃy: Thåi gian thąy phân tái °u là 4 giå, tỷ lå dung dách KOH/cao chiÁt oleoresin là 0,5/1(mL/g), nãng đá KOH tái °u là 40 % (w/v)

Bolanos và cáng sď [89] dùng 200 g cao chiÁt hoa CVT thąy phân trong dung dách KOH (nãng đá 45 %) duy trì ç nhiåt đá tĉ 65 đÁn 70 °C cho đÁn khi trên 98 % lutein este đ°āc chuyán hóa thành lutein tď do Quá trình thąy phân tiÁn hành trong 35 phút

Joseph và cáng sď [102] đã cÁi tiÁn quy trình thąy phân lutein oleoresin bằng dung dách KOH trong n°ãc vãi sď có mặt cąa hßn hāp r°āu béo (ancol lauryl) và axit béo (axit caprylic capric) đá bÁo vå lutein khßi bá oxy hóa ç nhiåt đá cao nh° sau: 10 kg oleoresin đ°āc đun nóng và khuÃy ç 45 °C trong 5-10 phút cho đãng nhÃt Thêm tĉ tĉ 1,95 kg KOH 95 % trong 3 kg n°ãc và 0,86 kg axit caprylic capric, 4,3 kg ancol lauryl,

pháp này tuy không dùng dung môi EtOH và sÁn phÇm carotenoit thu đ°āc có đá tinh khiÁt cao (91,75 % carotenoit tång sá) nh°ng phÁi dùng hßn hāp axit caprylic capric, ancol lauryl và n°ãc vãi l°āng khá lãn, khó có khÁ năng thu hãi, yêu cÅu thiÁt bá phćc t¿p (ly tâm tác đá cao)

Nh° vÁy, đa sá ph°¢ng pháp thąy phân đßu sċ dăng KOH trong ancol Tuy nhiên, không có sď t°¢ng đãng vß đißu kiån thąy phân lutein este Nguyên nhân là do các tác giÁ đã sċ dăng các dung môi khác nhau (n-hexan, ete dÅu mß, etyl axetat, &) đá chiÁt lutein tď do tĉ hßn hāp thąy phân cjng nh° dùng các ph°¢ng pháp và kỹ thuÁt khác nhau (TLC, UV-Vis, HPLC) đá đánh giá hiåu suÃt quá trình thąy phân Vì vÁy, viåc đánh giá l¿i Ánh h°çng cąa đißu kiån thąy phân đÁn hiåu suÃt chuyán hóa lutein este thành lutein tď do, tĉ đó chãn lďa ph°¢ng pháp thích hāp cho viåc thąy phân lutein este là cÅn thiÁt

1.3.5 Ph°¢ng pháp tinh ch¿ lutein

Lutein tď do thu đ°āc sau quá trình thąy phân cao chiÁt hoa CVT có đá tinh khiÁt th°ång đ¿t d°ãi 80 % [89, 94, 95, 103], do vÁy cÅn phÁi kÁt tinh l¿i đá thu đ°āc lutein có đá tinh khiÁt cao

1.3.5.1 Tinh chế bằng hệ dung môi nước/etanol

R Kumar và các cáng sď [104] tinh chÁ lutein bằng cách hòa tan 1,135 gam lutein 89 % trong 760 ml etanol ç nhiåt đá môi tr°ång Theo đó, thu đ°āc 0,5291 g lutein có đá tinh khiÁt 98 % (hiåu suÃt 51,3 %) và 0,2817 g lutein có đá tinh khiÁt 92 % (hiåu suÃt 25,7 %), tång hiåu suÃt thu hãi đ¿t 77 %

Swaminathan [95] tinh chÁ lutein bằng cách cho lutein thô thu đ°āc tĉ quá trình thąy phân hòa tan vào n°ãc, tỷ lå lutein thô (g)/n°ãc (mL) là 1/8, ç 75 °C, đá pH bằng 7,0 Lãc lo¿i bß dung môi, thu lÃy kÁt tąa màu cam TiÁp tăc rċa kÁt tąa mát lÅn nča bằng etanol, tỷ lå lutein thô (g)/etanol (mL) là 1/3, ç 50 °C trong 10 phút KÁt quÁ thu đ°āc lutein có đá tinh khiÁt 90,83 % vãi hiåu suÃt thu hãi đ¿t 76,76 %

Bolanos và cáng sď [89] đ°a ra ph°¢ng pháp tách, tinh chÁ lutein sau quá trình thąy phân cao chiÁt cąa cánh hoa CVT nh° sau: 200 g cặn đ°āc đãng nhÃt trong hßn hāp n°ãc cÃt (700 mL)/etanol (300 mL), t¿i nhiåt đá phòng trong 30 phút Hßn hāp sau đó đ°āc lãc, lo¿i bß dung môi, thu lÃy kÁt tąa màu cam Rċa kÁt tąa bằng n°ãc cÃt cho đÁn khi n°ãc rċa hÁt màu và pH trung tính TiÁp tăc rċa kÁt tąa mát lÅn nča bằng 200

mL etanol và n-hexan l¿nh (0 °C-5 °C) KÁt quÁ thu đ°āc tinh thá lutein có đá tinh khiÁt

trên 70 %

1.3.5.2 Kết tinh l¿i bằng diclometan/hexan

Nhóm nghiên cću cąa Frederick Khachik [105] kÁt tinh l¿i lutein trong hå dung

môi diclometan/n-hexan (1/1, v/v) bằng cách hòa tan lutein 70 % trong 550 ml diclometan chća 1 % trietylamin Thêm tĉ tĉ n-hexan vào hå cho đÁn khi hå trç nên må

đăc, gič ç nhiåt đá tĉ -20 °C đÁn -10 °C trong 3 giå thu đ°āc lutein tinh thá Tinh thá

đ°āc lãc và rċa vãi 200 ml n-hexan (0 °C) Sau đó sÃy chân không ç 50 °C trong 3 ngày

KÁt quÁ đ°āc lutein có đá tinh khiÁt 97 %

1.3.5.3 Tinh chế bằng THF/Nước

Frederick Khachik và các cáng sď [106] tiÁn hành hòa tan 2 g lutein 70 % trong 20 ml tetrahidrofuran (THF) và 30 ml n°ãc cÃt đá tinh chÁ lutein Hßn hāp đ°āc khuÃy ç nhiåt đá phòng 10 phút Dung môi đ°āc lo¿i bß bằng ph°¢ng pháp ly tâm KÁt tąa lutein đ°āc lÃy ra khßi dung dách, tiÁp tăc rċa kÁt tąa bằng 20 ml etanol, ly tâm, sau đó sÃy khô trong chân không t¿i nhiåt đá phòng thu đ°āc 1,2 g lutein đ¿t đá tinh khiÁt 97 %

1.3.5.4 Kết tinh l¿i bằng hexan/axeton (80/20)

Halagur và cáng sď [90] tiÁn hành cho 25,01 g cao chiÁt thô hòa tan trong 100 mL hå dung môi n-hexan/axeton (80/20, v/v) t¿i nhiåt đá phòng 30 phút KÁt tąa cąa tinh

thá lutein đ°āc lãc, rċa vãi metanol Tinh thá màu vàng cam đ°āc sÃy chân không t¿i nhiåt đá phòng 72 giå

1.3.6 K¿t tinh l¿i zeaxanthin

Swaminathan [98] cho zeaxanthin (0,48 g, 75 %) hòa tan trong THF (5 mL) và n°ãc (10 mL) đá kÁt tinh l¿i Hßn hāp đ°āc khuÃy ç nhiåt đá phòng trong 10 phút ChÃt rÃn đ°āc tách ra bằng ly tâm Lo¿i bß dung dách, tinh thá zeaxanthin đ°āc rċa bằng 5 mL etanol Ly tâm và làm khô ç đißu kiån chân không trong khoÁng 8 giå ç nhiåt đá phòng KÁt quÁ thu đ°āc 0,35 g zeaxanthin

Nh° vÁy, sau khi tinh chÁ, đá tinh khiÁt cąa lutein đßu đ°āc tăng lên đáng ká Dung môi đ°āc sċ dăng tinh chÁ lutein th°ång là hå hai dung môi, đißu này có thá đ°āc giÁi thích là do mát sá dung môi đác lÁp có khÁ năng hòa tan tát lutein nh°ng không thá kÁt tinh l¿i lutein bằng ph°¢ng pháp h¿ nhiåt đá hoặc bay h¢i dung môi Trong các hå dung môi đã công bá, hå dung môi etanol/n°ãc có tính an toàn cao nhÃt nh°ng thåi gian tinh

l°āng dung môi ít, không sċ dăng bÃt kì dung môi đác h¿i nào, các nghiên cću xác đánh dung môi và đißu kiån tinh chÁ s¿ đ°āc tiÁn hành khÁo sát trong luÁn án này

1.4 PH¯ƠNG PHÁP PHÂN TÍCH LUTEIN VÀ ZEAXANTHIN

Phân tích lutein và zeaxanthin đ°āc thďc hiån bằng nhißu ph°¢ng pháp khác nhau vãi nhčng đißu kiån khác nhau tùy thuác vào nguãn gác thu nhÁn lutein tĉ nguãn thďc vÁt khác nhau, chÃt l°āng lutein cjng Ánh h°çng đÁn viåc lďa chãn ph°¢ng pháp Ph°¢ng pháp phân tích chą yÁu đ°āc sċ dăng là HPLC, UV-Vis, LC-MS vãi các đißu kiån că thá (bÁng 1.7) Không thá sċ dăng ph°¢ng pháp GC đá phân tích hàm l°āng lutein do lutein là hāp chÃt kém bßn vãi nhiåt

Theo d°āc đián Mĩ thì có hai ph°¢ng pháp chính đá phân tích hàm l°āng lutein và zeaxanthin là UV - Vis và LC [110]

BÁng 1 7 Các ph°¢ng pháp phân tích lutein, zeaxanthin

Beckman, Fullerton, CA)

Dung môi: etanol/diclometan/axetonitril/n°ãc (67,5/22,5/9,5/0,5, v/v)

[98]

BÁng 1 8 Ph°¢ng pháp phân tích lutein, zeaxanthin theo d°ÿc điển Mĩ USP 40 TT Ph°¢ng pháp

phân tích

Điều kián

1 UV-Vis

Xác đánh lutein tång

¼max: 446 nm

Dung môi: n-hexan/axeton/toluen/etanol (10/7/7/6, v/v)

Dung dách gác: 0,3 mg/ml trong dung môi

Dung môi pha đáng: n-hexan/etylaxetat (3/1, v/v)

1.5 MÞT SÞ BIÞN PHÁP C¾I THIÞN SINH KH¾ DĀNG CĂA LUTEIN DÙNG Đ¯ÞNG UÞNG

Nhißu công trình nghiên cću vß d°āc đáng hãc cąa lutein cho thÃy: đá tan thÃp, chuyán hóa m¿nh và thÁi trĉ nhanh là các lý do chính d¿n đÁn sinh khÁ dăng (SKD) cąa lutein thÃp Do đó, các biån pháp cÁi thiån SKD cąa lutein chą yÁu tÁp trung là làm tăng đá tan, giÁm chuyán hóa hoặc sċ dăng chÃt ćc chÁ quá trình chuyán hóa cąa lutein và giÁm thÁi trĉ, kéo dài thåi gian l°u thông trong đ°ång tiêu hóa cąa lutein Đá đ¿t đ°āc măc tiêu này, các công trình nghiên cću đã đß cÁp đÁn các biån pháp làm thay đåi đặc tính vÁt lý cąa d°āc chÃt (DC) nh° giÁm kích th°ãc phân tċ (KTTP) xuáng kích cÿ nanomet (bào chÁ hå nano tinh thá) và t¿o d¿ng bào chÁ trung gian chća lutein nh° hå phân tán rÃn, hå micell, vi nhj t°¢ng, nhj t°¢ng nano, hå tď nhj hóa hoặc d¿ng liên hāp

1.5.1 Bào ch¿ há nano tinh thể

Nano tinh thá d°āc chÃt là tinh thá vãi kích th°ãc d°ãi 1 µm, mang đặc tính cąa tiáu phân nano và tinh thá [111], [112] Tiáu phân nano tinh thá có thá cÁi thiån đá tan và tăng sinh khÁ dăng (SKD) cąa DC Mát sá ph°¢ng pháp bào chÁ nano tinh thá đ°āc trình bày ç bÁng 1.9 [113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120].

BÁng 1 9 Mßt sá ph°¢ng pháp bào ch¿ nano tinh thể

Sċ dăng lďc phân chia là lďc va ch¿m, nén ép, mài mòn và lďc ma sát do t°¢ng tác giča tiáu phân vãi thành buãng nghißn, giča các bi vãi nhau và giča tiáu phân vãi tiáu phân

Đ¢n giÁn, áp dăng đ°āc cho cÁ DC có đá tan thÃp hoặc không tan Tuy nhiên, chi phí thiÁt bá đÃt tißn, dã nhiãm vi sinh vÁt, t¿p tĉ thiÁt bá mài mòn và h¿n chÁ vß kích th°ãc buãng nghißn

Nghiền khô

Sď giÁm KTTP trong quá trình nghißn khô do ma sát, sď cã mòn, va ch¿m và đćt gãy cąa t°¢ng tác tiáu phân vãi tiáu

phân hoặc tiáu phân vãi thiÁt bá

Thåi gian nghißn kéo dài, năng l°āng đÅu vào cao gây nóng thiÁt bá và Ánh h°çng đÁn đá ån đánh cąa DC nh¿y cÁm vãi nhiåt, các viên bi có thá bá mài mòn do va ch¿m vãi thành buãng nghißn t¿o ra t¿p

Nghiền °át

Nghißn °ãt là quá trình giÁm KTTP trong đó tiáu phân rÃn đ°āc phân tán vào môi tr°ång lßng

Đ°āc sċ dăng nhißu h¢n nghißn khô đá tránh tác đáng cąa nhiåt và rút ngÃn thåi gian nghißn, đãng thåi trďc tiÁp t¿o ra d¿ng bào chÁ