cndt2 trần đình thu uyên 21126574 thứ 2 789

Tại Việt Nam, cây trồng biến đổi gen đã được đưa vào thử nghiệm gần 5 năm và đến năm 2015, những sản phẩm được chế biến từ ngô, đậu nành… biến đổi gen sẽ xuất hiện trong siêu thị, chợ và

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

Môn học : Công nghệ di truyền II Giảng viên : TS Phạm Đức Toàn

Sinh viên thực hiện : Trần Đình Thu Uyên MSSV : 21126574

TP Thủ Đức, 06/2024

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

Chương 1: Tổng quan tài liệu 1

Chương 2: Vật liệu và phương pháp 2

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2

2.2.1.Vật liệu và dụng cụ 2

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 2

2.2.2.1 Li trích mẫu DNA thực vật 2

2.2.2.2 Điện di tổng số DNA 4

2.2.2.3 Kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA bằng máy BioDrop 4

2.2.2.4 Khuyến đại DNA bằng PCR 5

2.2.2.5 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR 6

Chương 3: Kết quả và thảo luận 7

3.1 Điện di tổng số DNA mẫu bắp 7

3.1.1 Kết quả 7

3.1.2 Thảo luận 7

3.2 Kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA bằng máy BioDrop 8

3.2.1 Kết quả 8

3.2.2 Thảo luận 9

3.3 Điện di xác định GMO 9

3.3.1 Kết quả 9

3.3.2 Thảo luận 10

Chương 1: Tổng quan tài liệu

GMO (geneticaly modified organism hay sinh vật biến đổi gen) là những sinh vật

mà vật liệu di truyền đã được thay đổi nhân tạo trong phòng thí nghiệm thông qua kỹ thuật di truyền (genetic engineering), gọi tắt là GE Công nghệ khoa học tương đối mới này tạo ra sự kết hợp không ổn định của cây trồng, động vật, vi khuẩn và các gen của virus vốn không xảy ra trong tự nhiên hoặc thông qua các phương pháp lai giống truyền thống Người tiêu dùng còn gặp nhiều khó khăn để luôn cập nhật về nguyên liệu thực phẩm có nguy cơ cao bị biến đổi gen, khi danh sách này thường xuyên thay đổiĐịnh nghĩa về sinh vật biến đổi gen (GMO) không rõ ràng và rất khác nhau giữa các quốc gia,

tổ chức quốc tế và các cộng đồng khác Theo nghĩa rộng nhất, định nghĩa về GMO có thể bao gồm bất kỳ thứ gì đã bị thay đổi gen, kể cả do tự nhiên Ở một góc nhìn ít rộng hơn, nó có thể bao gồm mọi sinh vật đã bị con người thay đổi gen, bao gồm tất cả các loại cây trồng và vật nuôi

Tại Việt Nam, cây trồng biến đổi gen đã được đưa vào thử nghiệm gần 5 năm và đến năm 2015, những sản phẩm được chế biến từ ngô, đậu nành… biến đổi gen sẽ xuất hiện trong siêu thị, chợ và bữa ăn của các gia đình Việt Nam Tuy vậy những loại thực phẩm biến đổi gen đang có mặt hầu hết ở các chợ và siêu thị tại thành phố Hồ Chí Minh Một cuộc khảo sát cho thấy 111 trên 323 mẫu thực phẩm gồm: bắp, đậu nành, khoai tây,

cà chua, đậu Hà lan Chọn ngẫu nhiên ở 17 chợ, siêu thị trên địa bàn thành phố được kiểm nghiệm cho kết quả là sản phẩm biến đổi gen Trong đó có bắp Mỹ, bắp trái non, bắp non đóng hộp, bột bắp, bắp giống có nguồn gốc trong nước và nước ngoài dương tính với promoter 35S hoặc terminator nos – một dạng biến đổi gen

Có nhiều tranh cãi về GMO, đặc biệt là liên quan đến việc chúng được thải ra ngoài môi trường phòng thí nghiệm Nhiều mối quan tâm trong số này liên quan đến cây trồng biến đổi gen và liệu thực phẩm được sản xuất từ chúng có an toàn hay không và tác động của việc trồng chúng đối với môi trường Hầu hết các mối quan tâm xoay quanh việc GMO ảnh hưởng đến sức khỏe và môi trường như thế nào Chúng bao gồm việc gây ra

dị ứng hay không, các gen chuyển đổi có thể chuyển sang tế bào người hay không và liệu các gen không được phép sử dụng cho con người có thể lai xa vào an ninh lương thực hay không

Chương 2: Vật liệu và phương pháp 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Từ ngày 01/06/2024 đến ngày 03/06/2024

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1.Vật liệu và dụng cụ

Đối tượng: Mẫu bắp số 02

Đối với phản ứng PCR cần có: mồi 35S; Master mix, mẫu DNA Đối với điện di mẫu cần có: bồn điện di; micropipette; gel agarsose; gelred; loading dye, và một số hóa chất dùng trong ly trích

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Buổi 1: Tiến hành lý trích DNA từ hạt bắp, điện di tổng số kiểm tra sự có mặt của

DNA trong mẫu và tiến hành đo chất lượng và hàm lượng DNA bằng máy BioDrop

Buổi 2: Tiến hành PCR khuếch đại với vùng trình tự 35S phát hiện thực vật GMO,

điện di kiểm tra sự hiện diện của vùng 35S trên gen chuyển và kích thước

2.2.2.1 Li trích mẫu DNA thực vật

Bước 1: Cho 1 lượng vừa đủ mẫu (khoảng 0,05 g) đã nghiền nhuyễn vào ống tube

đã được đánh dấu, lựa chọn những phần bột mịn, tránh lấy những phần vỏ màng không thể nghiền nhuyễn ít DNA Thêm vào tube 400 μL SDS, nghiền cho đến khi mẫu bắp được hoà tan thì tiếp tục cho thêm 200 μL SDS

Bước 2: Thêm 600 μL Phenol/CH3Cl/Isoamyl (25:24:1) vào ống tube, lắc đều hỗn

hợp một cách nhẹ nhàng nhiều lần Sau đó đem đi ly tâm ở 10000 rpm trong vòng 5 phút

Bước 3: Hút 500 μL dịch nổi sau ly tâm vào 1 ống tube mới, thêm 500 μL CH3Cl

và trộn đều hỗn hợp, tiếp tục đem đi ly tâm ở 10000 rpm trong vòng 5 phút

Bước 4: Hút 300 μL dịch nổi sau ly tâm cho vào 1 ống tube mới, thêm vào 180 μL

0,6 V Isopropanol, ủ lạnh mẫu ở nhiệt độ -20℃ trong 30 phút Sau đó ly tâm 14000 rpm trong vòng 10 phút Loại bỏ phần dịch nổi phía phía trên một cách nhẹ nhàng

Hình 2.1 Mẫu bắp số 02 Hình 2.2 Mẫu sau khi được nghiền nhuyễn

Hình 2.3 Hút dịch 500 μL qua ổng tube mới

Bước 5: Rửa mẫu lần 1 với dung dịch etOH 70%, đem đi ly tâm thời gian ngắn,

tiếp tục rửa lần 2 và phơi khô Quá trình rửa mẫu sẽ giúp loại bỏ được những dung dịch còn sót lại có thể làm ảnh hưởng đến độ chính xác khi đo OD

Bước 6: Hoà tan lại với 30 μL đệm TE buffer Ph 8 để giữ cho DNA được ổn định,

bảo quản ở -20℃

2.2.2.2 Điện di tổng số DNA

Bước 1: Chuẩn bị thạch Agarose 1% từ pha từ 0,2 g agarose và 20 mL TBE 0,5X Bước 2: Bơm 5 μL sản phẩm DNA đã hoà trộn cùng với 10 dung dịch gồm 5 μL

Loading dye và 5 μL Gel red vào giếng trên thạch

Bước 3: Điện di 25 phút ở hiệu điện thế là 100 V

2.2.2.3 Kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA bằng máy BioDrop

Thực hiện đo OD với máy BioDrop

Bước 1: Hút 0,3 DNA và tiến hành đo ở bước sóng 260 nm là bước sóng phát hiện

DNA

Bước 2: Đọc và ghi nhận kết quả, A260:280 nên nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 là phù hợp

Lưu ý khi sử dụng máy BioDrop rất nhạy nên thao tác cần chuẩn và ít sai sót nhất, nên thực hiện bằng người có thao tác tay ổn định

Hình 2.4 Sau khi ly tâm Hình 2.5 Sau khi hút dịch nổi 300 μL

2.2.2.4 Khuyến đại DNA bằng PCR

Bước 1: Chuẩn bị các thành phần phản ứng PCR Sử dụng My Taqmix gồm:

dNTPs; PCR primer; MgCl2; Taq polymerase Với cặp primer phát hiện trình tự 35S trên vecter chuyển gen có trình tự như sau:

Bảng 2.1 Thông tin primer xác định GMO

35S-1 5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’

195bp (Hurst et al.,1999) 35S-2 5’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’

Thành phần của phản ứng PCR được thể hiện trong bảng

Bảng 2.2 Thành phần tham gia phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ cuối Thể tích ( μL )

Bước 2: Cho tất cả thành phần vào ống tube 0.2, trộn đều và đem đi đặt vào máy

PCR

Bước 3: Điều chỉnh thực hiện phản ứng PCR với chu kì nhiệt như sau:

Hình 2.6 Đặt vào máy PCR

Bảng 2.3 Chu kì nhiệt phản ứng PCR

40

Bước 4: PCR trong thời gian 1 tiếng 30 phút, thu sản phẩm và đem đi thực hiện

điện di xác định sự có mặt và kích thước trình tự 35S trên vector chuyển gen

2.2.2.5 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Bước 1: Chuẩn bị bồn điện di và gel agarose 1% tương tự điện di tổng số DNA Bước 2: Bơm hỗn hợp gồm gồm 5 μL sản phẩm PCR và 10 μL hỗn hợp gồm

GelRed 0,6X và Gel Loading Dye được trộn chung với nhau

Bước 3: Điện di 100 V trong 45 phút

Chương 3: Kết quả và thảo luận 3.1 Điện di tổng số DNA mẫu bắp

3.1.1 Kết quả

Sau quá trình điện di, không thấy xuất hiện band sáng, xuất hiện vệt rất mờ trên đường di chuyển thạch Hai giếng đều không hiện vì thao tác bơm tràn như nhau

3.1.2 Thảo luận

Không xuất hiện band sáng cho thấy sự không xuất hiện của DNA tổng số có thể

do những nguyên nhân như sau:

Khi rửa mẫu quá mạnh làm cho DNA sau ly tâm đã đọng lại dưới ống tube trôi ra ngoài khiến cho lượng DNA còn lại rất ít ( DNA còn sót lại quanh thành đáy tube )

Do khi tiến hành mix mẫu DNA chưa mix hoàn toàn mẫu nên lượng DNA không đồng đều

Do thao tác khi bơm mẫu vào giếng điện di không chính xác, lượng lớn mẫu bị tràn ra ngoài do đó không đủ lượng mẫu chạy điện di

Sự xuất hiện vệt sáng mờ rất nhạt là tạp nhiễm của chất khác không phải DNA Vẫn có 1 lượng GelRed còn đọng trong giếng sau khi bơm tràn ra nên vẫn xuất hiện màu dưới đèn UV Vì điều này khó có thể nhận biết được có DNA tổng số hay không

Hình 3.1 Kết quả điện di tổng số DNA mẫu li trích ( 12A ) giếng bơm mẫu bắp số 2 lần

1; ( 12B) giếng bơm mẫu bắp số 2 lần 2 đã li trích

( 12A ) ( 12B )

3.2 Kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA bằng máy BioDrop

3.2.1 Kết quả

Lượng DNA trong mẫu li trích là 4,242 ng/μL rất nhỏ Chỉ số A260:280 = 1,308 thể hiện mẫu đã bị nhiễm phenol Lượng DNA li trích được rất ít

Hình 3.2 Kết quả hàm lượng DNA trên máy BioDrop

Hình 3.3 Kết quả đồ thị mẫu DNA trên máy BioDrop

3.2.2 Thảo luận

Đo trên máy BioDrop giúp kiểm tra được chất lượng cũng như hàm lượng của mẫu DNA, các thông số hiển thị trên máy cho phép kiểm tra mẫu DNA có bị nhiễm tạp chất hay bị đứt gãy không Kết quả đo mẫu cho thấy hàm lượng DNA thu nhận ở mức thấp

là 4,242 ng/μL, Chỉ số A 260:280 = 1,308 thấp hơn 1,8, đồ thị không nhọn ở bước sóng

260, đường độ thị nhiễu nhiều cho thấy mẫu đã bị nhiễm phenol

Kết hợp với kết quả điện di cho thấy lượng DNA li trích được là rất thấp có thể do nguyên nhân sau:

Lượng dung dịch chứa DNA còn lại quá ít sau khi tiến hành thực hiện điện di 2 giếng nên khó có thể hoà trộn đều mẫu vì còn sót lại rất ít dung dịch trong ống tube nên lượng mẫu hút đo BioDrop có thể đã không có nhiều DNA

Quá trình li trích không thu nhận được nhiều DNA từ mẫu do những sai sót trong thao tác

Để tiến hành PCR kiểm tra GMO thì hàm lượng DNA nên ở trên 10 ng/μL sẽ phù hợp Tuy nhiên vẫn tiến hành PCR vì lượng DNA để kiểm tra có GMO hay không

3.3 Điện di xác định GMO

3.3.1 Kết quả

Mẫu đối chứng âm không bị nhiễm Xuất hiện band sáng có kích thức 195 bp là mục tiêu, đồng thời xuất hiện dimer primer

Hình 3.4 Kết quả điện di xác định GMO (-) là dối chứng ấm; ( 12 ) là mẫu thực hiện

kiểm tra GMO

( 12 ) ( - )

195 bp

3.3.2 Thảo luận

Quá trình PCR là để khuyến đại 1 đoạn mục tiêu trở nên nhiều hơn và có thể dễ dàng phát hiện đoạn đó có trong mẫu hay không bằng cách quan sát sự xuất hiện band màu dưới ánh đèn UV

Tuy kết quả của điện di DNA tổng số và đo bằng BioDrop cho thấy lượng DNA li trích được rất ít nhưng qua kết quả PCR và điện di xác định GMO vẫn xuất hiện band mục tiêu Điều này cho thấy trong mẫu đã li trích có dấu hiệu là GMO vì phản ứng PCR

đã phát hiện được promotor 35S vector chuyển gen có trong mẫu li trích và khuyến đại

nó lên 1 giới hạn có thể quan sát được là đoạn band kích thước 195 bp

Mẫu điện di có độ sai lệch nhỏ so với độ dài lý thuyết là do hoá chất sử dụng Kết quả cho thấy mẫu bắp kiểm tra là GMO vì xuất hiện band sau quá trình thực hiện phản ứng PCR xác định GMO