Thiết bị

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CNSH Chẩn đoán sự hiện diện của Sarcoptes Scabiei từ vết xước da ở bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ bằng phương pháp PCR Giảng viên hướng dẫn: TS Huỳnh Văn Biết ThS Trương Quang Toản Hồ Chí Minh, thứ 7, ngày 28 tháng 10 năm 2023 1 THÀNH VIÊN NHÓM Họ và tên MSSV Dương Phạm Phương Nguyên 21126428 Trang Thị Tường Vi 21126236 Nguyễn Hùng Cường 21126295 2 NỘI DUNG THỰC HIỆN 1 • Đặt vấn đề 2 • Tổng quan 3 • Vật liệu và phương pháp 4 • Kết quả và kết luận 3 1 Đặt vấn đề • Bệnh ghẻ do ký sinh trùng Sarcoptes scabiei hominis gây nên có ở người và các động vật khác • Bệnh ghẻ được tìm thấy từ thế kỷ XVI nhưng mãi đến năm 1934 mới tìm được ký sinh trùng gây bệnh ghẻ ở người • Kí sinh trùng ghẻ lây lan từ người này qua người khác do dùng chung quần áo, hoặc khi quan hệ tình dục Hình 1.1 Tổn thương do Sarcoptes Scabiei gây nên 4 Mục tiêu và nội dung thực hiện Xác định chính xác kí sinh trùng con ghẻ Sarcoptes scabiei có xuất hiện trên da của bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR Hình 1.2 Ứng dụng phản ứng PCR trong xét nghiệm 5 2 Tổng quan 2.1 Một số đặc điểm của Sarcoptes Scabiei Sarcoptes scabiei var hominis thuộc giới động vật tiết túc, ngành chân khớp Arthropoda, bộ Sarcoptiformes, họ Sarcoptoidae, giống Sarcoptes, loài S Scabiei Ghẻ trưởng thành có hình bầu dục, màu xám, miệng rất ngắn, lưng gồ, bụng phẳng, không mắt, không lỗ thở, có bốn cặp chân, mỗi chân có 5 đốt Ghẻ cái dài 0,3 - 0,45 mm và rộng 0,25 - 0,35 mm, kích thước con đực khoảng ¾ con ghẻ cái Hình 2.1 Hình thái con ghẻ trưởng thành 6 2.2 Chu kỳ sinh sản và cơ chế xâm nhập của Sarcoptes Scabiei Con ghẻ Sarcoptes scabiei var hominis trải qua 4 giai đoạn: Trứng → ấu trùng → nhộng → con trưởng thành Tùy thuộc vào nhiễm vật chủ nào, các con cái thường hay đào hầm trong da, chủ yếu lớp ngoài da, ghẻ cái đẻ 2 - 3 trứng mỗi ngày Hình 2.2 Trứng Sarcoptes scabiei Hình 2.3 Cái ghẻ đào hang dưới da và đẻ trứng 7 2.3 Triệu chứng lâm sàng Thời kỳ ủ bệnh từ 2 - 40 ngày, trung bình từ 10 - 15 ngày Tổn thương đặc hiệu của bệnh ghẻ là luống ghẻ và mụn nước, thường do ngứa gãi gây nên Người bị nhiễm ký sinh trùng ghẻ lần đầu tiên trong vòng 2 tuần đầu hoàn toàn chưa có biểu hiện ngứa Hình 2.4 Vị trí đặc hiệu xuất hiện ghẻ 8 2.4 Chẩn đoán Hình 2.5 Chu kỳ phản ứng PCR 9 Triệu chứng lâm sàng Dịch tễ: gia đình, đơn vị, tập thể nhiều người bị Soi tươi: kính hiển vi thấy trứng hoặc cái ghẻ IgE tăng cao Phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp PCR 2.5 Kỹ thuật PCR Phương pháp PCR cho phép khuếch đại số lượng lớn đoạn gen mục tiêu Phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất của biến tính, hồi tính của DNA và sự tổng hợp DNA Qua 3 giai đoạn: Biến tính – Bắt cặp – Kéo dài 3 Vật liệu và phương pháp 3.1 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất Các dụng cụ, thiết bị sử dụng: máy đo OD, bộ điện di và máy chụp gel GelDoc It2, các Micropipette, máy Votex mixer, máy gia nhiệt và các dụng cụ, thiết bị trong phòng thí nghiệm Hình 3.1 Máy ly tâm Eppendorf Hình 3.2 Máy luân nhiệt Hình 3.3 Tủ an toàn sinh học 10 3.1 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng Tên hóa chất Bộ kit tách chiết DNA Số thứ tự Bộ kit PCR MyTaq Mix 2X 1 H2O nuclease - free water 2 3 Agarose 4 GelRed 6X (TBR) 5 Ladder 100 bp 6 Dung dịch đệm TAE 50X 7 Gel Loading Dye Purple 6X 8 11 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Nhận diện bằng kính hiển vi 1ml Mẫu bệnh phẩm Đồng nhất và bảo quản mẫu trong ethanol Mẫu sẽ được đổ vào đĩa petri và kiểm tra dưới kính hiển vi (đòi hỏi phải hình dung được con ghẻ hoặc trứng của chúng) 12 3.2.2 Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR Proteinase K WB1 CL Buffer Ethanol Ly tâm (96-100%) 13000rpm 1 phút Vortex đều Trộn đều Ly tâm WB2 Ủ 10 phút 13000rpm 1 phút Mẫu mô da được đồng Ly trích mẫu - chiết xuất DNA nhất trong dung dịch PBS EB DNA được sử Ủ 1 phút Làm khô cột dụng ngay hoặc Ly tâm bảo quản ở -20o C Ly tâm 13000rpm 1 phút 13000rpm 1 phút 13 3.2.2 Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR Kiểm tra chất lượng DNA Điện di: mẫu DNA vừa ly trích được kiểm tra trên gel agarose 1 % với thang chuẩn 100 bp ở hiệu điện thế 100V trong 15 phút Đo quang phổ: DNA sẽ được định lượng bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 260 và 280 nm để xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA Hình 3.5 Thiết bị điện di Công thức tính nồng độ DNA cDNA = OD260*50 ng/µL Trong đó: cDNA: Nồng độ DNA (ng/µL) OD260: Chỉ số OD ở bước sóng 260nm 14 3.2.2 Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR Phản ứng PCR Bảng 3.2 Trình tự primer Primer Trình tự (5’ - 3’) Số nu Ta (oC) Kích thước sản phẩm Forward (F) CTGGTAGAGGAACTGGCTG 19 58 374 bp Reverse (R) GTAAACTTCCGGGTGTCC 18 Thể tích (µL) Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR Hóa chất 5 My Taq Mix 2X 0,5 Primer F,R Primer R (10 pmol/µL) 0,5 Primer F (10 pmol/µL) 2 H2O nuclease My Taq Mix 2X H2O nuclease - free water 3 DNA (10 ng/µL) 11 Mẫu DNA sau chiết xuất Tổng 15 3.2.2 Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian (giây) Số chu kì Tiền biến tính 95 600 1 Biến tính 95 15 35 Bắt cặp 58 30 35 Kéo dài 72 60 35 Hậu kéo dài 72 420 1 Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách điện di kiểm tra trên gel agarose 1,8 % với thang chuẩn 100 bp Sau đó, miếng gel được chụp và quan sát trên máy chụp gel 16 4 Kết quả và kết luận 4.1 Kết quả kiểm tra DNA dự kiến Kết quả dự kiến của mẫu được ly trích cho thấy tỷ số OD260/OD280 trung bình là 1,8; cho thấy chất lượng DNA sau ly trích đảm bảo về độ tinh sạch Ngoài ra, kết quả đo OD còn cho thấy nồng độ DNA trung bình đạt 296,2 ng/µL Hình 4.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 1 % M: ladder 100bp (Nguồn: Naz và ctv, 2013) 17 4.2 Kết quả khuếch đại gen mục tiêu bằng phản ứng PCR dự kiến 4.2.1 Kết quả PCR tiến hành thử trên web Primer-BLAST Hình 4.2 Kết quả PCR được tiến hành trên Primer BLAST 18 4.2.2 Kết quả sản phẩm PCR 374bp Hình 4.3 Hình ảnh đại diện cho điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen mục tiêu trên gel agarose 1,8 % M: ladder 100 bp; Sản phẩm PCR: 374 bp, Giếng 1-5: Sản phẩm PCR khuếch đại từ các mẫu DNA thu từ bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ; Giếng 6: đối chứng dương; Giếng 7: đối chứng âm (Nguồn: Tamieka và ctv, 2018) 19 4.3 Kết quả thống kê so sánh Bảng 4.1 Kết quả thống kê và so sánh số bệnh nhân dương tính và âm tính từ hai phương pháp nhận diện bằng kính hiển vi và nhận diện bằng phản ứng PCR dự kiến Phương pháp Tổng số bệnh Tổng số bệnh Tổng bệnh nhân nhận diện nhân âm tính nhân dương tính được thu thập mẫu (người) (người) (người) Kính hiển vi 13 17 Phản ứng PCR 9 21 30 Kết quả Có thể thấy sự chênh lệch kết quả âm và dương tính từ các mẫu thu cùng nhau giữa 2 phương pháp nhận diện Sarcoptes scabiei Độ đặc hiệu của phản ứng PCR trong quá trình nhận diện và kiểm soát bệnh ghẻ Sarcoptes scabiei 20