luận văn thạc sĩ tách dòng và xác định trình tự gene glta mã hóa cho enzyme citrate synthase từ vi khuẩn e coli

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG Tên đề tài: TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE gltA MÃ HỐ CHO ENZYME CITRATE SYNTHASE TỪ VI KHUẨN Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khoá học : Chính quy : Cơng nghệ Sinh học : CNSH - CNTP : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 n ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG Tên đề tài: TÁCH DỊNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE gltA MÃ HỐ CHO ENZYME CITRATE SYNTHASE TỪ VI KHUẨN Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : K42 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn: TS Dương Văn Cường Thái Nguyên, năm 2014 n LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp tơi nhận quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình thầy bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn: Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Cường giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, kĩ sư Ma Thị Trang cán Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên người tận tình bảo, trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực để tài q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên, ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cán bộ, anh chị làm việc Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên,ngày 02 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hường n DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Danh sách vùng trồng diện tích vanillin chủ yếu giới Bảng 2: Thành phần tính chất dược liệu vanillin 12 Bảng 3: Danh sách quốc gia sản xuất sản lượng vanillin .14 Bảng 4: Tiền chất vi sinh vật chủ yếu để tổng hợp vanillin vanillin từ axit ferulic chu trình TCA đường Glyoxylate 25 Bảng 5: Cặp mồi sử dụng nhân gene gltA 31 Bảng 6: Các thành phần vector pTZ57R/T .34 Bảng 7: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 35 Bảng 8: Thành phần phản ứng PCR 40 Bảng 9: Thành phần phản ứng gắn nối .43 Bảng 10: Thành phần phản ứng cắt với NcoI 45 Bảng 11: Thành phần phản ứng cắt với SacI HindIII 45 n DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Hình dạng đặc điểm ba loài hoa Vanilla Hình 2: Lồi ong địa phương Melapona lồi chim giúp thụ phấn hoa Hình : Qúa trình thụ phấn nhân tạo cho hoa Vanilla planifolia .7 Hình 4: Các đường trao đổi chất sinh tổng hợp vanillin 21 Hình 5: Con đường sản xuất vanillin từ axit ferulic nhờ gene fcs ech 24 Hình 6: Sơ đồ biểu diễn tái chế coenzym A (CoA) từ acetyl-CoA sản xuất Hình 7: Cấu trúc vector tách dòng 33 Hình 8: Quy trình tách dịng xác định trình tự gene gltA từ vi khuẩn E coli 37 Hình 9: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 40 Hình 10: Hình ảnh tách chiết DNA tổng số E coli 47 Hình 11: Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR .48 Hình 12: Sản phẩm PCR trước sau tinh 49 Hình 13: Kết biến nạp vi khuẩn đối chứng 49 Hình 14: Kết biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào E coli DH5α khả biến 50 Hình 15: Kết điện di plasmid dòng khuẩn lạc chọn 50 Hình 16: Sản phẩm PCR plasmid dịng khuẩn lạc .51 Hình 17: Kết điện di sản phẩm cắt enzyme NcoI 52 Hình 18: Kết cắt kiểm tra đồng thời hai enzyme SacI HindIII .53 Hình 19: Kết so sánh trình tự gene dòng 55 Hình 20: Kết giải trình tự gene hiển thị máy tính dịng 56 Hình 21: Trình tự nucleotide gene gltA tách dịng 57 Hình 22: Kết dịch mã gene gltA 58 Hình 23: Kết so sánh trình tự gene gltA tách dịng với trình tự gene công bố ngân hàng gene .60 n luan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coli DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Amp Ampicillin Bp Base pair – cặp base nitơ BLAST Basic Local Aligenment Search Tool cDNA Complementary DNA - DNA bổ sung CoA Coenzyme Acetoacetyl DNA Deoxyribonucleic axit dNTP Deoxynucleotide Triphotphate E coli Escherichia coli Et al Cộng IPTG Isopropyl Thiogalactoside Kb Kilo base –kilo base nitơ LB Lauria Broth S cerevisiae Saccharamyces cerevisiae SDS Sodium Dodecyl Sulfate V planifolia Vanilla planifolia Polymerase Chain Reaction - Phản ứng PCR chuỗi trùng hợp TAE Tris- acetate- EDTA TE Tris- EDTA X -gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside luan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coli n luan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coli MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .3 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn gốc thực vật vanilla 2.2 Đặc điểm thực vật loài Vanilla planifolia 2.3 Đặc điểm cấu trúc, thành phần vanillin 2.4 Hoạt tính sinh học tác dụng vanillin 2.4.1 Hoạt tính sinh học vanillin 2.4.2 Tác dụng vanillin 11 2.5 Các phương pháp sản xuất vanillin 13 2.5.1 Vanillin chiết suất từ tự nhiên 13 2.5.2 Vanillin tổng hợp hóa học .14 2.5.3 Vanillin tổng hợp sinh học 16 2.5.3.1 Phương pháp sử dụng enzyme .16 2.5.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 17 2.5.3.3 Ứng dụng công nghệ sinh học tổng hợp vanillin 18 2.6 Vi khuẩn E coli gene gltA sinh tổng hợp vanillin .23 2.6.1 Vi khuẩn E coli .23 2.6.2 Vai trò gene gltA sinh tổng hợp vanillin 24 2.7 Tình hình nghiên cứu nước 26 2.7.1 Tình hình nghiên cứu giới 26 2.7.2 Tình hình nghiên cứu nước 28 PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Vật liệu nghiên cứu 30 luan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coli n luan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coli 3.1.1 Vi khuẩn 30 3.1.2 Hóa chất 30 3.1.3 Vật liệu 31 3.1.3.1 Mồi phản ứng PCR .31 3.1.3.2 Vector tách dòng 32 3.1.4 Thiết bị 35 3.2 Địa điểm thời gian thực tập 35 3.3 Nội dung nghiên cứu 36 3.4 Phương pháp nghiên cứu 37 3.4.1 Quy trình tách dịng xác định trình tự gene gltA từ vi khuẩn E.coli 37 3.4.2 Phương pháp nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến 38 3.4.3 Phương pháp thu cặn tế bào vi khuẩn .38 3.4.4 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 38 3.4.5 Phương pháp PCR 39 3.4.6 Điện di .40 3.4.7 Tinh sản phẩm PCR thu nhận lại DNA từ gel 41 3.4.8 Phản ứng gắn nối trình tự gene khuếch đại vào vetor tách dòng pTZ57R/T 42 3.4.9 Phương pháp biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α khả biến sốc nhiệt .43 3.4.10 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 44 3.4.11 Phương pháp cắt kiểm tra dòng plasmid tái tổ hợp với enzyme cắt giới hạn .45 3.4.12 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 46 3.4.13 Phương pháp so sánh trình tự gene gltA tách dịng với trình tự công bố ngân hàng gene giới 46 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn E coli 47 4.2 Kết nhân gene gltA từ vi khuẩn E coli DH5α phương pháp PCR 47 4.3 Kết tinh sản phẩm PCR từ gel điện di 48 4.4 Kết biến nạp sản phẩm gắn nối 49 luan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coli n luan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coli 4.5 Kết chọn lọc dòng vi khuẩn .50 4.5.1 Kết sàng lọc dòng điện di so sánh kích thước plasmid 50 4.5.2 Kết chọn lọc dòng PCR 51 4.5.3 Kết chọn lọc dòng plasmid lập đồ giới hạn 52 4.5.3.1 Kết cắt kiểm tra độc lập enzyme NcoI 52 4.5.3.2 Kết cắt kiểm tra đồng thời hai enzyme SacI HindIII .53 4.6 Kết giải trình tự gene 54 4.6.1 Kết so sánh trình tự gene dịng giải trình tự 54 4.6.2 Kết phân tích thành phần thiết yếu gene theo thiết kế insilico 56 4.6.3 Kết dịch mã gene gltA 58 58 4.6.4 Kết so sánh trình tự gene xác định với trình tự gene công bố ngân hàng gene 58 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 5.1 Kết luận 61 5.2 Kiến nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 luan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coli n luan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coli PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) hợp chất thơm quan trọng sử dụng nhiều ngành thực phẩm, mĩ phẩm, dược phẩm (Ranadive 1994)…Sản lượng tiêu thụ ước tính toàn giới hàng năm 12.000 (Lee, Yoon et al 2009) Vanillin tự nhiên, chiết xuất từ lồi lan có tên khoa học Vanilla planifolia đáp ứng khoảng 1% nhu cầu thương mại, cịn lại chủ yếu vanillin tổng hợp hóa học nhân tạo (Li and Rosazza 2000) Trên thực tế, giá thành kg vanillin tự nhiên dao động khoảng 1200 – 4000 USD, giá kg vanillin nhân tạo khoảng 15 USD (Lomascolo, Stentelaire et al 1999) Tuy nhiên, theo quy định Mỹ châu Âu vanillin tổng hợp hóa học không coi tương đương với vanillin tự nhiên (Muheim and Lerch 1999) Do mà vanillin khơng thể cung cấp cách chiết xuất từ vanilla tự nhiên hay tổng hợp hóa học, sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ sinh học nghiên cứu trình thay (Krings and Berger 1998) Ứng dụng công nghệ sinh học để tổng hợp sản phẩm vanillin tự nhiên thay quan tâm ngày tăng năm gần (LesageMeessen, Stentelaire et al 1999) Hơn nữa, trình sản xuất vanillin sinh học cho chi phí rẻ tận dụng phế phụ phẩm sẵn có rẻ tiền, tạo sản phẩm phụ không mong muốn chủ yếu thực điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, nguy hiểm, sử dụng lượng gây ô nhiễm môi trường (Dal Bello 2013) Nghiên cứu sinh tổng hợp vanillin sử dụng vi sinh vật enzyme chuyển hóa tiền chất glucose, ligin, isoeugenol, eugenol, axit ferulic… thực công bố (Lomascolo, Stentelaire et al 1999) Trong biến đổi sinh học để tạo vanillin từ axit ferulic ý quan tâm nghiên cứu Một số vi sinh vật, chẳng hạn chủng Amycolatopsis sp HR167 (Achterholt, Priefert et al 2000), Bacillus subtilis (Peng, Misawa et al 2003), Pseudomonas putida (Plaggenborg, Overhage et al 2003), Delftia acidovorans (Plaggenborg, Steinbuchel et al 2001), Sphingomonas (Masai, Harada et al 2002), Streptomyces setonii (Muheim and Lerch 1999)… dùng để sản xuất vanillin từ axit ferulic Tuy nhiên, vanillin sản xuất từ sinh vật cho suất thấp luan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coliluan.van.thac.si.tach.dong.va.xac.dinh.trinh.tu.gene.glta.ma.hoa.cho.enzyme.citrate.synthase.tu.vi.khuan.e.coli n