luận văn thạc sĩ phân tích đánh giá biểu hiện của gen chịu hạn gmchs7 trong các dòng ngô chuyển gen

P NGUYÊN ĐẠI HỌC THÁI TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN ĐỨC VỊNH Tên đề tài: PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CỦA GEN CHỊU HẠN GmCHS7 TRONG CÁC DỊNG NGƠ CHUYỂN GEN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, 2014 n ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN ĐỨC VỊNH Tên đề tài: PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CỦA GEN CHỊU HẠN GmCHS7 TRONG CÁC DỊNG NGƠ CHUYỂN GEN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Cơng nghệ Sinh học Khoa : CNSH – CNTP Khóa học : 2010 – 2014 Người hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Văn Đồng Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ tế bào thực vật Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam TS Nguyễn Văn Duy Khoa CNSH - CNTP - ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 n LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường, tồn thể Thầy Cơ Khoa Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm Trường Đại học Nông Lâm - Thái Nguyên tạo điều kiện học tập tốt suốt trình học trường Đồng thời, định hướng xếp cho Em thực tập tốt nghiệp Viện Di truyền Nơng Nghiệp Việt Nam để hồn thiện chương trình học, củng cố kiến thức hồn thành Khóa luận tốt nghiệp Đại học PGS.TS Nguyễn Văn Đồng giám đốc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Cơng nghệ Tế bào thực vật Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để Em thực tập tốt nghiệp Phịng hồn thành Khóa luận tốt nghiệp Đồng thời Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Nguyễn Hữu Kiên, anh Lương Thanh Quang, anh Dương Tuấn Bảo toàn thể nhân viên, học viên nghiên cứu Phịng tận tình giúp đỡ bảo em trình thực tập Thầy giáo, giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Văn Duy giúp em định hướng, hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành Kháo luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn đến tồn thể bạn bè, người thân, gia đình bên cạnh cổ vũ tinh thần, động viên khích lệ Em học tập hồn thành Khóa luận tốt nghiệp Thái Nguyên, ngày…tháng…năm 2014 Sinh viên NGUYỄN ĐỨC VỊNH n DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Giá trị dinh dưỡng ngô Bảng 2.2 Tình hình sản xuất ngơ số nước đứng đầu giới từ năm 2004 - 20112 .8 Bảng 2.3 Tình hình sản xuất ngơ năm gần .9 Bảng 2.4 Dự kiến diện tích, suất sản lượng ngô nước đến năm 2020 10 Bảng 3.1 Danh sách dịng ngơ sử dụng nghiên cứu, đánh giá 19 Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng kĩ thuật lai Shouthern blot 20 Bảng 3.3 Trình tự mồi phân tích PCR 23 Bảng 3.4 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả kháng hạn ngô chuyển gen GmCHS7 giai đoạn .24 Bảng 4.1 Kết PCR gen GmCHS7 dòng T0 30 Bảng 4.2 Kết đo chiều cao trung bình dịng ngô chuyển gen .32 hệ T1 lần thứ 32 Bảng 4.3 Kết đo chiều cao trung bình dịng ngơ chuyển gen đối chứng lô số (tưới nước đầy đủ) 33 Bảng 4.4 Kết đo chiều cao trung bình dịng ngô chuyển gen sau xử lý hạn lần lần 35 Bảng 4.5 Các lựa chọn dịng để tiến hành phân tích Southern Blot 37 n luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số dịng ngơ nghiên cứu 28 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen GmCHS7 hệ T0 29 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen GmCHS7 dịng ngơ chuyển gen hệ T1 31 Hình 4.4 Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dịng ngơ chuyển gen đối chứng lơ số tưới nước đầy đủ 34 Hình 4.5 Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dịng ngơ chuyển gen .35 Hình 4.6 Kết lai Southern Blot sản phẩm cắt gen GmCHS7 với mẫu dò tương ứng từ dịng ngơ chuyển gen hệ T1 .37 luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen n luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CNSH : Công nghệ sinh học CTAB : Cetyltrimethylammonium Bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid ĐC : Đối chứng GFP : Green Fluorescent Protein GMO : Genetically Modified Organism GMC : Genetically Modified Corn OD : Optical Density PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid TB : Trung bình TGST : Thời gian sinh trưởng PEG : Polyetylenglycol TCN : Trước Công nguyên LEA : Late embryogenesis abundant luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen n luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .3 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung ngô 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Giá trị ngô 2.1.3 Đặc điểm thực vật ngô 2.1.4 Đặc tính sinh học giống ngô .6 2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất ngơ giới Việt Nam .8 2.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất ngơ giới 2.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất ngô Việt Nam 2.2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất ngô chuyển gen giới Việt Nam 10 2.3 Các phương pháp chuyển gen thực vật 12 2.3.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp 12 2.3.1.1 Chuyển gen súng bắn gen 12 2.3.1.2 Chuyển gen xung điện 12 2.3.1.3 Chuyển gen PEG (Polyetylenglycol) 13 2.3.1.4 Chuyển gen phương pháp vi tiêm .13 2.3.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp 13 2.3.2.1 Chuyển gen thông qua virus .13 2.3.2.2 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 14 2.4 Tổng quan tính chịu hạn trồng gen chịu hạn GmCHS .15 2.4.1 Tính chịu hạn trồng tiêu đánh giá tính chịu hạn .15 2.4.1.1 Tính chịu hạn trồng 15 2.4.1.2 Các hình thức chịu hạn trồng 16 luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen n luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen 2.4.1.3 Các tiêu đánh giá tính chịu hạn trồng .16 2.4.2 Tổng quan gen chịu hạn GmCHS 17 Phần 19 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 3.1 Vật liệu nghiên cứu 19 3.1.1 Vật liệu thực vật 19 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 19 3.1.2.1 Hóa chất .19 3.1.2.2 Thiết bị thí nghiệm .21 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 21 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.3 Nội dung nghiên cứu 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 21 3.4.1 Phân tích đánh giá có mặt gen GmCHS7 số dịng ngơ sau chuyển gen phương pháp PCR 21 3.4.2 Phân tích biểu khả kháng hạn dịng ngơ chuyển gen GmCHS7 giai đoạn 24 3.4.3 Phân tích đánh giá có mặt gen GmCHS7 dịng ngơ sau chuyển gen phương pháp Southern blot 25 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 27 Phần 28 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết Phân tích đánh giá có mặt gen GmCHS7 số dịng ngơ sau chuyển gen phương pháp PCR 28 4.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số .28 4.1.2 Kết phân tích có mặt gen GmCHS7 dịng ngơ chuyển gen phương pháp PCR 29 4.2 Đánh giá khả kháng hạn ngô chuyển gen giai đoạn .31 4.2.1 Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển GmCHS7 dịng ngô hệ T1 31 luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen n luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen 4.2.2 Kết đánh giá khả chịu hạn hệ T1 thông qua tiêu đo chiều cao điều kiện hạn .32 4.3 Kết phân tích, đánh giá có mặt gen GmCHS7 dịng ngơ chuyển gen hệ T1 phương pháp lai Southern Blot 36 Phần 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 I Tài liệu tiếng Việt 40 II Tài liệu tiếng Anh 41 luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen n luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ngơ có tên khoa học Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Graminaae, năm loại lương thực giới (ngơ, lúa nước, lúa mì, sắn khoai tây) [3] Cây ngô biết đến từ kỷ 16 Columbus mang hạt giống từ châu Mỹ về, sau sản xuất ngô trở nên phổ biến khắp giới trở thành loại ngũ cốc quan trọng cung cấp lương thực cho người, cung cấp nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi[11] Sản lượng sản xuất ngơ giới trung bình hàng năm từ 713,6 đến 789,8 triệu (năm 2005-2007) Trong nước Mỹ sản xuất 40,62% tổng sản lượng ngô lại 59,38% nước khác sản xuất Sản lượng ngơ xuất giới trung bình hàng năm từ 82,6 đến 86,7 triệu Trong đó, Mỹ xuất 64,41 % tổng sản lượng nước khác chiếm 35,59 % [21] Ở Việt Nam ngô loại lương thực quan trọng thứ hai sau lúa, có phát triển rộng khắp, liên tục đạt đỉnh điểm năm 2005 Theo số liệu thống kê sản xuất ngơ năm 2005 có tiến vượt bậc: Diện tích đạt 1039 nghìn ha, suất đạt 35,5 tạ/ha sản lượng đạt 3,69 triệu tấn, làm thay đổi tỉ trọng cấu sản lượng lương thực từ 5,7% năm 2000 lên 9% năm 2005 [1] Đến năm 2009 diện tích gieo trồng ngơ tăng mạnh vượt ngưỡng triệu so với năm 1960 200 nghìn [2] So với nước có nơng nghiệp phát triển suất ngơ nước ta thuộc loại thấp số địa phương miền núi vùng sâu, vùng xa tỉnh Lai Châu, Sơn La, Hà Giang, Tuyên Quang, Lạng sơn, Phú Thọ, Thanh Hóa, Quảng Nam, Lâm Đồng… cộng đồng dân tộc người thường sử dụng giống ngô địa phương tập quán canh tác lạc hậu đặc biệt điều kiện khí hậu đất đai khắc nghiệt làm cho suất ngô thấp Đặc biệt hạn hán ảnh hưởng lớn tới sinh tưởng phát triển suất ngô tỉnh vùng cao Việt Nam Hạn hán tình trạng lượng nước tự nhiên thấp mức trung bình thời gian dài diện rộng mang tính khu vực Trong yếu tố bất lợi môi trường, hạn hán ảnh hưởng lớn đến suất trồng toàn giới [20] Hạn hán làm giảm sinh khối thân, suất ngô giới Việt Nam, vùng trồng ngô dựa vào nước tự nhiên Theo Viện luan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.genluan.van.thac.si.phan.tich.danh.gia.bieu.hien.cua.gen.chiu.han.gmchs7.trong.cac.dong.ngo.chuyen.gen n