luận văn thạc sĩ nghiên cứu đánh giá khả năng phân hủy polylactic axit pla của một số chủng vi sinh vật phân lập ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THANH LỊCH NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY POLY LACTIC AXIT (PLA) CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2011 z ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THANH LỊCH NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY POLY LACTIC AXIT (PLA) CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN QUANG HUY HÀ NỘI - 2011 z Luận văn Thạc sĩ Khoa học MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nhiễm mơi trƣờng giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình nhiễm mơi trƣờng giới 1.1.2 Tình trạng ô nhiễm môi trƣờng Việt Nam 1.2 Tình trạng nhiễm rác thải nilon 1.3 Một số phƣơng pháp xử lý rác thải 1.3.1 Phƣơng pháp chôn lấp 1.3.2 Phƣơng pháp đốt 1.3.3 Phƣơng pháp xử lý rác đƣờng sinh học 10 1.4 Polymer sinh học 11 1.4.1 Khái niệm 12 1.4.2 Nhựa sinh học – Khả ứng dụng nhu cầu thị trƣờng 12 1.4.3 Một số loại polymer sinh học phổ biến 13 1.4.3.1 Polylactic acid (PLA) 13 1.4.3.2 Polyhydroxyalkanoate(PHA) Poly–3–hydroxybutyrate (PHB 14 1.4.3.3 Poly – ε – caprolactone (PCL) 15 1.4.3.4 Polyamide (PA) 16 1.4.3.5 Polybutylene succinate (PBS) polyethylene succinate (PES) 17 1.4.3.6 Polyethylene (PE) 17 Khoá 2009-2011 Nguyễn Thị Thanh Lịch z Luận văn Thạc sĩ Khoa học 1.4.4 Ƣu, nhƣợc điểm hƣớng phát triển polymer sinh học 18 1.4.4.1 Ƣu điểm 18 1.4.4.2 Nhƣợc điểm 19 1.5 Các vi sinh vật có khả phân hủy polymer sinh học 20 1.5.1 Vi khuẩn 21 1.5.2 Xạ khuẩn 22 1.5.3 Nấm 23 1.6 Cơ chế phân hủy polymer sinh học theo đƣờng sinh học 23 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Nguyên liệu 26 2.2 Hóa chất thiết bị 26 2.2.1 Hóa chất 26 2.2.2 Thiết bị 26 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu 27 2.3.2 Môi trƣờng phân lập nuôi cấy 27 2.3.2.1 Mơi trƣờng khống 27 2.3.2.2 Môi trƣờng LB 27 2.3.3 Phân lâ ̣p mơi trƣờng khoáng có bổ sung 0,2% PLA 28 2.3.3.1 Phƣơng pháp cấ y trải 28 2.3.3.2 Phƣơng pháp nuôi cấ y lắ c 28 2.3.3.3 Phƣơng pháp cấy điểm 28 Khoá 2009-2011 Nguyễn Thị Thanh Lịch z Luận văn Thạc sĩ Khoa học 2.3.4 Phƣơng pháp xác đinh, ̣ nhâ ̣n da ̣ng chủng nghiên cƣ́u 28 2.3.4.1 Phƣơng pháp nhuô ̣m Gram 28 2.3.4.2 Chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét 29 2.3.4.3 Phƣơng pháp giải trình tự gen mã hóa 16S rARN 30 2.3.5 Phƣơng pháp xác đinh ̣ hoa ̣t đô ̣ số enzyme ngoại bào 30 2.3.5.1 Xác đinh ̣ khả sinh amylase 30 2.3.5.2 Xác đinh ̣ khả sinh cellulase 31 2.3.5.3 Xác định hoạt độ catalase 31 2.3.5.4 Xác định hoạt độ protease 32 2.3.6 Phƣơng pháp đánh giá khả phân hủy PLA 34 2.3.6.1 Phƣơng pháp đo vòng phân hủy PLA 34 2.3.6.2 Phƣơng pháp thu hồi PLA 35 2.3.6.3 Phƣơng pháp tăng khả phân hủy PLA 35 2.3.7 Phƣơng pháp tối ƣu hóa điề u kiê ̣n nhiê ̣t ̣, pH, nồ ng đô ̣ muố i NaCl 36 2.3.8 Phƣơng pháp thống kê sinh học 36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân hủy PLA 37 3.2 Đặc điểm hình thái chủng T2 41 3.3 Phân loại chủng T2 dựa trình tự 16S rARN 43 3.4 Hoạt độ số enzym ngoại bào chủng T2 44 3.4.1 Khả sinh amylase 44 3.4.2 Khả sinh cellulase 45 Khoá 2009-2011 Nguyễn Thị Thanh Lịch z luan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.nam Luận văn Thạc sĩ Khoa học 3.4.3 Hoạt độ catalase protease 46 3.5 Khả phân hủy polymer sinh học 47 3.5.1 Khả phân hủy PLA chủng Klebsiella variicola T2 47 3.5.2 Khả phân hủy số polymer sinh học khác chủng Klebsiella variicola T2 49 3.6 Tối ƣu hóa điều kiện phân hủy PLA 51 3.6.1 Tối ƣu khả phân hủy PLA từ chủng Klebsiella variicola T2 51 3.6.2 Tối ƣu điều kiện nhiệt độ 52 3.6.3 Tối ƣu điều kiện pH 54 3.6.4 Ảnh hƣởng NaCl 55 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHI 56 ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 65 Khoá 2009-2011 Nguyễn Thị Thanh Lịch z luan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.nam luan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.nam Luận văn Thạc sĩ Khoa học BẢNG MỘT SỐ KÝ HIỆU VIẾT TẮT CMC Cacboxymetyl cellulase CHCl3 Chlorofom INT Iodonitrotetrazolium chloride PA Polyamide PBS Polybutylene succinate PBSA Polybutylene succinate - co-butylene adipate PCL Poly – ε – caprolactone PE Polyetylene PEC Polyester cacbonate PES Polyetylene succinate PHA Polyhyroxyalkanoate PHB Poly–3–hydroxybutyrate PHBV Poly–3–hydroxybutyrate - co -3-hydroxy valerate PLA Poly lactide acid PP Polypropylene PS Polystyrene PVC Polyvinylchlorua w/v Khố i lươ ̣ng (g)/thể tić h (ml) Nguyễn Thị Thanh Lịch K18 - Sinh học Thực nghiệm z luan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.nam luan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.nam Luận văn Thạc sĩ Khoa học MỞ ĐẦU "Ơ nhiễm mơi trường làm thay đổi tính chất môi trường, vi phạm tiêu chuẩn môi trường" (Theo Luật Bảo vệ Môi trường Việt Nam) Trên giới, ô nhiễm môi trường hiểu việc chuyển chất thải lượng vào môi trường đến mức có khả gây hại đến sức khoẻ người, đến phát triển sinh vật làm suy giảm chất lượng môi trường Các tác nhân ô nhiễm bao gồm chất thải dạng khí (khí thải), lỏng (nước thải), rắn (chất thải rắn) chứa hoá chất tác nhân vật lý, sinh học dạng lượng nhiệt độ, xạ Ô nhiễm môi trường trở thành hiểm họa đời sống sinh giới người phạm vi nào, từ quốc gia, khu vực đến tồn cầu Ơ nhiễm mơi trường sản phẩm q trình cơng nghiệp hóa thị hóa diễn 200 năm Ơ nhiễm lan tràn vào nơi, từ đất, nước đến khí quyển, từ bề mặt đất đến lớp sâu đất đại dương Giá nhiên liệu tăng cao vấn đề môi trường mối bận tâm hàng đầu nhân loại Việc sử dụng sản phẩm từ nhựa polymer có nguồn gốc sinh học để thay dần loại nhựa polymer tổng hợp hướng triển vọng Các sản phẩm từ polymer sinh học có ưu điểm khả tự phân hủy thành thành phần không gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên khả tự phân hủy chúng đất diễn chậm phải nhiều thời gian để trình phân hủy bắt đầu xảy Vi sinh vật phân hủy polymer sinh học nói chung ln tồn môi trường tự nhiên khác đất, nước, bùn Số lượng, chủng loại vi sinh vật có khả phân hủy polymer sinh học phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [37, 48, 57] Kết nghiên cứu Song cộng cho thấy 1g đất chứa từ 1,6104 đến 8,7105 tế bào, đất bùn 5,1105 tế bào nước biển có từ 102 đến 103 Nguyễn Thị Thanh Lịch z luan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.nam Khóa 2009-2011 luan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.nam Luận văn Thạc sĩ Khoa học tế bào/ml vi sinh vật có khả sử dụng hay phân hủy loại polymer sinh học khác [44] Trên giới có nhiều cơng bố chủng vi sinh vật có khả phân hủy polymer sinh học vi khuẩn, nấm sợi xạ khuẩn Ơ nhiễm mơi trường Việt Nam vấn đề gây nhức nhối với tồn xã hội, có nhiễm rác thải từ sản phẩm nhựa Viê ̣c phát triể n ứng dụng sản phẩm polymer si nh ho ̣c vào đời số ng nhằ m giảm thi ểu ô nhiễm môi trường ngày quan tâm Việc phân lập, tuyển chọn nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả phân hủy polymer sinh học cơng việc có ý nghĩa góp phần xử lý làm mơi trường Tuy nhiên Việt Nam số lượng công bố điều tra nghiên cứu vi sinh vật có khả phân huỷ polymer sinh học không nhiều Từ lí trên, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu đánh giá khả phân hủy poly lactic axit (PLA) số chủng vi sinh vật phân lập Việt Nam” làm sở cho việc ứng dụng việc tạo chế phẩm chủ động việc tăng nhanh trình phân huỷ tự nhiên giảm thiểu ô nhiễm môi trường Nguyễn Thị Thanh Lịch z luan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.nam Khóa 2009-2011 luan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.nam Luận văn Thạc sĩ Khoa học CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nhiễm mơi trƣờng giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình nhiễm mơi trƣờng giới Trong năm gần đây, nhân loại đối đầu với hiểm họa ô nhiễm môi trường gây Vấn đề ô nhiễm mơi trường khơng cịn riêng quốc gia nào, mà trở thành mối quan tâm tồn giới Các nhà hoạt động mơi trường Anh gọi xứ sở sương mù “hố rác châu Âu” Hiện tại, số lượng rác thải Anh năm tăng trung bình khoảng 3% Nếu khơng có biện pháp hữu hiệu, bãi rác có Anh hết chỗ chứa sau năm nữa, dẫn tới nguy khủng hoảng tương tự Napoli vừa qua Nguy tải bãi chứa rác không vấn đề riêng Italia Anh, mà nhiều quốc gia Liên minh châu Âu (EU) buộc phải quy định, bắt buộc nước thành viên phải giảm bớt nhanh chóng lượng rác thải, hạn chế đáng kể việc sử dụng lại bãi rác Theo Quyết định số 99/31/EU ngày 26-41999, thành viên EU đến năm 2010 phải giảm 25% lượng chất thải chở đến bãi rác so với mốc thời điểm năm 1995 đến năm 2020 65% [69] Ngồi nước có chiến lược xử lý rác đắn Đức, Hà Lan Áo; quốc gia vùng Bắc Âu đặc biệt coi trọng vấn đề Tại Thụy Điển phổ biến sản xuất phân bón từ rác thải sinh hoạt Chính nhờ biện pháp trên, Thụy Điển tăng tỷ lệ rác thải tái chế lên 49%, đồng thời giảm số lượng rác nói chung xuống tới 19% [69] Theo số liệu Cơ quan Bảo vệ mơi trường Mỹ có 55% tổng số rác Mỹ chở tới bãi rác năm 2006 Theo nghiên cứu Tổ chức “Hòa Bình Xanh”, đại dương khắp giới trở thành bãi rác khổng lồ chứa đựng gần 6,5 triệu rác thải (hình 1) [69] Nguyễn Thị Thanh Lịch z luan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.namluan.van.thac.si.nghien.cuu.danh.gia.kha.nang.phan.huy.polylactic.axit.pla.cua.mot.so.chung.vi.sinh.vat.phan.lap.o.viet.nam Khóa 2009-2011