luận văn thạc sĩ nghiên cứu tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen oshkt14 nhằm đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa oryza sativa 21

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đặng Ngọc Hoa NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở LÚA (Oryza sativa) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 z ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đặng Ngọc Hoa NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở LÚA (Oryza sativa) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Thị Phúc XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Giáo viên hƣớng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn thạc sĩ khoa học TS Đỗ Thị Phúc PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội - 2015 z LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Phúc, Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội thu nhận, hƣớng dẫn tận tình tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực luận văn thạc sỹ khoa học Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô công tác môn Di truyền học Khoa Sinh học bảo tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Trong trình học tập nghiên cứu phịng thí nghiệm Bộ mơn Di truyền học, nhận đƣợc giúp đỡ chia sẻ tận tình chun mơn tập thể anh chị bạn phịng thí nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu ! Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình tất bạn động viên chia sẻ khó khăn tơi thời gian qua ! Đặng Ngọc Hoa z MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây lúa khả chịu mặn 1.1.1 Giới thiệu lúa (Oryza sativa) 1.1.2 Đáp ứng với stress mặn thực vật lúa 11 1.2 Protein High-Affinity K+ Transporter (HKT) thực vật 16 1.2.1 Họ protein HKT thực vật 16 1.2.2 Họ protein HKT lúa 17 1.2.3 Gen OsHKT1;4 18 1.3 Một số phƣơng pháp sử dụng nghiên cứu đa hình 20 1.3.1 Phƣơng pháp PCR PCR-RFLP 20 1.3.2 Phƣơng pháp giải trình tự 21 1.4 Một số phƣơng pháp sử dụng phân tích biểu gen 24 1.4.1 Lai northern blot Lai huỳnh quang chỗ 24 1.4.2 RT-PCR Real time PCR 24 1.4.3 Microarray 25 1.5 Tình hình nghiên cứu liên quan đến họ gen HKT lúa 26 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 27 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 27 2.1.1 Vật liệu 27 2.1.2 Hóa chất 27 2.1.3 Thiết bị 29 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 2.2 Nhóm phƣơng pháp sử dụng phân tích đa hình gen 29 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 29 2.2.2 PCR khuếch đại vùng gen 29 2.2.3 Điện di gel agarose 30 2.2.4 Tinh sản phẩm PCR giải trình tự DNA 30 2.2.5 Phân tích số liệu 31 2.3 Nhóm phƣơng pháp sử dụng phân tích biểu gen 31 2.3.1 Trồng lúa dung dịch thủy canh xử lý mặn 31 2.3.2 Tách chiết RNA tổng số 31 2.3.3 Xử lý với DNase I 32 2.3.4 Tổng hợp cDNA 32 2.3.5 RT-PCR 32 2.3.6 Phân tích số liệu 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân tích đa hình vùng promoter gen OsHKT1;4 lúa 34 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lúa 34 3.1.2 Khuếch đại vùng promoter gen OsHKT1;4 34 3.1.3 Phân tích đa hình vùng promoter gen OsHKT1;4 lúa 35 3.1.4 Phân tích yếu tố cis thuộc vùng promoter gen OsHKT1;4 công cụ tin sinh 38 3.2 Phân tích đa hình vùng mã hóa gen OsHKT1;4 lúa 42 3.2.1 Khuếch đại vùng exon exon gen OsHKT1;4 42 3.2.2 Phân tích đa hình vùng exon exon gen OsHKT1;4 43 luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 3.3 Phân tích mức độ biểu gen OsHKT1;4 lúa 44 3.3.1 Trồng lúa thủy canh xử lý mặn 45 3.3.2 Tách chiết RNA tổng số từ mô 45 3.3.3 Phân tích mức độ biểu gen OsHKT1;4 phƣơng pháp RT-PCR 46 3.3.3.1 Tổng hợp cDNA 46 3.3.3.2 Phân tích mức độ biểu gen OsHKT1;4 phƣơng pháp RT-PCR 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các bậc phân loại phân bố lúa [8] 11 Bảng 1.2 Danh pháp, vị trí locus gen thuộc họ HKT lúa [37] 18 Bảng 2.1 Các mẫu sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.2 Trình tự mồi cho phản ứng PCR 28 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 30 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen 30 Bảng 2.5 Thành phần quy trình tổng hợp cDNA 32 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng RT-PCR 33 Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 33 Bảng 3.1 Các vị trí đa hình vùng promoter gen OsHKT1;4 giống lúa thuộc nhóm II so với sở liệu 38 Bảng 3.2 Kết dự đoán yếu tố cis vùng promoter gen OsHKT1;4 12 giống lúa nghiên cứu 40 luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây lúa phận Hình 1.2 Sơ đồ tiến hóa lúa [13] 10 Hình 1.3 Mơ hình hóa hệ thống số kênh vận chuyển Na+ thân bẹ rễ [65] 12 Hình 1.4 Tổng quan chế vận chuyển Na+ thành phần quan trọng hệ thống đáp ứng stress mặn tế bào rễ thực vật 14 Hình 1.5 Sự khác kích thƣớc intron phân họ HKT [37] 16 Hình 1.6 Vị trí phân bố kích thƣớc gen OsHKT1;4 NST số lúa 18 Hình 1.7 Mơ hình vận chuyển Na+ gen OsHKT1;4 thân bẹ [61] 19 Hình 1.8 Mơ hình phân tử dạng tồn vẹn (A) dạng sai khác cắt nối luân phiên (B) protein OsHKT1;4 [61] 20 Hình 1.9 Giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger 22 Hình 3.1 DNA tổng số tách từ mẫu 12 giống lúa 34 Hình 3.2 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng promoter gen OsHKT1;4 12 giống lúa 35 Hình 3.3 Kết phân tích đa hình trình tự nucleotide vùng promoter gen OsHKT1;4 12 giống lúa nghiên cứu so với sở liệu phần mềm MUTALIN 37 Hình 3.4 Trình tự vùng promoter gen OsHKT1;4 vị trí yếu tố cis giống lúa thuộc nhóm II 41 Hình 3.5 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng exon gen OsHKT1;4 sử dụng mồi OsHKT1;4-2 12 giống lúa 42 Hình 3.6 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng exon gen OsHKT1;4 sử dụng mồi OsHKT1;4-3 12 giống lúa 43 Hình 3.7 Kết phân tích đa hình trình tự nucleotide exon (A) exon (B) gen OsHKT1;4 12 giống lúa sở liệu 44 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số giống Pokkali 46 Hình 3.9 Kết phản ứng RT-PCR giống lúa Nipponbare (A) Pokkali (B) mức độ điều kiện stress mặn khác 47 Hình 3.10 Kết phân tích bán định lƣợng biểu gen OsHKT1;4 mức độ phiên mã giống lúa Nipponbare (A) Pokkali (B) 48 luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT bp Basepair cDNA Complementary DNA DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate dS/m deci Siemens per meter EC Electric Conductivity EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid gDNA Genomic DNA Gly Glycine HKT High-Affinity K+ Transporter mRNA Messenger RNA Os Oryza sativa PCR Polymerase Chain Reaction ppm part per million QLT quantitative trait loci RFLP Restriction fragment length polymorphism RT Reverse Transcriptase RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Ser Serine IRRI International Rice Research Institute TF Transcription factor luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 MỞ ĐẦU Hiện nay, nông nghiệp giới phải đối mặt với thử thách cung cấp khoảng 70% nguồn thức ăn cho thêm 2,3 tỷ ngƣời đến năm 2050 [27] Năng suất trồng nông nghiệp thấp chủ yếu stress phi sinh học khác nhƣ độ mặn cao, hạn hán, nhiệt độ mối đe dọa đến an ninh lƣơng thực toàn giới [82;53] Đáng ý, diện tích đất nhiễm mặn ngày tăng nhiều yếu tố bao gồm biến đổi khí hậu, mực nƣớc biển dâng cao, tồn mỏ đá muối… dẫn đến 50% diện tích đất canh tác nơng nghiệp vào năm 2050 [85] Việt Nam có đƣờng bờ biển dài 3.260 km, hệ thống sông chằng chịt đổ biển qua nhiều cửa sông Hai khu vực trồng nơng nghiệp nƣớc đồng sông Hồng sông Cửu Long hàng năm bị ảnh hƣởng nghiêm trọng xâm lấn nƣớc biển, nguyên nhân gây nhiễm mặn đất trồng trọt Stress mặn dẫn đến ức chế nghiêm trọng tăng trƣởng phát triển thực vật, gây cân ion tích lũy Na+ Cl-, tăng cƣờng peroxide lipid, tăng sản phẩm dạng phản ứng oxy nhƣ gốc superoxide hydroxyl Hiện có phƣơng pháp khắc phục nhiễm mặn Một cải tạo môi trƣờng, tạo điều kiện thuận lợi cho trồng phát triển, phƣơng pháp địi hỏi phải thực quy mơ lớn, kinh phí tốn nên khó áp dụng viêc canh tác trồng trọt ngƣời dân Phƣơng pháp thứ lựa chọn tạo giống trồng đáp ứng đƣợc với điều kiện stress: dễ tiếp cận, ứng dụng rộng rãi hơn, hạn chế kinh phí, hiệu cao lâu dài [91] Để cải thiện suất trồng điều kiện stress mặn việc cần thiết hiểu chế phân tử đằng sau đáp ứng stress mặn thực vật Khả chịu mặn tính trạng số lƣợng đƣợc kiểm sốt nhiều gen [15] luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21luan.van.thac.si.nghien.cuu.tinh.da.hinh.va.muc.do.bieu.hien.cua.gen.oshkt14.nham.danh.gia.moi.lien.quan.den.kha.nang.chiu.man.o.lua.oryza.sativa.21 z