luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính kháng kháng sinh của neisseria meningitidis tại các ổ dịch lưu hành trong quân đội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ XUÂN THU NGHÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA Neisseria meningitidis TẠI CÁC Ổ DỊCH LƢU HÀNH TRONG QUÂN ĐỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 z ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ XUÂN THU NGHÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA Neisseria meningitidis TẠI CÁC Ổ DỊCH LƢU HÀNH TRONG QUÂN ĐỘI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐOÀN TRỌNG TUYÊN GS TS PHẠM VĂN TY Hà Nội – 2015 z LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa Sinh Học-Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-Đại Học Quốc Gia Hà Nội, hết lòng tạo điều kiện để chúng tơi học tập tốt đạt thành ngày hôm Đặc biệt, với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy hướng dẫn TS Đoàn Trọng Tuyên GS TS Phạm Văn Ty đã tâ ̣n tâm hướng dẫn , giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhấ t đế n cán bô ̣ nhân viên của khoa Vi sinh Vật viê ̣n Y họ c Dự phòng Quân đội và Lañ h đa ̣o huy viện đã giúp đỡ tạo điều kiện để thu thập số liệu , thực nghiên cứu hoàn thành luận văn tốt nghiệp Xin gửi tới Ban lãnh đạo Bệnh viện Phổi Hà Nội lời cảm ơn sâu sắc tạo điều kiện thời gian để tơi hồn thành khóa học Một lần nữa, tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô, bạn bè tồn người thân gia đình ln giúp đỡ nhiệt tình động viên tơi suốt trình học tập Học Viên Vũ Thị Xuân Thu z MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh viêm màng não Neisseria meningitidis 1.1.1 Dịch tễ học bệnh viêm màng não 1.1.2 Dịch tễ học người mang mầm bệnh không triệu chứng 1.2 Đặc điểm sinh học N meningitidis 1.2.1 Danh pháp phân loại Não mô cầu [32] 1.2.2 Tính chất ni cấy 1.2.3 Sức đề kháng 1.2.4 Những kháng nguyên quan trọng Não mô cầu [2], [5], [9], [62] 1.3 Các kỹ thuật chẩn đốn phịng thí nghiệm 11 1.3.1 Kỹ thuật nhuộm soi 11 1.3.2 Kỹ thuật phân lập 11 1.3.3 Kỹ thuật điện di miễn dịch 12 1.3.4 Kỹ thuật ngưng kết 12 1.3.5 Kỹ thuật sinh học phân tử phát vi khuẩn gây viêm màng não 13 1.4 Đặc điểm gene đích phát N meningitidis 14 1.5 Đặc điểm gene đích (gene đặc hiệu) xác định nhóm huyết N meningitidis 16 1.6 Đáp ứng miễn dịch 19 1.7 Điều trị dự phòng 21 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng 24 2.2 Vật liệu nghiên cứu 24 z 2.2.1 Thiết bị 24 2.2.2 Sinh phẩm 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang 25 2.3.2 Phương pháp thực nghiệm phịng thí nghiệm 25 2.4 Xử lý số liệu phần mềm Epi–info 3.2 34 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 35 3.1 Đặc điểm sinh học cấu nhóm huyết Neisseria meningitidis phân lập số đơn vị tân binh quân đội 35 3.1.1 Đặc điểm sinh học chủng Neisseria meningitidis phân lập đơn vị tân binh quân đội 35 3.1.2 Cơ cấu nhiễm Neisseria meningitidis nhóm huyết chủng Neisseria meningitidis phân lập đơn vị tân binh quân đội phương pháp PCR 38 3.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh học phân tử chủng N.meningitidis phân lập cặp mồi đặc hiệu lồi nhóm N.meningitidis thơng qua phản ứng PCR 44 3.2 Đánh giá nhậy cảm với kháng sinh chủng N meningitidis nhóm huyết B C 53 KẾT LUẬN 58 KHUYẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 71 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh học Neisseria meningitidis Bảng 1.2 : Dạng nhóm huyết capsule gene đích cho genotype N meningitidis 18 Bảng 1.3 Protein màng N meningitidis 20 Bảng 1.4 Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán, điều trị nhiễm N meningitidis 21 Bảng Các hóa chất gắn giếng thẻ định danh NH 26 Bảng 2.2: Trình tự mồi khảo sát phát gene đích N meningitidis nhóm huyết (A; B; C) 31 Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn Viện lâm sàng chuẩn thức phịng thí nghiệm (CLSI) năm 2013 33 Bảng 3.1 Đặc điểm chuyển hóa axit amin N.meningitidis 35 Bảng 3.2 Đặc điểm chuyển hóa đường N.meningitidis 36 Bảng 3.3 Đặc điểm chuyển hóa axit amin N.meningitidis 37 Bảng 3.4 Đặc điểm chuyển hóa đường N.meningitidis 37 Bảng 3.5: Tỷ lệ nhiễm N meningitidis nhóm huyết lưu hành 03 đơn vị giám sát 38 Bảng 3.6: Tần suất nhiễm N meningitidis nhóm huyết 39 theo trung đoàn 39 Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm N meningitidis nhóm huyết theo vị trí địa lý 41 Bảng 3.8 Kết kiểm tra chủng N meningitidis NH cấu nhóm huyết kỹ thuật Multiplex-PCR 42 Bảng 3.9: Xác định MIC chủng Neisseria meningitidis, nhóm huyết B (n=23) 53 Bảng 3.10: Kết thử nghiệm in vivo người nhiễm N meningitidis, nhóm huyết B 55 Bảng 3.11 : Xác định MIC (in vitro) chủng Neisseria meningitidis, nhóm huyết C (n=4) 55 Bảng 3.12: Kết thử nghiệm in vivo người nhiễm N meningitidis, nhóm huyết C 56 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doi z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N meningitidis từ dịch não tủy Hình 1.2:Khuẩn lạc N meningitidis thạch chocolate Hình 1.3: Khuẩn lạc N meningitidis thạch máu Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N meningitidis cắt ngang Hình 1.5: Hình ảnh ni cấy N meningitidis mơi trường thạch chocolate có kháng sinh 12 Hình1.6: Hình ảnh định danh N meningitidis định danh API NH 12 Hình 1.7 : Hình ảnh sinh phẩm Pastorex phát N meningitidis 13 Hình 1.8: Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên N meningitidis 15 Hình 1.9 : Bản đồ gene capsule (CPS) Nmen (14), ctrABCD operon mã hóa ATP-protein 19 Hình 2.1 : Thiết kế nghiên cứu đặc điểm sinh học N meningitidis 25 Hình 2.2 Thanh E test 33 Hình 2.3 Kết thử nghiệm MIC E test 33 Hình 3.1: Khảo sát gene CtrA 32 chủng N Meningitidis 45 Hình 3.2: Khảo sát gene ctrA 32 chủng N Meningitidis 46 Hình 3.3: Tiếp tục khảo sát xuất gene ctrA 32 chủng N Meningitidis 47 Hình 3.4: Kết khảo sát có mặt gene Por A 32 chủng N meningitidis phân lập 48 Hình 3.5: Khảo sát gene CrgA mã hóa LysR N meningitidis 32 49 Hình 3.6: Khảo sát gene SodC 32 chủng N meningitidis 50 Hình 3.7 : Khảo sát gene sac D phát N meningitidis nhóm huyết A, 51 Hình 3.8: Khảo sát gene sac Db phát N meningitidis nhóm B 52 Hình 3.9: Khảo sát gene sia Dc phát N meningitidis nhóm C 53 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doi z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT NMC: Não mô cầu VMN: Viêm màng não PS: Polysaccharide LOS: Lipo – oligosaccharide LPS: Lipopolysaccharide OMP: OuRer membrase protein PCR: Polymerase chain reaction MIC Minimum inhibition concentration VSV: Vi sinh vật luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doi z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doi MỞ ĐẦU Viêm màng não bệnh lý nhiễm trùng nghiêm trọng, tỷ lệ tử vong cao không nghĩ đến, khơng chẩn đốn điều trị kịp thời Sự hiểu biết tác nhân gây bệnh thường gặp, hỗ trợ cho công tác điều trị xây dựng chương trình phịng chống bệnh tật Quốc gia Hầu hết liệu dịch tễ viêm màng não mủ người lớn xuất phát từ quốc gia phát triển, tác nhân gây bệnh thường gặp là: Streptococcus pneumoniae (30%-60%), Neisseria meningitidis (13-37%), Listeria monocytogenes Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae type b (Hib) Streptococcus pneumoniae loại vi khuẩn có vỏ (polysaccharide-encapsuleated) nguyên nhân quan trọng gây bệnh tử vong giới [23] Hàng năm có từ 400.000 – 500.000 người chết viêm màng não (WHO, 2006) Trong thời gian cuối kỷ 20 đầu kỷ 21, có chuyển đổi việc chẩn đốn tác nhân sinh học, kết hợp kiểu hình huyết học với việc xác định kiểu gene kỹ thuật sinh học phân tử [39] Phân tích tính đa dạng tổ hợp trình tự nhiều vùng gene (MLST) tiêu chuẩn vàng cho việc xác định đặc điểm vi khuẩn N meningitidis phục vụ công tác giám sát dịch tễ học Sự phát triển kỹ thuật phân tử cho phép phân tích vi khuẩn gây viêm màng não từ mẫu nuôi cấy phân lập khơng phân lập để chẩn đốn xác định ca bệnh trở thành cơng cụ hữu ích cho nâng cao chất lượng giám sát, phát tiên lượng dịch, chiến lược phịng ngừa nước Châu âu [7] Nhằm nâng cao chất lược, hiệu việc phát tác nhân sở xác định đặc điểm kiểu hình kiểu gene Neisseria meningitidis quan trọng giúp tiên lượng, dự báo dịch đề xuất phác đồ dự phòng, điều trị nhằm hạn chế tỷ lệ nhiễm N meningitidis, mắc bệnh luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doi z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doi cộng đồng Với đề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu đặc điểm sinh học tính kháng kháng sinh Neisseria meningitidis ổ dịch lưu hành quân đội Với mục tiêu: Xác định đặc điểm sinh học cấu nhóm huyết Neisseria meningitidis phân lập số đơn vị tân binh quân đội Xác định tính nhạy cảm kháng sinh chủng Neisseria meningitidis phân lập từ người mang mầm bệnh không triệu chứng luan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doiluan.van.thac.si.nghien.cuu.dac.diem.sinh.hoc.va.tinh.khang.khang.sinh.cua.neisseria.meningitidis.tai.cac.o.dich.luu.hanh.trong.quan.doi z