luận văn thạc sĩ một số đặc tính sinh học của virus lở mồm long móng type o phân lập được ở lợn tại miền bắc việt nam năm 2015 2016

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM HỒNG VĂN TỜ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP ĐƯỢC Ở LỢN TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM NĂM 2015 - 2016 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa đượccông bố công trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận văn Hoàng Văn Tờ i c năm 2017 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập hồn thành luận văn, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý báu quý thầy cô, anh chị bạn Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cám ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa Thú y, thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam chia sẻ tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trường Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thầy kính mến TS Lê Văn Phan, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình bảo, ln giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo toàn thể anh chị, bạn Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam, đặc biệt anh chị phòng R&D Lab nơi tơi cơng tác tận tình hướng dẫn bảo, chia sẻ giúp đỡ suốt thời gian thực tập Cuối xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, bạn tập thể lớp CH24 TYC, người ln động viên, giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu để hồn thành tốt luận văn Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận văn Hoàng Văn Tờ ii c năm 2017 MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh Mục Bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích nghiên cứu .2 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình bệnh LMLM giới việt nam 2.1.1 Thông tin chung bệnh lở mồm long móng 2.1.2 Tình hình bệnh LMLM nghiên cứu bệnh LMLM giới .3 2.1.3 Tình hình bệnh LMLM nghiên cứu bệnh LMLM Việt Nam .5 2.2 Đặc điểm sinh học virus LMLM 10 2.2.1 Căn bệnh 10 2.2.2 Sự phân bố chủng virus gây bệnh 12 2.2.3 Dịch tễ học 13 2.2.4 Triệu chứng lợn 15 2.2.5 Bệnh tích 15 2.2.6 Các phương pháp chẩn đoán 15 2.2.7 Phòng bệnh 18 2.2.8 Điều trị 18 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 20 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 20 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 iii c 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22 3.1.4 Thời gian nghiên cứu .22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 3.2.1 Chẩn đoán chủng virus LMLM sinh học phân tử .22 3.2.2 Nghiên cứu đặt tính sinh học chủng virus LMLM type O phân lập miền bắc Việt Nam 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Phương pháp thu thập xử lý mẫu 22 3.3.2 Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm 23 3.3.3 Phương pháp One-step RT-RCR 23 3.3.4 Phương pháp phân lập virus LMLM môi trường tế bào BHK-21 .24 3.4.5 Phương pháp xác định hiệu giá virus môi trường tế bào 27 3.4.6 Phương pháp giải trình tự gen 28 3.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 29 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 30 4.1 Kết chẩn đoán chủng virus lmlm sinh học phân tử 30 4.1.1 Kết thu thập mẫu 30 4.1.2 Kết RT- PCR chẩn đốn định tính virus LMLM 31 4.1.3 Kết chẩn đoán định type virus LMLM .31 4.2 Kết phân lập xác định số đặc điểm sinh học virus LMLM Type o phân lập 33 4.2.1 Kết phân lập virus xác định khả gây bệnh tích tế bào qua đời cấy chuyển 33 4.2.2 Kết RT-PCR kiểm tra mẫu virus LMLM type O phân lập 37 4.2.3 Kết xác định hiệu giá virus LMLM type O 38 4.2.3.1 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển virus tế bào 38 4.2.3.2 Thích nghi virus LMLM type O phân lập tế bào BHK-21 39 4.3 Kết giải trình tự GEN VP1 41 4.3.1 Kết phân tích trình tự gen VP1 chủng virus LMLM phân lập 43 iv c luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016 4.4 Kết xây dựng phát sinh chủng loại 51 Phần Kết luận kiến nghị 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị .54 Tài liệu tham khảo 55 Phụ lục 59 v c luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016 luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt µl Microlit BHK Baby Hamster Kidney DNA Complement Deoxynucleotide Acid CPE Cytopathogenic Effect DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FMDV Foot and Mouth Disease Virus LMLM Lở mồm long móng OIE Office International des Epizooties PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleotide Acid RT-PCR Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction SN Serum Neutralizing TBE Tris Borate EDTA TCID50 50% The Tissue Culture Infectious Dose vi c luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016 luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi dùng chẩn đốn định type virus Lở 20 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT-PCR 23 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 24 Bảng 4.1 Thông tin mẫu bệnh phẩm nghi mắc LMLM 30 Bảng 4.2 Kết chẩn đoán định tính định type virus LMLM 32 Bảng 4.3 Kết gây nhiễm mẫu virus LMLM môi trường tế bào BHK-21 34 x Bảng 4.4 Kết chuẩn độ virus LMLM type O (10 TCID50/ml) 38 Bảng 4.5 Hiệu giá chủng virus LMLM type O qua đời cấy chuyển (10x TCID50/ml) 40 Bảng 4.6 Thông tin chủng virus LMLM type O tham chiếu sử dụng nghiên cứu 42 Bảng 4.7 Tỷ lệ tương đồng (%) gen VP1 chủng virus O/VN/HD/2016 type O topotype Cathay nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác Việt Nam 45 Bảng 4.8 Tỷ lệ tương đồng (%) amino acid gen VP1 chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 với chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác Việt Nam 46 Bảng 4.9 Tỷ lệ tương đồng (%) gen VP1 chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam 49 Bảng 4.10 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự amino acid gen VP1 chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam 51 vii c luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016 luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái cấu tạo virus Lở mồm long móng 10 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc hệ gen virus LMLM 12 Hình 4.1 Kết chẩn đốn định tính virus LMLM 15 mẫu bệnh phẩm phản ứng RT-PCR 31 Hình 4.2 Kết định type virus LMLM phản ứng RT-PCR 32 Hình 4.3 Kết theo dõi gây nhiễm chủng LMLM tế bào BHK-21 36 Hình 4.4 Kết RT-PCR kiểm tra chủng virus LMLM phân lập .37 Hình 4.5 Kết RT-PCR kiểm tra chủng virus LMLM phân lập với mồi định type A LMLM 37 Hình 4.6 Kết RT-PCR kiểm tra chủng virus LMLM phân lập với mồi định type Asia1 LMLM 38 Hình 4.7 Đường cong sinh trưởng chủng virus LMLM theo thời gian 39 Hình 4.8 Log10 Hiệu giá chủng virus LMLM type O qua đời cấy chuyển 41 Hình 4.9 Mức độ tương đồng nucleotide chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 type O topotype Cathay nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác Việt Nam 44 Hình 4.10 Mức độ tương đồng amino acid gen VP1 chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 với chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác Việt Nam 45 Hình 4.11 Mức độ tương đồng nucleotide chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam 48 Hình 4.12 Mức độ tương đồng amino acid chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam 50 Hình 4.13 Cây phát sinh chủng loại chủng virus LMLM type O phân lập Việt Nam 52 viii c luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016 luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016 TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hoàng Văn Tờ Tên luận văn: “Một số đặc tính sinh học virus lở mồm long móng type O phân lập lợn miền bắc Việt Nam năm 2015 - 2016” Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Các chủng virus LMLM type O phân lập nguồn vi sinh vật quan trọng phục vụ nghiên cứu khác nghiên cứu bảo tồn quỹ gen, nghiên cứu sản xuất vắc xin, nghiên cứu tạo kit chẩn đốn… Cung cấp thơng tin hữu ích chủng virus LMLM type O lợn lưu hành Việt Nam làm sở để lựa chọn vắc xin phịng bệnh thích hợp việc định hướng sản xuất vắc xin tương lai Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu thập xử lý mẫu bệnh phẩm; Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm; Phương pháp One-step RT-RCR; Phương pháp phân lập virus LMLM môi trường tế bào BHK-21; Phương pháp xác định hiệu giá virus môi trường tế bào; Phương pháp giải trình tự gen; Phương pháp xử lý số liệu Kết kết luận - Kết chẩn đốn cho thấy có 9/15 mẫu bệnh phẩm thu thập cho kết dương tính với virus LMLM, kết định type cho thấy 9/9 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus Lở mồm long móng type O - Kết phân lập virus môi trường tế bào BHK-21 thu chủng virus LMLM, chủng virus phân lập gây bệnh tích tế bào BHK- 21: Kết gây nhiễm virus môi trường tế bào cho thấy 80-90% tế bào bị phá hủy sau 48h gây nhiễm virus - Kết nghiên cứu đường cong sinh trưởng virus cho thấy chủng virus LMLM phân lập phát triển nhanh sau từ 12 đến 48 giờ, sau 48 gây ix c luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016luan.van.thac.si.mot.so.dac.tinh.sinh.hoc.cua.virus.lo.mom.long.mong.type.o.phan.lap.duoc.o.lon.tai.mien.bac.viet.nam.nam.2015.2016