(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị alzheimer trên thực nghiệm của đan sâm di thực (salvia miltiorrhiza bunge, lamiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG THEO HƯỚNG ĐIỀU TRỊ ALZHEIMER TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA ĐAN SÂM DI THỰC (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2021 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG THEO HƯỚNG ĐIỀU TRỊ ALZHEIMER TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA ĐAN SÂM DI THỰC (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LÝ - DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ : 62720405 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đào Thị Vui PGS.TS Nguyễn Thành Hải HÀ NỘI, NĂM 2021 luan an LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thực Các số liệu kết nêu luận án trung thực, chưa công bố tác giả cơng trình khác Tác giả luận án Trần Thị Loan luan an LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, nỗ lực thân, nhận nhiều giúp đỡ từ phía thầy cơ, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS Đào Thị Vui – Trưởng môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội PGS.TS Nguyễn Thành Hải – Giảng viên môn Dược lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội, người Thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình dìu dắt, bảo, trang bị cho kiến thức khoa học quý giá động viên suốt trình thực luận án Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược lực, Bộ mơn Dược lâm sàng, Bộ mơn Dược liệu, Phịng Quản lý Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Dược Hà Nội quan tâm tạo điều kiện, cho học tập nghiên cứu Ban Giám đốc Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, Khoa Dược Phòng chức - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên động viên tạo điều kiện, giúp đỡ suốt trình học tập PGS.TS Phương Thiện Thương khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu; PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu ; PGS.TS Bùi Thanh Tùng ThS Đặng Kim Thu – Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội; ThS Trần Danh Việt – Trung tâm nghiên cứu trồng chế biến thuốc Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tơi thời gian hồn thành luận án DS Ngơ Thị Dịu – sinh viên khóa 68 DS Nguyễn Thị Thanh – sinh viên khóa 69 đồng hành thời gian nghiên cứu Cuối cùng, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè thân thiết ln bên động viên chỗ dựa tinh thần để vượt qua khó khăn vất vả suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Trần Thị Loan luan an MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ v ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Dịch tễ .3 1.1.3 Triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng .4 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh đích liên quan đến chế bệnh sinh 1.2 Tổng quan thuốc điều trị bệnh Alzheimer hợp chất nghiên cứu 13 1.2.1 Tổng quan thuốc điều trị bệnh Alzheimer 13 1.2.2 Tổng quan hợp chất nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer 15 1.3 Tổng quan số mơ hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm phương pháp đánh giá nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer 17 1.3.1 Các mơ hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm .17 1.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng thông qua test hành vi 22 1.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng số đích liên quan đến chế bệnh sinh bệnh Alzheimer 25 1.4 Tổng quan Đan sâm .28 1.4.1 Tên khoa học 28 1.4.2 Đặc điểm thực vật phân bố 28 1.4.3 Bộ phận dùng 29 1.4.4 Các nghiên cứu thành phần hóa học rễ Đan sâm 29 1.4.5 Các nghiên cứu tác dụng dược lý liên quan đến điều trị bệnh Alzheimer thực nghiệm Đan sâm 29 Chương NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .33 luan an 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 33 2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 33 2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 34 2.1.3 Động vật nghiên cứu .36 2.1.4 Tế bào nghiên cứu 36 2.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 36 2.2.1 Hóa chất nghiên cứu 36 2.2.2 Máy móc thiết bị nghiên cứu 37 2.3 Địa điểm nghiên cứu 38 2.4 Nội dung nghiên cứu 38 2.5 Phương pháp nghiên cứu 40 2.5.1 Phương pháp nghiên cứu tác dụng cao rễ Đan sâm di thực mơ hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thơng qua số test hành vi 40 2.5.2 Phương pháp đánh giá tác dụng cao rễ Đan sâm di thực số đích liên quan đến chế bệnh sinh bệnh Alzheimer 48 2.6 Xử lý số liệu .58 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59 3.1 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực mơ hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua test hành vi 59 3.1.1 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực mơ hình gây suy giảm trí nhớ scopolamin 59 3.1.2 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực mơ hình gây suy giảm trí nhớ β-amyloid25-35 65 3.1.3 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực mô hình gây suy giảm trí nhớ trimethyltin 68 3.2 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực số đích liên quan đến chế bệnh sinh bệnh Alzheimer 72 3.2.1 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết cholinergic 72 3.2.2 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid 78 luan an 3.2.3 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa 81 Chương BÀN LUẬN 87 4.1 Đối tượng nghiên cứu liều dùng cao rễ Đan sâm nghiên cứu 87 4.1.1 Dược liệu nghiên cứu 87 4.1.2 Chiết xuất mẫu nghiên cứu .88 4.1.3 Liều dùng cao rễ Đan sâm nghiên cứu 89 4.2 Tác dụng cao rễ Đan sâm mơ hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thơng qua test hành vi 90 4.2.1 Các test hành vi sử dụng nghiên cứu .90 4.2.2 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực mơ hình gây suy giảm trí nhớ scopolamin 93 4.2.3 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực mơ hình gây suy giảm trí nhớ β-amyloid25-35 97 4.2.4 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực mơ hình gây suy giảm trí nhớ trimethyltin 102 4.3 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực số đích liên quan đến chế bệnh sinh bệnh Alzheimer 105 4.3.1 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực đích liên quan đến giả thuyết cholinergic .105 4.3.2 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid 110 4.3.3 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa 113 4.4 Bàn luận chung .118 4.5 Đóng góp hạn chế đề tài 120 4.5.1 Đóng góp đề tài .120 4.5.2 Hạn chế đề tài 121 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO v luan an DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng việt/ tiếng anh AChE Acetylcholinesterase APP Protein tiền chất amyloid/ Amyloid precursor protein ATCI Acetylthiocholin iodid BACE Enzym phân cắt vị trí APP beta /beta-site APP-cleaving enzyme BDNF Yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não/ Brain-derived neurotrophic factor BuChE Butyrylcholinesterase CAT Catalase ChAT Choline acetyltransferase CYP P450 Cytochrom P450 DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl DTNB Acid 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic EĐS Cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm FDA Cục Quản lý Thực phẩm Dược Hoa Kỳ/ Food and Drug Administration GPx Glutathion peroxidase/ Glutathione peroxidase GSH-Px Glutathione peroxidase GT Giả thuyết HĐS Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao/ High performance liquid chromatography I.c.v Tiêm vào bên não thất/ Intracerebroventricularly I.p Tiêm phúc mạc/ Intraperitoneal i luan an Chữ viết tắt Tên tiếng việt/ tiếng anh IC50 Nồng độ ức chế 50%/ 50% inhibitory concentration Km Hằng số Michalis Menten LD50 Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm/ Lethal dose 50 MDA Malondialdehyde MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2,5-diphenyltetrazolium bromid NaCMC Natri carboxymetyl cellulose NBT Nitro blue tetrazolium NFTs Đám rối sợi thần kinh / Neurofbrillary tangles NG108-15 Dòng tế bào u nguyên bào thần kinh chuột cống N18TG2 lai với dòng tế bào u thần kinh đệm chuột nhắt C6BU-1/ Neuroblastoma x glioma hybrid cell NMDA N-methyl-D-aspartat PC-12 Tế bào PC12/Pheochromocytoma 12 SC50 Nồng độ có khả dọn 50% gốc tự do/ 50% scavenging concentration SH-SY5Y Tế bào u nguyên bào thần kinh SH-SY5Y/ SH-SY5Y human neuroblastoma cells SGTN Suy giảm trí nhớ SKD Sinh khả dụng SOD Superoxid dismutase/ Superoxide dismutase T1/2 Thời gian bán thải TBA Acid thiobarbituric Tmax Thời gian đạt nồng độ đỉnh huyết tương TNF-α Yếu tố hoại tử khối u α/ Tumor Necrosis Factor-α v Tốc độ phản ứng Vd Thể tích phân bố vmax Tốc độ phản ứng cực đại ii luan an DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh Alzheimer Bảng 1.2 Một số test hành vi thường dùng chuột nhắt .23 Bảng 1.3 Một số nghiên cứu đánh giá tác dụng thông qua test hành vi chuột nhắt bị gây suy giảm trí nhớ 24 Bảng 1.4 Tổng hợp nghiên cứu tác dụng dược lý Đan sâm liên quan đến điều trị bệnh Alzheimer thực nghiệm 30 Bảng 2.1 Thành phần mẫu để xác định khả ức chế enzym AChE cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro 50 Bảng 2.2 Thành phần mẫu để xác định đặc điểm động học ức chế enzym AChE cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro 51 Bảng 2.3 Thành phần mẫu để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào NG108-15 khỏi độc tính gây β-amyloid25-35 cao rễ Đan sâm di thực 54 Bảng 2.4 Thành phần giếng để xác định khả dọn gốc DPPH cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro 56 Bảng 2.5 Thành phần giếng để xác định khả dọn gốc superoxid cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro 57 Bảng 3.1 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực test mê lộ chữ Y mơ hình gây suy giảm trí nhớ scopolamin .59 Bảng 3.2 Ảnh hưởng cao rễ Đan sâm di thực đến thời gian khám phá đồ vật pha luyện tập test nhận diện đồ vật mơ hình scopolamin 61 Bảng 3.3 Ảnh hưởng cao rễ Đan sâm di thực đến thời gian khám phá đồ vật pha kiểm tra test nhận diện đồ vật mơ hình scopolamin 62 Bảng 3.4 Ảnh hưởng cao rễ Đan sâm di thực đến thời gian tiềm tàng vào buồng tối mơ hình scopolamin 64 Bảng 3.5 Tác dụng cao rễ Đan sâm di thực test mê lộ chữ Y mơ hình gây suy giảm trí nhớ β-amyloid25-35 66 Bảng 3.6 Ảnh hưởng cao rễ Đan sâm di thực đến thời gian tiềm tàng vào buồng tối mơ hình gây suy giảm trí nhớ β-amyloid25-35 .67 iii luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) 8.4 Kết thử nghiệm xác định mức liều β-amyloid25-35 gây suy giảm trí nhớ - Ảnh hưởng mức liều β-amyloid25-35 test mê lộ chữ Y Trong test mê lộ chữ Y, ảnh hưởng β-amyloid25-35 tiêm vào não thất đánh giá thông qua tỷ lệ chuyển tiếp tổng số lần vào cánh tay Kết trình bày bảng 8.1 Bảng 8.1 Ảnh hưởng β-amyloid25-35 tiêm vào não thất đến trí nhớ chuột test mê lộ chữ Y Lô Dung dịch tiêm vào não thất Tỷ lệ chuyển tiếp (%) Tổng số lần vào cánh tay Chứng sinh lý Nước cất 72,91 ± 9,03 47,0 ± 14,44 71,58 ± 4,64 38,44 ± 12,39 Chứng bệnh Tỷ lệ giảm so với chứng sinh lý β-amyloid25-35 nmol 1,82 58,76 ± 10,80## Chứng bệnh Tỷ lệ giảm so với chứng sinh lý ## β-amyloid25-35 nmol 49,33 ± 12,29 19,41 p0,05) - Ảnh hưởng mức liều β-amyloid25-35 test né tránh thụ động Trong test né tránh thụ động, ảnh hưởng tiêm não thất β-amyloid25-35 đánh giá thông qua thời gian tiềm tàng vào buồng tối pha luyện tập kiểm tra Kết trình bày bảng 8.2 xxviii (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) Bảng 8.2 Ảnh hưởng β-amyloid25-35 tiêm vào não thất đến thời gian tiềm tàng vào buồng tối test né tránh thụ động Dung dịch tiêm vào não thất Lô Thời gian tiềm tàng vào buồng tối Pha luyện tập Pha kiểm tra Chứng sinh lý Nước cất 46,12 (35,05-57,05) 283,03 (146,14 - 300,0) Chứng bệnh β-amyloid25-35 nmol 63,0 (31,14-117,85) 300,0 (297,50 - 300,0) 19,59 (8,83-49,30) 42,84 (14,81-159,09)## Chứng bệnh β-amyloid25-35 nmol Tỷ lệ giảm so với chứng sinh lý ## 84,86 p0,05) Trong pha kiểm tra, lô chứng bệnh tiêm não thất β-amyloid25-35 liều nmol làm thời gian tiềm tàng vào buồng tối giảm 84,86% so với lô chứng sinh lý (p0,05) xxix (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) PHỤ LỤC THẦM ĐỊNH MƠ HÌNH GÂY SUY GIẢM TRÍ NHỚ BẰNG TRIMETHYLTIN 9.1 Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng, giống đực chủng Swiss albino, khỏe mạnh, – tuần tuổi, khối lượng ban đầu 20-25 g, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột ni điều kiện phịng thí nghiệm (nhiệt độ: 25 ± 2oC, độ ẩm: 60-70%), cho ăn thức ăn tiêu chuẩn uống nước tự điều kiện sáng tối đảo ngược (pha sáng: 19 - giờ; pha tối: - 19 giờ) 9.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 9.2.1 Hóa chất nghiên cứu Trimethyltin clorid 146498 Sigma Aldrich, Đức 9.2.2 Máy móc thiết bị nghiên cứu Bộ dụng cụ cho test mê lộ chữ Y, mê lộ nước Morris thiết kế theo hướng dẫn Panlab, Mỹ 9.3 Phương pháp nghiên cứu Trimethyltin hợp chất hữu thiếc có độc tính cao thần kinh trung ương Trong nghiên cứu thực nghiệm, trimethyltin tỷ lệ gây chết động vật tương đối cao Dựa nghiên cứu trước đây, mức liều trimethyltin tiêm phúc mạc hay dùng chuột nhắt gồm 2,3; 2,4; 2,5 mg/kg [39], [111], [118], [146], [166] Thời điểm đánh giá hành vi sau gây mơ hình thường sau hay ngày [12], [99], [146] Do đó, đề tài tiến hành khảo sát: - Tỷ lệ động vật chết ba mức liều trimethyltin bao gồm: 2,3; 2,4; 2,5 mg/kg - Khả gây suy giảm trí nhớ test hành vi bắt đầu đánh giá sau ngày kể từ tiêm trimethyltin 9.3.1 Phương pháp đánh giá độc tính cấp trimethyltin chuột nhắt trắng - Thiết kế nghiên cứu Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô xxx (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) Lô sinh lý: Chuột tiêm phúc mạc nước muối sinh lý 0,2 ml/10 g cân nặng Lô TMT1: Chuột tiêm phúc mạc trimethyltin liều 2,3 mg/kg Lô TMT2: Chuột tiêm phúc mạc trimethyltin liều 2,4 mg/kg Lô TMT3: Chuột tiêm phúc mạc trimethyltin liều 2,5 mg/kg Sau thích nghi, chuột tiêm phúc mạc trimethyltin với mức liều khác tương ứng với ba lô bệnh (riêng lô chứng sinh lý tiêm nước muối sinh lý) Theo dõi liên tục đầu đến 48 sau tiêm - Thông số đánh giá + Tình trạng chung chuột, hoạt động tự nhiên lại, leo trèo, tư thế, màu sắc mũi, tai, đuôi… dấu hiệu nhiễm độc nôn, co giật, kích động, tiết phân, nước tiểu… + Số lượng chuột chết vòng 48 sau tiêm 9.3.2 Phương pháp đánh khả gây suy giảm trí nhớ cuả trimethyltin test hành vi Dựa kết thử nghiệm đánh giá độc tính trimethyltin, lựa chọn mức liều có tỷ lệ gây chết động vật 48 thấp Trong thử nghiệm tiến hành đánh giá hành vi sau tiêm trimethyltin ngày - Thiết kế nghiên cứu Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô Lô sinh lý 2D: Chuột tiêm phúc mạc nước muối sinh lý 0,2 ml/10 g cân nặng Lô sinh lý 7D: Chuột tiêm phúc mạc nước muối sinh lý 0,2 ml/10 g cân nặng Lô TMT 2D: Chuột tiêm phúc mạc trimethyltin với liều xác định từ TN1 Lô TMT 7D: Chuột tiêm phúc mạc trimethyltin với liều xác định từ TN1 Sau thích nghi, chuột tiêm phúc mạc trimethyltin với mức liều xác định từ thử nghiệm với hai lô bệnh (riêng lô chứng sinh lý tiêm nước xxxi (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) muối sinh lý) Ngày thứ 2, bắt đầu tiến hành test mê lộ chữ Y ngày thứ 5, bắt đầu tiến hành test mê lộ nước Morris lô sinh lý 2D lô TMT 2D Ngày thứ 7, bắt đầu tiến hành test mê lộ chữ Y ngày thứ 10, bắt đầu tiến hành mê lộ nước Morris lô sinh lý 7D lô TMT 7D Quy trình đánh giá trình bày hình - Thông số đánh giá Thông số đánh giá test hành vi (trình bày chi tiết mục 2.4.1.4), gồm có: + Trên test mê lộ chữ Y, thông số đánh giá gồm tỷ lệ chuyển tiếp tổng số lần vào cánh tay + Trên test mê lộ nước Morris, thông số đánh giá gồm thời gian tiềm tàng để tìm thấy bến đỗ thời gian chuột lưu lại góc phần tư đích Hình 9.1 Quy trính đánh giá gây suy giảm trí nhớ trimethyltin test hành vi 9.4 Kết nghiên cứu 9.4.1 Kết đánh giá độc tính cấp trimethyltin Ảnh hưởng trimethyltin tiêm phúc mạc đến số lượng chuột chết co giật trình bày bảng 9.1 xxxii (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) Bảng 9.1 Ảnh hưởng trimethyltin tiêm phúc mạc đến chuột nhắt trắng Liều Số lượng trimethyltin chuột co giật (mg/kg) (con) Lô (n=6) Chứng sinh lý Số lượng chuột chết (con) Tỷ lệ chuột chết co giật (%) 0 TMT1 2,3 16,7 TMT2 2,4 1 33,3 TMT3 2,5 50,0 Kết bảng 9.1 cho thấy lô bệnh TMT1 tiêm phúc mạc trimethyltin liều 2,3 mg/kg không gây chết chuột mà làm co giật 01 Trong hai lơ bệnh TMT2 TMT3 mức liều cao gây chết chuột Dựa vào kết trimethyltin tiêm phúc mạc liều 2,3 mg/kg lựa chọn cho thử nghiệm đánh giả khả gây suy giảm trí nhớ 9.4.2 Kết khả gây suy giảm trí nhớ trimethyltin chuột nhắt 9.4.2.1 Ảnh hưởng trimethyltin test mê lộ chữ Y Trong test mê lộ chữ Y, ảnh hưởng trimethyltin tiêm phúc mạc liều 2,3 mg/kg đánh giá thông qua tỷ lệ chuyển tiếp tổng số lần vào cánh tay Kết trình bày bảng 9.2 Bảng 9.2 Ảnh hưởng trimethyltin test mê lộ chữ Y Tổng số lần vào cánh Lô Tỷ lệ chuyển tiếp (%) Sinh lý 2D 70,49 ± 4,03 38,83 ± 5,91 TMT 2D 56,27 ± 10,60* 41,50 ± 12,55 % giảm so với sinh lý 20,17 Sinh lý 7D 67,85 ± 4,08 35,50 ± 7,50 TMT 7D 62,38 ± 4,76 36,50 ± 5,28 % giảm so với sinh lý 8,06 xxxiii tay (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) Kết bảng 9.2 cho thấy, lô chứng bệnh TMT 2D đánh giá test mê lộ chữ Y ngày sau tiêm trimethyltin có tỷ lệ chuyển tiếp giảm 20,17% so với lô chứng sinh lý (p0,05) 9.4.2.2 Ảnh hưởng trimethyltin test mê lộ nước Morris Trong test mê lộ nước Morris, ảnh hưởng trimethyltin đánh giá thơng qua thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ thời gian chuột lưu lại góc phần tư đích - Ảnh hưởng trimethyltin đến thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ Trong tập có bến đỗ test mê lộ nước Morris, ảnh hưởng trimethyltin đến thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ trình bày bảng 9.3 Bảng 9.3 Ảnh hưởng trimethyltin đến thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ test mê lộ nước Morris Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ (giây) Lơ (n=8) Ngày Sinh lý 2D 79,15 ± 12,52 % giảm so với ngày TMT 2D 73,23 ± 13,96 % giảm so với ngày Sinh lý 7D 71,33 ± 15,71 % giảm so với ngày TMT 7D Ngày Ngày 46,40 ± 25,43* 38,13 ± 24,79** 28,97 ± 13,38*** 41,38 51,83 63,40 72,78 ± 18,37 58,37 ± 14,92 62,38 ± 26,57 0,61 20,29 14,82 42,67 ± 17,70* 40,18 ± 18,58** 27,37 ± 22,07** 40,18 70,63 ± 13,96 % giảm so với ngày Ngày 43,67 47,24 ± 14,02* 39,47 ± 14,02** 33,12 44,12 61,63 62,92 ± 11,97 10,92 Kết bảng 9.3 cho thấy, mơ hình gây suy giảm trí nhớ trimethyltin, thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ lơ chứng sinh lý 2D lô xxxiv (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae)(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tac.dung.theo.huong.dieu.tri.alzheimer.tren.thuc.nghiem.cua.dan.sam.di.thuc.(salvia.miltiorrhiza.bunge lamiaceae) chứng sinh lý 7D ngày 2, giảm có ý nghĩa thống kê so với ngày Trong đó, lơ bệnh TMT 2D có thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ngày 2, khơng có khác biệt so với ngày (p>0,05) Lơ chứng bệnh TMT 7D có thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ngày giảm khác biệt so với ngày - Ảnh hưởng trimethyltin đến thời gian chuột lưu lại góc phần tư đích Trong tập khơng có bến đỗ test mê lộ nước Morris, ảnh hưởng trimethyltin đánh giá thông qua thời gian chuột lưu lại góc phần tư đích Kết trình bày bảng 9.4 Bảng 9.4 Ảnh hưởng trimethyltin đến thời gian chuột góc phần tư đích test mê lộ nước Morris Lơ (n=8) Thời gian góc phần tư đích Tỷ lệ giảm so với (giây) lơ chứng sinh lý (%) Sinh lý 2D 32,19 ± 6,22 TMT 2D 20,20 ± 3,08** Sinh lý 7D 25,52 ± 2,16 TMT 7D 21,61 ± 2,88* 37,25 15,32 Kết bảng 9.4 cho thấy, lô chứng bệnh TMT 2D đánh giá test mê lộ nước Morris ngày sau tiêm trimethyltin có thời gian chuột góc phần tư đích giảm 37,25% so với lơ chứng sinh lý 2D (p