BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CÔNG
TRINH THI HAI
DAP UNG O MUC DO PHAN TU CUA DONG TE BAO UNG THU
DAI TRUC TRANG HT-29 DOI VOI THUOC SELUMETINIB:
KET QUA NGHIEN CUU IN VITRO
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC MÃ SỎ CHUYÊN NGÀNH: 8720601
Trang 2TRINH THI HAI
DAP UNG O MUC DO PHAN TU CUA DONG TE BAO UNG THU
DAI TRUC TRANG HT-29 DOI VOI THUOC SELUMETINIB:
KET QUA NGHIEN CUU IN VITRO
LUAN VAN THAC Si KY THUAT XET NGHIEM Y HOC MA SO CHUYEN NGANH: 8720601
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS DUONG HONG QUAN
Trang 3AJCC CA 19-9 CAV-1 CDHI CEA EGFR MIC NCCN PTNS PCR RT-PCR UTĐTT UICC
DANH MUC CHU VIET TAT
: Hiép hdi ung thu My (American Joint Committee on Cancer) : Khang nguyén Carbohydrat ( Carbohydrat Antigen)
: Caveolin-]
: Cadherin loai 1
: Khang nguyén sinh ung thu bao thai (Carcino Embryonic Antigen) : Epidermal growth factor receptor
: Chụp cộng hưởng từ
: Minimum Inhibitory Concentration
: Mang lưới ung thư toàn cầu (National Comprehensive Cancer Network)
: Phẫu thuật nội soi
: Polymerase Chain Reaction
: Real time Polymerase Chain Reaction
: Khối u, hạch vung, di can (Tumor-Node-Metastasis)
: Ung thu dai tre trang
Trang 4
MUC LUC
v20 077 ,L.Ô 1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU -e£©ECVE+E+++++tEt©EEE2AedestEEtrrrrrrrssrie 3 CHƯƠNG 1: TƠNG QUAN TÀI LIỆỆU -.2 <°©sseevveeeertvssesrrer 4
In? iu L 4 1.1.1 Ung thư đại trực tràng +5+2++2+z+2+*rzx+rxErrErrrxrkrrrrrrrrrrrkrrrrkrrrrrrrre 4 1.1.2 Các yếu tổ nguy cơ ung thư đại trực tràng -2-522222222222222222222222222 4 1.2 Phương pháp chân đoán ung thư đại trực tràng . 22222222z222222zzs2czse2 5
1.2.1 Chan dod 1am sang .00 ccccceccesccssssseesssvsseeesssinesssssnsessssuneceeesnecesssteeesssseseeeete 5 1.2.2 Chân đốn cận lâm sàng .-©2©22222S2S22222E22121222271212212112222212122.21121 22.21, 7 5
1.3 Các phương pháp kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu 6 In iá0 )À)// 0 0n 6
132K y thuật MS coi ESSHSDGDSHSEOIMORDGEOIRSIYTERISHBSISSwpsspeaai 6
18.5 K.ÿ:thưật.Realtitrle.PcsscoossssaosssoitiiksiloisdLlg2040A001861805588018400018038013400019008030/20 7
1.3.4 Kỹ thuật nuôi cây tế bảo 2- 222222222 2222222211122121112221711122211212.112 e2 7
1.3.5 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 2222-22222222222222222221222222222 8
1.4 Kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bảo HT-29 2222222222222 22czre2 8
1.4.1 Tế bảo HT-29 8
1.4.2 Selumetinib 9
1.4.3 Phương pháp điều trị đích 22-©22222222222122221211222212112271212 22221122 10
1.4.4 Cơ chế tác dụng của Selumetinib trên tế bào ung thư đại trưc tràng HT-29 11 1.4.5 Thực trạng kháng thuốc Selumetinib -22 ©2¿2222222+22222222222222zzrrrvz 12 1.5 Cau trúc phân tử và cơ chế kháng thuốc của tế bào . 22-52222zz+2ecs2 12
1.5.1 Cầu tạo tế bảo 2-2 22222222 12
1.5.2 Cơ sở tế bào và phân tử của ung thư
1.5.3 Một số cơ chế sinh học phân tử trong kháng thuốc điều trị ung thư 15
1.5 Tình hình nghiên cứu về ƯTĐTT ở Việt Nam và trên thế giới 18
1.6 Dia co nnẽ Ả Ỏ 20
Trang 5iil
CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
221 Wat U6 wi NHIÊN CŨ: eercsgs0EERSITEREEHGSIDEDIDROEDINEBOEDINESSHRSRASE 23
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2-2 22222222222212222212122221122222122- c2 23
2/3 PhfyngspliáprmphiEiiÐiÊsoseesssssssseniissikindsirisoitiiSEigSES014001S1405501400140530130018 23
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu . 22-©22222222222122221211122212121221121221211122217112.1 cce 23
2.3.2 Cỡ mẫu và chọn mẫu 2 +2222SE+ES2SE22EEEEE2EE2E12112711217117117121E 211111 e 23
2.3.3 Phương pháp nghiên cỨu - +22 5++2+z++++*E+zE+x+Erxerrxrxrrrrrxerrxrxrrrrrrxre 23 2.3.4 Biến số nghiên cứu
2.4 Xử lý và phân tích só liệu
Z;0 2)g6idUCtlrorIpitig HIỂTHGỨU:secsesssssneniskingSES01408110186360150015140550140140530130018 28
CHUONG 3: KET QUA NGHIÊN CỨU -i <ss++eeeetrrrcee 29
3.1 Thay đổi khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29/P ban đầu và tế bào kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR 29 3.1.1 Kết quả tạo dòng tế bào UTĐTT kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR từ dòng
tế báo HT-Z25ƒP ban đẦN::aoscsecsiotoantraiidbinininDdiD002 001010101 d0ữ100g0cg2ngghagogg 29
3.1.2 Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bảo bằng kỹ thuật MTS 30 3.1.3 Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào bằng kỹ thuật tạo dòng khuẩn lạc .-.2222222222222222222EEEE.eEEErrrrrrrrrrrrrrrrrrree 3T 3.2 Sự biến đổi ở mức độ phân tử của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-
29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban dau 32
3.2.1 Kết quả đánh giá con đường tín hiệu nội bào MAPK giữa dòng tế bào HT-
29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu 3⁄2
3.2.2 Kết quả đánh giá con đường tín hiệu nội bào AKT1/2 giữa dòng tế bào HT-
29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu 33
3.2.3 Sự biến đổi phân tử đáp ứng sự kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT- 29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu 34
3.24 Sự biểu hiện của dấu ấn sinh học quyết định tính kháng thuốc
Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế
Trang 6CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN -2-<2sss+E22A229922233500334130002330 0202.030 38
4.1 Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29/P ban dau và tế bào kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR 38
4.1.1 Đặc điểm dòng tế bào HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng
thuốc Selumetinib . ©222222++2222EEEY2E++22EEE2212EE.727.2271E1E1E 71.27171111 re 38 4.1.2 Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của dòng tế bảo ung thư đại trực tràng
ban dau HT-29/P và tế bào kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR 39
4.2 Sự biến đổi ở mức độ phân tử của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR so với dòng tế bảo ung thư đại trực tràng ban đầu HT-29/P 40 4.2.1 Mối liên quan giữa các con đường tín hiệu nội bào MAPK, AKT trong dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dong té bào HT-29/P ban dau .40 4.2.2 Sự biến đổi phân tử kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng té bao HT-29/P ban đầu . -zz=2 43 4.2.3 Mối liên quan của Caveolin-1 với tính kháng thuốc Selumetinib ở ung thư đại
TPG [FÄ HD ¿ostccicpinc nhi há tú ene nnn nena eat anion ene 44
(0:i/9)1e186.s⁄0n0 00 ).) 47
5.1 Sự thay đổi khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của dòng tế bảo ung thư đại trực tràng kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR so với dòng tế bào ung thư đại trực
tràng ban đầu HT-29/P AT
5.2 Su bién déi ở mức độ phân tử của dòng tế bào ung thư đại trực tràng kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR so với dòng tế bảo ung thư đại trực tràng ban đầu HT-29/P 47
KHUYEN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 7DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, kích thước và điều kiện ni cây dịng tế bào HT- 29/SR kháng thuốc Selumetinib từ đòng tế bào HT-29/P ban đầu 29 Bảng 3.2: Kết quả đánh giá tỷ lệ tế bào sóng giữa dịng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib và dòng tế bào HT-29/P ban đầu tiếp xúc với thuốc Selumetinib
bằng kỹ thuật MTS M
Bảng 3.3: Kết quả đánh giá tỷ lệ tạo khuân lạc giữa dòng tế bào HT-29/SR kháng
Trang 8
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Hình ảnh tế bào HT-29 nuôi cây với mật độ tế bào thấp và mật độ tế bào cao 9 Hình 1.2 Một số thuốc tác động vào sự phát triển và biệt hóa tế bảo 11
Hình 1.3 Tình trạng kháng thuốc ở các phương pháp điều trị ung thư 12 Hình 1.4 Câu trúc nhân của tế bảo ¿2 2 222112 22212251E22211122211x£+ 13
Hình 2.1 Quy trình tạo dịng tế UTĐTT kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR 24
Hình 3.1 Đặc điểm kích thước, hình thái và sự phân bố tế bào giữa dòng tế bào HT-29/P ban dau va dong tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib 30
Hình 3.2 Tỉ lệ sống của dòng tế bào HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng
thuốc Selumetinib sau tiếp xúc với thuốc Selumetinib ở các nồng độ khác nhau 31
Hình 3.3 Hình ảnh tạo khuẩn lạc của dòng tế bảo HT-29/P ban đầu và của tế bào
HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib sau khi tiếp xúc với Selumetinib ở các nồng độ
khác nhau - 2-52-2722 22222222 SE 22
Hình 3.4: Kết quả đánh giá sự biến đổi tín hiệu nội bào MAPK giữa dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu bằng kỹ
THunt WGdtbriit:DÌBELo:sscsvissssssststisttosisdhogtEAitdugttdtg3'Gv0t050 01 i250001501801E.:24:63/230G85i0/60Ggu0018000/6/2/6 33
Hình 3.5 Kết quả đánh giá sự biến đổi tín hiệu nội bào AKT1/2 giữa dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bảo HT-29/P ban đầu bằng kỹ
thuật Western blot 34
Hình 3.6: Kết quả đánh giá sự biến đôi phân tử của dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban dau bằng kỹ thuật Westem blot 3 5 Hình 3.7 Kết quả đánh giá sự biến đổi RNA dấn ấn phân tử quyết định tính kháng
thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế
bào HT-29/P ban đầu +2 2222222222221 t 22 1 re 36
Hình 3.8 Kết quả đánh giá sự biến đổi protein dân ấn phân tử quyết định tính kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với
Trang 9vil
TOM TAT NGHIEN CUU
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và bệnh tật trên thế giới (1) Ngày nay cùng với liệu pháp miễn dịch,
liệu pháp điều trị đích được biết đến như là phác đồ điều trị hiệu quả và thích hợp
trong điều trị UTĐTT dựa trên đặc điểm gen của từng người bệnh Thuốc điều trị
đích Selumetinib đã và đang được sử dụng trong điều trị thử nghiệm người bệnh
UTĐTT có mang đột biến BRAF Mặc dù vậy, một số lớn người bệnh UTĐTT đã
bị kháng thuốc điều trị đích Selumetinib sau một thời gian tiến hành điều trị dẫn tới làm ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị người bệnh UTĐTT Do vậy, xác định các chỉ
thi/d4u ấn sinh học quan trọng có liên quan đến UTĐTT (tế bào HT-29) giúp tăng hiệu quả đáp ứng thuốc điều trị đích Selumetinib từ đó góp phần nâng cao hiệu quả điều trị người bệnh UTĐTT mang đột biến BRAF, cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế phân tử liên quan tới tính kháng thuốc điều trị đích Selumetinib Để đánh giá sự thay đổi đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc
Selumetimb so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu và xác định sự biến đổi ở mức độ
phân tử của các dòng tế bào HT-29/P kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P, chúng tôi đã sử dụng các quy trình kỹ thuật gồm kỹ thuật tạo dòng tế bào
kháng thuốc, kỹ thuật nuôi cay tế bào, kỹ thuật MTS, kỹ thuật Western Blot, ky
thuật RT- PCR Trong nghiên cứu này, khi chúng tôi tăng dần nồng độ Selumetinib thì tỉ lệ tế bào sống của dòng tế bào HT-29/P ban đầu giảm, cũng như số lượng
khuẩn lạc của dòng tế bào HT-29/P ban đầu giảm, đặc biệt ở dòng té bao HT-29/SR khang thuốc Selumetinib, số lượng khuẩn lạc nhiều hơn ở tất cả các nông độ
Selumetinib Điều này chứng tỏ khả năng đáp ứng thuốc ở dòng tế bảo HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib là khác nhau Con đường
tin hiéu néi bao MAPK (p-MAPK tai Y202/T204) va AKT1/2 (p-AKT1/2 tai S473)
ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib tăng mạnh hơn so với dòng tế
bao HT-29/P ban đầu Hình ảnh tín hiệu protein E-Cadherin ở dòng tế bảo HT-29/P
ban đầu mạnh hơn so với dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib Hình ảnh tín hiệu protein Vimentin thì ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib
Trang 10của Caveolin-l của dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib tăng mạnh hơn so với dòng tế bào HT-29/P ban dau, điều nay cho thay Caveolin-1 có thé là đâu ấn phân tử quyết định sự kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib
Trang 11DAT VAN DE
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và bệnh tật trên thế giới (1) Với hơn 1,360,600 trường hợp mắc mới và hơn 693,900 ca tử vong môi năm, UTĐTT hiện đang là loại ung thư phô biến đứng hàng thứ 3 và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 4 trên thế giới (2) Tỷ lệ tử vong do UTĐTT ở các nước Đông Âu, Chau My La Tinh va Chau A đứng hàng đầu
trên thế giới (3) Đặc biệt, ở hầu hết các khu vực trên thế giới, tỉ lệ mắc mới và tử
vong do UTĐTT ở nam giới thường cao hơn ở nữ giới Ở Việt nam, theo số liệu công bố của Tổ chức nghiên cứu ung thư Quốc tế mỗi năm có khoảng 7367 bệnh
nhân mắc mới, 4131 bệnh nhân chết do căn bệnh UTĐTT Tỷ lệ mắc và chết do UTĐTT đứng vị trí thử 4 ở nam, đứng vị trí thử 6 ở nữ (4) Những khác biệt về vị
trí địa lý dân đến những khác biệt về chế độ ăn uống và điều kiện môi trường sống, cùng với nền tảng di truyền đã quyết định nguyên nhân gây ung thư hiệu quả cũng
như tính kháng thuốc điều trị UTĐTT(4) Hơn thế nữa, khoảng 75% bệnh nhận
UTĐTT là ung thư mắc phải và khơng có tiền sử gia đình - khuynh hướng di truyền,
và 25 % người bệnh UTĐTT còn lại liên quan tới yếu tố lịch sử gia đình Chính vì
vậy, UTĐTT hiện đang là mối quan tâm của toàn xã hội đề từ đó tập trung nghiên cứu và đưa ra các phác đồ điều trị mới trong điều trị hiệu quả người bệnh UTĐTT
Cho đến nay, ứng dụng các công nghệ mới trong sàng lọc, chân đoán sớm và
phác đồ điều trị hiệu quả liên quan đến phâu thuật cắt bỏ khối u, liệu pháp hóa trị,
liệu pháp xạ trị và liệu pháp điều trị đích sẽ quyết định sự thành công trong điều trị người bệnh UTĐTT Tuy nhiên, người bệnh UTĐTT giai đoạn cuối hoặc tái phát bao gồm cả người bệnh mang đột biến KRAS hoặc BRAF thường kháng với các
thuốc hóa trị liệu và xạ trị liệu thông thường, đặc biệt liệu pháp hóa trị và liệu pháp
xạ trị gây ra rất nhiều tác dụng phụ trong điều trị người bệnh UTĐTT Do đó ngày
nay cùng với liệu pháp miễn dịch, liệu pháp điều trị đích được biết đến như là phác
đồ điều trị hiệu quả và thích hợp trong điều trị người bệnh UTĐTT dựa trên đặc
điểm gen của từng người bệnh
Trang 12Do vay, phát hiện các chỉ thị/dấu ấn sinh học quan trọng mới nhằm mục đích đánh
giá hiệu quả đáp ứng thuốc điều trị đích Selumetinib từ đó góp phần nâng cao hiệu
Trang 13MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1 Đánh giá sự thay đôi đáp ứng thuốc Selumetinib của dòng tế bảo ung thư đại trực tràng HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dong tế bào ung thư đại trực trang HT-29/P ban đầu
2 Xác định sự biến đổi ở mức độ phân tử của dòng tế bảo ung thư đại trực tràng
Trang 141.1 Đại cương
1.1.1 Ung thw đại trực tràng
UTĐTT là nguyên nhân chính gây mắc mới và tử vong trên thé giới (2) UTĐTT là loại ung thư phô biến đứng hàng thứ 3 và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 4 với ước tính khoảng 1,800,000 trường hợp mắc mới và hơn 881,000 ca tir vong xây ra trong năm 2018 (3) Tỉ lệ mắc mới và tử vongdo UTĐTT ở nam giới cao hơn nữ giới ở hầu hết các khu vực trên thế giới (4) Tỉ lệ mắc
UTĐTT cao nhất thuộc về Châu Âu, Uc, New Zealand và một số quốc gia thuộc khu vực Đông Á như Nhật Bản, Hàn Quốc (4)
Theo công bồ của tô chức ung thư tồn cầu (GLOBOCAN) về tình hình ung thư tại Việt Nam trong năm 2020, UTĐTT là nguyên nhân đứng thứ tư gây tử vong trong số các loại ung thư với hơn 16.426 trường hợp mắc mới và hơn 8.203 ca tử
vong (5) Theo thống kê của Bệnh Viện Ung bướu Hà Nội, tỉ lệ mắc UTĐTT vào
khoảng 9% tổng số người mắc bệnh ung thư Dự báo trong vài năm tới, số người mắc UTĐTT sẽ tăng nhanh do thói quen ăn uống ít chất xơ, giàu thịt và thức ăn chế biến săn ngày một phổ biến Theo ghi nhận ung thư Hà Nội tỷ lệ mắc chuân theo
tuổi là 7,5/100.000 (6)
1.1.2 Các yéu t6 nguy cơ ung thư đại trực tràng
Các yếu tố nguy cơ gây UTĐTT gồm tiền sự gia đình, chế độ ăn, nghiện
thuốc lá, nghiện rượu, béo phì, lối sống ít vận động, bệnh viêm loét đại trực tràng và
yếu tô di truyền Trong đó, Tiền sử gia đình: Khoảng 20% những người UTĐTT có ít nhất một người thân trong gia đình cũng bị UTĐTT; Chế độ ăn uống: Chế độ ăn uống nhiều các loại thịt đỏ làm tăng nguy cơ UTĐTT; Nghiện thuốc lá: Nghiện thuốc lá làm tăng 25% nguy cơ ung thư nói chung trong đó có UTĐTT và các bệnh
tim mạch so với người không hút thuốc (7): Nghiện rượu: Ngay cả một lượng rượu
Trang 15lỗi sống vận động thường xuyên; Bệnh viêm loét đại trực tràng: Một số bệnh viêm
loét đại trực tràng làm tăng cơ UTĐTT và Yếu tố di truyền: Yếu tố di truyền bệnh đa polyp tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis - FAP) là bệnh di truyền
do đột biến gen APC gây ra Tỷ lệ đột biến gen APC gây bệnh FAP từ 1/10.000 đến
1/15.000 người (8) Hội chttng Lynch (HNPCC - hereditary nonpolyposis colorectal cancer) Theo thông kê khoảng 2-5% trường hợp UTĐTT 1a do HNPCC Khoảng 90% nam giới và 70% phụ nữ có đột biến HNPCC sẽ phát triển thành UTĐTT trước
tuổi 70 (9)
1.2 Phương pháp chân đoán ung thư đại trực tràng 1.2.1 Chân đoán lâm sàng
Triệu chứng cơ năng: Những triệu chứng thay đôi về bài tiết phân Đau quặn,
mót rặn đại tiện phân có nhày máu mũi, hội chứng tảo bón, đau bụng Đặc biệt, triệu
chứng toàn thân gồm Sức khỏe suy giảm: xuất hiện với tỷ lệ 20%, do ăn uống, tiêu
hóa kém, do đau, mất máu; Thiếu máu: xuất hiện với tý lệ 11%, do tình trạng chảy máu mạn tính kéo dải, chấn đoán muộn, thường là thiếu máu nhược sắc; và Gay sut:
xuất hiện với tỷ lệ 6%, người bệnh có thể gầy sút 5 -10kg trong vòng 2 - 4 tháng 1.2.2 Chẩn đoán cận lâm sàng
Kỹ thuật X quang: Chụp khung đại tràng có Barit, chụp CT Scanner, chụp nhấp nháy miễn dịch phóng xạ với kháng thể đơn dòng đặc hiệu Nội soi đại tràng bằng ống soi mềm, chụp cộng hưởng từ (MRI)
Kỹ thuật xét nghiệm: Kháng nguyên sinh ung thu bao thai: CEA (Carcino Embryonic Antigen) là một glycoprotein có p = 200KDa Được tìm thấy trong màng tế bào của nhiều mơ, nó khơng đặc hiệu trong ung thư đại tràng CEA tăng cao bat thường trong ung thư đại tràng và các nơi khác thuộc ống tiêu hoá Một số ung thư thuộc ống tiêu hoá mức CEA cũng tăng cao, CEA được phát hiện bởi phương pháp miễn dịch phóng xạ của huyết thanh Hơn thế nữa, CA 19-9 (Carbohydrat Antigen) là một kháng nguyên được nhận biết bởi kháng thê đơn dịng Bình thường nồng độ CA 19-9 < 37u/ml Nồng độ CA 19-9 tăng cao ở người
Trang 16Sinh thiết: Hiện nay có rất nhiều phương pháp sinh thiết nói chung nhưng đối với UTĐTT nói riêng chúng ta có thể áp dụng một trong hai phương pháp gồm phương pháp I: Sinh thiết qua nội soi có giá trị chân đốn chắc chắn UTĐTT loại ung thư nhưng khơng có giá trị nhiều trong chân đoán giai đoạn và phương pháp 2: Sinh thiết tức thì trong khi phâu thuật: có thê chân đoán được giai đoạn của ung thư và xem 2 đầu cắt còn tế bảo ung thư hay không (12,13)
1.3 Các phương pháp thực nghiệm sử dụng trong nghiên cứu 1.3.1 Phương pháp Western Blot
Phương pháp Western là kỹ thuật sử dụng các kháng thể đặc hiệu đề phát
hiện các protein (kháng nguyên) chuyên biệt được tách chiết từ mô hoặc tế bảo, đĩ
nhiên mẫu cũng có thể là virus hoặc môi trường Kỹ thuật Western Blot được dùng để phát hiện tín hiệu của một phân tử protein đích từ hỗn hợp protein, kỹ thuật
Western Blot được sử dụng để so sánh biểu hiện của phân tử protein đích với một
hoặc một vài protein khác Trong đó ưu điêm của kỹ thuật Western Blot dùng làm
xét nghiệm khẳng định, ít có dương tính giả, có tính đặc hiệu cao, có thé phat hién
được với lượng protein với hàm lượng rất nhỏ (bệnh phẩm ít) Nhược điểm của kỹ thuật thao tác kỹ thuật phức tạp, tốn nhiều thời gian, chỉ phí xét nghiệm cao Do vậy, sử dụng kỹ thuật này đề so sánh sự biéu hiện của protein liên quan tới các con đường tín hiệu quy định sự đáp ứng thuốc đích Selumetinib
1.3.2 Kỹ thuật MTS
MTS là một xét nghiệm định lượng đê đánh giá sự tăng sinh của tế bảo, khả
năng tổn tại của tế bảo và độc tính của tế bảo Quy trình xét nghiệm MTS dựa trên
sự khử hợp chất MTS tetrazolium của tế bào nuôi cây để tạo ra formazan hòa tan trong môi trường cấy tế bào Sự chuyển đổi này được thực hiện bởi enzyme
NAD(P) dehydrogenase trong các tế bào có hoặt động trao đổi chất Đặc biệt, formazan được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 490-500nm Ưu
Trang 17ít nhân lực Nhược điểm của kỹ thuật là hóa chất khơng để được lâu sau khi mở
hộp
1.3.3 Kỹ thuật Realtime PCR
Realtime PCR ciing la ky thuat nhan bản DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt, tin
hiệu khuếch đại sẽ được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt, Mỗi trong phản ứng
Realtime PCR thường có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55 - 60°C và thấp hơn mẫu dò TaqMan khoảng 5 - 10°C để đảm bảo mẫu dò ln bắt cặp trước Trình tự đích lựa chọn cũng không nên dài quá 150bp đề phản ứng diễn ra tối ưu nhất Đăc biệt, chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR có 3 giai đoạn gồm: Biến tính ở 94°C trong 30 giây; Bắt cặp 55-60°C trong trong 30 giây; và Kéo đài ở 72°C trong 30 giây
Qua 3 bước, một DNA đích sẽ được nhân lên thành hai bản sao và chu kỳ được lặp đi lặp lại liên tục từ 30 - 40 chu kỳ Lúc này, từ một DNA đích sẽ nhân lên
thành 2°° đến 2” ban sao, tite 14 hang ty bản sao Ưu điểm của phản ứng Realtime PCR là có độ nhạy cao và nhược điểm của phản ứng Realtime PCR là giá thành đắt
và không xác định được chiều đải của đoạn DNA cần khuếch đại
1.3.4 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là quá trình tế bào được phát triển trong điều kiện được kiêm soát, thường là bên ngồi mơi trường tự nhiên của chúng, sau đó chúng có thể được duy trì trong các điều kiện được kiêm soát cân thận Những điều kiện này khác nhau
đối với từng loại tế bào, nhưng thường bao gồm một bình phù hợp với chất nền
hoặc môi trường cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu (các amino acid, carbohydrate, vitamin, và khoáng chất), các yêu tô tăng trưởng, các hormone và các
khí (CO2, On) va điều chỉnh môi trường hóa lý (đệm pH, nhiệt độ, áp suất thâm thấu) Đặc biệt, hầu hết các tế bảo đòi hỏi một bề mặt hoặc chất nền nhân tạo, trong
khi các tế bảo khác có thể được nuôi thả nổi tự do trong môi trường nuôi cấy (nuôi
cay huyén phù) Tuổi thọ của hầu hết các tế bào được xác định về mặt di truyền,
nhưng một số tế bào nuôi cây tế bào đã được biến đổi thành các tế bào bát tử sẽ sinh
Trang 18thuốc Selumetinib HT-29/SR và dòng tế bào HT-29/P được tiến hành bằng
RNAeasy mini (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Quy trình kỹ thuật tách chiết được tiến hành các bước chính gồm Tế bào được xử lý trong đệm ly giải có bổ sung proteinase K; RNA trong mâu sẽ bám lên cột silica gel; Sau khi rửa hai lần bằng đệm rửa RPE; Bồ sung nước vô trùng tuyệt đối; Ly tâm thu dịch RNA
1.3.6 Phương pháp đo nồng độ RA
Nong độ RNA nồng độ tách chiết từ dòng tế bảo UTĐTT mang đột biến
BRAF kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR và dòng tế bào HT-29/P được xác định
bằng phương pháp đo mật độ quang trên máy Nanodrop bằng cách đo hấp thụ ở
bước sóng 260nm (ODs¿o) và 280nm (ODssạ) Nông d6 RNA (Cpna) duoc tinh theo công thức CgụA = ODzø /OD;so x 40 x d trong do d: d6 pha loang mẫu khi đo Nếu
1.8< OD;sg /OD;sọ < 2 thi mau RNA được đánh giá là đạt yêu cầu về mức độ tỉnh
sạch cho phản ứng Realtime PCR
1.4 Kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29
1.4.1 TẾ bào HT-29
Tế bảo UTĐTT HT-29 (Số Catalogue: 91072201) được cung cấp bởi ngân
hàng tế bào Hoa kỳ (ATCC: American Type Culture Collection, US) và được bán
thương mại trên thị trường (14) Tế bào HT-29 là dòng tế bào UTĐTT biểu mô
được phân lập vào năm 1964 từ một khối u nguyên phát phâu tích từ người bệnh da
trắng, 44 tuổi, nữ giới bị ung thư biểu mô tuyến trực tràng Đặc biệt, tế bào HT-29
được biết đến là dòng tế bào ung thư có đặc điểm phân tử mang đột biến gen BRAF
tại vị trí V600E, chính vì vậy cho đến nay HT-29 chính là dịng tế bào chuân thích
hợp và được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu cơ chế bệnh học UTĐTT và nghiên
cứu phát hiện thuốc điều trị ung thư mới
Trang 19FBS va 1% Penicillin-Steptomicin ở nhiệt độ 37°C trong tủ nuôi cấy 5% CO¿, tế
bảo HT-29 sinh trưởng và phát triển tốt, khả năng bám dính trên bề mặt đĩa nuôi cây
khi nuôi cay với mật độ tế bao thấp hoặc/và mật độ tế bào cao (Hinh 1.1)
ATCC Number: HTB-38
Designation: HT-2?
High Density ‘Scale Bar = 100m
Low Density ‘Seale Bar= 100um
Hình 1.1 Hình ảnh tế bào HT-29 nuôi cây với mật độ tế bào thấp và mật độ tế bao cao (hình ảnh được chụp dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần)
1.4.2 Selumetinib
Selumetinib là chất ức chế điểm dich MEK1/2 duoc biết đến như thuốc có
khả năng ức chế sự phát triển và sinh trưởng của các khối u thể rắn gồm UTĐTT
Đặc biệt, Selumetinb hiện đang được thử nghiệm lâm sàng trong điều trị UTĐTT,
ung thư tuyến tụy, ung thư da ác tính, ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư tuyến giáp Hơn thế nữa, Selumetinib có thê được sử dụng ở dạng phác đồ đơn và/hoặc
phác đồ kết hợp với liệu pháp hóa trị, liệu pháp xạ trị nhằm thúc đây hiệu quả điều
trị người bệnh ung thư Mặt khác, tác dụng phụ ở người bệnh dùng thuốc Selumetinib khơng có dẫu hiệu trầm trọng như tiêu chảy, buổn nôn và nơn, khó thở, mờ mắt, mệt mỏi, phát ban
Ở UTĐTT mang đột biến KRAS hoặc BRAF, Selumetinb có vai trị lâm
Trang 20biệt, thông qua điểm đích RPS6, dau ấn sinh học tiềm năng liên quan trực tiếp tới
khả năng kháng thuốc điều trị Selumetinib ở UTĐTT mang đột biến KRAS, hoặc BRAF (1)
1.4.3 Phương pháp điều trị dich
Hiện nay có ba phương pháp điều trị UTĐTT truyền thống đang được áp dụng phổ biến trong điều trị UTĐTT đó là phương pháp phẫu thuật, phương pháp xạ trị, phương pháp hóa trị Tuy nhiên với ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp này và tùy thuộc vào giai đoạn của ung thư, các phương pháp điều trị khác nhau có thê được sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp đồng thời nhằm phát huy hiệu quả tối đa của môi phương pháp Trong lựa chọn kế hoạch điều trị, một trong những yếu tô quan trọng nhất là đánh giá giai đoạn của ung thư Các yếu tố khác để xem xét bao gồm sức khỏe tổng thê của người bệnh, các yếu tô về kinh tế và xã hội có ảnh hưởng đến lựa chọn phương pháp điều trị cho môi người bệnh
Phương pháp điều trị mới đó là phương pháp điều trị đích, dựa vào đặc điểm
gen của từng người bệnh đề lựa chọn thuốc điều trị đúng, phù hợp và hiệu quả nhất
Chính vì vậy, cùng với liệu pháp miễn dịch, liệu pháp điều trị đích được biết đến
như là phác đồ rất hiệu quả và thích hợp trong điều trị người bệnh UTĐTT dựa trên đặc điểm gen của từng bệnh nhân ung thư Áp dụng phương pháp điều trị đích đối với những người bệnh UTĐTT có mang gen đột biến Có rất nhiều đột biến gen ở người bệnh UTĐTT nhưng thường gặp nhất là đột biến gen KRAS hoặc BRAF Người bệnh UTĐTT giai đoạn cuối hoặc tái phát thường kháng với các thuốc hóa trị liệu và xạ trị liệu thông thường, vậy nên áp dụng phương pháp điều trị đích sẽ quyết định sự thành công trong điều trị người bệnh UTĐTT EGER đã được chứng mỉnh có biểu hiện quá mức ở người bệnh UTĐTT và cũng là đích nhắm đến của
liệu pháp điều trị bằng kháng thé đơn dòng Mục tiêu chính của thiết kế thuốc chống
ung thư mới là nhắm trực tiếp vào các tốn thương phân tử cụ thê được tìm thấy trong các tế bào khối u với hy vọng cải thiện tỷ lệ chữa khỏi ung thư và giảm độc
Trang 2111
lượng và đáp ứng điều trị mà còn có thể hoạt động như các mục tiêu điều trị tiềm
năng (15,16)
1.4.4 Cơ chế tác dụng của Selumetinib trên tễ bào ung thư đại trưc tràng HT-29
Cơ chế tác dụng của thuốc điều tri dich Selumetinib, phân tử Selumetinib khi
gắn kết với thụ thé EGFR sé irc ché dịng tín hiệu tăng trưởng từ thụ the EGFR vao
trong tế bảo dân đến ức chế quá trình tăng trưởng của tế bào làm phát triển biểu mơ
EGFE có ái lực cao với thụ thê yếu tô phát triển biểu mô (EGER) trên bề mặt tế bào
(17) Yếu tố này có khả năng kích hoạt tính tyrosine kinase nội bào của thụ thê Tiếp theo cdc tyrosine kinase sé khởi động dịng thác tín hiệu đề tác động lên nhiều q trình hóa sinh trong tế bào như: tăng nồng độ Ca2+ nội bào, tăng cường quá trình đường phân và sinh tổng hợp protein, tăng cường quá trình biêu hiện một số gen kế cả gen mã hóa EGER, thúc đây quá trình tái ban DNA va quá trình phân chia tế bào xảy ra mạnh mẽ hơn (1) EGER đã được chứng minh có biêu hiện quá mức ở
người bệnh UTĐTT và cũng là đích nhắm đến của liệu pháp điều trị bằng
Selumetimb (1,16) Anti-EGFR antibody - Cetuximab EGFR —"* E—$> - Panitumumab BRAF inhibitor - Encorafenib - Vemurafenib - Dabrafenib MEK inhibitor - Binimetinib - Trametinib Cell growth and differentiation
Trang 221.4.5 Thực trạng kháng thuéc Selumetinib
Với sự tiền bộ của ngành sinh học phân tử đặc biệt là việc làm sáng tỏ cơ chế
và vai trò của EGER trong bệnh lý ung thư, các nhà khoa học đã tìm ra một số loại
thuốc điều trị ung thư nhằm mục tiêu EGER (liệu pháp điều trị đích) Selumetinib kết hợp với hóa trị cải thiện tỷ lệ đáp ứng khối u và thời gian sống còn so với hóa trị
đơn thuần (17) Trong những năm gần đây, các chất ức chế phân tử đích và liệu pháp miễn dịch được xem là những cách hiệu quả nhất cho điều trị ung thư Tuy nhiên, tỷ lệ tái phát cao và sự gia tăng của tình trạng kháng thuốc đối với hầu hết các loại ung thư nói chung và UTĐTT nói riêng cho thay sự cần thiết phải đánh giá
khả năng đáp ứng thuốc Bên cạnh đó, hầu hết các loại thuốc điều trị ung thư hiện
nay đều yêu cầu phải sử dụng lặp lại nhiều lần và người bệnh ƯTĐTT thường mang gen đột biến chính vì vậy mà khả năng kháng thuốc của người bệnh là rất cao Điều
nảy làm tăng độc tính, chỉ phí điều trị và đặc biệt làm giảm nghiêm trọng chất lượng
cuộc sống của bệnh nhân, khắc phục được việc sử dụng lặp lại nhiều lần của các
loại thuốc điều trị ung thư truyền thống cũng như cải thiện hiệu quả điều trị (18)
Targeted therapy
Ligandsargeted Therapy Therapeutic Antbodlos Toxins Metalloproteinase Inhibitors ine Kinase Inhibitors (Glivec, Gefitinib) Immunotherapy ‘Angiogenesis Inhibitors (Angiostatin, Endostatin &
Avastin)
Hình 1.3 Tình trạng kháng thuốc ở các phương pháp điều trị ung thư 1.5 Cấu trúc phân tử và cơ chế kháng thuốc của tế bào
1.5.1 Cấu tạo tế bào
Tế bào là đơn vị cấu tạo cơ bản nhất của mọi vật sống Cơ thể người được
tạo nên bởi hàng tỉ tế bào Chúng xây dựng nên các cấu trúc của cơ thê, lấy chất
Trang 2313
năng chuyên biệt Tế bào cũng mang các vật chất di truyền và có thể tự nhân lên Các tế bào có rất nhiều thành phần, mỗi phần thực hiện các chức năng khác nhau
Một số cấu trúc của tế bào được gọi là các bào quan và thực hiện các chức năng đặc
thù trong tế bào Hầu hết bào quan của tế bảo được câu tạo bởi màng bao gồm lipid và protein Những mảng này gồm mảng tế bào, màng nhân, màng lưới nội sinh chất, mang ti thé, lysosome va b6 may golgi Trong đó nhân của hầu hết tế bào chứa một
hoặc nhiều cấu trúc bắt màu gọi là hạch nhân, RNA và những loại protein như tìm
thấy ở ribosome Hạch nhân trở nên lớn hơn khi tế bảo tích cực tơng hợp protein Sự hình thành hạch nhân bắt đầu ở trong nhân tế bào Đầu tiên, những gene DNA riêng biệt của nhiễm sắc thê tổng hợp nên RNA Một số RNA được tổng hợp được chứa ở hạch nhân, nhưng hầu hết chúng được vận chuyền ra ngoài qua các lỗ nhân
tới bào tương Tại đây, chúng được kết hợp với những protein đặc biệt đề tạo thành
ribosome trưởng thành đóng vai trị chủ yếu tơng hợp protein bào tương
màng nhân lỗ nhân Nhân tế bào hạch nhân
chất nhân sợi nhiễm sắc
Hình 1.4 Cấu trúc nhân của tế bảo
1.5.2 Cơ sở tễ bào và phân tử của ung thư
Các đột biến gen dân tới sự hình thành của các tế bào ung thư, do đó chúng
Trang 24hòa sự tăng trưởng và phân chia tế bảo cũng như sửa chữa DNA Hai loại gen đột biến chính là gen sinh ung thư và gen ức chế khói u (19)
Gen sinh ung thư
Các gen sinh ung là dạng bất thường của gen bình thường (proto-
oncogenes) điều chỉnh các khía cạnh khác nhau của sự phát triển và biệt hóa tế
bào Đột biến các gen này gây ra kích thích trực tiếp và liên tục nhiều con đường dẫn truyền (vi du: các thy thé yếu tố phát triển bề mặt tế bảo, các con đường dân truyền tín hiệu tải nạp nội bào, các yếu tố sao chép, các yêu t6 phát triển khác) kiểm soát sự tăng trưởng và phân chia tế bào, sửa chữa DNA, tăng sinh mạch và nhiều quá trình sinh lý học khác Có > 100 gen gây ung thư có thể góp phần vào sự chuyển dạng thành tế bào ung thư ở người Ví du, gen RAS ma hoa protein ras, mang tín hiệu từ các thụ thể gắn vào màng tế bảo trên con đường RAS-
MAPKinase tới nhân tế bào, điều hòa phân chia tế bào Các đột biến có thể dân
đến sự hoạt hóa khơng thích hợp của protein ras, dẫn đến tăng trưởng tế bào khơng kiểm sốt được Trên thực tế, protein ras bất thường gặp trong khoảng 25% các loại ung thư ở người Các gen sinh ung thư khác cũng được chỉ ra có liên quan đến
các loại ung thư nhất dinh Bao gm HER2, BCR-ABL, CMYCC-MYC, NMYCN-
MYC, EGFR, EML4ALK Cac gen sinh ung thw diac hiệu có thể có ý nghĩa quan
trong trong chẩn đoán, điều trị và tiên lượng điều trị ung thư như: các đột biến điểm tế bào soma, sự khuếch đại gen, sự chuyển đoạn Những thay đổi này có thể
làm tăng hoạt tính của sản phẩm gen (protein) hoặc thay đổi chức năng của nó
Đơi khi, sự đột biến của các gen trong tế bao mam dan đến sự di truyền của một
xu hướng ung thư (20)
Gen ire chế khối u
Các gen như 7P53BRCA1 và BRC42 đóng vai trò trong sự phân chia tế bào bình thường và sửa chữa DNA, rất cần thiết trong phát hiện tín hiệu tăng trưởng bat thường hay tổn thương DNA của tế bào Nếu những gen này mắt chức năng do
đột biến di truyền hoặc đột biến mới, hệ thống theo dõi bắt cặp DNA bị mắt hiệu
quả, các tế bào có đột biến di truyền tự phát vân tôn tại và được nhân lên, cuối
Trang 25ức chế khói u Một allen bất thường của một gen có thể di truyền, dân đến co thé chỉ còn một allen còn chức năng của gen ức chế khói u Nếu đột biến xảy ra ở một allen còn lại này, cơ chế bảo vệ của gen ức chế khối u bình thường thứ hai này cũng mất đi Một protein điều hoà quan trọng khác, p53, có vai trị ngăn ngừa sự sao chép DNA bị tồn thương ở tế bào bình thường và thúc đây sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) 6 tế bào có DNA bắt thường Protein p53 bất hoạt hoặc bị thay đổi chức năng dân đến các tế bào có DNA bát thường tiếp tục sống sót và phân chia 7P53 các đột biến được di truyền cho các tế bào con, làm tăng nguy cơ sao chép DNA bát thường và hậu quả là sự chuyển dạng thành tế bào ung thư 7P53 bị khiếm khuyết trong nhiều bệnh ung thư ở người Giống như các gen sinh ung thư, đột biến gen ức chế khối u như 7P53 hay ®ð ở các dòng tế bảo trong các dòng tế bảo sinh dục có thê di truyền và làm tăng nguy cơ ung thư ở thế hệ sau (19)
1.5.3 Một số cơ chế sinh học phân từ trong kháng thuốc điều trị ung thư
Một vấn đề rât được quan tâm trong điều trị ung thư là sự đề kháng các hóa chất và thuốc điều trị ung thư của các tế bào khối u (gọi tắt là kháng thuốc) Trên lâm sàng, kháng thuốc có thé xảy ra ngay từ đầu hoặc sau một thời gian điều trị đối với các thuốc điều trị ung thư nói chung và thuốc điều trị đích nói riêng Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều cơ chế cho thay tế bào ung thư kháng lại các thuốc
điều trị Nguyên nhân chính hạn chế hiệu quả điều trị là do xuất hiện các dòng tế bảo mới kháng lại các thuốc điều trị theo quy luật của chọn lọc tự nhiên Thường thì
tại thời điểm bắt đầu điều trị, số lượng tế bảo kháng thuốc là rất thấp (khoảng I tế
bào kháng thuốc trên 105 tế bào nhạy cảm với thuốc) và theo thời gian điều trị số lượng các tế bào kháng thuốc tăng lên nhanh chóng do ưu thế chọn lọc, gây nên hiện tượng kháng thuốc mắc phải trên lâm sảng (21)
Hiệu quả thuốc điều trị ung thư phụ thuộc nhiều vào tốc độ phát triển của tế
Trang 26thư có khả năng kháng lại các thuốc điều trị ung thư, gây nên hiện tượng kháng thuốc Hiện nay, các nghiên cứu còn cho thay thời gian bệnh thuyên giảm dài hay ngắn còn phụ thuộc vào quân thể tế bào gốc ung thư (22) Tế bảo gốc ung thư chiếm tỷ lệ rất ít trong khối u nhưng lại đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng của khối u Tế bảo gốc ung thư cũng có các đặc điểm như tế bào gốc bình thường, nhưng khơng có khả năng kiểm soát số lượng tế bào nên có khả năng tạo ra các khối
u mới từ khối u ban đầu
Sự nhạy cảm với thuốc điều trị ung thư không những phụ thuộc vào bản chất của các tế bào khối u, mà còn phụ thuộc vào vi môi trường xung quanh tế bào
Thuốc chỉ có tác dụng tiêu diệt tế bào khối u nếu thuốc đến được tế bào với nồng độ
đủ lớn Vì vậy, nguyên nhân gây kháng thuốc tăng lên ở những khối u đặc có ít
mạch máu làm cho thuốc khó khăn khi khuếch tán từ mạch máu vào khối u, làm giảm tác dụng của thuốc điều trị Ngoài ra, sự nhạy cảm của thuốc với khối u còn
liên quan tới khả năng thâm thâu qua các hàng rào của cơ thể (hàng rào máu não, hàng rào dịch não tủy ) bởi điều này liên quan tới nồng độ thuốc đạt được tại mơ đích (21)
Một số cơ chế phân tử gây kháng thuốc tại tế bào khói u: giảm hấp thu thuốc
vào tế bào, tăng đào thải thuốc ra khỏi tế bảo, giảm hoạt tính của thuốc, tăng dị hóa
thuốc, tăng hoặc giảm hoạt tính enzyme đích, biến đổi ở protein đích, bất hoạt bằng
viée gan sulfhydryls (glutathione, metallothionein), tăng sửa chữa DNA, giảm khả năng chết theo chương trình
Ngồi những ngun nhân về cơ chế phân tử gây kháng thuốc thì cịn có các ngun nhân khác như: Do thuốc không tác dụng với một hoặc nhiều dòng tế bào trong khối u, các dòng tế bào kháng thuốc được tạo ra một cách ngẫu nhiên do xuất hiện đột biến gen kháng thuốc Nguyên nhân là do bộ gen của các tế bào u không ồn
định và sự tương tác giữa các thuốc với DNA dân đến xuất hiện các đột biến kháng
thuốc, số lượng tế bào kháng thuốc tăng và hoạt động của gen kháng thuốc tăng ở những tế bào chứa gen kháng thuốc, sự biến đổi các protein đích ở nhiều tế bào kháng thuốc (do đột biến gen gây ra), hiện tượng chuyên gen kháng thuốc từ tế bào
Trang 2717
các bác sỹ điều trị cần phải xác định được tỷ lệ tế bào kháng thuốc trong các khói u (21) Lần đầu tiên sử dụng mơ hình phát triển các tế bào của khói u kháng thuốc sẽ phụ thuộc vào: kích thước của khối u, tỷ lệ xảy ra đột biến kháng thuốc với từng
loại thuốc Mơ hình chỉ ra cơ hội điều trị cho bệnh nhân tăng lên nếu quá trình điều trị được bắt đầu sớm, khi kích thước khối u còn nhỏ và nên lựa chọn các thuốc có
xác suất tạo ra đột bién kháng thuốc thấp (19)
Các nghiên cứu cho thấy trên DNA của người có các đảo CpG là những đoạn DNA dài khoảng 1000bp chứa rất nhiều Cytosine với Guanineđi cùng nhau, thường nằm trong những vùng nhỏ, riêng biệt của gen (thường là vùng khởi động của gen — vùng promoter) chứ không “phân tán” ngẫu nhiên trong gen Vùng này thường không methyl hố trong tế bào bình thường, nhưng trong tế bảo u thường xảy ra hiện tượng tăng cường methyl hóa và quá trình phiên mã của các gen có thê bị ảnh hưởng do tác dụng vào vùng promoter của gen Khi methyl hóa quá mức sẽ gây bắt hoạt các gen và hậu quả sẽ ảnh hưởng tới các con đường tín hiệu trong tế bảo Vì vậy, khi các gen mã hóa các enzyme sửa chữa DNA (ví dụ MGMT (O-6- methylguanine-DNA methyltransferase)), gen mã hóa protein vận chuyên thuốc, protein tham gia đào thải thuốc khỏi tế bào, hoặc gen mã hóa protein điều hịa chu
kỳ tế bào và chết theo chương trình khi bị methyl hóa quá mức làm thay đổi mức độ
đáp ứng với các thuốc điều trị ung thư của khối u Tiếp theo, cơ chế q trình acetyl hóa và deacetyl hóa của histon, một protein quan trọng kết hợp với DNA cấu tạo nên nhiễm sắc thể có thê ảnh hưởng tới mức độ nhạy cảm của thuốc tới khói u Khi quá trình acetyl hóa histon tăng lên sẽ làm tháo xoắn nhiễm sắc thé và cho phép quá trình phiên mã Vì vậy, khi kết hợp giữa chất ức chế methyl hóa DNA và ức chế
acetyl hóa histone có thể tạo ra hiệu quả đặc biệt, duy trì mức độ nhạy cảm thuốc của khối u thậm chí là khối u đặc Cuối cùng, các gen liên quan tới sự nhạy cảm và
kháng thuốc còn duge diéu hoa boi RNAi (RNA interfence — RNA can thiệp) Đây là các RNA có trọng lượng phân tử rất nhỏ, có thể bất hoạt các gen do nó gắn với những vị trí khơng mã hóa trên RNA thông tin làm ức chế quá trình giải mã hoặc
Trang 281.5 Tình hình nghiên cứu về UTĐTT ở Việt Nam và trên thế giới 1.5.1 Trên thế giới
Khái niệm về liệu pháp điều trị đích nhắm mục tiêu phân tử lần đầu tiên
được đề xuất vào đầu những năm 1900 và được áp dụng vào điều trị ung thư kế từ năm 1988 Liệu pháp điều trị đích trực tiếp ức chế sự phát triển và khả năng vận động của tế bảo ung thư Cho đến nay, có hai loại thuốc điều trị đích gồm kháng thé đơn dòng và chất/tác nhân ức chế hoạt động enzyme cụ thể liên quan tới con đường tín hiệu tế bào từ đó giúp ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và dẫn tới quá trình chết theo chương trình (apoptosis) Ở UTĐTT, chất/tác nhân điều trị đích đầu
tiên là Cetuximab tir nam 2004 Sau đó, nhiều chất/tác nhân điều trị đích mới được
nghiên cứu, phát triển và đánh giá thử nghiệm lâm sàng và được chỉ định trong điều
trị UTĐTT nhu Bevacizumab, Regorafenib, Ramucirumab (chất/tác nhân ức chế thụ
thể VEGF), Panitumumab (chất/tác nhân ức chế thụ thể EGFR), Vemurafenib và
Dabrafenib (chất/tác nhân ức chế BRAF (23) Đặc biệt, để tăng cường vai trò của hệ
thống miễn dịch trong kìm hãm và ức chế sự phát triển của tế bao ung thư, liệu pháp
miễn dịch đã được nghiên cứu, phát triển và thử nghiệm điều trị ung thư Tuy nhiên,
bắt chấp những tiến bộ y học này, liệu pháp hóa trị, liệu pháp điều trị đích và liệu
pháp miên dịch đã cho thấy tỷ lệ thất bại cao, nguyên nhân có thể do xâm lần va di căn kháng thuốc liên quan đến ung thư, dân đến giảm tỷ lệ sống sót của người bệnh (24)
Các báo cáo gần đây cho thây các mïRNA này có liên quan đến kháng thuốc chống ung thư bằng cách điều chỉnh sự phát triển của tế bào, quá trình chết theo chương trình (apoptosis), thiếu oxy, hình thành mạch và chuyên tiếp dạng tế bào biểu mô và tế bào trung mơ Ví dụ, miR-125b và miR-504 làm giảm quá trình chết rụng bằng cách ức chế biểu hiện của p53; miR-34a làm giảm quá trình apoptosis
bằng cách ức chế biêu hiện của SIRTI, điều chỉnh p53 Trên thé giới đã có nhiều
Trang 2919
Điều trị đích là một chiến lược quan trọng để điều trị ung thư, mặc dù hiệu
quả của nó bị hạn chế bởi tình trạng kháng thuốc Do đó, tính kháng thuốc của các tế bào ung thư phải được khắc phục bằng cách sử dụng các chiến lược mới và đối với điều này, việc hiểu các cơ chế phân tử cơ bản của nó là rất quan trọng Theo các nghiên cứu trước đây, liên quan giữa cơ chế phân tử và kháng thuốc điều trị đích ở
người bệnh UTĐTT, tất cả đều có thể được kiểm sốt bởi miRNA Đã có một số
nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại (microarray) dẫn tới nêu bật được vai trò của miRNA tham gia vào mạng lưới biểu hiện gen liên quan tới tình trạng kháng thuốc chống ung thư Mặc di nhiều nghiên cứu đã sử dụng miRNA để dự đoán đáp ứng thuốc trong UTĐTT Tuy nhiên, việc thiếu hiểu biết đầy đủ về các cơ chế mà qua đó miRNA điều chỉnh tình trạng kháng thuốc vẫn là một hạn chế lớn (25)
1.3.2 Tại Việt Nam
Gần đây hơn, đã có một số nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như microarray đề nghiên cứu đánh giá sự thay đôi biểu hiện gen trong
UTĐTT, hay sàng lọc các đột biến gen APC (26), KRAS, EGER, và BRAF (đề tài
Bộ KH&CN, MS: KC04.06/11-15; đề tài Quỹ NAFOSTED, MS: 106-YS.06- 2016.16) Tuy nhiên, những nghiên cứu đánh giá đặc điểm sinh học phân tử UTĐTT sâu rộng để từ đó nghiên cứu phát hiện các thuốc điều trị đích mới trong
thử nghiệm điều trị người bệnh UTĐTT, đặc biệt ở cộng đồng Việt Nam vẫn còn hạn chế
Đối với các bệnh ung thư nói chung và ở UTĐTT nói riêng, sự thay đổi bộ gen hoặc thay đổi vất chat di truyền có thể gây ra những thay đổi rõ rệt về chức năng của tế bảo và quá trình kiểm sốt sự sinh trưởng của UTĐTT Những thay đổi
này bao gồm sự tăng hoạt động tín hiệu Wnt và đột biến KRAS/BRAE Sự thay đổi
các con đường tín hiệu nay do tần suất đột biến KRAS/BRAF được tìm thấy ở nhiều loại ung thư như UTĐTT, ung thư phổi (27)
Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, phác đồ điều trị đích mới thơng qua
ức chế hoạt động của BRAF bằng thuốc điều trị đích nhắm các mục tiêu tín hiệu
Trang 30trong thử nghiệm điều trị bệnh nhân UTĐTT Mặc dù đây là liệu pháp điều trị đích
mới tiềm năng tập trung vào điểm đích BRAF trong thử nghiệm điều trị UTĐTT, tuy nhiên phác đồ điều trị này không đạt hiệu quả cao do sự tăng kích hoạt con
đường tín hiệu MAPK trở lại đề từ đó hóa giải hiệu quả của thuốc dé tế bào UTĐTT
tăng sinh và phát triển trở lại (28)
Tuy nhiên, thật đáng tiếc, những nghiên cứu gần đây về phát triển phác đồ
điều trị đích mới trong điều trị UTĐTT đã cho biết hiệu quả điều trị với liệu pháp
điều trị đích mới này trong điều trị UTĐTT có hiệu quả không khả quan khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng (28) Những kết quả thu được không mong muốn là do
sự hiểu biết hạn chế về đặc điểm di truyền và cơ chế sinh học phân tử của UTĐTT (29)
1.6 Địa điểm nghiên cứu
Trung tâm Xét nghiệm là đơn vị thuộc Trường Dai hoc Y tế công cộng được
thành lập theo QÐ số 2926/QĐ-BYT ngày 15/7/2015 của Bộ trưởng Bộ Y tế Tại
trường Đại học Y tế công cộng, Trung tâm Xét nghiệm là đơn vị thực hiện các hoạt động đào tạo, nghiên cứu khoa học, cung ứng dịch vụ về xét nghiệm, quan trắc môi
trường và môi trường lao động với hệ thống phòng xét nghiệm đạt chuân quốc tế cùng đội ngũ cán bộ có chuyên môn sâu được đào tạo bài bản ở trong nước và nước ngoài Một trong những hoạt động chính của Trung tâm Xét nghiệm, Trường Đại
học Y tế công cộng là thực hiện các dịch vụ xét nghiệm phục vụ khám chữa bệnh, khám sức khỏe định kỳ và xét nghiệm khám sức khỏe bệnh nghề nghiệp, với hệ
thống phòng thí nghiệm thiết kế mới theo chuẩn quốc tế, đạt chuẩn ISO 17025
Trang thiết bị xét nghiệm hiện đại được đầu tư trên 7 triệu USD từ tổ chức AP Tại khoa xét nghiệm y học của Trung tâm Xét nghiệm, Trường Đại học Y tế
Trang 3121
Chức năng nhiệm vụ của khoa xét nghiệm y học gồm tổ chức thực hiện các xét nghiệm sinh hóa, huyết học, miễn dịch, vi sinh và sinh học phân tử phục vụ chân đoán và theo dõi kết quả điều trị bệnh; thực hiện các dịch vụ xét nghiệm phục vụ khám chữa bệnh, khám sức khỏe định kỳ và xét nghiệm khám sức khỏe bệnh
nghề nghiệp; nghiên cứu xây dựng các phương pháp kỹ thuật xét nghiệm chuyên
ngành; tham gia đảo tạo, nghiên cứu khoa học và xây dựng tải liệu thuộc lĩnh vực
chuyên môn; quản lý, sử dụng và khai thác hiệu quả các máy móc thiết bị được
trang bị để nâng cao chất lượng và hiệu quả khám và điều trị bệnh, đề xuất việc trang bị máy móc, thiết bị phục vụ cho công tác khám, chữa bệnh; quản lý các hóa
chất độc, các chủng vi rút, vi khuân gây bệnh theo đúng quy định kỹ thuật, đảm bảo an toàn tuyệt đối, chống lây nhiễm và tham gia công tác kiểm tra vô khuân, khử
khuẩn trong hoạt động khám chữa bệnh, thực hiện các chế độ bảo hộ lao động theo
quy định; phối hợp hoạt động với các tô chức, cá nhân trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực chuyên môn
1.7 Giới thiệu về nghiên cứu gốc
Đề tài “Nghiên cứu cơ chế phân tử kháng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào UTĐTT mang đột biến gen BRAF hoặc KRAS và đánh giá khả năng điều
trị UTĐTT kháng Selumetinib bằng một số thuốc điều trị đích mới” có mã số
108.06-2020.03 do Quỹ Khoa học và công nghệ Quốc Gia tài trợ bao gồm thông tin
tôm lược sau
Nội dung nghiên cứu: Đề tài thực hiện 4 nội dung nghiên cứu gồm 1) Nghiên cứu
xác định cơ chế phân tử kháng thuốc điều trị trúng đích Selumetinib ở các dòng tế
bào UTĐTT mang đột biến BRAF hoặc KRAS; 2) Nghiên cứu ứng dụng giải trình
tự thế hệ mới (giải trình tự tồn bộ RNA) trong xác định đặc điểm phân tử của các
dòng tế bào UTĐTT mang đột biến BRAF hoặc KRAS kháng thuốc selumetinib; 3) Nghiên cứu sàng lọc các thuốc điều trị trúng đích mới tiềm năng trong điều trị UTĐTT mang đột biến BRAF hoặc KRAS kháng thuốc selumetinib; và 4) Nghiên
cứu đánh giá phác đồ điều trị phối hợp giữa thuốc điều trị trúng đích mới và
Trang 32thuốc selumetinib để từ đó ứng dụng trong điều trị UTĐTT mang đột biến BRAF hoặc KRAS kháng thuốc
Thời gian thực hiện nghiên cứu: 36 tháng từ tháng 10/2020 đến tháng 10/2023 Kết quả của đề tài: Tạp chí quốc tế có uy tín (02 bài báo); Tạp chí quốc gia có uy
tín (01 bài báo); Hội nghị khoa học quốc tế, quốc gia (02 báo cáo); Học viên cao
học (01 học viên)
Đóng góp và vai trò của học viên Trịnh Thị Hải: Với vai trò là học viên cao học, tham gia trực tiếp nội dung nghiên cứu I “Nghiên cứu xác định cơ chế phân tử kháng thuốc điều trị trúng đích Selumetinib ở các dòng tế bào UTĐTT mang đột biến BRAF hoặc KRAS” với 3 phần công việc đã hoàn thành gồm 1) Tạo dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib tir dong tế bào HT-
29/P ban đầu; 2) Xác định con đường tín hiệu nội bào ở dòng tế bào ung thư đại
Trang 33CHƯƠNG 2
DOI TUGNG VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Mâu tế bào UTĐTT HT-29/P ban dau và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc
Selumetimb tại Trung tâm Xét nghiệm, Trường Đại học Y tế công cộng
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2021 đến tháng 8/2022
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Xét nghiệm, Trường Đại học Y tế công cộng 2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm ïz vio sử dụng dòng tế bào HT-29
2.3.2 Cỡ mẫu và chọn mẫu
2.3.2.1 Cỡ mẫu
Một dòng tế bào HT-29 được sử dụng trong nghiên cứu và đều được thực hiện lập lại trên ba mẫu tương đương trong một lần thực hiện thực nghiệm Tần suất
thực hiện lặp lại ba lần và kết quả thu được trong ba lần tương đương nhau 2.3.2.2 Chọn mẫu
Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu nghiên cứu:
Dòng tế bào HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc
Selumetinib cịn sơng không bị nhiễm nắm/vi khuẩn Tiêu chuẩn loại trừ mẫu nghiên cứu:
Dòng tế bào HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc
Selumetinib còn sông bị nhiễm nâm/vi khuân
Dòng tế bảo HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc
Selumetinib bị chết
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.3.1 Kỹ thuật tạo dòng tế bào HT-29 kháng thuốc điều trị đích Selumetinib (HT- 29/SR)
Trang 34Selumetimb theo quy trình tóm lược (Hình 2.1)
Ni cây dòng té bao HT-29/P ban đầu Tế bảo HT-29/P ban đầu sẽ được thử
với thuốc Selumetinib từ /C;¿ để tạo ra các dòng tế bảo HT-29/SR kháng thuốc
Selumetinib từ nồng độ 0.05 uM
Nông độ thuốc Selumetinib sẽ được tăng lên từng bước cho đến 1.5wM khi mà các tế bảo tiếp tục có động lực sinh trưởng như các tế bào không được thử bằng Selumetinib
Dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib với khả năng phát triển và
sinh trưởng trong mơi trường có bô sung 1.5uM thuốc Selumetinib sẽ được thu
hoạch sau thời gian 6 tháng kể từ thời điểm tiếp xúc ban đầu với Selumetinib
Đề thâm định sự thành công trong việc tạo các dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib, phương pháp MTS sẽ được thực hiện sau khi cho phép các tế bảo phát triển trong điều kiện không bổ sung thuốc Selumetinib trong thời gian ít
nhất là 4 ngày
Tế bào HT-29/P ban đầu sẽ được duy trì đồng thời trong điều kiện không bô sung thêm thuốc Selumetinib và sự kháng thuốc ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib sẽ được kiểm tra qua 5 phân đoặn nuôi cấy
Bắt đầu
HT-29/P: Dòng tế bao ung thư đại trực tràng HT-29 ban đầu
' HI-29/SR( 5): dong té bao ung thư dai tre trang HT-29 khang thuoc Selumetinib (1.5 1M)
HI-29/P HT-29/SR(1.5) 1 |} WWI 1 WARDS Vv ¥ Ỳ 0.05 0.25 0.5 0.75 1 1.25 HỆ 0 Selumetinib 5-6 thang
Hình 2.1 Quy trình tạo dịng tế UTĐTT kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR 2.3.3.2 Kỹ thuật nuôi cấy dòng tế bào HT-29 ban đầu (HT-29/P) và đòng tế bào
HT-29 kháng thuốc điều trị đích Selumetinib (HT-29/SR)
Tế bảo HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib
Trang 352.3.3.3 Kỹ thuật MTS
Đề đánh giá sự thay đôi khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của dòng té bao HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với các dòng tế bào HT-29/P ban đầu, quy
trình kĩ thuật MTS được thực hiện các bước như sau:
Dòng té bao HT-29/P ban dau và dong té bao HT-29/SR kháng thuốc
Selumetinib sẽ được nuôi cấy theo từng cặp trong đĩa 96 giếng đáy tắm phẳng với mật độ 2000 tế bào trong một giếng
Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào sẽ được thử thuốc với các nông độ khác nhau (0, 0.1, 1, 10, 100 và/hoặc 1000nM của thuốc Selumetinib trong thời gian 72 giờ
Số lượng tế bảo sống sẽ được xác định bằng phương pháp MTS chuan Gia
trị JCs9 (The half maximal inhibitory concentration) sé duoc tinh bang cách sử dụng
phan mém CompuSyn (ComboSyn, Inc, Paramus, NJ) dé đánh giá tính kháng thuốc Selumetinib của dịng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với các dòng tế
bào HT-29/P ban đầu
2.3.3.4 Kỹ thuật tạo khuẩn lạc tế bào
Đề đánh giá sự thay đổi khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào
HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với các dòng tế bào HT-29/P ban đầu, quy trình
kỹ thuật tạo khuân lạc tế bào được tiền hành các bước như sau
Dòng tế bào HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc
Selumetinib sẽ được nuôi cây theo từng cặp trong đĩa 6 giếng đáy tắm phẳng với mật độ 500 tế bảo trong một giếng
Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào sẽ được thử thuốc với các nông độ khác nhau (0, 0.1, 1, 10, 100 và/hoặc 1000nM của thuốc Selumetinib trong thời gian 48 giờ
Sau hai tuần nuôi cay các khuẩn lạc được nhuộm bằng thuốc nhuộm tím tỉnh
thé và sẽ đếm khuân lạc bằng kính hiển vi quang học 2.3.3.5 K thuật Western blot
Đề xác định sự biến đổi ở mức độ phân tử của dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu, quy trình kỹ thuật Western
Trang 36Tách protein từ dòng tế bào HT-29/P ban đầu và các dòng tế bào HT-29/SR
kháng thuốc Selumetinib
Xác định nồng độ protein từ dòng tế bào HT-29/P ban đầu và các dòng tế bảo HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib
Điện di phân tách protein từ dòng tế bảo HT-29/P ban đầu và các dòng tế bào
HT-29/SR khang thuéc Selumetinib trén gel polyacrylamide
Chuyên protein đã phan tach (blotting) 1én mang nitrocellulose
Cho lai với kháng thê sơ cấp Các kháng thê ban đầu được sử dụng bao gồm MAPK (S6 Catalogue: 9102S), p-MAPK (Y202/T204) (S6 Catalogue: 4370S),
AKT (S6 Catalogue: 9272S), p-AKT (S473) (S6 Catalogue: 9271S), Caveolin-1 (S6
Catalogue: 3267S), E-Cadherin (Số Catalogue: 14472S), Vimentin (Số Catalogue:
5741S) va a-Tubulin (Số Catalogue: 3873S) duoc cung cấp bởi hãng Cell
Signaling, Danvers, MA, United States
Cho lai với kháng thể thứ cấp dé bám đặc hiệu lên kháng thê sơ cấp Kháng
thể thứ cấp có gắn phân tử tín hiệu dạng tạo màu
Sử dụng phần mềm Image I (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) để đánh giá mức độ tăng hoặc giảm của các protein thu được bằng kỹ thuật Western blot
2.3.3.6 Kỹ thuật Realtime PCR
Đề xác định được độ biến đổi ở mức độ phân tử của dòng tế bảo HT-29/SR
kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu, quy trình kỹ thuật
Realtime PCR được tiến hành các bước như sau
Quy trinh chay phan tmg Realtime PCR được thực hiện tại 55°C trong 10 phút đề phiên mã ngược, tiếp theo là 95°C trong 3 phút, sau đó là 45 chu kỳ ở 95°C trong 15 giây, 58°C trong 30 giây Phan tmg Realtime PCR được thực hiện trên hệ thống Applied Biosystems 7500 Trình tự mỗi xuôi, mỗi ngược của gen Caveolin-1
(Caveolin-I F: S-GGTCAATCTCCTTGGTGIGC3 và Cavweolim-l R: 5-
ATGTCTGGGGGCAAATACG-3) và gen GAPDH (GAPDHF: 5-
AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3` và GAPDH R: 55
GGGGTCGTTGATGGCAAC A-3) Mức độ biểu hiện phiên mã của gen Caveolin-l ở
Trang 37Sử dụng phương pháp 27
27
-AACt của Livak để định lượng tương đối mức độ
phiên mã của gen Caveolin-1 6 mau dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib và mâu dòng tế bào HT-29/P ban đầu theo công thức cụ thê như sau
Chu kỳ ngưỡng của gen Caveolin-l ở mâu dòng tế bảo HT-29/SR kháng thudc Selumetinib: Ct Caveolin-1 (HT-29/SR)
Chu ky nguéng ctia gen Caveolin-1 & mau dong té bao HT-29/P ban dau: Ct Caveolin-1 (HT-29/P)
Chu kỳ ngưỡng của gen GAPDH ở mâu dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib: Ct GAPDH (HT-29/SR)
Chu kỳ ngưỡng của gen GAPDH ở mâu dòng tế bào HT-29/P ban đầu: Ct GAPDH (HT-29/P)
ACt HT-29/SR= Ct Caveolin-1 (HT-29/SR) - Ct GAPDH (HT-29/SR) ACt HT-29/P = Ct Caveolin-1 (HT-29/P) - Ct GAPDH (HT-29/P) AACt= ACt HT-29/SR - ACt HT-29/P
Tỷ lệ biểu hién Caveolin-1 & mau dong té bao HT-29/SR khang thuéc Selumetinib với mẫu dòng tế bào HT-29/P ban đầu là R= 2'^^€!,
2.3.4 Biễn số nghiên cứu
STT Các biến số Định nghĩa / tiêu chí đánh
giá biến
Phương pháp thu thập
Dòng tế bào ban
1 đầu
Dòng tế bào ban đầu đã biết trước đặc điểm nuôi cây và
di truyền, đâm bảo tiêu chí
vô khuân không bị nhiễm vi
khuẩn, nấm hoặc tác nhân
gây bệnh khác
Ngân hàng tế bào Hoa kỳ (ATCC)
Dịng tế bào kháng thc
được tạo ra từ dòng tế bào Dòng tế bào kháng thuốc
ban đầu có khả năng sinh bình thường trong mơi trường có
trưởng phát triển
bổ sung thuốc và đảm bảo tiêu chí vơ khuân không bị
nhiễm vi khuẩn, nấm hoặc
tác nhân gây bệnh khác Nuôi cấy có bổ sung thuốc đích
Trang 38
3 Selumetinib Chat ức ché diém dich | Astrazeneca
MEK1/2 2.3.5 So dé nghién ciku Selumetinib
Ky thuat MTS [Tao khuin lac Realtime PCR
Đánh giá sự thay đổi khä năng đáp ứng phân tử của HT-29/Pvà HT-29/SR Xác định sự biến đổi ở mức độ thuốc Selumetinib của HT-29/P và HT-29/SR
2.4 Xử lý và phân tích số liệu
Số liệu được thống kê và xử lý bằng phần mềm Excel 2013 và SPSS 22.0,
với mức ý nghĩa thông kê được xác lập khi P< 0.05 Kết quả nghiên cứu được trình bày dưới dạng văn bản và bảng số liệu, hình
2.5 Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu này nằm trong khuôn khô của đề tài “Nghiên cứu cơ chế phân tử kháng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào UTĐTT mang đột biến gen BRAF hoặc KRAS và đánh giá khả năng điều trị UTĐTT kháng Selumetinib
bằng một số thuốc điều trị đích mới” mã số 108.06-2020.03 do Quỹ Khoa học và
công nghệ Quốc Gia tài trợ Nghiên cứu này tuân thủ đầy đủ các quy định về đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học theo quy định của Bộ Y tế Nghiên cứu được thực
hiện sau khi được Hội đồng đạo đức của Trường Dai hoc Y tế công cộng thông qua
Trang 3929
CHƯƠNG 3
KET QUA NGHIEN CUU
3.1 Thay đổi khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào ung thư
đại trực tràng HT-29/P ban đầu và tế bào kháng thuốc Selumetfinib HT-29/SR 3.1.1 Kết quả tạo dòng tế bào UTĐTT kháng thuốc Selumetinib HT-29⁄SR từ dong té bao HT-29/P ban dau
Sau khi tiến hành nuôi cấy dù điều kiện ni cấy hồn tồn giống nhau nhưng tế bào HT-29/P ban đầu và tế bào HT-29/SR kháng thuốc đã có sự khác biệt
ro rang về đặc điểm kích thước, hình thái và sự phân bồ tế bào (Hình 3.1, Bảng 3.1)
Trong đó, tế bào HT-29/P ban đầu có kích thước, hình thái và sự phân bố tế bào tương đối đồng đều; trong khi tế bảo HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib có kích
thước, hình thái và sự phân tế bào không đồng đều, đã bị biến đổi đề tế bào có thê
sống, sinh trưởng, phát triển và tồn tại trong điều kiện có sự tiếp xúc với thuốc
Selumetinib (Hình 3.1, Bảng 3.1) Hơn thế nữa, tế bào HT-29/P ban đầu có đặc
điểm hình dạng giống như tế bào biểu mơ cịn tế bảo HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib có hình dạng giống như tế bào trung mô (Bảng 3.1)
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, kích thước và điều kiện nuôi cấy dòng tế bào HT-
29/SR kháng thuốc Selumetinib từ dòng tế bào HT-29/P ban đầu
# 2 Dac diém kich `
Dong té bao | Dac diém hinh thai Điều kiện nuôi cây
thước
Đồng đều, có hình ` ¬ , to , | Đông đêu giữa các tê ớ
HT-29/P thái trịn đêu giơng tê : 37C, 5% CO,
š ảo °
bao biêu mô
Không đông đêu, có | Khơng đơng đều, dài
HT-29/SR hình thái dẹt giống tế | ngắn khác nhau giữa | 37C, 5% CO,
bào trung mô các tế bào
Trang 40
HT-29/P HT-29/SR
Hình 3.1 Đặc điểm kích thước, hình thái và sự phân bố tế bào giữa dòng tế bào HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib (Hình ảnh
được chụp dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần)
3.1.2 Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào bằng kỹ thuật MTS
Sau khi ni cấy hai dịng tế bao nay và bằng kỹ thuật MTS chúng tôi thu được ở các nồng độ thuốc khác nhau tỉ lệ % tế bào sống của hai dòng tế bào HT- 29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib được tổng hợp qua
Bảng 3.2 và Hình 3.2 Đặc biệt, ở nồng độ 0.1uM và 0.3uM của thuốc Selumetinib,
dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib có tỉ lệ tế bào sống trên 100% và bắt đầu có sự giảm tỷ lệ sông khi nồng độ Selumetinib tăng trong khi dòng tế bào HT-29/P ban đầu có tỉ lệ tế bào sống giảm dần ngay sau khi tăng dần nồng độ Selumetinib Khi nồng độ thuốc Selumetinib cao thì tỉ lệ tế bảo sống của dòng tế
bào HT-29/SR kháng thuốc cao hơn dòng tế bào HT-29/P ban đầu (Bảng 3.2 và