(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu tổng hợp và xác định hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất hemiasterlin

MỞ ĐẦU Nghiên cứu tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển xu hướng phát triển mạnh mẽ Hiện nay, có khoảng gần 20000 hợp chất phân lập từ sinh vật biển Tuy nhiên, việc thu thập mẫu sinh vật biển khó khăn số lượng khơng nhiều Các hợp chất tách chủ yếu để phục vụ xác định cấu trúc đánh giá hoạt tính in vitro, khn mẫu cho nghiên cứu tổng hợp đường sinh học hóa học Nghiên cứu tổng hợp tồn phần bán tổng hợp hợp chất có nguồn gốc sinh vật biển nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, cung cấp đủ mẫu cho nghiên cứu sâu hoạt tính in vivo thử nghiệm lâm sàng, đồng thời thay đổi tạo thành dẫn xuất có cấu trúc hoạt tính lý thú [2,49-61] Hemiasterlin tripeptit có hoạt tính chống ung thư ngưỡng nM (0,3 nM) với nhiều dòng tế bào ung thư thực nghiệm, phân lập từ h loài hải miên Hemiasterella minor vào năm 1994 [1] Hoạt tính gây độc tế bào hemiasterlin làm ngưng trệ phân bào giai đoạn metaphase động học tế bào nhờ ức chế trình polyme hóa tubulin depolyme hóa microtubule gắn lên vị trí vinca peptit tubulin Tác động tương tự số thuốc gắn lên tubulin ứng dụng điều trị ung thư paclitaxel (3,9 nM) vinblastin (0,79 nM) [4] Do hàm lượng thiên nhiên thấp việc thu thập mẫu khó khăn [1,2] Hợp chất có cấu trúc lý thú hoạt tính sinh học cao nên nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu tổng hợp Đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất hemiasterlin cách thay đổi nhóm ba axit amin (ba block) phân tử hemiasterlin tạo thành dẫn xuất hemiasterlin có cấu trúc độc đáo hoạt tính lý thú [1-9,34] Trong số đó, dẫn xuất có cấu trúc lược giản hemiasterlin có hoạt tính mạnh hemiasterlin [7,8] Các nghiên cứu phát số hemiasterlin (63a, 63b) có cấu hình phi thiên nhiên (R) nguyên tử cacbon gắn với nhóm NH-metyl block thể hoạt tính mạnh [9] h Ngoài ra, số hợp chất thiên nhiên 4, có độc tính mạnh với tế bào ung thư có nhóm α,α-dimetylbenzylic thay hệ α,βcacbonylbenzylic[32,33,35] Như vậy, nghiên cứu tổng hợp tìm kiếm cấu trúc hemiasterlin, đặc biệt chất có cấu trúc lược giản nhiều nhà khoa học quan tâm Do đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp xác định hoạt tính sinh học số dẫn xuất hemiasterlin” có ý nghĩa khoa học thực tiễn Đề tài thực nhờ biến đổi cấu trúc ban đầu hemiasterlin việc thay nhân N-metylindol bioisostere naphthalen benzofuran; tổng hợp hợp chất có cấu hình thiên nhiên (S) phi thiên nhiên (R) nguyên tử cacbon gắn với nhóm NH-metyl block tổng hợp dẫn xuất hemiasterlin có cấu trúc lược giản chứa hệ α,β-cacbonyl-N-axetyl liên hợp (chứa hệ Michael) nhằm tìm kiếm hợp chất hemiasterlin h Chương TỔNG QUAN 1.1 HEMIASTERLIN Hemiasterlin nhóm tripeptit thiên nhiên mạch thẳng phân lập từ loài hải miên Hemiasterella minor Phân tử hemiasterlin cấu tạo từ ba đơn vị amino axit bất thường Do có độc tính mạnh với nhiều dòng tế bào ung thư nên nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Hiện nay, số hemiasterlin thử nghiệm điều trị ung thư giai đoạn hai 1.1.1 Phân lập hemiasterlin Năm 1994, lần nhóm nghiên cứu Kashman phát phân lập hemiasterlin (1) từ loài hải miên Hemiasterella minor vịnh Dodwana với hàm lượng thấp 0,01% so với khối lượng mẫu khô h [1] Cấu trúc phức tạp hemiasterlin Kashman chứng minh nhiều phương pháp phổ phổ khối lượng phân giải cao bắn phá nhanh ghép nối khối phổ (HRFABMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D 2D phổ IR khẳng định cấu trúc mạch thẳng hemiasterlin gồm ba amino axit bất thường xếp theo thứ tự A,B,C, khơng giải thích cấu hình khơng gian nhóm ba amino axit Tiếp theo, nhóm nghiên cứu Raymond J Andersen phân lập hai dẫn xuất khác hemiasterlin hemiasterlin A (5), hemiasterlin B (6) từ loài hải tiêu Auletta Cymbastella [2] Do cấu trúc phức tạp hemiasterlin hàm lượng hemiasterlin mẫu hải tiêu thấp nên đến năm 1996 cấu trúc không gian hemiasterlin khẳng định nhờ phổ nhiễu xạ tia X [3], sau nhà khoa học chứng minh nhiều phương pháp đại [20] Năm 1999, nhóm nghiên cứu Chandra K Westergaard, Michael R Boyd cộng phân lập bốn dẫn xuất hemiasterlin (1), hemiasterlin A, B C (5-7) từ hai loài hải miên Auletta sp Siphonochalina spp., lần hemiasterlin C (7) phân lập chứng minh cấu trúc [5] Như vậy, việc phân lập hemiasterlin từ loài hải miên với cấu trúc độc đáo hút nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu phân lập nhằm tìm kiếm hợp chất có trúc lý thú từ sinh vật biển 1.1.2 Hoạt tính sinh học hemiasterlin h Kết sàng lọc hoạt tính ban đầu Kashman khẳng định khả gây độc tế bào ung thư P388 leukaemia hemiasterlin (1) nồng độ IC50 = 19 nM [1] Năm 1995, Andersen thử nghiệm lại độc tính tế bào hemiasterlin dòng P388 leukaemia với nồng độ ức chế IC50 = 8,7 nM [2] So sánh hai kết nghiên cứu, nhóm Andersen giải thích mẫu hemiasterlin họ có độ cao hơn, điều phù hợp với khẳng định nhóm Kashman năm 1994 mẫu hemiasterlin cho nghiên cứu hoạt tính có độ chưa cao [1,2] Cũng cơng trình này, Andersen khẳng định độc tính hemiasterlin với nhiều dịng tế bào khác như: ung thư vú MCF7 (ED50 = 0,089 µg/ml), ung thư glioblastoma/astrocytoma U373 (ED50 = 0,012 µg/ml), ung thư ovarian carcinoma HEY (ED50 = 0,0014 µg/ml), dẫn chất hemiasterlin A, B có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hemiasterlin (1) [2] Năm 1997, nhóm nghiên cứu Andersen phát chế chống ung thư hemiasterlin Hoạt tính độc tế bào hemiasterlin làm ngưng trệ phân bào giai đoạn metaphase động học tế bào nhờ ức chế q trình polyme hóa tubulin gắn kết hemiasterlin lên vị trí Vinca peptit tubulin Tác động tương tự số tác nhân chống ung thư khác gắn kết lên tubulin ứng dụng hóa trị liệu ung thư paclitaxel vinblastin, khoảng liều ED50 từ 0,5 nM đến 28 nM [4,22,50] Như vậy, nhóm chất hemiasterlin phân lập từ lồi hải miên khơng có cấu trúc hóa học độc đáo mà chúng cịn có hoạt tính gây độc tế bào mạnh với nhiều dòng tế bào ung thư Kết mở hướng nghiên cứu tìm hợp chất chống ung thư có nguồn gốc sinh vật biển [23] 1.2 TỔNG HỢP TOÀN PHẦN HEMIASTERLIN THEO ANDERSEN h Hemiasterlin có hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao nên nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm tìm kiếm thuốc cho điều trị ung thư có nguồn gốc thiên Tuy nhiên, hàm lượng hemiasterlin tự nhiên thấp (0,01%) trình thu thập mẫu hải miên gặp nhiều khó khăn nên q trình phân lập hemiasterlin thường không đủ cho nghiên cứu sâu hoạt tính cấu trúc [1] Đặc biệt hemiasterlin có cấu trúc độc đáo gồm ba đơn vị axit amin bất thường nên nhiều nhà tổng hợp hữu nghiên cứu tổng hợp toàn phần Từ ý tưởng Andersen cộng đưa phương pháp tổng hợp toàn phần hemiasterlin lần năm 1997 [6,7] Để tổng hợp toàn phần hemiasterlin, người ta phân tích tổng hợp ngược từ block1, block block sau tổng hợp block ghép nối block tạo thành hemiasterlin Hình 1.1 Cấu trúc block hemiasterlin Bước khó qui trình tổng hợp hemiasterlin block phải điều khiển cấu hình bất đối nhóm NH-metyl Tổng hợp block tóm tắt sơ đồ 1.1 sơ đồ 1.2 [6,7] CO2Me CO2H KHMDS, CH2N2, Et2O N H CO2Me N Me KHMDS MeI, THF N 10 CH=CHOMe 11 Me DIBAL-H, THF, -78 tíi oC CH2OH TPAP, NMO, CH2Cl2 KOt-Bu, THF 13 N Me N Me 12 h TsOH, dioxan, H2O N MeI, THF Me CHO Ph3PCH2OMeCl, N Me 14 CO2Me CH2CHO CH2CO2H NaClO2, NaH2PO4, N Me 15 t-BuOH, H2O N Me 16 Sơ đồ 1.1 Đầu tiên, nguyên liệu indol-3-ylaxetic axit (8) chuyển hóa thành dẫn xuất metyl este nhờ phản ứng với diazometan dung môi dietyl ete, hợp chất metyl hóa liên tiếp hai lần có mặt bazơ mạnh KHMDS với tác nhân metyl hóa MeI dung mơi THF, tạo thành sản phẩm dimetyl hóa 11 Sau đó, khử hóa chọn lọc chất 11 tác nhân DIBAL-H THF nhiệt độ thấp tạo thành ancol bậc 12 Tiếp theo ancol 12 oxy hóa chọn lọc MNO có mặt TPAP dung mơi diclometan tạo thành andehit 13 Tăng mạch cacbon chất 13 nhờ phản ứng Wittig với Ph3PCH2OMeCl, xúc tác t7 BuOK dung môi THF tạo thành chất 14, thủy phân chất 14 TsOH dioxan tạo thành andehyt 15, sau chất 15 oxy hóa tác nhân natri clorit môi trường kiềm yếu tạo thành axit 16 (sơ đồ 1.1) Chất 16 gắn với tác nhân Evan tạo thành chất 17, hợp chất 17 azit hóa chọn lọc tác nhân trisyl azit tạo thành chất 18 có độ chọn lọc lập thể cao nhờ định hướng tác nhân Evan Sau đó, azit 18 khử hóa hydro có xúc tác Pd(C) tạo thành amin 19 Nhóm amin chất 19 bảo vệ Boc nhờ phản ứng với Boc2O dung môi etyl axetat tạo thành chất 20 Hợp chất 20 loại bỏ tác nhân Evan nhờ phản ứng oxy hóa H2O2 mơi trường kiềm LiOH tạo thành axit 21, sau metyl hóa chất 21 MeI có mặt tác nhân kiềm NaH dung môi DMF tạo thành chất 22 Thủy phân hợp chất 22 LiOH dung môi MeOH/H2O tạo thành axit 23 (block 1) (sơ đồ 1.2) h O O O Pivaloyl clorid, THF N OH OLi N 16 Me , THF, -78oC N O N Me O 17 24 KHMDS, trisylN3, THF, -78oC O O O N O Boc2O, EtOAc NH N Boc Me N N Me 20 O O O H2/Pd(C) NH2 N Me 19 O N O N3 18 LiOH, H2O2, MeOH O OH OCH3 LiOH, MeOH, H2O HN N Me 21 O O NaH, MeI, DMF Boc N Me 22 OH HN HN Me N Me Me 23 Block Sơ đồ 1.2 Như trình bày Andersen tổng hợp block riêng lẻ sau tổng hợp hemiasterlin nhờ ghép nối block với theo nguyên tắc dipeptit block 2-3 ghép nối với block Cho nên sau tổng hợp block Andersen tổng hợp block nhờ sử dụng nguyên liệu đầu cho tổng hợp block L-Boc-valin Cấu hình E-olefin block tổng hợp chọn lọc nhờ phản ứng Wittig, sơ đồ tổng hợp block Andersen đưa sau: Sơ đồ 1.3 Tổng hợp block hemiasterlin liệu (S)-N-Boc-metylvalin h Nguyên 25 phản ứng với [H2N(OMe)Me]Cl có mặt DCC i-Pr2NEt, dung môi axetonitrin tạo thành Weinreb amit 26 Tiếp theo, khử hóa chất 26 với tác nhân khử LiAlH4 THF -78oC tạo thành andehit 27 với hiệu suất 55% Phản ứng chất 27 với tác nhân Wittig Ph3P=C(Me)CO2Et dung môi CH2Cl2 tạo thành sản phẩm chọn lọc lập thể E-olefin 28 Sau loại bỏ nhóm bảo vệ Boc chất 28 axit trifloaxetic tạo thành chất 29 (block 3) với hiệu suất 95% Andersen tổng hợp dipeptit block 2,3 (32) nhờ phản ứng ghép nối block (29) với block L-Boc-leuxin (30) có mặt tác nhân hoạt hóa PyBroP DMAP, dung mơi diclometan tạo thành chất 31 Sau loại nhóm bảo vệ Boc nhờ phản ứng TFA tạo thành muối 32, muối 32 phản ứng với chất 23 (block 1) tạo thành dẫn xuất etyl este 33 có nhóm bảo vệ Boc block Nhóm Boc este 33 loại bỏ nhờ phản ứng với TFA tạo thành chất 34, cuối thủy phân chất 34 để loại bỏ nhóm etyl đầu este tác nhân tủy phân chọn lọc LiOH hỗn hợp dung mơi metanol: nước nhiệt độ phịng thời gian 15h tạo thành hemiasterlin (1) với hiệu suất 83% [2] (sơ đồ 1.4) Hiệu suất tổng mà Andersen tổng hợp hemiasterlin từ nguyên liệu đầu 0,6% h Sơ đồ 1.4 Tổng hợp mạch nhánh hemiasterlin Như vậy, lần Andersen tổng hợp toàn phần hemiasterlin với hiệu suất cao nhờ tổng hợp riêng biệt block 1,2 sau ghép nối block với block tạo thành dipeptit block 2-3, cuối ghép nối với block tạo thành hemiasterlin Đây kết lý thú nhiều nhà khoa học quan tâm phương pháp để áp dụng cho tổng hợp hemiasterlin nhằm tìm kiếm hợp chất có cấu trúc lý thú hoạt tính sinh học cao 1.3 TỔNG HỢP DẪN XUẤT HEMIASTERLIN HTI-286 Từ thành công phản ứng tổng hợp toàn phần hemiasterlin Andersen nghiên cứu tổng hợp nhiều dẫn chất khác hemiasterlin nhờ thay block 1, block block phân tử nguyên gốc nhóm khảo sát hoạt tính chống ung thư chúng [7,22,49] Kết 10