Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm từ nguồn giao tử nội và ngoại nhập

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 26 tháng 03 năm 2009) TẠO PHÔI BỊ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG CƠNG NGHỆ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ NGUỒN GIAO TỬ NỘI VÀ NGOẠI NHẬP CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PHAN KIM NGỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/2009 TĨM TẮT Nhân giống cơng nghệ phôi đại giải pháp khả thi góp phần triển khai thành cơng Chương trình Quốc gia 200.000 bò sữa Đề tài tiến hành nhằm nghiên cứu hồn thiện quy trình tạo phơi bị cơng nghệ thụ tinh ống nghiệm khu vực Tp HCM đồng thời góp phần đào tạo cán kỹ thuật cho lĩnh vực CNSH động vật Nội dung 1: buồng trứng thu nhận lò mổ chuyển nhanh phịng thí nghiệm nước muối sinh lý sau thu nhận trứng phương pháp chọc hút kim tiêm 18G xi lanh 5ml, ni chín môi trường C1 (TCM -199 bổ sung FBS, EGF) tiến hành thụ tinh ống nghiệm với tinh trùng đông lạnh ngoại nhập Kết thụ tinh đánh giá thông qua phôi tế bào Tiến hành sinh thiết xác định giới tính phơi nang kỹ thuật PCR LAMP Nội dung 2: trứng thu nhận phương pháp siêu âm, sau ni chín, tiến hành thụ tinh ống nghiệm với tinh trùng đông lạnh ngoại nhập Tiến hành sinh thiết xác định giới tính phơi dâu phơi nang kỹ thuật PCR Nội dung 3: thụ tinh ống nghiệm trứng đơng lạnh (do phịng thí nghiệm tự đơng lạnh trứng mua) thử nghiệm cấy truyền phôi cho bò mẹ mang thai hộ Kết nội dung 1: tỷ lệ trứng chín 69,83 ± 8,04% (Trứng thu lò mổ Vissan) 81,19 ± 2,75% (Trứng thu lò mổ Long An); tỷ lệ thu tinh 48,43 ± 6,74%; 18,01 ± 4,91% phát triển đến giai đoạn phôi nang; sinh thiết phôi kỹ thuật PCR LAMP đạt tỉ lệ 41,53% 46,29% Kết nội dung 2: tỷ lệ trứng chín đạt 82,78 ± 7,01%; tỷ lệ thu tinh đạt 67,83 ± 2,61%; 27,32 ± 3,68% phát triển đến phôi nang; sinh thiết phôi đạt tỷ lệ 47,86% Kết nội dung 3: tỷ lệ thụ tinh ống nghiệm đạt 11,67% (trứng phịng thí nghiệm tự đơng lạnh) có 46/144 phôi (3,72%) phát triển đến giai đoạn phôi nang có 02 bê đời khỏe mạnh Từ khóa: ni chín trứng, thụ tinh ống nghiệm, đơng lạnh trứng, đơng lạnh phơi, xác định giới tính phơi, chuyển phôi ABSTRACT Breeding by modern embryo production technology is the most feasible solution, contributing to the success of the 200,000 milk cows National Program The main target of our research is studying and improving bovine embryo production process by in vitro fertilization technology in Ho Chi Minh city, simultaneously, contributing to train technicians of animal biotechnology field In the first experiment, cow ovaries were obtained from abattoir and transported to the laboratory in 0.9% (w/v) saline solution at 33 to 35oC The cumulus-oocyte complexes (COC) were recovered by aspiration of to mm follicles using an 18-gauge needle attached to 5ml syringe Oocytes with a two or three layers of cumulus cells (CC) and homogeneous cytoplasm were washed in flushing medium Groups of 25 to 30 oocyte were placed in 100 µl drops of C1 maturation medium (TCM-199 medium supplemented with 10% FBS, 0.2 mM sodium pyruvate, 50µg/ml gentamicin, 10ng EGF) under sterile mineral oil at 38.5◦C in an humidified atmosphere of 5% (v/v) CO2 in air for 22h - 24 h Mature oocytes were inseminated with imported sperm suspension to a final concentration of 1.106 sperms/ml at 38.5◦C in a humidified atmosphere of 5% (v/v) CO2 in air The insemination rate is evaluated by 2-cell embryo Sex of blastocyst embryos were determined by PCR and LAMP technique In the second experiment, the cumulus-oocyte complexes (COC) were recovered by ultrasound guided ovum pick-up technique After 22- 24h culture, mature oocytes were inseminated with sperm suspension Sex of morula and blastocyst embryo is determined by PCR In the last experiment, IVF was performed with cryopreservated oocytes (from our lab or purchase) The morulas and blastocysts created by this procedure were transferred into the recipient cows In the first experiment, the rates of the metaphase II (MII) oocytes after IVM are 69.83 ± 8.04% (Vissan slaughter - house) and 81.19 ± 2.75% (Long An slaughter - house); insemination rates are 48.43 ± 6.74% and 18.01 ± 4.91% blastocysts The rates of successful sex determination by PCR and LAMP technique are 41.53% and 46.29%, respectively In the second experiment, the rate of MII oocytes after IVM is 82.78 ± 7.01%; insemination rate is 67.83 ± 2.61%; and having 27.32 ± 3.68% blastocysts The rate of successful sex determination by PCR is 47.86% In the last experiment, insemination rate is 11.67% (oocytes from our lab) and two calves were born Keywords: in vitro maturation, in vitro fertilization, cryopreservation, vitrification, embryo biopsy, embryo transfer MỤC LỤC Trang Tóm tắt đề tài/dự án (gồm tiếng Việt tiếng Anh) I Mục lục IV Danh sách chữ viết tắt VII Danh sách bảng VIII Danh sách hình IX PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài/dự án Chủ nhiệm đề tài/dự án Cơ quan chủ trì Thời gian thực Kinh phí duyệt Kinh phí cấp Mục tiêu Nội dung Sản phẩm đề tài/dự án CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước 10 1.2 Lý chọn đề tài 14 1.3 Đối tượng nghiên cứu 15 1.4 Ý nghĩa khoa học khả ứng dụng thực tiễn 15 CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: Tạo phơi bị giai đoạn blastocyst trứng 16 thu nhận từ lò mổ tinh trùng ngoại nhập đông lạnh 2.1.1 Chuẩn bị trứng 16 2.1.2 Chuẩn bị tinh trùng 19 2.1.3 Thụ tinh ống nghiệm 20 2.1.4 Nuôi phôi đánh giá phôi 21 2.1.5 Sinh thiết phôi 21 2.1.6 Xác định giới tính kĩ thuật PCR LAMP 23 2.1.7 Đông lạnh phôi 26 2.2 Nội dung 2: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst trứng 28 thu từ siêu âm tinh trùng ngoại nhập đông lạnh 2.3 Nội dung 3: Tạo phơi bị giai đoạn blastocyst trứng 29 đông lạnh tinh trùng ngoại nhập đông lạnh 2.4 Xử lí số liệu 31 CHƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu nội dung 32 3.1.1 Kết thu nhận nuôi trứng trửơng thành 32 3.1.2 Kết đông lạnh trứng 35 3.1.3 Kết thụ tinh ống nghiệm 36 3.1.4 Kết nuôi phôi 37 3.1.5 Kết sinh thiết phơi 39 3.1.6 Kết xác định giới tính 40 3.1.7 Kết đông lạnh phôi 42 3.2 Kết nghiên cứu nội dung 42 3.2.1 Kết thu nhận nuôi trưởng thành trứng 42 3.2.2 Kết thụ tinh ống nghiệm 44 3.2.3 Kết nuôi phôi 3.2.4 Kết sinh thiết phôi 46 3.2.5 Kết xác định giới tính 46 3.2.6 Kết đơng lạnh phôi 47 3.3 Kết nghiên cứu nội dung 48 3.3.1 Kết giải đông trứng mua 48 3.3.2 Kết thụ tinh ống nghiệm 49 3.3.3 Kết nuôi phôi 53 3.3.4 Kết đông lạnh phôi 55 3.4 So sánh kết nội dung thí nghiệm 58 3.4.1 So sánh kết ni chín trứng từ nguồn trứng khác 58 3.4.2 So sánh kết IVF từ nguồn trứng khác 58 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 61 4.2 Kiến nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO Dimethyl sulfoxide EG Ehthylen glycol FSH Folliccle Stimulating Hormone GVBD Germinal vesicle break dowm Hormone kích thích nang trứng Giai đoạn túi mầm ICSI Intracytoplasmic sperm injection Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh ống nghiệm IVM In Vitro Maturation Nuôi trưởng thành ống nghiệm LAMP Loop mediated isothermal amplification Phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt MII Methaphase II Kỳ methaphase nhiễm phân II MPF Maturation Promoting Factor Nhân tố thúc đẩy trưởng thành PCR Polymere Chain Reaction Phản ứng chuỗi PN Pronuclear Tiền nhân PTN Phịng thí nghiệm PVP polyvinylpyrolidone PZD Partial Zona Disection Tiêm tinh trùng vào khoang quanh SUZI Subzonal Sperm Injection Tạo lỗ thủng nhân tạo màng zona TE Trophoblast embryonic Lớp dưỡng bào phôi ZP Zona pellucidae Lớp màng suốt bảo vệ trứng nỗn DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung Error! Bookmark not defined Hình 2 Rửa buồng trứng Error! Bookmark not defined Hình Thu nhận trứng từ buồng trứng Error! Bookmark not defined Hình Cọng rạ chứa trứng Error! Bookmark not defined Hình Giải đông cọng rạ chứa tinh trùng water bath 370C Error! Bookmark not defined Hình Cách hút phôi vào cọng rạ Error! Bookmark not defined Hình Hút phơi vào cọng rạ Error! Bookmark not defined Hình 10.Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung Error! Bookmark not defined Hình 11 Một số hình ảnh siêu âm thu nhận trứng bò Error! Bookmark not defined Hình 12 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung Error! Bookmark not defined Hình 1.Trứng bò trước IVM (a) sau IVM (b; c); trứng trưởng thành xuất thể cực thứ sau 22 – 24h nuôi (d) Error! Bookmark not defined Hình Phơi tế bào Error! Bookmark not defined Hình 3 Phơi tế bào Error! Bookmark not defined Hình Phơi dâu Error! Bookmark not defined Hình Phôi nang Error! Bookmark not defined Hình 3.6 Xác định giới tính phơi bị phản ứng PCR M: thang chuẩn, Giếng 1: thịt bò đực, Giếng 2: Thịt bò cái, Giếng 3, 4: Phôi đực, Giếng 5, 6,7: Phôi cái, Giếng 8, 9: Phôi không xác định Error! Bookmark not defined Hình 3.7 Xác định giới tính phơi bị phản ứng LAMP Error! Bookmark not defined Hình 3.8 Trứng bò trước IVM (a) xuất thể cực sau IVM (b) Error! Bookmark not defined Hình 3.9 Phơi tế bào (a) tế bào (b), phôi morula (c) phơi nang (d) Error! Bookmark not defined Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR, mẫu phơi bị đực (a), bị (b) Error! Bookmark not defined Hình 3.11.Phơi tế bào, thụ tinh tinh trùng đông lạnh với trứng đông lạnh Error! Bookmark not defined Hình 12 Trứng thụ tinh (phơi 2) từ IVF trứng mua Error! Bookmark not defined Hình 3.13 Phơi bị (a) 4-8 tế bào, (b) 16 tế bào, (c) morula (d) phôi nang Phôi thu từ IVF từ trứng đông lạnh Error! Bookmark not defined Hình 3.14 Bê sinh từ phơi tạo ống nghiệm từ trứng đông lạnh vào ngày 17/04/2008 gia đình ơng Nguyễn Văn Cường Error! Bookmark not defined Hình 3.15 Bê sinh từ phôi tạo ống nghiệm từ trứng đông lạnh vào ngày 26/02/2008 gia đình ơng Võ Văn Sa Error! Bookmark not defined Hình 3.16 Bê (có đốm trắng dười bụng) sinh từ phơi tạo ống nghiệm từ trứng đông lạnh vào ngày 26/02/2008 Error! Bookmark not defined Biểu đồ Kết ni trứng từ nguồn trứng thu lị mổ Error! Bookmark not defined Biểu đồ Kết đông lạnh trứng Error! Bookmark not defined Biểu đồ 3.3 Kết nuôi trứng từ nguồn trứng siêu âm Error! Bookmark not defined Biểu đồ 3.4 Kết thu nhận trứng sau giải đông Error! Bookmark not defined Biểu đồ 3.5 Kết thụ tinh từ nguồn trứng đông lạnh Error! Bookmark not defined Biểu đồ 3.6 So sánh hiệu tạo phôi giai đoạn khác ………… 59 lần thứ nhất1800 vòng/phút phút, hút bỏ phần trên, để lại phần đáy khoảng 0,5ml huyền phù dịch Tiếp theo tiến hành ly tâm lần với tốc độ thời gian lần 1, phần lắng đáy ống falcon pha lỗng mơi trường BO cho đạt mật độ 5-6x106 tinh trùng/ml Dịch huyền phù dùng để tạo vi giọt thụ tinh đĩa giếng (100µl/giọt), phủ dầu khống, giữ tủ ấm 38,50C, 5% CO2 Như vậy, vi giọt chứa khoảng 5-6x105 tinh trùng Lượng tinh trùng sử dụng cho thụ tinh 15-20 trứng vi giọt Nghĩa cần khoảng 25 đến 30 ngàn tinh trùng để thụ tinh cho trứng THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Chuẩn bị - Đĩa chứa vi giọt (100 µl/giọt) tinh trùng chuẩn bị sẵn (đĩa 35mm) - Đĩa chứa vi giọt (100 µl/giọt) mơi trường CR1aa (chuẩn bị trước trước sử dụng) - Trứng IVM - Tủ ấm CO2 Tiến hành - Chuyển 15 – 20 trứng IVM vào vi giọt thụ tinh (có sẵn tinh trùng) đĩa 35mm có phủ dầu khống Lưu ý, chuyển trứng, hút lượng mơi trường ni trứng kèm theo tốt Đặt đĩa vào tủ ni 38,5oC; 5% CO2 5-6 giờ, sau quan sát đánh giá kết thụ tinh NUÔI PHÔI VÀ ĐÁNH GIÁ PHƠI Chuẩn bị Mơi trường ni cấy phơi (mơi trường CR1aa) trước lấy phôi/trứng thụ tinh Môi trường ủ tủ ấm 38,50C, 5% CO2, bão hòa nước Mouth pipette: đường kính pipette 100µm Tiến hành Sau thụ tinh 5-6 thụ tinh, tế bào trứng loại bỏ cumulus mouth pipette có gắn pipette pasteur Các hợp tử giả định chuyển vào vi giọt môi trường CR1aa, đĩa nuôi phủ dầu khống ni 38,5oC; 5% CO2 Sự phân chia hợp tử đánh giá dựa vào phân chia tế bào 46 – 48 sau thụ tinh Sau ngày nuôi cấy, tiến hành đánh giá tốc độ phân chia: Tốc độ phân chia xác định dựa số phôi phân chia số phôi/trứng giọt nuôi cấy ban đầu Sau ngày nuôi cấy bổ sung huyết vào giọt nuôi cấy: Thêm 5µl FBS lọc vơ trùng làm ấm vào giọt nuôi cấy Sau - ngày nuôi cấy đánh giá phát triển phôi: Đánh giá phát triển phôi đến giai đoạn blastocyst SINH THIẾT PHÔI Chuẩn bị - Holding pipette sử dụng quy trình thử nghiệm có đường kính ngồi: 80 – 150µm đường kính trong: 18 – 25µm Góc nghiêng đoạn cuối 30o - Zona Drilling mài đầu bằng, có đường kính 10µm, góc nghiêng đoạn cuối 30o - Biopsy pipette sử dụng quy trình thử nghiệm có đường kính khoảng 30 – 35µm, đường kính ngồi vào khoảng 35 – 40µm, góc nghiêng đoạn cuối 30o - Tạo đĩa vi giọt chứa môi trường sinh thiết phôi: + Dùng nắp đĩa X tạo vi giọt 50µl mơi trường CR1aa + Tạo vi giọt 100µl Tyrode (T1788, Sigma) đĩa + Sau phủ dầu khoáng đầy vi giọt + Cho vào tủ ấm, ủ ấm trước tiến hành sinh thiết Tiến hành - Khoan màng pellucida: Khoan màng pellucida Tyrode + Chỉnh vi giọt chứa Tyrode vào vùng trung tâm, hạ zona drilling pipette hút khoảng 10µl Tyrode + Nâng zona drilling pipette lên, chỉnh vi giọt chứa phôi vào vùng trung tâm + Hạ holding pipette xuống, điều chỉnh phôi giữ phôi holding pipette + Hạ zona drilling pipette xuống, tiếp cận phôi, vừa tiến lại gần vừa đẩy từ từ nhẹ nhàng dung dịch Tyrode ra, không đâm vào phôi, đến tạo lỗ thủng vừa phải màng zona, lấy zona drilling pipette - Hút 2-8 tế bào lớp nuôi phôi (TE) biopsy pipette Chuyển cụm tế bào vào eppendorf 0,2 ml (eppendorf PCR nắp phẳng) - Sau đó, chuyển phơi sau sinh thiết vào đĩa nuôi, đặt vào tủ ấm 5% CO2, 37°C Tế bào TE thu dùng làm nguyên liệu cho kĩ thuật phân tích chẩn đốn XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KĨ THUẬT PCR 6.1 Tách DNA DNA phôi tách chiết phương pháp nhiệt - Bổ sung µl Tris-HCl 10 mM pH 8,0 vào eppendorf 0,2 ml chứa sẵn cụm 2-8 tế bào sau sinh thiết - Đun eppendorf 95o C phút để tách DNA (sử dụng máy PCR) - DNA phơi lưu trữ tủ lạnh -20oC 6.2 Phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi S4 Tiến hành Hỗn hợp phản ứng bao gồm: - µl DNA phơi (từ việc tách trên) - 15 pmol mồi - 1,25 U Taq polymerase - 0,2 mM dNTP - 1X Taq buffer - Hỗn hợp phản ứng 25µl Mồi cho xác định giới tính bị cặp mồi S4B có trình tự sau: (Theo Kageyama cs., 2004) S4BF: CAAGTGCTGCAGAGGATGTGGAG S4BR: GAGTGAGATTTCTGGATCATATGGCTACT Chu kì phản ứng PCR: - Phản ứng PCR thực 45 chu kỳ - Mỗi chu kì: 95oC, 30s; 52oC, 45s; 72oC, 45s - Với phút pre-heat phút 720C sau hoàn tất 45 chu kì, sau hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống 40oC phút Xác định kết quả: Nếu vạch vị trí 145 bp, đực có hai vạch 178 bp 145 bp ĐÔNG LẠNH PHƠI Chuẩn bị dung dịch Dung dịch 1: Mơi trường PBS + 15% FCS Dung dịch 2: Môi trường PBS + 10% Glycerol Tiến hành Hút phôi vào cọng rạ Phôi sau đánh giá phân loại đạt tiêu chuẩn rửa dung dịch lần, chuyển phôi sang dung dịch phút cuối nạp phôi vào cọng rạ (1 phôi/cọng rạ), hàn cọng rạ máy ép, để cân cọng rạ 15 phút Để tránh nhầm lẫn việc chọn phôi, cọng rạ phải ghi số thông tin như: giống, chất lượng phôi, giai đoạn phát triển phơi Quy trình đơng lạnh phơi Đặt sẵn chương trình máy đơng lạnh sau: - Đưa phôi vào máy, hạ nhiệt độ xuống – 7oC, giữ phôi -10 phút Tốc độ hạ nhiệt 1oC/phút - Tạo đá: lấy pank nhúng vào nitơ lỏng, sau đó, kẹp vào phía đầu cọng rạ (đầu có nút bấc), sau để vào máy phút, môi trường thành đá trình tạo đá hồn thành - Hạ nhiệt độ từ -7oC xuống -33oC 35oC với tốc độ 0,2 - 0,4oC/phút Giữ phôi nhiệt độ -10 phút Sau đó, đưa cọng rạ có chứa phơi thẳng vào nitơ lỏng -196oC bảo quản với thời gian mong muốn PHỤ LỤC QUY TRÌNH TẠO PHƠI BẰNG TRỨNG ĐÔNG LẠNH VỚI TINH TRÙNG ĐÔNG LẠNH CHUẨN BỊ TRỨNG - Hóa chất NaCl 0,9%: nước muối sinh lý sử dụng để rửa giữ mẫu buồng trứng thời gian vận chuyển từ lò mổ đến PTN Dung dịch nước muối sinh lý hấp khử trùng, để nguội 450C, trước sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) Streptomicin 0,1 mg/ml (S9137, Sigma) Dung dịch D – PBS: môi trường sử dụng để thu dịch nang trứng Trước sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml với Streptomicin 0,1mg/ml ủ ấm 37oC Môi trường Flushing (FLUSH 050, Fertipro) (môi trường W1): sử dụng để rửa trứng trước IVM TCM-199 (M3769, Sigma) + 10% FBS (Gibco) (mơi trường C1): mơi trường ni chín trứng chứa 10% huyết bị mơi trường quan trọng giúp trứng phát triển trưởng thành Môi trường C1 cần ủ ấm 38,5oC, 5% CO2 tối thiểu hai trước sử dụng Parafin lỏng (dầu khống) (Merck): dùng phủ vi giọt đĩa có tác dụng ngăn nhiễm, tránh làm bốc vi giọt để lâu tủ ấm, đồng thời cố định giúp ổn định vi giọt Hyaluronidase (H4272, Sigma): dạng dung dịch sử dụng để phá tế bào cumulus quanh trứng đánh giá trứng sau IVM Môi trường VS1: TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG: dung để cần trứng Môi trường VS2: TCM–199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose: dung để bảo quản trứng -196oC Môi trường RĐ1: TCM–199 + 10% FBS + 0,25M Sucrose Môi trường RĐ2: TCM–199 + 10% FBS + 0,15M Sucrose Môi trường RĐ3: TCM–199 + 10% FBS - Dụng cụ Đĩa Petri d = 90mm, 60mm, 35mm (Corning, Mỹ), đĩa giếng (Nunc, Đức), kim 18G, syringe 5ml, gạc vơ trùng, pipette Pasteur kéo đường kính 120µm, mouth pipette, cọng rạ 0,25ml (imv, Pháp), máy ép nhựa, bình đựng nitơ lỏng, số dụng cụ thủy tinh: bercher, erlen… - Thiết bị Water bath (Memmert, Đức), kính hiển vi soi (độ phóng đại tối đa 40 lần, Nikon, Nhật), tủ ấm CO2 (Sanyo, Nhật) ™ Thu nhận trứng Buồng trứng bò thu nhận lò mổ bảo quản nước muối sinh lí ấm, chuyển nhanh phịng thí nghiệm (PTN) Tại PTN, lọ mẫu buồng trứng lau cồn 70o, rửa máu, mỡ chuyển vào tủ cấy vô trùng Dùng kẹp vô trùng chuyển mẫu khay, rửa buồng trứng từ đến lần dung dịch NaCl 0,9% bổ sung kháng sinh làm ấm 37oC Cho buồng trứng vào đĩa Petri d = 90mm có chứa NaCl 0,9% bổ sung kháng sinh làm ấm 37oC để giữ mẫu Dùng gạc vô trùng lau khô buồng trứng chuyển vào becher chứa D – PBS có kháng sinh làm ấm để giữ mẫu Thu nhận trứng phương pháp chọc hút: Sử dụng đầu kim 18G gắn vào syringe 5ml hút khoảng 1ml dung dịch D –PBS có kháng sinh làm ấm becher (khơng phải becher giữ mẫu) Đâm mũi kim vào nang có đường kính từ - 8mm, hút dịch nang khoảng 3ml chuyển dịch vào đĩa petri nhựa Φ60 đĩa chứa dịch nang trứng chuyển vào tủ ấm 38,5oC từ 5–10 phút để lắng Sau soi tìm phân loại trứng kính hiển vi đảo ngược (hoặc kính hiển vi soi nổi) độ phóng đại 40 lần Việc phân loại trứng dựa vào độ dày lớp tế bào cumulus; chia thành loại: A, B C Trong đó, trứng A B cịn lớp cumulus bám vào trứng trứng C lớp cumulus bị bong phần ™ Nuôi trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM) - Dùng mouth pipette thu trứng loại A B (có từ lớp cumulus trở lên) từ đĩa D – PBS cho vào giếng có mơi trường W1 rửa – lần, chuyển sang đĩa chứa môi trường C1 để rửa Sau cho khoảng 10 đến 20 phức hợp COC (phức hợp trứng cumulus) vào giếng nuôi chứa môi trường C1 (loại đĩa giếng chứa 100 µl/giếng phủ dầu khống) - Ni trứng tủ ấm điều kiện 38,5oC, 5% CO2, nước bão hịa Lưu ý: Mơi trường W1, C1 cần ủ ấm 38,5oC, 5% CO2 tối thiểu hai trước sử dụng - Sau 22 - 24h nuôi cấy, chuyển trứng có cumulus giãn nở rộng sang vi giọt môi trường C1 chờ để thụ tinh Trong thí nghiệm đánh giá hiệu trưởng thành sau IVM, tất trứng sau IVM bị tách bỏ lớp cumulus mouth pipette hyaluronidase Trứng cho trưởng thành cực, tế bào chất sáng, đều, lớp cumulus giãn nở rộng Ở thí nghiệm này, trứng sau IVM dùng để đông lạnh nên không loại bỏ cumulus ™ Đông lạnh trứng Sau 22 – 24h nuôi, chọn trứng chín (lớp cumulus giãn nở rộng) đem đơng lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) bước: Trứng cân môi trường VS1 (TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG) 45 giây, sau chuyển qua môi trường VS2 (TCM–199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose) 25 giây Sau chuyển trứng vào cọng rạ (straw) vòng 30 giây Cách chuyển trứng vào cọng rạ sau: hút khoảng mơi trường VS2, sau hút khoảng đệm khí, hút tiếp đoạn mơi trường VS2 dùng mouth pipette chuyển trứng vào (5-7 trứng/cọng rạ), hút thêm khoảng đệm khí, cuối hút thêm đoạn môi trường VS2 hàn đầu cọng rạ máy ép nhựa Đưa thẳng cọng rạ vào bình nitơ lỏng (thao tác nhanh) Trên cọng rạ ghi số lượng trứng, ngày đông lạnh ™ Giải đông trứng Trứng mua: Trứng mua dạng đông lạnh cọng rạ hở (0,25ml) phải giải đông trước sử dụng Lấy cọng rạ chứa trứng nhiệt độ -196oC để khơng khí giây, nhúng vào nước ấm 35 – 37oC 30 giây Sau đó, trứng chuyển sang đĩa petri trống, thu nhận trứng kính hiển vi soi chuyển vào đĩa nuôi chứa môi trường OCM làm ấm, để – tủ nuôi 38,5oC 5% CO2 nhằm theo dõi đánh giá sống, chết trứng Trứng đơng lạnh phịng thí nghiệm: Trứng rã đông theo 03 bước Lấy cọng rạ chứa trứng khỏi bình nitơ lỏng, để khơng khí giây, nhúng vào nước ấm 33 – 35oC, dùng bơng gịn tẩm cồn lau cọng rạ, dùng kéo cắt đầu, sau cắt đầu cịn lại, chuyển trứng vào đĩa nhựa Φ35 trống Dùng mouth pipette pipette Pasteur hút trứng từ đĩa Φ35 chuyển qua môi trường giải đông số (RĐ1) khoảng 1,5 phút, chuyển trứng sang môi trường RĐ2 (1,5 phút), chuyển trứng qua môi trường RĐ3 (5 phút) nhiệt độ phịng Sau chuyển trứng vào đĩa chứa mơi trường nuôi trứng, để tủ nuôi (38,5oC, 5% CO2) khoảng 2-3 tiếng để giúp trứng hồi phục hoàn toàn trước đánh giá sống chết trứng Lưu ý: lần chuyển trứng sang giọt môi trường tương ứng, cần quan sát hình thái trứng kính hiển vi soi (hoặc kính hiển vi đảo ngược) thao tác nhanh, tránh làm tổn thương trứng Tất trứng (mua tự đông lạnh) đánh giá cịn sống sau rã đơng, khơng bị tổn thương mặt hình thái đem làm thụ tinh ống nghiệm CHUẨN BỊ TINH TRÙNG - Hóa chất Mơi trường BO dùng để hoạt hóa tinh trùng đông lạnh tạo vi giọt thụ tinh Dầu khoáng (Merck) - Dụng cụ Kép, kẹp, buồng đếm hồng cầu, lamelle, ống Falcon 15ml, đĩa 35mm, loại pipetteman, đầu típ 1ml, 0,2ml - Thiết bị Water bath, tủ ấm CO2 - Tiến hành Nguồn tinh trùng: tinh trùng nhập ngoại giống tốt, mua Trung tâm Chuyển giao Khoa học Kĩ thuật, Viện Chăn nuôi Giải đông tinh trùng - Lấy cọng rạ chứa tinh từ bình nitơ lỏng, để khí giây cho vào bể ổn nhiệt nhiệt độ 35-37o C 30 - 40 giây Thu nhận hoạt hóa tinh trùng Tinh trùng sau giải đơng pha lỗng hoạt hóa mơi trường BO bổ sung sodium caffeine benzoate 0,3885mg/ml heparin 4µl/ml, sau li lần thứ nhất1800 vòng/phút phút, hút bỏ phần trên, để lại phần đáy khoảng 0,5ml huyền phù dịch Tiếp theo tiến hành ly tâm lần với tốc độ thời gian lần 1, phần lắng đáy ống falcon pha lỗng mơi trường BO cho đạt mật độ 5-6x106 tinh trùng/ml Dịch huyền phù dùng để tạo vi giọt thụ tinh đĩa giếng (100µl/giọt), phủ dầu khống, giữ tủ ấm 38,50C, 5% CO2 Như vậy, vi giọt chứa khoảng 5-6.105 tinh trùng Lượng tinh trùng sử dụng cho thụ tinh 15-20 trứng vi giọt Nghĩa cần khoảng 25 đến 30 ngàn tinh trùng để thụ tinh cho trứng THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Chuẩn bị - Đĩa chứa vi giọt (100 µl/giọt) tinh trùng chuẩn bị sẵn (đĩa 35mm) - Đĩa chứa vi giọt (100 µl/giọt) mơi trường CR1aa (chuẩn bị trước trước sử dụng) - Trứng IVM - Tủ ấm CO2 Tiến hành - Chuyển 15 – 20 trứng IVM vào vi giọt thụ tinh (có sẵn tinh trùng) đĩa 35mm có phủ dầu khống Lưu ý, chuyển trứng, hút lượng mơi trường ni trứng kèm theo tốt Đặt đĩa vào tủ ni 38,5oC; 5% CO2 5-6 giờ, sau quan sát đánh giá kết thụ tinh NUÔI PHƠI VÀ ĐÁNH GIÁ PHƠI Chuẩn bị Mơi trường ni cấy phơi (mơi trường CR1aa) trước lấy phôi/trứng thụ tinh Môi trường ủ tủ ấm 38,50C, 5% CO2, bão hòa nước Mouth pipette: đường kính pipette 100µm Tiến hành Sau thụ tinh 5-6 thụ tinh, tế bào trứng loại bỏ cumulus mouth pipette có gắn pipette pasteur Các hợp tử giả định chuyển vào vi giọt môi trường CR1aa, đĩa nuôi phủ dầu khống ni 38,5oC; 5% CO2 Sự phân chia hợp tử đánh giá dựa vào phân chia tế bào 46 – 48 sau thụ tinh Sau ngày nuôi cấy, tiến hành đánh giá tốc độ phân chia: Tốc độ phân chia xác định dựa số phôi phân chia số phôi/trứng giọt nuôi cấy ban đầu Sau ngày nuôi cấy bổ sung huyết vào giọt nuôi cấy: Thêm 5µl FBS lọc vơ trùng làm ấm vào giọt nuôi cấy Sau - ngày nuôi cấy đánh giá phát triển phôi: Đánh giá phát triển phôi đến giai đoạn blastocyst ĐÔNG LẠNH PHÔI Chuẩn bị dung dịch Dung dịch 1: Môi trường PBS + 15% FCS Dung dịch 2: Môi trường PBS + 10% Glycerol Tiến hành Hút phôi vào cọng rạ Phôi sau đánh giá phân loại đạt tiêu chuẩn rửa dung dịch lần, chuyển phơi sang dung dịch phút cuối nạp phôi vào cọng rạ (1 phôi/cọng rạ), hàn cọng rạ máy ép, để cân cọng rạ 15 phút Để tránh nhầm lẫn việc chọn phôi, cọng rạ phải ghi số thông tin như: giống, chất lượng phôi, giai đoạn phát triển phôi Quy trình đơng lạnh phơi Đặt sẵn chương trình máy đông lạnh sau: - Đưa phôi vào máy, hạ nhiệt độ xuống – 7oC, giữ phôi -10 phút Tốc độ hạ nhiệt 1oC/phút - Tạo đá: lấy pank bơng nhúng vào nitơ lỏng, sau đó, kẹp vào phía đầu cọng rạ (đầu có nút bấc), sau để vào máy phút, mơi trường thành đá trình tạo đá hoàn thành - Hạ nhiệt độ từ -7oC xuống -33oC 35oC với tốc độ 0,2 - 0,4oC/phút Giữ phôi nhiệt độ -10 phút Sau đó, đưa cọng rạ có chứa phơi thẳng vào nitơ lỏng -196oC bảo quản với thời gian mong muốn Phụ lục SỐ LIỆU THƠ CỦA CÁC THÍ NGHIỆM Kết phần nội dung 1.1 Kết thu nhận, ni trứng từ nguồn trứng thu nhận lị mổ Số đợt TN 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 số buồng Tổng trứng loai A trứng thu 73 37 59 21 114 50 32 14 91 61 183 85 76 34 18 312 164 14 204 123 13 212 143 53 25 121 56 77 33 143 57 186 85 11 192 97 64 23 101 43 132 43 89 45 134 55 72 33 12 208 103 96 51 loai B 29 33 43 12 12 31 26 95 62 44 17 25 17 34 54 49 18 23 53 24 37 25 54 23 Tổng trứng đem nuôi 66 54 92 26 73 116 60 259 185 187 42 81 50 91 139 146 41 66 96 69 92 58 157 74 Số trứng chín 41 29 70 18 57 87 47 197 127 141 29 53 33 67 101 112 29 49 71 51 61 43 97 33 1.2 Kết thụ tinh ống nghiệm từ nguồn trứng thu nhận lị mổ lơ TN 10 11 12 13 Số trứng Số trứng đem thụ thụ tinh (phôi tinh 2) 57 22 87 35 47 28 197 94 127 51 141 63 29 11 53 22 33 17 67 37 101 48 112 53 29 14 phôi 4-8 phôi dâu phôi nang 17 27 13 82 39 42 11 33 36 39 11 17 10 49 25 23 21 25 27 10 15 43 21 18 17 22 23 14 15 16 17 18 19 20 TC: 49 71 51 61 43 97 33 1485 29 31 28 33 23 47 18 704 21 23 18 19 17 34 14 513 16 14 15 14 26 338 13 11 12 11 18 272 1.3.Kết xác định giới tính phơi dâu từ nguồn trứng thu nhận từ lị mổ Số phơi ngun Số đợt thí Số phơi đem TN vẹn nghiệm 3 4 9 8 TC: 65 27 Phôi Phôi đực Phôi không xác định 0 1 0 2 1 1 12 1 1 2 13 1.4.Kết xác định giới tính phơi nang từ nguồn trứng thu nhận từ lò mổ Số đợt thí Số phơi ngun Số phơi đem TN nghiệm vẹn 15 14 14 14 16 14 15 8 14 16 10 15 TC: 147 68 Phôi đực Phôi 5 4 37 2 4 2 25 Phôi không xác định 0 1 0 Kết nội dung 2.1 Kết nuôi trứng từ nguồn trứng siêu âm Lần thí nghiệm TC: Số trứng chưa trưởng thành 416 177 588 1181 Số trứng trưởng thành 312 150 521 983 2.2.Kết thụ tinh ống nghiệm từ nguồn trứng siêu âm Số đợt Số trứng đem thụ Số trứng thu tinh Phôi 4-8 TN tinh 312 208 135 150 99 69 521 369 284 TC: 983 676 488 Phôi dâu Phôi nang 124 59 232 415 72 44 154 270 2.3.Kết sinh xác định giới tính phơi dâu từ nguồn trứng siêu âm Số đợt thí nghiệm Số phơi dâu 35 Số phôi nguyên vẹn 13 Phôi đực Phôi phôi không xác định 39 37 111 TC: 16 17 46 10 25 20 1 2.4 Kết sinh xác định giới tính phơi nang từ nguồn trứng siêu âm Số đợt thí nghiệm TC: Số phôi nang Số phôi nguyên vẹn Phôi đực 47 48 45 140 22 24 21 67 Phôi không xác định Phôi 15 11 13 39 13 26 Kết nội dung 3.1 Kết nuôi trứng trưởng thành Số đợt TN 10 11 12 13 14 15 TC: Số buồng trứng 12 14 11 10 11 12 12 10 12 11 12 10 10 10 166 Trứng A Trứng B 185 197 156 124 76 98 107 132 155 149 134 141 78 92 107 1931 72 35 68 87 103 148 127 59 79 98 121 56 103 102 87 1345 Tổng trứng đem nuôi 257 232 224 211 179 246 234 191 234 247 255 197 181 194 194 3276 Số trứng chín 197 185 168 169 141 201 194 161 189 207 212 163 148 164 159 2658 3.2.Kết đông lạnh trứng Số đợt TN Số cong 10 11 12 13 14 15 30 30 24 22 20 30 28 21 24 30 22 22 21 28 23 375 TC: Số trứng đông Số trứng thu hồi lạnh 150 118 152 121 142 114 137 109 127 108 183 152 163 125 127 102 144 123 176 153 134 109 115 95 122 104 147 126 136 117 2155 1776 Số trứng sống 76 87 73 81 74 116 88 89 93 121 84 83 81 107 96 1349 3.3.Kết thụ tinh ống nghiệm từ nguồn trứng đông lạnh Số đợt TN Sô trứng sống Số trứng đem thụ tinh Số trứng thụ Phôi 4-8 tinh Morula Blastocyst 10 11 12 13 14 15 TC: 76 87 73 81 74 116 88 89 93 121 84 83 81 107 96 1349 56 74 63 75 66 108 76 81 88 112 73 68 72 95 87 1194 17 12 14 12 13 13 144 16 13 9 11 12 123 7 67 3.4.Kết thụ tinh ống nghiệm từ nguồn trứng mua Số Số trứng trứng Số Số trứng thụ Phôi Số trứng thu trứng Morula blastocyst Số cọng rạ dem thụ tinh tinh 4-8 cọng rạ hồi sống (phôi sau rã 2) đông 0 10 62 59 17 17 0 0 10 65 61 12 12 0 0 10 63 57 14 14 0 0 10 58 55 15 15 0 0 10 66 61 16 16 0 0 10 55 21 21 21 1 0 10 57 52 13 13 1 0 10 61 47 23 23 1 0 10 54 46 21 21 0 0 10 48 42 19 19 0 0 TC: 589 501 171 171 3 2 3 46