THÔNG TIN TÀI LIỆU
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - a lu HOÀNG THỊ THÚY QUỲNH n va n Tên đề tài: tn to TÁCH DỊNG VÀ GIẢI TÌNH TỰ GENE MÃ HÓA ENZYME p ie gh FERULOYL-COA SYNTHASE TỪ CHỦNG Amycolatopsis sp HR104 d oa nl w KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC a lu a nv Hệ đào tạo : Chính quy u nf Chuyên ngành : Công nghệ sinh học ll : CNSH-CNTP n oi : 2011-2015 tz Khóa học m Khoa z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên, 2015 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - a lu HOÀNG THỊ THÚY QUỲNH n va n Tên đề tài: tn to TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TÌNH TỰ GENE MÃ HĨA ENZYME p ie gh FERULOYL-COA SYNTHASE TỪ CHỦNG Amycolatopsis sp HR104 d oa nl w KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC a lu : Công nghệ sinh học u nf Chuyên ngành : CNSH-CNTP ll Khoa : Chính quy a nv Hệ đào tạo : 2011-2015 n oi TS DƢƠNG VĂN CƢỜNG tz Giảng viên hƣớng dẫn m Khóa học PGS.TS NGƠ XN BÌNH z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên, 2015 n va ac th si i LỜI CÁM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành đề tài với nỗ lực thân, nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cơ, bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành khóa luận : Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo PGS.TS Ngơ Xn Bình T.s Dương Văn Cường, người tận tình giúp đỡ hướng dẫn bảo, giải đáp thắc mắc củng cố kiến thức cho Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Chị Ma Thị Trang, cán phịng thí a lu nghiệm công nghệ gene - Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên trực tiếp n bảo kĩ làm việc, tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu va n Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Công Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè bên cạnh p ie gh tn to nghệ thực phẩm đào tạo dạy dỗ suốt thời gian qua động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn q trình học tập nghiên cứu oa nl w tháng 06 năm 2015 Thái Nguyên, ngày d Sinh viên a nv a lu ll u nf m Hoàng Thị Thúy Quỳnh tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th si ii BẢNG DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Đặc điểm cấu trúc thành phần vanillin Bảng 2.2: Hàm lượng vanillin mặt hàng thực phẩm Bảng 2.3: Các chủng vi sinh vật có khả sản xuất vanillin từ acid ferulic 19 Bảng 3.1: Các thành phần vector pTZ57R/T 29 Bảng 3.2 : Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 30 Bảng 3.3:Bảng danh mục thiết bị thí nghiệm .31 Bảng 3.4: Bảng thành phần phản ứng PCR: .33 a lu Bảng 3.5: Bảng thành phần phản ứng gắn nối 34 n Bảng 3.6: Bảng thành phần phản ứng cắt enzyme .38 n va p ie gh tn to d oa nl w a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Con đường loại bỏ nhóm acetyl khơng có q trình β-oxidative ( phụ thuộc CoA) 10 Hình 2.2: Con đường loại bỏ nhóm acetyl trình β-oxidative (phụ thuộc CoA)11 Hình 2.3: Con đường loại bỏ nhóm cacboxyl 12 Hình 2.4: Con đường loại bỏ nhóm acetyl nhóm cacboxyl từ CoA 13 Hình 2.5: Con đường Con đường loại bỏ chuỗi bên 14 Hình 2.6 : Quá trình tổng hợp vanillin từ guaiacol 17 a lu Hình 2.7: Vi sinh vật tổng hợp vanillin từ acid ferulic 21 n Hình 2.8: Con đường phân hủy vanillin chủng vi sinh vật 21 n va Hình 2.9: Sơ đồ đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA 23 tn to Hình 3.2: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene fcs 33 p ie gh Hình 4.2: Kết gắn sản phẩm PCR vào vector đích pTZ57R/T 42 Hình 4.3: Kết sàng lọc dòng mang vector pTZ-fcs 43 oa nl w Hình 4.4: Kết cắt kiểm tra đồng thời hai enzyme EcoRI BamHI 44 Hình 4.5: Kết PCR khuếch đại gene fcs từ plasmid 45 d Hình 4.6: Kết giải trình tự hai đầu sản phẩm DNA plasmid pTZ-fcs 47 a lu Hình 4.7 : Kết so sánh tương đồng giải trình tự kết hợp mồi xi a nv mồi ngược 48 u nf Hình 4.8: Kết phân tích so sánh trình tự gene từ hai chiều 50 ll m Hình 4.9: Kết trình tự đoạn gene fcs sau giải trình tự 51 n oi Hình 4.10 Kết phân tích sai khác nucleotide 53 tz z m co l gm @ an Lu n va ac th si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 iv DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT Amp : Ampicillin BLAST : Basic Local Alignment Search Tool ( Cơng cụ tìm kiếm so sánh chuỗi cấu trúc sở) n n va CoA : Coenzyme Acetoacetyl DNA : Deoxyribonucleic Acid DMSO : Dimethylsulfoxide dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate E coli : Escherichia coli EDTA : Etilendiamin tetraaxetic acid Et al : Cộng fcs : Feruloyl-coA synthetase :Enoyl-CoA hydratase p ie gh tn to : Base pair – Cặp bazơ nitơ a lu Bp ech oa nl w : Isopropyl Thiogalactoside Kb : Kilo base – Kilo bazơ nitơ : Laria Broth a nv NCBI a lu LB d IPTG : National Cetrer for Biotechnology Information ( Trung tâm u nf quốc gia thông tin công nghệ sinh học) ll : Polymerase Chain Recation (Phản ứng chuỗi trùng hợp) SDS : Natri lauryl sulfat TA : TA-Cloning TAE : Tris-acetate-EDTA UV : Ultraviolet X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside m PCR tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 v MỤC LỤC PHẦN :MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN :TỔNG QUAN TÀI LIỆU a lu 2.1 Giới thiệu vanillin n n va 2.1.1 Lịch sử nguồn gốc vanillin tn to 2.1.2 Đặc điểm hình thái Vanillin planifolia 2.1.3 Cấu trúc đặc điểm lý hóa vanillin p ie gh 2.1.4 Hoạt tính sinh học vanillin 2.1.5 Vai trị vanillin cơng nghiệp đời sống oa nl w 2.2 Các đường sinh tổng hợp vanillin 2.2.1 Con đường sinh tổng hợp vanillin thực vật d 2.2.2 Con đường sinh tổng hợp vanillin từ vi sinh vật a lu a nv 2.3 Các phương pháp sản xuất vanillin 15 u nf 2.3.1 Sản xuất vanillin từ thực vật 15 ll 2.3.2 Sản xuất vanillin tổng hợp hóa học 16 m n oi 2.3.3 Sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ sinh học 17 tz 2.4 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp sản xuất vanillin 20 2.4.1 Các gene mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic 20 z 2.5 Tình hình nghiên cứu nước nước 24 @ gm 2.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 24 l 2.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 26 m co PHẦN :VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 Lu 3.1 Vật liệu nghiên cứu 28 an 3.1.1 Vật liệu 28 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 vi 3.1.2 Enzyme, hóa chất 30 3.1.3 Dụng cụ 31 3.1.4 Thiết bị 31 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 32 3.3 Nội dung nghiên cứu 32 3.4 Phương pháp nghiên cứu 32 3.4.1 Khuếch đại đoạn DNA phương pháp PCR 33 3.4.2 Điện di DNA gel agarose 33 3.4.3 Gắn DNA vào vector pTZ57R/T enzyme T4 Ligase 34 a lu 3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả biến 34 n 3.4.5 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến 35 n va 3.4.6 Tách chiết DNA plasmid phương pháp sử dụng SDS - kiềm 36 tn to 3.4.7 Phương pháp lập đồ giới hạn 37 p ie gh 3.4.8 Xác định trình tự nucleotit phương pháp sanger 38 3.4.9 So sánh trình tự DNA ngân hàng gene NCBI 39 oa nl w PHẦN : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 4.1 Kết nhân gene fcs phương pháp PCR 40 d 4.2 Kết gắn sản phẩm PCR vào vector đích pTZ57R/T 42 a nv a lu 4.3 Sàng lọc dòng mang vector pTZ-fcs điện di so sánh kích thước gel agarose 43 ll u nf 4.4 Kết chọn lọc dòng mang vector pTZ-fcs lập đồ giới hạn 44 m 4.5 Kết chọn lọc dòng phương pháp PCR 45 n oi 4.6 Kết phân tích giải trình tự gene fcs 46 tz PHẦN :KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 5.1 Kết luận 55 z gm @ 5.2 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 m co l an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vanillin (3-methoxy-4 hydroxybenzaldehyde) chất thơm quan trọng sử dụng phổ biến giới công nghiệp thực phẩm, đồ uống, nước hoa, dược phẩm, dinh dưỡng (Hua, Ma et al 2007) [27] Sản lượng vanillin tiêu thụ giới hàng năm ước tính khoảng 12000 (Krings 1998, Lomascolo 1999) [33,38] Vanillin tự nhiên sản xuất chủ yếu phương pháp tách chiết từ nguồn vỏ loài lan Vanilla phanifolia Lượng vanillin tạo a lu phương pháp đáp ứng khoảng 1% nhu cầu từ thị trường (Prince, n n va 1994) [44], lượng vanillin lại chủ yếu tổng hợp nhân tạo theo tn to phương pháp hóa học (Li and Rosazza, 2000) [36] Tuy nhiên, theo quy định Mỹ châu Âu vanillin tổng hợp hóa học khơng coi tương đương với p ie gh vanillin tự nhiên (Muheim A, 1999) [41] Trên thực tế, giá thành kg vanillin tự nhiên dao động khoảng 1,200 tới 4,000 USD, giá kg oa nl w vanillin nhân tạo vào khoảng 15 USD (Yoon, Li et al 2005) [55] Ngồi q trình tổng hợp vanillin theo phương pháp tổng hợp hóa học tác động gây ảnh hưởng d a lu xấu tới môi trường a nv Có số nghiên cứu vanillin tổng hợp từ vi sinh vật u nf khác thơng qua chuyển hóa sinh học từ nguồn chất khác acid ll ferulic, eugenol, isogenol, lignin Trong số acid ferulic đối m n oi tượng nghiên cứu đường sinh tổng hợp để tạo vanillin sử tz dụng vanillin tự nhiên Ở vi sinh vật acid ferulic biến đổi thành feruloyl-CoA xúc tác enzyme feruloyl-coA synthetase mã hóa gene z gm @ fcs sau feruloyl-CoA tiếp tục chuyển hóa thành vanillin tác động enzyme enoyl-CoA hydratase/aldolase hóa gene ech (Yoon, Li et al 2005) l co [55] Những chủng vi sinh vật xác định có mang gene fcs ech mã hóa cho m q trình chuyển hóa acid ferulic để tạo vanillin như: Amycolatopsis sp HR104 Lu an (Yoon, Li et al 2005) [55] Amycolatopsis sp HR167 (Achterholt, Priefert et al n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 2000) [5], Pseudomonas putida (Plaggenborg, Overhage et al 2003) [42], Bacillus subtili (Plaggenborg, Overhage et al 2003) [42], Pseudomonas fluorescens (Di Gioia, Luziatelli et al 2010) [15] Mặc dù vanillin tổng hợp từ sinh vật lượng vanillin tạo cho suất thấp sản phẩm nhanh chóng bị chuyển đổi thành sản phẩm phụ khác bị vi sinh vật sử dụng nguồn cacbon cung cấp lượng cho sinh vật phát triển (Yoon, Li et al 2005) [55 ] Ngồi q trình lên men số xạ khuẩn gặp khó khăn dịch ni cấy có độ nhớt cao sinh trưởng hệ sợi xạ khuẩn bào tử (Bushell ME, 1999) [10] a lu Trong năm gần với kết hợp thành tựu công n n va nghệ DNA tái tổ hợp thành tựu kỹ thuật di truyền, nhà khoa học tn to giới nghiên cứu đưa phương pháp sản xuất sản xuất vanillin công nghệ DNA tái tổ hợp Chủng tái tổ hợp tạo thành mang gene tách p ie gh dòng từ sinh vật có khả sinh tổng hợp sản xuất vanillin Với đặc tính khả sinh trưởng phát triển tốt, có khả tiếp nhận gene ngoại oa nl w lai vào hệ gene nội hệ gene khơng có đường phân hủy vanillin đặc điểm di truyền với quy trình lên men nghiên cứu kĩ (Priefert, d a lu Rabenhorst et al 2001) [43] E coli coi số đối tượng thích hợp để a nv nghiên cứu ứng dụng tạo chủng tái tổ hợp cho sản xuất vanillin Việc sử dụng u nf phương pháp DNA tái tổ hợp sản xuất vanillin khắc phục khó ll khăn cịn tồn việc sản xuất vanillin m n oi Ở Việt Nam sản xuất vanillin dừng lại phương pháp tổng hợp hóa tz học việc sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp hướng Xuất phát từ thực tiễn tiến hành thực đề tài: "Tách dịng z gm @ giải trình tự gene mã hóa enzyme feruloyl-coa synthase từ chủng Amycolatopsis sp HR104" Nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho nghiên cứu tạo chủng vi l m tổ hợp co sinh vật tái tổ hợp có khả sản xuất vanillin, trước mắt tạo chủng E coli tái an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 55 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã tách dịng thành cơng gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp HR104 Gene fcs tách dòng có tương đồng 99% với gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp HR167 công bố ngân hàng gene 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục gắn gene fcs vào vector pET22-GE tạo tổ hợp pET22-GEF hoàn chỉnh a lu - Biến nạp vector tái tổ hợp pET22-GEF vào chủng vi khuẩn có hệ thống n n va enzyme T7 RNA polymerase, cho phép T7 promorter hoạt động hiệu mạnh p ie gh tn to chủng vi khuẩn E.coli BL21 để kiểm chứng hoạt động gene tách dòng d oa nl w a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Bích Thủy, Đào Văn Trường ( 1991),"Tổng hợp vanillin từ eugenol ", Tạp chí hóa học 29(4): 21-27 Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Bích Thủy, Đào Văn Trường (1992)," Nghiên cứu oxy hóa ligin thành Vanillin", Tạp chí hóa học Đinh Thị Ngọ (1996),"Tổng hợp vanillin từ tinh dầu quế", Tạp chí hóa học cơng nghệ a lu II Tiếng anh n Abraham DJ, M A., Wireko FC, Whitney J, Thomas RP, Orringer EP (1991), va n "Vanillin, a potential agent for the treatment of sickle cell anemia", Blood 77: tn to 1334 - 1341 p ie gh Achterholt, S., H Priefert and A Steinbuchel (2000), "Identification of Amycolatopsis sp strain HR167 genes, involved in the bioconversion of oa nl w ferulic acid to vanillin", Appl Microbiol Biotechnol 54(6): 799-807 Akagi K, H M., Hoshiya T, Mizoguchi Y, Ito N, Shirai T (1995), " Modulating d effects of elagic acid, vanillin and quercetin in a rat medium term a lu a nv multi-organ carcinogenesis model", Cancer Lett 94: 113 -121 u nf Barghini, P., D Di Gioia, F Fava and M Ruzzi (2007), "Vanillin production ll using metabolically engineered Escherichia coli under non-growing m n oi conditions", Microb Cell Fact 6: 13 tz Belanger, D H F A F C (2007), "Application of metabolic engineering to vanillin biosynthetic patthways in vanilla planifolia." The Biotechnology z @ Center for Agriculture and the Environment NJ, 08903, USA: 175-196 l gm Boonchird , F T (1982), "In vitro antifungal activity of eugenol and vanillin against Candida albicans and Cryptococcus neoformans", Can J Microbiol m co 28: 1235 -1241 an Lu 10 Bushell ME, B A (1999), "Sporulation at minimum specific growth rate in n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 57 Aspergillus nidulans chemostat culture predicted using protein synthesis efficiency estimations",J Basic Microbio 39(5–6): 293–298 11 Chakrabarti, R.,& Schutt, C E (2001), "The enhancement of PCR amplification by low molecular-weight sulfones." Gene 274: 293–298 12 Chakrabarti, R and C E Schutt (2002), "Novel sulfoxides facilitate GC-rich template amplification", Biotechniques 32(4): 866, 868, 870-862, 874 13 Chen, S Gao, T Pang, X.Luo, K.Li, Y.Li, X.Jia, X.Lin, Y Leon, C, (2010), " Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species" PLoS One a lu 14 Daphna Havkin-Frenkel, F C B ( 2010), "Handbook of Vanilla Science and n n va Technology", (Biotechnology Center for Agriculture and the Environment University of New Jersey New Brunswic New Jersey, USA) p ie gh tn to School of Environmental and Biological Sciences Rutgers, The State 15 Di Gioia, D., F Luziatelli, A Negroni, A G Ficca, F Fava and M Ruzzi (2010), "Metabolic engineering of Pseudomonas fluorescens for the oa nl w production of vanillin from ferulic acid", J Biotechnol 156(4):309-316 16 Durant S, K P and 5512 (2003), "Vanillins a novel family of DNA-PK d a lu inhibitors", Nucleic Acids Res, 31-5501 a nv 17 Esposito, L J K F G K F M V M G R F T (1997), "Vanillin", u nf Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4th edition 24 New ll York: John Wiley & Sons pp: 812–825 m n oi 18 Farell, E M., & Alexandre, G (2012), "Bovine serum albumin further enhances tz the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates," BMC Research Notes 5: 257 z of vanillin in preventing yeast spoilage of ready-to-drink beverages", J co l Food Prot 67: 391 -395 gm @ 19 Fitzgerald DJ, S M., Gasson MJ, Narbad A (2004), "The potential application m 20 Fitzgerald, D J., M Stratford, M J Gasson and A Narbad (2005), Lu an "Structure-function analysis of the vanillin molecule and its antifungal n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 58 properties", J Agric Food Chem 53(5): 1769-1775 21 Funk, C., Brodelius, P.E (1990), "Phenylpropanoid metabolism in suspension cultures of Vanilla planifolia And III Conversion of 4-methoxycinnamic acids into 4-hydroxybenzoic acids", Plant Physiol 22 Gupta, J K., Hamp, S.G., Buswell, J.A and Eriksson, K.E (1981),"Metabolism of trans-ferulic acid by the white-rot fungus Sporotrichum pulverulentum", Archives of Microbiology 128: 349–354 23 Gustafson DL, F H., Ueno AM, Smith CJ, Doolittle DJ, Waldren CA ( 2000), "Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) inhibits mutation induced by a lu hydrogen peroxide,N-methyl-N-nitrosoguanidine and mitomycin C but not n n va 137C-radiation at the CD59 locus in human hamster hybrid AL cells", tn to Mutagenesis 15: 207 - 213 p ie gh 24 Hansen, E H., Moller, B L., & Kock, G R (2009), Applied and Environmental Microbiology, 75, 2765-2774 25 Hocking, M B (1997), "Vanillin Synthetic Flavoring from Spent Sulfite oa nl w Liquor." Journal of Chemical Education 74(9): 1055–1059 26 Hopp, R., & Rabenhorst, J (2000), "Process for the preparation of vanillin and d microorgainisms suitable therefor", Google pantents a lu 27 Hua, D., C Ma, L Song, S Lin, Z Zhang, Z Deng and P Xu (2007), a nv "Enhanced vanillin production from ferulic acid using adsorbent resin", Appl u nf Microbiol Biotechnol 74(4): 783-790 ll m 28 Lesage-Meessen, L., Lomascolo, A., Bonnin, E., Thibault, J F., Buleon, A., n oi Roller,M,Asther, M., Record, E., & Ceccaldi, B C.(2002), Applied tz Biochemistry and Biotechnolog 102–103(1–6): 141–153 H, S Y., Matsumoto K, Watanabe M, Ohta T, Shirasu Y, Tutikawa K z 29 Imanishi @ mice by vanillin", Mutat Res 243: 151 -158 l spot formations in gm (1990), "Suppression of 6-TG-resistant mutations in V79 cells and recessive m co 30 Juliane Strien, J S., Gita Mall (2013), "Enhancement of PCR Amplification of Lu Moderate GC-Containing and Highly GC-Rich DNA", Sequences Mol Biotechno an 31 Knorr, D., Caster, C., Doă rneburg, H., Dorn, R., Graă f, S., Havin- and D n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 59 Frenkel, Podstolski, A., Werrman, U (1993) "Biosynthesis and yield improvement of food ingredients from plant cell and tissue cultures", Food Technol: 47, 57–63 32 Kramer, M F., & Coen, D M.(2001), "Enzymatic amplification of DNA by PCR: Standard procedures and optimization", Current Protocols in Immunology 24 33 Krings, U a R G B (1998), "Biotechnological production of flavours and fragrances", Appl Microbiol Biotechnol 49: 1-8 34 Kumar SS, P K., Sainis KB (2002), "Free radical scavenging activity of vanillin and o-vanillin using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical", Redox a lu Rep : 35 -40 n n va 35 Lee, E G., S H Yoon, A Das, S H Lee, C Li, J Y Kim, M S Choi, D K Oh increased acetyl-CoA consumption in recombinant Escherichia coli", Biotechnol p ie gh tn to and S W Kim (2009), "Directing vanillin production from ferulic acid by Bioeng 102(1): 2000-2008 36 Li, T and J P Rosazza (2000), "Biocatalytic synthesis of vanillin", Appl oa nl w Environ Microbiol 66(2): 684-687 37 Lo´ pez-Malo A, A S., Angriz A (1998), "Vanillin and pH synergistic effects on d a lu mould growth." Food Sci 63: 143 -146 a nv 38 Lomascolo,A.,C.Stentelaire,M.Asther,andL.Lesage-Meessen(1999)."Basidiomy u nf cetes as new biotechnological tools to generate natural aromatic flavours for ll the food industry", Trends Biotechnol 17: 282-289 m tz Mutat Res 307: 395 - 410 n oi 39 LR, F (1994.), " Antimutagens as cancer chemopreventive agents in the diet", 40 Mokshagundam LRV, M S.( 2003),"Triglyceride reducing agent", US Patent 6: z gm @ 599,522 41 Muheim A, L K C (1999),"Towards a high-yield bioconversion of ferulic acid l co to vanillin", Appl Microbiol Biotechnol 51(4): 456–461 m 42 Plaggenborg, R., J Overhage, A.Steinbuchel and H Priefert (2003), "Functional Lu an analyses of genes involved in the metabolism of ferulic acid in Pseudomonas n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 60 putida KT2440", Appl Microbiol Biotechnol 61(5-6): 528-535 43 Priefert, H., J Rabenhorst and A Steinbuchel (2001), "Biotechnological production of vanillin", Appl Microbiol Biotechnol 56(3-4): 296-314 44 Prince, R C a D E G (1994), "Just plain vanilla?" , Trends Biochem Sci 19: 521 45 Ravishankar, S R R a G (2000), "Vanilla flavour production by conventional and biotechnological routes", Journal of the Science of Food and Agriculture: 289-304 46 Sambrook J,Fritsch E F, Maniatis.T, (1989),"Molecular Cloning", Alaboratory manual second edition a lu 47 Sang-Hwal Yoon, C L., Young-Mi Lee, Sook-Hee Lee, Sung-Hee Kim, n n va Myung-Suk Choi, Weon-Taek Seo, Jae-Kyung Yang, Jae-Yeon Kim, recombinant strains of Escherichia coli", Biotechnology and Bioprocess p ie gh tn to Seon-Won Kim (2005), "Production of vanillin from ferulic acid using Engineering 10(4): 378-384 48 Sarangi, P K., & Sahoo, H P (, 2010) Journal of American Science 6(5): 1–5 oa nl w 49 Sinha, A K., U K Sharma and N Sharma (2008), "A comprehensive review on vanilla flavor: extraction, isolation and quantification of vanillin and others d a lu constituents", Int J Food Sci Nutr 59(4): 299-326 a nv 50 Susan Frackman Chakrabarti, R., & Schutt, C E (2001), "The enhancement of u nf PCR amplification by low molecular-weight sulfones", Gene 274: 293–298 ll 51 Vaghasiya YK, N R., Soni M, Baluja S, Chanda S (2004) "Synthesis, m 4-aminoantipyrine", J Serb Chem Soc 69: 991 -998 tz from vanillin and n oi structural determination and antibacterial activity of compounds derived 52 Yamada, M., Y Okada, T Yoshida and T Nagasawa, (2007), "Applied z gm @ Microbiology and Biotechnolog", 73: 1025–1030 53 Yamada, M., Okada, Y., Yoshida, T., & Nagasawa, T (2008), "Vanillin l co production using Escherichia coli cells over-expressing isoeugenol m monooxygenase of Pseudomonas putida", Biotechnol Lett 30(4): 665-670 Lu an 54 Yoon, S H., E G Lee, A Das, S H Lee, C Li, H K Ryu, M S Choi, W T n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 61 Seo and S W Kim (2007),"Enhanced vanillin production from recombinant E coli using NTG mutagenesis and adsorbent resin", Biotechnol Prog 23(5): 1143-1148 55 Yoon, S H., C Li, J E Kim, S H Lee, J Y Yoon, M S Choi, W T Seo, J K Yang, J Y Kim and S W Kim (2005),"Production of vanillin by metabolically engineered Escherichia coli," Biotechnol Lett 27(22): 1829-1832 56 Zheng, L Z., P.; Sun, Z.; Bai, Y.; Wang, J.; Guo, X (2007), "Production of vanillin from waste residue of rice bran oil by Aspergillus niger and a lu Pycnoporus cinnabarinus", Bioresour Technol 98: 1115-1119 n n va 57 Zhang, Y., Xu, P., Han, S., Yan, H., & Ma, C (2006) Applied Microbiology and Biotechnology, 73(4), 771-779 p ie gh tn to d oa nl w a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 PHỤ LỤC a lu n n va p ie gh tn to d oa nl w a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 a lu n n va p ie gh tn to d oa nl w a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 a lu n n va p ie gh tn to d oa nl w Hình 1: Ảnh sắc ký đồ thể kết giải trình tự gene fcs a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 a lu n n va p ie gh tn to d oa nl w a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu Hình 2: Kết dịch mã đoạn gene fcs sử dụng phần mềm vector NTI n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 a lu n n va p ie gh tn to d oa nl w a nv a lu Hình 3: Kết so sánh trình tự gene fcs so sánh với ngân hàng genbank NCBI ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 Query trình tự gene fcs chủng Amycolatopsis sp HR104 Sbjct trình tự gene fcs chủng Amycolatopsis sp HR167 Query TGCGCAACCAGGGTCTGGGCTCCTGGCCGGTGCGCCGCGCCAGGATGAGCCCGCACGCGA 61 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct TGCGCAACCAGGGTCTGGGCTCCTGGCCGGTGCGCCGCGCCAGGATGAGCCCGCACGCGA 61 Query 62 Sbjct 62 Query 122 Sbjct 122 Query 182 Sbjct 182 Query 242 a lu Sbjct 242 n Query 302 va n Sbjct 302 Sbjct 362 p ie gh tn to Query 362 Query 422 Sbjct 422 Query 482 CAGCCGTCCGGCACGGCGGGACGGCGCTGACCTACGCCGAGCTGTCCCGCCGCGTCGCGC 121 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCCGTCCGGCACGGCGGGACGGCGCTGACCTACGCCGAGCTGTCCCGCCGCGTCGCGC 121 GGCTCGCCAACGGGCTGCGGGCCGCCGGGGTCCGCCCCGGCGACCGGGTGGCCTACCTCG 181 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCTCGCCAACGGGCTGCGGGCCGCCGGGGTCCGCCCCGGCGACCGGGTGGCCTACCTCG 181 GGCCGAACCACCCGGCCTACCTGGAGACCCTGTTCGCGTGCGGGCAGGCCGGCGCGGTGT 241 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCCGAACCACCCGGCCTACCTGGAGACCCTGTTCGCGTGCGGGCAGGCCGGCGCGGTGT 241 TCGTGCCGCTGAACTTCCGGCTGGGCGTCCCGGAACTGGACCACGCGCTGGCCGACTCCG 301 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCGTGCCGCTGAACTTCCGGCTGGGCGTCCCGGAACTGGACCACGCGCTGGCCGACTCCG 301 GCGCGTCGGTCCTTATCCACACCCCGGAGCACGCGGAGACGGTCGCGGCGCTCGCCGCCG 361 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGCGTCGGTCCTTATCCACACCCCGGAGCACGCGGAGACGGTCGCGGCGCTCGCCGCCG 361 GCCGGCTGCTGCGCGTGCCCGCGGGCGAGCTGGACGCCGCGGACGACGAGCCGCCCGACC 421 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCGGCTGCTGCGCGTGCCCGCGGGCGAGCTGGACGCCGCGGACGACGAGCCGCCCGACC 421 TGCCCGTCGGCCTCGACGACGTGTGCCTGCTGATGTACACCTCGGGCAGCACCGGACGCC 481 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCCCGTCGGCCTCGACGACGTGTGCCTGCTGATGTACACCTCGGGCAGCACCGGACGCC 481 oa nl w CCAAGGGCGCGATGCTCACCCACGGCAACCTCACCTGGAACTGCGTCAACGTCCTGGTGG 541 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCAAGGGCGCGATGCTCACCCACGGCAACCTCACCTGGAACTGCGTCAACGTCCTGGTGG 541 Sbjct 482 Query 542 TCTTCACCGACGTGCGGCTGGCCGGCCCGTCCGGCGAGCCGGTGCCGCCGGGGGAGAAGG 1021 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTTCACCGACGTGCGGCTGGCCGGCCCGTCCGGCGAGCCGGTGCCGCCGGGGGAGAAGG 1021 an Lu Sbjct 962 m Query 962 TGCTGGTCCTCGACCGCGCGCACGTCGCGGAGAAGATCGGCTCCGCCGGGGTGCCCTCGT 961 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTGGTCCTCGACCGCGCGCACGTCGCGGAGAAGATCGGCTCCGCCGGGGTGCCCTCGT 961 co Sbjct 902 l Query 902 ACCTCGACCGCGGGCTCGCGTTCGTGCAGGGCTACGGCATGACCGAGGCCGCGCCGGGCG 901 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCTCGACCGCGGGCTCGCGTTCGTGCAGGGCTACGGCATGACCGAGGCCGCGCCGGGCG 901 gm Sbjct 842 @ Query 842 CCAGCCTGCGGACCCTGCTGTGCGGCGGCGCGCCGGTGCCCGCCGACCTCGCCAGCCGCT 841 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCAGCCTGCGGACCCTGCTGTGCGGCGGCGCGCCGGTGCCCGCCGACCTCGCCAGCCGCT 841 z Sbjct 782 GCGTGCCCACGATGTACCAGGCGATCGCCGCGCACCCGCGGTGGCGCAGCGCCGACCTGT 781 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGTGCCCACGATGTACCAGGCGATCGCCGCGCACCCGCGGTGGCGCAGCGCCGACCTGT 781 tz Query 782 n oi Sbjct 722 m Query 722 CGTTCGACCCCGGCGCCGTGCTGTCCGCGGTGGAACAGGAGCGGGTCACGCTCGTGTTCG 721 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGTTCGACCCCGGCGCCGTGCTGTCCGCGGTGGAACAGGAGCGGGTCACGCTCGTGTTCG 721 ll Sbjct 662 u nf Query 662 CGCTCGGCATGGTGTGCCTGCCCACCCTGCTCAAGGGCGGCACGGTGATCCTGCACTCCG 661 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCTCGGCATGGTGTGCCTGCCCACCCTGCTCAAGGGCGGCACGGTGATCCTGCACTCCG 661 a nv Sbjct 602 a lu Query 602 d Sbjct 542 AGACCGACCTGGCGAGCGACGAGCGGGCACTGGTCGCCGCGCCGCTGTTCCACGCCGCCG 601 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGACCGACCTGGCGAGCGACGAGCGGGCACTGGTCGCCGCGCCGCTGTTCCACGCCGCCG 601 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 Query 1022 GCGAGATCGTGGTCAGCGGGCCCAACGTGATGAAGGGCTACTGGGGCAGGCCGGAGGCGA 1081 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1022 GCGAGATCGTGGTCAGCGGGCCCAACGTGATGAAGGGCTACTGGGGCAGGCCGGAGGCGA 1081 Query 1082 CCGCCGAGGTGCTGCGCGACGGGTGGTTCCACTCCGGCGACGTGGCCACCGTGGGCGGCG 1141 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| Sbjct 1082 CCGCCGAGGTGCTGCGCGACGGGTGGTTCCACTCCGGCGACGTGGCCACCGTGGACGGCG 1141 Vị trí 1136 Query 1142 ACGGGTACTTCCACGTCGTCGACCGGCTCAAGGACATGATCATCTCCGGCGGCGAGAACA 1201 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1142 ACGGGTACTTCCACGTCGTCGACCGGCTCAAGGACATGATCATCTCCGGCGGCGAGAACA 1201 Query 1202 TCTACCCGGCCGAGGTGGAGAACGAGCTGTACGGCTACCCGGGTGTGGAGGCGTGCGCCG 1261 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1202 TCTACCCGGCCGAGGTGGAGAACGAGCTGTACGGCTACCCGGGTGTGGAGGCGTGCGCCG 1261 Query 1262 TGATCGGCGTGCCGGACCCGCGCTGGGGCGAGGTGGGCAAGGCGGTCGTCGTGCCCGCCG 1321 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1262 TGATCGGCGTGCCGGACCCGCGCTGGGGCGAGGTGGGCAAGGCGGTCGTCGTGCCCGCCG 1321 a lu Query 1322 ACGGGAGCCGCATCGACGGCGACGAGCTGCTGGCCTGGCTGCGCACCCGGCTGGCCGGGT 1381 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1322 ACGGGAGCCGCATCGACGGCGACGAGCTGCTGGCCTGGCTGCGCACCCGGCTGGCCGGGT 1381 n Query 1382 ACAAGGTGCCCAAGTCGGTCGAGTTCACCGACCGGCTGCCCACGACCGGCTCCGGCAAGA 1441 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1382 ACAAGGTGCCCAAGTCGGTCGAGTTCACCGACCGGCTGCCCACGACCGGCTCCGGCAAGA 1441 n va p ie gh tn to Query 1442 TCCTCAAGGGCGAGGTCCGCCGCCGCTTCGGCTGA 1476 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1442 TCCTCAAGGGCGAGGTCCGCCGCCGCTTCGGCTGA 1476 oa nl w Hình 4: Kết so sánh trình tự gene fcs chủng Amycolatopsis sp HR104 với trình tự gene fcs chủng Amycolatopsis sp HR167 đƣợc d a nv a lu công bố ngân hàng gene NCBI ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99
Ngày đăng: 25/09/2023, 19:12
Xem thêm: