Luận án tiến sĩ nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài anopheles maculatus ở việt nam luận án ts sinh học62 42 70 10

Mục lục Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị Mở đầu Ch-ơng : Tổng quan tài liệu 1.1 Đại c-ơng vấn đề nghiên cứu loài đồng hình 1.2 Đa hình di truyền nghiên cứu đa hình di truyền muỗi 1.2.1 Đa hình enzym ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền muỗi 1.2.2 Di truyền tế bào ứng dụng nghiên cứu đa hình di truyền 13 1.2.3 Đại c-ơng PCR ứng dụng nghiên cứu đa hình di truyền muỗi 19 1.3 Những nghiên cứu vai trò truyền bệnh tính -a vật chủ vectơ 35 1.3.1 Những nghiên cứu vai trò truyền bệnh sốt rét muỗi 35 1.3.2 Xác định tÝnh -a vËt chđ cđa vect¬ 35 1.4 Những nghiên cứu nhóm loµi An maculatus 36 1.4.1 Những nghiên cứu n-ớc 37 1.4.2 Nghiªn cøu n-íc 41 Ch-ơng : Đối t-ợng ph-ơng pháp nghiên cứu 43 2.1 Đối t-ợng nghiên cứu 43 2.2 Thời gian nghiên cứu, địa điểm nghiên cøu 43 2.3 Ph-ơng pháp nghiên cứu 43 2.3.1 Ph-ơng pháp thu thập xử lý mẫu vật thực địa 45 2.3.2 Nghiên cứu phòng thí nghiệm 45 Ch-¬ng : Kết nghiên cứu 60 Đa hình dấu hiệu kiểu hình thành viên nhóm loài An maculatus 60 3.1.1 Đa hình dấu hiệu hình thái thành viên nhóm loµi An maculatus 60 3.1.2 Đa hình di trun çc dÊu hiƯu sinh häc, sinh th¸i häc thành viên nhóm loài An maculatus 80 3.2 Đa hình di truyền tế bào dấu hiệu kiểu gen thành viên nhóm loài An maculatus 89 3.2.1 Đa hình dấu hiệu di truyền tế bào thành viên nhóm loài An maculatus 89 3.2.2 Đa hình di truyền đặc điểm điện di enzym thành viên nhãm loµi An maculatus 92 z 3.2.3 Kết phân tích đa hình dựa vào thị PCR-RFLP nhóm loµi An maculatus 112 3.2.4 Kết đánh giá đa hình di truyền thành viên nhóm loài An maculatus dựa vào thị RAPD 116 3.2.5 Định loại thành viên nhóm loài An maculatus PCR ®a måi 126 3.2.6 KÕt qu¶ đánh giá đa hình di truyền thành viên nhóm loài An maculatus dựa vào kết giải trình tự đoạn ITS2 128 3.3 Thành phần loài phân bố thành viên nhãm loµi An maculatus 135 3.3.1 B¶ng định loại thành viên đÃ xác định tên nhãm loµi 135 An maculatus 135 3.3.2 Phân bố thành viên nhóm loài An maculatus 137 3.4 Vai trß trun bệnh thành viên nhóm loài An maculatus 141 Ch-ơng 4: Bàn luận 144 4.1 Đa hình di truyền mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus 144 4.1.1.Đa hình dấu hiệu kiểu hình thành viên nhóm loài An maculatus 144 4.1.2 Đa hình di truyền dấu hiệu kiểu gen thành viên nhóm loài An maculatus ViÖt Nam 155 4.2 Thành phần loài phân bố thành viên nhóm loài An maculatus 161 4.2.1 Xây dựng bảng định loại thành viên đÃ đ-ợc định tên nhóm loài An maculatus Việt Nam 161 4.2.2 Phân bố thành viên nhóm loài An maculatus 162 4.3 Vai trß trun bƯnh thành viên nhóm loài An maculatus 163 KÕt luËn 164 Çc công trình tác giả liên quan đến luận án đÃ công bố 167 NHững đóng góp luËn ¸n 168 tài liệu tham khảo 169 Phô lôc 189 z danh môc ký hiệu chữ viết tắt ADN: Acid Deoxyribonucleic ALDOX: aldehyde oxidase An : Anopheles ATP: Adenosine triphosphate bp: cặp bazơ (Base pair) COI: Gen ti thể Cytochrome C oxidase I cs: Cộng ctv: Cộng tác viên DN: Khoảng cách di truyền (Genetic distance) dATP: deoxyadenosine triphosphate dCTP: deoxycytidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dNTP: deoxynucleoside triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate (E.C): M· sè enzym (Enzym code) (Enzym commission) EC: Cộng đồng Châu Âu (European commission) EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid ELISAs: Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzym (enzym linked immunosorbent assay) EST: Esterase et al: ng-êi kh¸c EtBr: Ethidium bromide FUM: Fumerate hydratase GPI: Glucosephosphate isomerase GPDH: glycerophosphate dehydrogenase HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase HK: Hexokinase IGS: Intergenic space (Vïng ®Ưm néi gen) ITS: Internal transcripbed spacer (Vùng đệm nội phiên mÃ) IDH: Isocitrate dehydrogenase z IN : Hệ số t-ơng đồng di truyền (Genetic Identity) KST: Ký sinh trïng LAP: Leucine aminopeptidase LDH: Lactate dehydrogenase Mabs: Kháng thể đơn dòng ( Monoclone antibody) MDH: Malate dehydrogenase ME: Malic enzym MPI: Manosephosphate isomerase NAD: 1-Naphthaleneacetamide NST: NhiƠm s¾c thĨ ODH: Octanol dehydrogenase P.: Plasmodium PCR: Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction) PGM: Phosphoglutamutase QT: Quần thể RAPD: Đa hình đoạn nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA ) RFLP: Đa hình đoạn phân cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) PGM: Phosphoglucomutase Rf: Tốc độ chuyển dịch t-ơng đối cấu tử điện di ARN: Acid ribonucleic Ribosome SSCP: Đa hình cấu tạo sợi đơn r ( Single Strand Conformational polymorphism) SDS: Sodium dodecyl sulfate TBE: Tris-Borate-EDTA TE: Tris-EDTA ViÖn SR-KST-CT TƯ: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng-Côn trùng Trung -¬ng XDH: xanthine dehydrogenase WHO: Tỉ chøc y tÕ giới (World Health organization) z danh mục bảng Bảng 2.1: Các enzym giới hạn trình tự giới hạn t-ơng ứng 53 Bảng 2.2: Thành phần chất tham gia phản ứng PCR 53 Bảng 2.3: Thành phần chất tham gia vào phản ứng giới hạn cđa çc enzym Cfr131, Alul, XbaI, BamHI 54 B¶ng 2.4: Thành phần chất tham gia vào phản ứng giới hạn enzym Msp1 EcoRI, HindII, HaeII, HeaIII, HindIII 54 B¶ng 2.5: Trình tự mồi ngẫu nhiên sử dụng cho phản ứng RAPD- PCR 55 Bảng 2.6: Thành phần chất tham gia vào phản ứng RAPD- PCR 55 Bảng 2.7: Trình tự xÕp mÉu thư nghiƯm ELISA 57 Bảng 2.8: Trình tự mồi để xác định thoa trùng muỗi 58 Bảng 3.1: Số l-ợng mẫu vật thu đ-ợc từ dòng gia đình để cung cấp dấu hiệu phân loại thành viên nhóm An maculatus 60 Bảng 3.2: Số l-ợng mẫu vật đÃ thu thập giai đoạn 2001-2005 61 Bảng 3.3: Số l-ợng bọ gậy thành viên nhóm loài An maculatus thu thập đ-ợc ë çc kiĨu ỉ n-íc kh¸c 81 Bảng 3.4: Số l-ợng tỷ lệ loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus thu thập Quảng Bình giai đoạn 2001-2005 86 B¶ng 3.5: Số l-ợng tỷ lệ loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus thu thập Sơn La giai đoạn 2001-2005 87 Bảng 3.6: Số l-ợng tỷ lệ loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus thu thập Hoà Bình giai đoạn 2001-2005 88 Bảng 3.7: Tần số alen mÃ hóa enzym ODH thành viên nhóm An maculatus 93 Bảng 3.8: Tần số alen mÃ hóa enzym LDH thành viên nhãm An maculatus 94 B¶ng 3.9: Tần số alen mÃ hóa enzym MDH thành viên nhóm An maculatus 96 Bảng 3.10: Tần số alen mÃ hóa enzym GOT thành viên nhóm An maculatus 97 Bảng 3.11: Tần số alen mÃ hóa enzym 6PGD thành viên nhóm An maculatus 100 Bảng 3.12: Tần số alen mÃ hóa enzym IDH thành viên nhóm An maculatus 101 Bảng 3.13: Tần số alen mÃ hóa enzym PGM thành viên nhãm An maculatus 103 B¶ng 3.14: Tần số alen mÃ hóa enzym MPI thành viên nhóm An maculatus 103 Bảng 3.15: Tần số alen mÃ hóa enzym -GPD thành viên nhóm An maculatus 105 Bảng 3.16: Tần số alen mÃ hóa enzym MPI thành viên nhóm An maculatus 106 z Bảng 3.17: Tần số alen mÃ hóa enzym HAD thành viên nhóm An maculatus 107 B¶ng 3.18: HƯ số t-ơng đồng di truyền (I) khoảng cách di truyền (D) thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích izozym 108 Bảng 3.19: Hệ số t-ơng đồng di truyền khoảng cách di truyền thành viên toàn nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích izozym 110 Bảng 3.20: Hệ số t-ơng đồng di truyền(I) khoảng cách di truyền (D) thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa số liÖu RAPD-PCR 122 B¶ng 3.21: HƯ sè t-ơng đồng di truyền khoảng cách di truyền thành viên toàn nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích RAPD-PCR 124 Bảng 3.22: So sánh dấu hiệu đa hình di truyền kiểu hình kiểu gen thành viên nhóm loài An maculatus 134 Bảng 3.23: Phân bố loài thành viên nhóm loài An maculatus 138 Bảng 3.24: Kết thử nghiệm ELISA đánh giá vai trò truyền bệnh muỗi nhóm loài An maculatus Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà 141 Bảng 3.25: Kết thử nghiệm ELISA đánh giá vai trò truyền bệnh muỗi nhóm loài An maculatus Đắc Ơ, Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc 141 z Danh mục hình vẽ, Đồ thị Hình 1.1 Tháp Babel phát loài đồng hình H×nh 1.2: Tr×nh tù hình thái học Hình 1.3: Sơ đồ ph-ơng pháp mô tả đặc điểm loài đồng hình Hình 2.1: Thiết kế nghiên cứu đa hình di truyền vai trò truyền bệnh nhóm loài An maculatus ë ViÖt Nam 44 Hình 2.2: Hình thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định alen đồng tréi .49 Hình 2.3: Hình thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định alen ®ång tréi .50 Hình 2.4: Hình thái điện di enzym có cấu trúc dimer đ-ợc quy định alen ®ång tréi 50 Hình 2.5: Hình thái điện di enzym có cấu trúc tetramer đ-ợc quy định bëi alen ®ång tréi .50 H×nh 2.6: H×nh thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định alen trội lặn 51 H×nh 3.1: Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành thành viên thuộc nhóm loài An maculatus .64 H×nh 3.2: Đa hình quan sinh dục đực thành viên thuộc nhóm loài An maculatus 66 H×nh 3.3: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An maculatus 67 Hình 3.4: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An maculatus dạng 67 Hình 3.5: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An maculatus dạng 68 Hình 3.6: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An maculatus d¹ng 68 H×nh 3.7: H×nh ảnh số đặc điểm hình thái quăng An dravidicus 69 Hình 3.8: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An notanandai 69 Hình 3.9: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An.pseudowillmori .70 Hình 3.10: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An sawadwongporni dạng 70 H×nh 3.11: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng cđa An sawadwongporni d¹ng 71 Hình 3.12: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An sawadwongporni dạng 71 Hình 3.13: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An willmori .72 Hình 3.14: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An maculatus 73 Hình 3.15: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An maculatus dạng 73 z Hình 3.16: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An maculatus d¹ng 74 H×nh 3.17: H×nh ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An maculatus d¹ng 74 H×nh 3.18: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An dravidicus 75 Hình 3.19: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An notanandai 75 Hình 3.20: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An pseudowillmori 76 H×nh 3.21: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gËy cđa An sawadwongporni d¹ng 76 Hình 3.22: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An sawadwongporni d¹ng 77 Hình 3.23: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An sawadwongporni dạng 77 Hình 3.24: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An willmori 78 Hình 3.25: Đa dạng hình thái trứng số thành viên nhóm loµi An maculatus 79 H×nh 3.26: ỉ bä gËy cđa An notanandai vµ An sawadwongporni ë si lín .82 Hình 3.27: Vũng n-ớc đáy suối cạn có sỏi ổ bọ gậy thích hợp loài nhãm An maculatus 83 H×nh 3.28: ỉ bä gËy cđa An dravidicus suối có đáy đá lớn 83 Hình 3.29: ổ bọ gậy thích hợp An dirus, An minimus đồng thời bắt đ-ợc An pseudowillmori .84 Hình 3.30: Hình ảnh nhiễm sắc thể kiểu nhân thành thành viên nhóm loài An maculatus .91 Hình 3.31: Hình ảnh điện di enzym ODH thành viên nhóm loài An maculatus 93 H×nh 3.32: Hình ảnh điện di enzym LDH thành viên phức hợp An maculatus 95 H×nh 3.33: Hình ảnh điện di enzym MDH thành viên nhãm loµi An maculatus 97 H×nh 3.34: H×nh ảnh điện di enzym 6PGD thành viên nhãm loµi An maculatus 99 H×nh 3.35: : H×nh ảnh điện di enzym IDH thành viên nhãm loµi An maculatus 101 Hình 3.36: Hình ảnh điện di enzym GPI thành viên nhóm loµi An maculatus 104 Hình 3.37 Hình ảnh điện di enzym HAD thành viên nhóm loài An maculatus 106 z Hình 3.38: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích izozym 108 Hình 3.39: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên toàn nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích izozym 111 Hình 3.40: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus b»ng enzym HeaIII 112 Hình 3.41: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus enzym HindII 113 H×nh 3.42: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhãm loµi An maculatus b»ng enzym HeaII 114 Hình 3.43: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loµi An maculatus b»ng enzym MspI 115 Hình 3.44: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus b»ng enzym XbaI 115 Hình 3.45: Sản phẩm phản øng RAPD- PCR sư dơng måi A1 117 Hình 3.46: Sản phẩm phản ứng RAPD- PCR sư dơng måi A5 118 H×nh 3.47: S¶n phÈm cđa ph¶n øng RAPD- PCR sư dơng måi F2 119 Hình 3.48: Sản phẩm phản øng RAPD- PCR sư dơng måi OPL1 120 Hình 3.49: Sản phẩm phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi F4 121 Hình 3.50: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR 123 Hình 3.51: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR 125 Hình 3.52: Kết định loại thành viên nhóm loài An maculatus ph-ơng pháp PCR đa mồi theo C.Walton 127 Hình 3.53: Hình ảnh giải trình tự đoạn gen ITS2 An maculatus dạng 128 Hình 3.54: So sánh kết giải trình tự với mẫu đÃ đ-ợc l-u giữ Genebank 129 Hình 3.55: Sự khác biệt kết giải trình tự An sawadwongporni thu Vân Nam Trung Quốc với mẫu An sawadwongporni l-u giữ ë Genebank 130 Hình 3.56: Kết t-ơng đồng trình tự An sawadwongporni thu Vân Nam Trung Quốc với mẫu An maculatus l-u giữ Genebank 130 Hình 57: So sánh kết giải trình tự thành viên đÃ định tên nhãm loµi An maculatus 131 Hình 3.58: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu giải trình tự đoạn ITS2 131 z Hình 3.59: So sánh kết giải trình tự thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus với trình tự nhóm loài đ-ợc l-u Genebank 132 H×nh 3.60: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu giải trình tự đoạn ITS2 số liệu đ-ợc l-u giữ Genebank 133 Hình 3.61: Phân bố loài nhóm loài An maculatus 140 Hình 3.62: Kết thử nghiệm ELISA xác định thoa trùng P.vivax muỗi An maculatus Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà 142 Hình 3.63: Kết kiểm tra mẫu muỗi nhiễm P.falciparum Đắc Ơ, Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc kỹ thuËt PCR lång 142 z Mở đầu Những nghiên cứu côn trùng truyền bệnh, có muỗi Anopheles, trung gian truyền bệnh sốt rét ngày đ-ợc đẩy mạnh ph-ơng diện: phân loại, phân bố, vai trò truyền bệnh, sinh học, tập tính biện pháp phòng chống Ngày nghiên cứu hệ thống học chủng loại phát sinh đÃ thâm nhập sâu vào hầu hết lĩnh vực sinh vật học, phân biệt loài trình phát triển sinh giới Cùng với thời gian, phát triển ph-ơng pháp mới, kết phân loại xác định phát sinh chủng loại ngày phong phú Từ năm 60 kỷ XX trở lại đây, nhiều cách mạng khoa học kỹ thuật đÃ xảy đặc biệt cách mạng sinh học phân tử Các ph-ơng pháp xác định cấu trúc phân tử protein, axít nucleic đÃ sớm đ-ợc nhà sinh vật học áp dụng Nhiều ph-ơng pháp kỹ thuật nghiên cứu nhằm phân loại xác định nguồn gốc phát sinh sinh vật đ-ợc ứng dụng mạnh Nổi bật ph-ơng pháp phát triển kỹ thuật đ-ợc phát vào thập kỷ 80 kỷ tr-ớc gọi phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction-PCR) Ph-ơng pháp nhân gen kết hợp với việc thiết kế loại mồi khác đÃ phát số l-ợng lớn số liệu biến đổi trình tự ADN loài Nhân gen đồng thời tạo b-ớc khởi đầu để tiếp cận với viƯc ph©n tÝch dÊu v©n tay ADN (DNA fingerprinting), cịng nh- phân tích tiểu vệ tinh (Microsaterllite) (Weber, May, 1989) [210] đa hình đoạn ADN nhân ngÉu nhiªn (Random Amplified Polymorphism DNA-RAPD) [216] Cïng víi sù phát triển kỹ thuật sinh học phân tử không nên bỏ qua kỹ thuật phân tích sinh học sở th-ờng dùng Các kỹ thuật điện di hệ enzym (allozyme) di truyền tế bào công cụ tốt bổ sung cho việc phân loại [31, 120, 213] chúng ph-ơng pháp có giá trị thực tiễn nghiên cứu sinh học Những ph-ơng pháp để phân tích ADN nh- PCR, lai ADN, phân tích đa hình đoạn giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), Microsaterllite, RAPD, ADN fingerprinting ,đÃ đ-ợc sử dụng ph-ơng pháp có điểm mạnh điểm hạn chế riêng Nhiều loài muỗi lúc đầu đ-ợc xác định nh- loài đơn, nh-ng trình nghiên cứu sâu vai trò z dịch tễ, đặc tính sinh học việc sử dụng kỹ thuật mới, áp dơng çc dÊu hiƯu nhËn biÕt vỊ di trun, sinh hoá đÃ xác định chúng phức hợp loài đồng hình (sibling species complex, cryptic species complex) Một ví dụ kinh điển nhóm loài An macullipenis châu Âu đÃ đ-ợc Mayer [25, 26] dẫn sách giáo khoa phân loại Càng sau, ng-ời ta phát có nhiều loài đồng hình, đặc biệt loài có vai trò truyền bệnh Có thể kể hàng loạt ví dụ khác nh- phức hợp Anopheles gambiae Ch©u Phi, Anopheles quandrimaculatus ë Ch©u Mü [46, 68], nhãm loài An hyrcanus, An leucosphyrus Châu [35, 36, 55, 70] Loài muỗi Anopheles (Cellia) maculatus đ-ợc Theobald phát Hồng Kông Trung Quốc vào năm 1901 Sau loạt loài khác t-ơng tự đ-ợc phát ấn Độ, Đài Loan đ-ợc coi tên đồng vật (synonym) Anopheles maculatus [156] Đây loài muỗi phân bố rộng rÃi vùng Đông ph-ơng [2, 6-10] Từ năm 1901 đến năm 1925, nhóm loài Anopheles maculatus đÃ có loài đ-ợc đặt tên [161] Năm 1986 Rattanarithikul Green đÃ phát thêm loài Thái Lan [156] Năm 1990 hai loài Philippin đ-ợc Rattanarithikul Harbach đặt tên An greeni An dispar [157] Nh- nay, phức hợp An maculatus gồm 12 loài thành viên: An maculatus Theobald, 1901; An willmori (James, 1903); An indicus (Theobald, 1907); An dudgeonii (Theobald, 1907); An pseudowillmori (Theobald, 1910); An maculosa (James and Liston, 1911); An dravidicus Christophers, 1924; An hanabusai Yamada, 1925; An sawadwongporni Rattanarithikul and Green , 1986; An notanandai Rattanarithikul and Green, 1986; An greeni Rattanarithikul and Harbach, 1990 vµ An dispar Rattanarithikul and Harbach, 1990 Nhiều thành viên nhóm đÃ đ-ợc xác định có vai trò truyền bệnh ë Malaysia [122], Th¸i Lan [89-91], Nepal [151], Trung Quèc, Singapore.[122] Việt Nam, tr-ớc đây, muỗi Anopheles maculatus đ-ợc xác định loài đơn, phân bố rộng rÃi vùng rừng núi toàn quốc [2, 6-10] Những nghiên cứu gần hình thái, tế bào cho thấy phức hợp loài gồm loài đÃ đ-ợc định z tên số dạng ch-a xác định rõ vị trí phân loại [6-10, 22] Năm 1936, Toumanoff, đÃ tiến hành mổ An maculatus thấy chúng cã nhiƠm ký sinh trïng sèt rÐt [196] §Õn loài An maculatus đ-ợc coi vectơ truyền bệnh thø yÕu ë n-íc ta [10, 16, 17, 20-22, 21, 24] Nh- việc nghiên cứu muỗi Anopheles maculatus Thế giới Việt Nam khác Nhiều vấn đề liên quan đến phân loại, vai trò truyền bệnh loài muỗi Việt Nam cần đ-ợc giải Với lý nêu tiến hành đề tài :Nghiên cứu tính đa hình di truyền vai trò truyền bệnh thành viên nhãm loµi Anopheles maculatus ë ViƯt Nam” nh»m mơc đích : Xác định thành phần loài phân bố thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam Xác định tính đa hình di truyền mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài Xác định vai trò truyền bệnh chúng nhằm góp phần vào việc phòng chống vect¬ sèt rÐt ë n-íc ta z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 Ch-¬ng : Tổng quan tài liệu 1.1 Đại c-ơng vấn đề nghiên cứu loài đồng hình Trong nghiên cứu côn trùng y học, loài có vai trò truyền bệnh th-ờng thể tính đa hình cách sâu sắc Việc tồn loài đồng hình gối giới hạn biến dị loài nhóm loài hay phức hợp loài phổ biến Việc phân biệt loài đồng hình, loài có quan hệ họ hàng gần gũi xuất biến dị khác giới hạn biến dị chúng gối lên nhiều đến mức hình nh- không dấu hiệu chuẩn tuyệt đối để phân biệt Việc phát phân loại loài đồng hình phân tích hình thái khó xác Do vậy, ng-ời ta phải kết hợp phân tích hình thái với nhiều ph-ơng pháp phân tích tính đa hình khác Bệnh sốt rét thực bệnh nghiêm trọng toàn cầu, bệnh muỗi truyền có phạm vi phân bố rộng rÃi Muỗi Anopheles đÃ đ-ợc xác định vectơ trun bƯnh sèt rÐt ë ng-êi ChØ cã mét phÇn nhỏ loài muỗi giống muỗi đ-ợc coi vectơ truyền bệnh sốt rét, nhiên loài dạng muỗi Anopheles truyền bệnh sốt rét toàn thể giới đa đạng phong phú) [60, 203] Những nghiên cứu Anopheles maculipennis sau loài khác bao gồm việc nghiên cứu khả giao phối nhân tạo phòng thí nghiệm, nhà nghiên cứu đÃ phát nhiều loài muỗi Anopheles, vectơ truyền bệnh sốt rét tồn nh- thành viên phức hợp loài có loài truyền bệnh loài vai trò truyền bệnh Điều khó khăn là, thành viên phức hợp loài th-ờng có hình thái giống nhau, khó cho việc định loại hình thái nhằm vai trò truyền bệnh chúng đồng thời gây khó khăn cho việc nỗ lực phòng chống [134, 195, 203] ViƯc kh«ng chó ý tíi sù tån phức hợp loài làm cho phân định vectơ phức tạp, loài Anopheles đơn th-ờng tồn lai không đồng vùng địa lý rộng lớn [30] Sự tăng c-ờng tính mềm dẻo kiểu gen kiểu hình gây khó khăn cho việc phân loại quần thể vectơ tác động tới hiệu điều tra nh- chiến l-ợc phòng chống vectơ [82] Trong giai đoạn tr-ớc đây, thành công việc chống lại bệnh sốt rét có đóng góp việc phòng chống muỗi Nh-ng thời điểm chiến l-ợc bị thất bại loạt lý bao gåm sù ph¸t triĨn cđa tÝnh kh¸ng hoá chất, 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 hạn chế điều kiện kinh tế, khoảng trống hiểu biết sinh học vectơ đồng hình (Norris, 2002) [141] Một số nhà khoa học chuyển h-ớng từ nghiên cứu khả giao phối sang nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ, kết đÃ cung cấp cho nhà nghiên cứu chứng di truyền xác sử dụng để phân biệt nhận biết loài (trong phức hợp loài đồng hình) dạng nhiễm sắc thể [58, 194] Việc phát minh kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase đÃ tạo ph-ơng tiện cho nghiên cứu di truyền phân tử hệ gen kỹ thuật sau tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu di truyền cá thể nhở mức độ quần thể [45] Sự đa dạng phong phú thị phân tử sử dụng nghiên cứu vectơ sốt rét đÃ đ-ợc công bố liên tục vòng 10 năm trở lại Các thị phân tử tế bào từ công cụ truyền thống nghiên cứu tế bào học, nhiễm sắc thể khổng lồ, NST, kỹ thuật miễn dịch học, lai tạo phân tích isozyme [79] tới loạt thị phân tử Các thị bao gồm từ gọi thị di truyền kinh điển (ADN ty thể cADN) tới ph-ơng pháp sử dụng để phát phân biệt đa hình nucleotide (SNPs) cuối đến thị phân tử có tính đa hình cao (RAPD, SSR AFLP) Một -u điểm lín nhÊt cđa viƯc sư dơng mét sè l-ỵng lín thị di truyền khác ng-ời nghiên cứu lựa chọn sử dụng, kết hợp thị hay kỹ thuật để trả lời nhiều câu hỏi có liên quan đến lan truyền sốt rét [189] Những thị phân tử cung cấp công cụ hữu hiệu cho nhiều nghiên cứu ứng dụng khác bao gồm: phân loại phân tử, hệ thống tiến hoá, di truyền quần thể, đồ di truyền, loạt chẩn đoán phân tử Mặc dù vài năm vừa qua đÃ phát triển nhiều kỹ thuật di truyền học quần thể nh-ng không kỹ thuật đơn lẻ trả lời tốt cho câu hỏi đặt phân loại loài đồng hình Sự kết hợp phân tích đa hình độ dài đoạn phân cắt, điện di izozym phân tích nhiễm sắc thể khổng lồ ph-ơng cách tốt để xác định loài đồng hình, phân tích trật tự ADN cách tốt cho việc nghiên cứu phát sinh chủng loại mẫu dò ADN (DNA probes) cách tốt cho việc định loại th-ờng quy cá thể côn trùng phức hợp loài đÃ đ-ợc nhận biết Cách sử dụng nhiều ph-ơng cách, gồm hình thái học thị phân tử cần thiết cho việc nghiên cứu quần thể muỗi Hình thái học tảng phân loại học theo Aristotle cách hàng 2000 năm Nếu hai sinh vật trông giống chúng loài Nếu trông chúng khác chúng khác loài Những tranh cÃi phân loại học tóm lại thảo luận ngữ nghĩa giống diễn tả theo ngôn ngữ hình thái học Eanst Mayr đÃ đ-a khái niệm loài sinh học, xác định loài nhóm sinh vËt 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 mang vèn gen chung Nh- vậy, ông đÃ mở rộng tảng ổn định phân loại học Sau này, Cockburn đÃ xây dựng tháp Babel mô hình mà loài đồng hình đ-ợc đề xuất dựa kỹ thuật chuyên biệt (hình 1.1) Các quần thể đÃ đ-ợc xác định loài hình thái đơn thể tập tính phức tạp khác vùng khác Ví dụ điển hình phức hợp loài An gambiae, loµi An gambiae lµ loµi trun bƯnh chđ yếu châu Phi loài đ-ợc xác định dấu hiệu hình thái An quandrimaculatus chí lại không đốt máu ng-ời Sẽ thuận lợi cho nghiên cứu biết sử dụng tổ hợp kỹ thuật khác nhằm kết hợp -u điểm ph-ơng pháp, kỹ thuật ch-ơng trình nghiên cứu Có điều mâu thuẫn tiến hành phân loại loài đồng hình ph-ơng pháp tiến hành nhanh chóng tiết kiệm thời gian thông tin cung cấp cho việc phân loại ít, kết ph-ơng pháp tốn nhiều thời gian kinh phí lại cung cấp nhiều thông tin có giá trị cho vịêc định loại Hình 1.1 Tháp Babel phát loài đồng hình (Nguồn Cockburn, 1994 [59]) Mét sè kü thuËt cã thÓ héi đủ điều cần thiết để cân tốc độ thông tin hàm chứa Chúng gồm tế bào học nhiễm sắc thể khổng lồ, điện di izozym đa hình độ dài đoạn phân cắt (RFLPs) Cả hai kỹ thuật tế bào học nhiễm sắc thể khổng lồ điện di izozym đÃ đ-ợc sử dụng vài thập kỷ qua đÃ đóng góp nhiều kết việc phát loài đồng hình Chỉ thị RFLP bao gồm ADN ty thể ADN ribosome đÃ đ-ợc ứng dụng khoảng 10 năm so sánh với hai ph-ơng pháp 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 Hình 1.2: Trình tự hình thái học (Nguồn Cockburn, 1994 [59]) Giải trình tự ADN (hoặc ARN protein) kỹ thuật di truyền tốt thích hợp với việc phân tích phát sinh chủng loại có đủ số l-ợng đặc điểm không hạn chế (một hệ gen muỗi có 100 triệu đôi bazơ nitơ) Những đặc điểm giống dễ dàng thu nhận từ loài cách giải trình tự gen loại Chủ yếu sử dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu phát sinh chủng loại, nhà sinh học tiến hoá th-ờng dùng giải trình tự ADN Sức hấp dẫn cđa viƯc sư dơng çc kü tht di trun kh¸c phát sinh chủng loại mạnh mÏ ThÝ dơ, sau dÊu hiƯu RFLP cđa loài đồng hình đ-ợc tìm thấy, kiểu băng đ-ợc đem so sánh với loài họ hàng gần gũi từ chủng loại phát sinh đ-ợc hình thành Cách làm đ-ợc giúp đỡ ch-ơng trình phần mềm chuyên dụng chuyển số liệu phân tích di truyền thành chủng loại phát sinh Định loại ADN ty thể Nhiễm sắc thể khổng lồ Izozym Khẳng định Hình thái học Giao phối chéo Mô tả Nghiên cứu Mẫu dò ADN Sinh thái học Khả truyền bệnh Hình 1.3: Sơ đồ ph-ơng pháp mô tả đặc điểm loài đồng hình (Nguồn Rutledge cs, 1996 [170]) Các mẫu dò ADN (DNA probes) ph-ơng pháp tốt đ-ợc chọn cho việc định loại th-ờng quy Nhiều nhóm tác giả đÃ tách mẫu dò ADN đặc tr-ng cho 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 loài muỗi định nh- An gambiae [100], An dirus [143], An quandrimaculatus loµi A,B,C [57], An rangeli vµ An aquasilis [146] Nh- vËy râ ràng để tiến hành phân loại loài, đặc biệt phức hợp loài đồng hình phải áp dụng nhiều ph-ơng pháp khác từ đơn giản đến phức tạp (hình 1.3) Mỗi ph-ơng pháp phù hợp cho hoàn cảnh điều kiện cụ thể 1.2 Đa hình di truyền nghiên cứu đa hình di truyền muỗi Đa hình di truyền biểu đa dạng biến dị loài, quần xÃ loài, quần xÃ Đây đa dạng thành phần kiểu gen cá thể loài loài khác Tính đa dạng gen di truyền đ-ợc quần thể quần thể Tính đa hình di truyền thực chất t-ợng biến dị cách không liên tục kiểu gen Xét cho cùng, đa hình di truyền biểu biến đổi vật chất di truyền, biến đổi cặp bazơnitơ tổ hợp trình tự cặp bazơnitơ Tính đa hình di truyền đ-ợc xác định mức độ tổ chức bao gồm từ số l-ợng, cấu trúc ADN tế bào nh- số l-ợng, cấu trúc nhiễm sắc thể, protein, hay hình thái loài điều kiện tự nhiên khác 1.2.1 Đa hình enzym ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền muỗi Đa hình enzym hình thức biểu đa hình di truyền Thuật ngữ izozym xuất để biểu thị enzym có chức nh-ng locut khác quy định Các biến dạng t-ơng ứng izozym allozym Allozym sản phẩm alen khác locut Hiện t-ợng đa hình izozym tự nhiên kết đột biến gen cấu trúc locut kiểm soát việc tổng hợp sản phẩm Đột biến xảy nhiều mức độ khác Một số axit amin bị thay xảy đột biến vài bazơ nitơ ba mÃ hóa cđa gen cÊu tróc ThËm chÝ çc gen cÊu trúc xảy t-ợng lặp đoạn, đoạn, chuyển đoạn nucleotit [206] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 Vì vậy, sử dụng ph-ơng pháp điện di gel tinh bột thuỷ phân, gel agarose hay gel polyacrilamide cïng víi nhm ho¸ tỉ chøc ta cã thĨ thấy đ-ợc biến dạng khác phân tử enzym [48] Việc sử dụng dẫn liệu đa hình di truyền enzym đÃ mang lại thuận lợi cho phân tích di truyền học: chất di truyền enzym đơn giản tiếp cận cách trực quan đại đa số izozym có đặc điểm theo kiểu đồng trội Hơn nghiên cứu di truyền học quần thể số liệu độ dị hợp quần thể nghiên cøu lµ cùc kú quan träng Sè liƯu nµy cho phép đánh giá đ-ợc động thái di truyền quần thể thời điểm nghiên cứu Số liệu độ dị hợp quần thể đ-ợc sử dụng để đánh giá khả thích nghi quần thể Số liệu cho phép so sánh động thái di truyền quần thể với Izozym mét kü tht trun thèng cã tÝnh øng dơng cao Các hạn chế việc phân tích izozym mẫu vật phải đ-ợc giữ t-ơi sống, giữ lạnh phân tích trình sử lý mẫu vật yêu cầu số l-ợng mẫu vật lớn thay cho vài nanogram mẫu nh- việc phân tÝch ADN kü thuËt PCR Tuy nhiªn, izozym cung cấp số liệu có giá trị làm sở cho nghiên cứu đại Anopheles muỗi, t-ợng đa hình di truyền izozym lần đ-ợc Bianchi (1969) đề cập so sánh điện di photphatase kiềm thành viên phức hợp loài An maculipennis Những số liệu điện di hệ enzym muỗi giống nhcác quần thể sống khác, quần thể muỗi biểu tồn đa alen cao số quần thể muỗi, đa hình thể chỗ enzym có thĨ bao gåm sù biĨu hiƯn cđa tõ 5-7 alen [52, 54] Một nghiên cứu sử dụng ph-ơng pháp sinh hoá nghiên cứu Anopheles albimanus, đÃ công bố số liệu đáng tin cậy tính đa hình chủng muỗi phòng thí nghiệm, số liệu sau đ-ợc sử dụng để nghiên cứu đồ liên kết gen [140] Những nghiên cứu kỹ l-ỡng việc sử dụng kỹ thuật đÃ phát vị trí locut gen allozyme quần thể hoang dại trùng vùng phân bố muỗi Anopheles quandrimaculatus A B cho phép sử dụng ph-ơng pháp để nghiên cứu di truyền quần thể mức độ rộng [98] Công cụ đ-ợc sử dụng để xây dựng khoá định loại 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 10 nhị phân phân biệt loài phức hợp An.quandrimaculatus [140] đ-ợc sử dụng để tách biệt loài đồng hình phức hợp An minimus Thái Lan [185] Những dấu hiệu đa hình di truyền đÃ đ-ợc phát hầu hết loài Anopheles Những số liệu đÃ khác biến đổi phức tạp loài đồng hình Sáu locut ( Est-1, Est-2, Est-3, Est-5, Odh, Xdh) sè 30 enzym đ-ợc thử nghiệm có khác alen điện di dùng để phân biệt Anopheles gambiae Anopheles arabiensis (trong phức hợp Anopheles gambiae) với khoảng cách di truyền 0,15 [48-49] Khi phân biệt loài đồng hình ng-ời ta cần phân tích khoảng 15 locut gen trở lên Khoảng cách di truyền hệ số t-ơng đồng di truyền loài đồng hình thuộc nhóm loài nh- nhóm loài khác Năm 1992 A.C Green V Baimai đÃ tiến hành nghiên cứu hệ enzym An dirus nhận thấy hầu hết chúng đa hình Trên đối t-ợng Anopheles pseudopunctipennis thuộc 42 quần thể thu thập Trung Nam Mü, Sylvie Manguin et al (1999) [130] nhËn thÊy cã khác bịêt tần số alen locut enzym (glycerol dehydrogenase, 6- phosphogluconate dehydrogenase vµ phosphoglucomutase) tỉng số 33 locut phân tích Dựa vào số liệu thu đ-ợc đa hình izozym, tác giả đÃ xếp nhóm quần thể Anopheles pseudopunctipennis theo vùng địa lý khác nhau: nhóm trải dài từ miỊn nam n-íc Mü qua Mexico ®Õn Guatemala Nhãm phân bố từ Bắc đến Nam Mỹ qua Trung Mỹ đến Brazil nhóm có Đông Guatemala Nam Brazil Choochote et al, (1998) [54] ph©n tÝch 10 hÖ enzym (esterase-EST, aldehyde oxidase- ALDOX, fumerate hydratase-FUM, glucosephosphate isomerase-GPI, glycerophosphate dehydrogenase--GPDH, hexokinase-HK, lactate dehydrogenaseLDH, malic enzym- ME, xanthine dehydrogenase- XDH, amylase- MY) bọ gậy muỗi tr-ởng thành dạng Anopheles sinensis (dạng A B) Thái Lan, kết rằng: phần lớn izozym có khác biệt tần số alen ME, HK, Fum có băng đa hình bọ gậy muỗi tr-ởng thành dạng A B Những enzym khác mang băng đa hình hay alen locut Đi sâu phân tích enzym esterase, tác giả thấy EST có locut nh-ng có 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 11 Est5 dùng để phân biệt dạng A vµ B Est5 cã alen (96, 100, 101, 105 106) Dạng A có alen 100, 105, 101 106 với alen 100 có tần số bắt gặp cao Dạng B có alen 96, 100, 101 vµ 105 víi alen 96 chiÕm -u thÕ Nh- vËy dạng B có alen 96 mà dạng A ng-ợc lại dạng A có alen 106 với tần số thấp mà dạng B lại Theo nghiªn cøu vỊ izozym trªn gel cellulose acetate cđa phøc hợp loài Anopheles gambiae Tây Nam Burkina Faso Coosemans et al, (1998) [66] tất loài phức hợp phân biệt đ-ợc với locut ODH MPI chúng có thĨ cã sè alen chung ë locut nµy Phân tích đa hình 13 locut loài phức hợp Anopheles gambiae cho thấy khác biệt quan trọng mẫu thu thập thành phố mẫu thu thập vùng nông thôn tần sè alen, vỊ tÇn sè kiĨu gen cđa enzym isocitrate dehydrogenase I, malate dehydrogenase I tần số alen Mpi Anopheles sundaicus đ-ợc xác định vectơ truyền bệnh sốt rÐt chđ u ë vïng ven biĨn çc n-íc ë Đông ph-ơng [10, 20] Bằng nghiên cứu di truyền tế bào nhà khoa học nhận thấy phức hợp loài gồm dạng nhiễm sắc thể khác (dạng A, B, C) Indonesia Thái Lan Vào năm 1999, Sukowati et al, đÃ tiến hành nghiên cứu izozym dạng A, B, C thu thập từ quần thể địa lý khác ë Indonesia M-êi hai hƯ enzym víi tỉng sè 15 locut đ-ợc nghiên cứu kết hầu hết enzym đa hình hay quần thể phức hợp An sundaicus Tần số alen enzym Mpi (Mannose phosphate isomerase) cho phép phân loại dạng Anopheles sundaicus khác Dựa vào liệu thu nhận đ-ợc từ nghiên cứu trên, tác giả đÃ thiết lập mô hình chủng loại phát sinh dạng này, qua thấy dạng A có quan hệ gần gũi với dạng C, dạng B có khoảng cách di truyền xa hai dạng trên, Nh- vậy, kết củng cố khẳng định An sundaicus Indonesia phức hợp gồm loài đồng hình [186] Những chứng đa hình di truyền Anopheles nuneztovari đÃ đ-ợc Scarpasa Tadel công bố dựa vào việc phân tích izozym mẫu thu thập quần thể khác (4 quần thể rừng Amazon- Brazil quần thể Colombia) Các enzym ME XDH enzym đơn locut tất quần thể, 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 12 EST LAP lại có số locut nhiều EST có locut LAP có locut IDH có vùng bắt màu có khác biệt di truyền locut Idh I quần thể rừng Amazon- Brazil MDH đa hình cao tất quần thể nghiên cøu ë qn thĨ Sitromela, locut enzym ACON thĨ hiƯn có alen quần thể lại có alen PGM locut xác định nh-ng lại có đa hình cao quần thể rừng Amazon Những enzym thị quan trọng cho thấy đa hình quần thể Anopheles nuneztovari [174] Khoảng cách di truyền loài Anopheles rangeli, loµi Anopheles nuneztovari vµ loµi Anopheles dunhami ë rừng Amazon- Brazil đ-ợc tính toán sử dụng kết điện di izozym Ba loài thuộc phân nhãm Oswaldoi, ph©n gièng Nyssorhynchus M-êi ba enzym víi tỉng số 22 locut loài đÃ đ-ợc nghiên cứu đ-a đến kết luận: Anopheles nuneztovari Anopheles rangeli kh¸c ë çc locut Gpi1, Hk1, Me1 đặc biệt rõ rệt locut Mdh Năm locut (Mdh, Gpi1, Hk1, Gpd Me) dùng phân biệt hai loài An.rangeli An.dunhami có locut Gpd phân biệt đ-ợc An.nuneztovari An.dunhami Khoảng cách di truyền cao An.rangeli An.dunhami (0,28) thấp An.nuneztovari An.dunhami (0,072) Khoảng cách di truyền Anopheles nuneztovari Anopheles rangeli 0,237 Các tác giả đ-a nhận định An.dunhami An.nuneztovari loài chị em có mối quan hệ gần gũi đ-ợc tách từ nhánh tổ tiên chung [174] Bằng cách so sánh phổ điện di 12 hệ enzym thành viên phức hợp loµi Culex pipiens L ë California vµ Nam phi, Cornel, Collins (2003) nhËn thÊy ë Nam phi cã sù kh¸c biệt loài Cx pipiens Cx quinquefaciatus locut Ao, 6-Pgdh, Mdh2 Pgm Ng-ợc lại, California, toàn quần thể Cx pipiens có cân phù hợp với định luật Hardy Weinberg tất locut enzym thử nghiệm Những kết Nam Phi hai loài Cx pipiens Cx quinquefaciatus có khoảng cách di truyền khác biệt quần thể chúng loài riêng biệt, California lại có t-ơng đồng di truyền hai quần thể này, chúng đ-ợc coi nh- loài [69] Việt Nam, việc phân tích đa hình izozym muỗi đÃ đ-ợc tiến hành từ năm 80 kỷ tr-ớc Một nhóm loài trun bƯnh sèt rÐt 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 13 chÝnh ë Đông Nam nh- Việt Nam đ-ợc nghiên cứu rõ nhóm loài An minimus Những nghiên cøu vỊ An minimus ë ViƯt Nam chØ r»ng izozym Octanol dehydrogenase (ODH) loài muỗi biểu tính đa hình quần thể khác Các quần thể muỗi An minimus C phân bố chủ yếu sinh cảnh thích hợp sinh cảnh rừng rậm, rừng nguyên sinh đ-ợc đặc tr-ng Odh134 Odh146 Các quần thể An minimus A phân bố réng r·i ë vïng rõng nói toµn qc chóng mở rộng vùng phân bố tới vùng bán sơn địa có alen đặc tr-ng Odh100 Odh114 Hai dạng muỗi có tập tính thời gian sinh sản đặc tr-ng khác [1, 3, 11, 13] Năm 2000, cán Viện SR- KST- CT TƯ đÃ phân tích hệ izozym, là: glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD), phosphoglucomutase (PGM), Isocitrate dehydrogenase (IDH) cđa phøc hỵp loài An maculatus Việt Nam, tác giả nhận thấy có đa hình di truyền rõ rệt thể thành viên khác phức hợp loài Do sử dụng hệ izozym để nhận biết thành viên phức hợp [22] 1.2.2 Di trun tÕ bµo vµ øng dơng nghiên cứu đa hình di truyền Ph-ơng pháp di truyền tế bào ph-ơng pháp tập trung vào nghiên cứu nhiễm sắc thể tế bào: thông th-ờng nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ (polytene chromosome) nghiên cứu hình thể nhiễm sắc thể kỳ nguyên phân (karyotype) Làm tiêu nhiễm sắc thể sử dụng tác động học hoá học làm cho nhiễm sắc thể dàn bề mặt lam kính nhuộm màu Từ đó, ta quan sát số l-ợng, hình dạng băng đặc tr-ng nhiễm sắc thể Dựa vào đặc điểm quan sát đ-ợc ta xác định nét đặc tr-ng loài cần nghiên cứu, phân tích chuyển đoạn, đảo đoạn, trình tự xếp băng nhiễm sắc thể từ xác định mối quan hệ nguồn gốc phát sinh loài Nghiên cứu di truyền tế bào h-ớng nghiên cứu quan trọng nhằm củng cố tăng c-ờng hiểu biết sinh học loài Những công trình nghiên cứu di truyền tế bào quần thể muỗi thuộc giống Anopheles giúp chóng ta hiĨu râ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 14 h¬n vỊ máy di truyền chúng mức độ tế bào mối quan hệ tiến hoá loài họ muỗi Di truyền tế bào gồm có nghiên cứu kiểu nhân nhiễm sắc thể khổng lồ, công cụ sớm đ-ợc sử dụng để nghiên cứu di truyền muỗi Anopheles Một nh-ợc điểm kỹ thuật muỗi Anopheles nhiễm sắc thể khổng lồ phải đ-ợc chuẩn bị từ mô tế bào nuôi trứng bọ gậy tuổi IV Điều hạn chế sử dụng mẫu vật muỗi no máu giai đoạn cuối bọ gậy Thêm vào đó, có ng-ời có kinh nghiệm đ-ợc đào tạo để phân tích kết nhiễm sắc thể, đặc điểm không cung cấp nhiều, có lại thông tin số loài (Lounibos, Conn, 2000) [124] Mặc dù có hạn chế trên, nh-ng ph-ơng pháp tồn thiếu cho nghiên cứu Trong năm gần đây, nghiên cứu di truyền tế bào muỗi sốt rét Anopheles ngày đ-ợc quan tâm mở rộng đặc biệt việc phân biệt loài đồng hình phức hợp loài Các nhà khoa học đÃ sâu nghiên cứu kiểu nhân nhiễm sắc thể khổng lồ Ng-ời tiên phong lĩnh vực G Frizzi Kitzmiller đối t-ợng An maculipennis (1954) Tiếp đó, năm 1969, Coluzzi đÃ phát thấy nhiễm sắc thể khổng lồ tế bào nuôi trứng muỗi Anopheles tr-ởng thành Nhiễm sắc thể khổng lồ tế bào nuôi trứng hữu ích việc phân biệt loài đồng hình phức hợp loµi An gambiae [58, 85], An culicifacies vµ An maculatus [186] Di truyền tế bào cung cấp thông tin vô hữu hiệu để phân biệt loài vùng phân bố dạng nhiễm sắc thể khác Trên thực tế di truyền tế bào đ-ợc coi công cụ đáng tin cậy để phân biệt khác dạng nhiễm sắc thể An gambiae s.s [59] tận ngày công cụ đáng tin cậy để phân biệt thành viên nhóm loài Anopheles funestus [103] Sharakhov et al, (2001) [176] đÃ phát triển đồ nhiễm sắc thể khổng lồ An.funestus so sánh với cấu trúc di truyền tế bào An gambiae Ngoài ra, tần số đảo đoạn nhiễm sắc thể sử dụng để nghiên cứu cấu trúc quần thể -ớc l-ợng tác ®éng cđa kÝch cì qn thĨ [107, 148, 188] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 15 Các đảo đoạn NST đ-ợc sử dụng để nghiên cứu trình tiến hoá, tìm cấu trúc ban đầu, việc trì đan xen đảo đoạn NST tồn nhiều quần thể bậc phân loại trùng vùng phân bố nhiều nhóm loài Anopheles [60] Những thông tin nh- đÃ đ-ợc sử dụng nh- chứng tiến hoá di truyền biến đổi để thích nghi nhiễm sắc thể hai loài đồng hình, An gambiae s.s An arabiensis T-ơng tự, Caccone et al, (1998) [50] vµ Powell et al, (1999) đÃ phát h-ớng tiến hoá thông qua đảo đoạn nhiễm sắc thể đ-ợc chia sẻ thành viên phức hợp An gambiae Cũng nh- vậy, việc so sánh chia sẻ băng nhiễm sắc thể khổng lồ đ-ợc tìm thấy loài muỗi Anopheles vùng Tân giới [147] Trong hai tr-ờng hợp trên, nhà nghiên cứu phải kiểm tra dấu hiệu khác để có kết luận xác t-ơng đồng [186] vùng Đông ph-ơng, công trình nghiên cứu loài muỗi thuộc phân gièng Cellia vµ Anopheles Avirachan et al, (1968) [28] tiến hành.Tiếp công trình V Baimai nghiên cứu An balabacencis nhiều công trình khác đối t-ợng An dirus, An minimus [35,36] Theo nhiều tài liệu kết đÃ đ-ợc công bố, tác giả kết luận kiểu nhân tất loài Anopheles đÃ nghiên cứu có số nhiễm sắc thể l-ỡng bội 2n=6 gồm đôi: hai đôi nhiễm sắc thể th-ờng, đôi nhiễm sắc thể giới tính (XX XY đực) Hai đôi nhiễm sắc thể th-ờng tâm cân tâm cận giữa, đôi nhiễm sắc thể giới tính có hình thái khác đực và loài khác nhiễm sắc thể giới tính khác biệt Các kiểu nhân phân biệt với sở sai khác hình dạng kích th-ớc, nh- phân bố vùng dị nhiễm sắc nhiễm sắc thể th-ờng nhiễm sắc thể giới tính Những nét khác biệt thấy loài loài khác Theo nghiên cứu V Baimai (1988) [35], có loài đồng hình phức hợp loài An dirus Đông Nam A, B, C, D, E, F An takasagoensis Các loài đ-ợc phân biệt dựa vào khối dị nhiễm sắc tâm động nhiễm sắc thể giới tính kiểu nhân nguyên phân 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 16 Khi sâu nghiên cứu riêng loài An dirus A Thái Lan, Baimai đÃ nhận thấy nhiễm sắc thể giới tính loài không ổn định kích th-ớc có điểm sai khác cấu trúc vùng dị nhiễm sắc chúng Năm 1985, Green ng-ời khác đÃ phát loài An maculatus B C, loài có loại nhiễm sắc thể X khác hình dạng kích th-ớc [85] Trên đối t-ợng An minimus Thái Lan, Sucharit đÃ có loài An minimus khác nhau, dựa vào khác nhiễm sắc thể Y [185] Năm 1991, Xu Shubi Qu Fengyi [219] đÃ tiến hành nghiên cứu kiểu nhân 13 loài muỗi Anopheles Trung Quốc: loài thuộc phân giống Cellia lµ An maculatus, An dirus, An kochi, An splendidus, An minimus, loài thuộc phân giống Anopheles An barbirostris, An meseae, An crawfordi, An kunmingensis, An kweiyanensis, An hyrcanus, An sinensis An anthropophagus, kết cho thấy: - Nhiễm sắc thể th-ờng 13 loài khác biệt số tâm động chiều dài - Nhiễm sắc thể giới tính (con đực: XY, cái: XX) có khác biệt, đặc biệt nhiƠm s¾c thĨ Y Cã kiĨu nhiƠm s¾c thĨ X 13 loài: dạng tâm mút, dạng không tâm mút Kiểu nhân loài thuộc nhóm Maculatus có khác biệt số l-ợng phân bố cấu trúc vị trí nhiễm sắc nhiễm sắc thể giới tính vùng tâm động nhiễm sắc thể th-ờng [32] Bên cạnh công trình nghiên cứu kiểu nhân có nhiều công trình nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ Năm 1968, Coluzzi đÃ phát nhiễm sắc thể khổng lồ tế bào nuôi trứng muỗi tr-ởng thành [186] Trên tiêu nhiễm sắc thể khổng lồ, d-ới tác dụng thuốc nhuộm đặc tr-ng có phần đồng nhiễm nhiễm sắc thể X vai nhiễm sắc thể th-ờng đ-ợc quan sát thấy Sơ đồ trình tự băng vai nhiễm sắc thể khổng lồ tiêu chuẩn để nhận diện đặc điểm loài hay cá thể Sự khác biệt trội loài xếp lại đảo đoạn gần tâm nhiễm sắc thể [211] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 17 Danh pháp vai nhiễm sắc thể Anopheles đ-ợc chuẩn hoá Green Hunt (1980) Toàn bộ nhiễm sắc thể khổng lồ gồm cặp tiếp hợp: cặp nhiễm s¾c thĨ giíi tÝnh ng¾n nhÊt (nhiƠm s¾c thĨ sè 1) cặp nhiễm sắc thể th-ờng dài hơn, chia lµm vai: 2R/2; 2L/3; 3R/4; 3L/5 Green vµ Hunt (1980) đÃ xây dựng đồ nhiễm sắc thể khỉng lå chn cđa An funetus vµ nhËn thÊy cã 10 đảo đoạn không cố định (ngẫu nhiên) Các tác giả nhận thấy An parensis khác với An funetus đảo đoạn cố định vai 2, trao đổi đoạn ngẫu nhiên vai Dựa vào khác băng, đặc biệt nhiễm sắc thể khổng lồ, loài đồng hình phức hợp loài An gambiae châu Phi đÃ phân biệt đ-ợc (Coluzzi, Sabatini 1967, 1968, 1969) ( theo WHO,1975 ) [218] Khi nghiên cứu An culicifacies làng nhỏ gần Delhi, Green Miles (1980) đÃ phát thấy 23 mẫu đồng hợp tử nhiễm sắc thể chuẩn mẫu đồng hợp tử có trao đổi đoạn nhiễm sắc thể X Sự vắng mặt dạng dị hợp tử có trao đổi đoạn đÃ chứng minh tồn loài sinh học (loài A loài B) vùng Trên đối t-ợng An dirus Đông Nam á, V Baimai đ-a kết luận: An dirus B C đơn hình trật tự băng nhiễm sắc thể khổng lồ tuyến n-ớc bọt; An dirus A có đa hình trao đổi đoạn tâm cận nhiễm sắc thể X số quần thể Sự xếp loại băng nhiƠm s¾c thĨ X (Xa) ë An dirus A cịng thÊy xuÊt hiÖn ë An dirus D Chøng tá An dirus A D có chung trao đổi đoạn nhiễm sắc thể Xa Bên cạnh đó, An dirus D tồn đa hình nhiễm sắc thể với trao đổi đoạn tâm cận tất nhiễm sắc thể th-ờng [33] Vào năm 1987, Kaisen Seawright đÃ cung cấp đồ nhiễm sắc thể khổng lồ tế bào nuôi trứng An quandrimaculatus Việt Nam, nghiên cứu di truyền tế bào bắt đầu muộn so với giới Vào năm 80 kỷ 20, đối t-ợng Aedes aegypti đ-ợc nghiên cứu phòng thí nghiệm Viện Sốt rét - Ký sinh trùng Côn trùng phòng thí nghiệm cđa bé m«n Di trun häc, khoa Sinh häc, tr-êng Đại học Tổng hợp Hà Nội Kết đÃ thăm dò đ-ợc liều l-ợng phóng xạ liều l-ợng chiếu xạ thích hợp, 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 18 phân lập đ-ợc số dòng chuyển đoạn nghiên cứu sử dụng chất gây đột biến muỗi Aedes aegypti An sinensis đối t-ợng muỗi sốt rét đ-ợc nghiên cứu di truyền tế bào Việt Nam Chiều dài nhiễm sắc thể đÃ đ-ợc xác định xác Bộ nhiễm sắc thể khổng lồ trình giảm phân An sinensis đÃ đ-ợc quan sát, mô tả Năm 1989, Phạm Văn Lập, Đinh Xuân Khoảng ®· ®-a kÕt ln lµ An minimus cã kiĨu nhân maculipennis điển hình Độ dài nhiễm sắc thể Y không ổn định, nhiễm sắc thể X tâm cận giữa, phần vai ngắn đồng nhiễm sắc hoàn toàn, phần vai dài có vùng dị nhiễm sắc xen kẽ Nhiễm sắc thể Y tâm cận mút , dị nhiễm sắc hoàn toàn Theo tác giả quần thể nghiên cứu có ổn định mặt di truyền tế bào xem kiểu nhân chuẩn loài An minimus Việt Nam, làm sở để so sánh với kiểu nhân khác phát nơi khác [15] Trên đối t-ợng An jeyporiensis Hoà Bình, Phạm Văn Lập, Lê Văn Sơn (1992) đ-a nhận định: Kiểu nhân An jeyporiensis Hoà Bình kiểu nhân maculipennis điển hình, hình dạng kích th-ớc nhiễm sắc thể đÃ đ-ợc mô tả, ch-a phát thấy đa hình nhiễm sắc thể hay kiểu nhiễm sắc thể khác biệt địa bàn nghiên cứu [15] Nghiên cứu Phạm Văn Lập (1993) đÃ có t-ợng đa hình nhiễm sắc thể giới tính tồn loài An minimus, có loại nhiễm sắc thể X loại nhiễm sắc thể Y đÃ đ-ợc phát Theo tác giả: nhiễm sắc thể X lµ phỉ biÕn nhÊt vµ X2, X3, X4 xt từ X1 bị phần nhánh dài Riêng hình thành X4 cần có thêm đảo đoạn mang tâm, dẫn đến biến vùng dị nhiễm sắc khỏi nhánh ngắn Y1 phổ biến nhất, Y2, Y3 đ-ợc hình thành từ Y1 đoạn nhiễm sắc thể nhánh dài Bản ®å nhiƠm s¾c thĨ khỉng lå An minimus cịng ®· đ-ợc nghiên cứu Nó gồm nhánh: vai ngắn nhiễm sắc thể X, dài 2R Các nhánh 2L, 3R 3L có kích th-ớc xấp xỉ Nhiễm sắc thể X chia làm vùng Qua nghiên cứu nhiễm sắc thể loài đồng h×nh phøc hƯ An maculipennis, Frizzi (1947, 1948, 1957, 1959) đÃ rút đ-ợc -u điểm sư 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 19 dơng di trun tÕ bµo Sau đó, đ-ợc ứng dụng nghiên cứu muỗi Anopheles nhiều lĩnh vực Mỗi loài có nhiễm sắc thể đặc tr-ng cho riêng Các loài đồng hình với có khác đặc điểm hình dạng nhiễm sắc thể Mức độ khác biệt phụ thuộc vào mối quan hệ gần gũi chúng Dựa vào đặc điểm sai khác đó, phân biệt đ-ợc xác loài đồng hình Di truyền tế bào đ-ợc áp dụng việc nghiên cứu t-ơng quan áp lực chọn lọc tần số đảo đoạn nhiễm sắc thể 1.2.3 Đại c-ơng PCR ứng dụng nghiên cứu đa hình di truyền muỗi Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction- PCR) Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đ-ợc K.B Mullis phát minh năm 1985 Đây ph-ơng pháp in vitro để nhân nhanh đoạn ADN với xúc tác enzym ADN polymerase việc kéo dài mồi oligonucleotit (primer) bổ trợ với đầu đoạn ADN kép cần tổng hợp Kỹ thuật PCR có ứng dụng rộng rÃi, lĩnh vực áp dụng kỹ thuật hiệu nghiên cứu tiến hoá mức độ phân tử, xác định xác quan hệ tiến hoá loài Kỹ tht PCR cã mét -u thÕ nỉi bËt so víi ph-ơng pháp tr-ớc phân biệt đ-ợc loài dựa vào đoạn trình tự ADN đặc tr-ng mà loài muỗi có khác biệt nhỏ vài cặp bazơ nitơ Số l-ợng họ ADN lặp lại khác hệ gen muỗi mục tiêu tốt để sử dụng phân loại Những họ ADN lặp lại phổ biến hệ gen ty thể, lạp thể hệ gen nhân có lặp lại nh- histon, gen 5S ARN, ARN ribosome (rRNA) ADN ribosome (rDNA) mÃ hoá rRNA mục tiêu tốt Cả rRNA gen gốc mÃ hoá có tính bảo thủ cao (bền vững, đặc tr-ng), rRNA đ-ợc sử dụng nh- công cụ quan trọng nghiên cứu hệ thống học nghiên cứu phân loại Có vùng rRNA có biến đổi chí loài có quan hệ gần gũi với Những vùng có nhiều biến đổi th-ờng tập trung khoảng trình tự trống (không mÃ hoá), nguồn 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 20 cung cấp công cụ hữu hiệu cho việc phân loại loài xác định mối quan hệ họ hàng loài gần gũi [62] Những đoạn trình tự chép lặp lại cách vùng đệm nội gen (intergenic spaces-IGS) nối tiếp thành dÃy dài Một đơn vị chép bao gồm vùng mÃ hoá tiểu đơn vị rRNA (ở côn trùng tiểu đơn vị 18S; 5,8S vµ 28S) vµ mét vµi vïng phơ (vïng chép bên ngoài-external transcribed spacer, EST vùng chép bên trong-internal transcribed space ITS1 ITS2) vùng ch-a biết rõ chức Các loài riêng biệt khác trình tự ADN ribosome dễ đàng phát nhờ phản ứng PCR thiết kế mồi gắn vào nhân lên sản phẩm đặc tr-ng từ ADN khuôn Cách đơn giản tạo mồi đặc hiệu để phân biệt loài Một thí nghiệm thiết kế mồi dựa gắn vào đoạn trình tự đầu đoạn IGS đÃ đ-ợc tiến hành để phân biệt loài phức hợp Anopheles gambiae [175] Phản øng PCR sư dơng måi kh¸c nhau: mét måi chung gắn vào đoạn trình tự đầu đoạn IGS phát tất loài phức hợp mồi nhỏ, mồi đặc tr-ng cho loài phức hợp (có mồi phát đ-ợc loài Anopheles merus Anopheles melas, loài không trùng vùng phân bố) Quá trình kéo mồi xảy đầu mồi nhỏ mồi gắn vào vị trí đặc tr-ng tạo đoạn ADN có chiều dài đặc tr-ng cho loài Ph-ơng pháp đÃ đ-ợc thử nghiệm với mẫu đ-ợc thu từ thực địa phù hợp hoàn toàn (100%) với kỹ thuật khác đ-ợc dùng nh- Southern blot (Taylor et al, 1993), ph©n tÝch di truyền tế bào (Fontenille et al, 1993) phân tích ®iÖn di izozym (Paskewitz et al, 1993) Møc ®é biÕn đổi vùng IGS cao tính đặc hiệu để phân loại loài tốt Tuy nhiên, độ dài chung độ dài đoạn IGS làm cho vùng khó đ-ợc nhân kỹ thuật PCR hiƯn Do ®ã hiƯn ng-êi ta sư dụng phổ biến mồi đ-ợc thiết kế để nhân đoạn ADN ngắn nói chung đa hình trình tự ITS Để phân biệt loài phức hợp Anopheles gambiae phản ứng PCR đ-ợc thiết kÕ t-¬ng tù nh- víi måi IGS 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 21 Vùng ITS2 đại diện cho loài Anopheles phân giống Cellia, Anopheles Nyssorhynchus đÃ đ-ợc thử nghiệm theo cách [85, 144, 150] Thông tin thu đ-ợc từ thử nghiệm đÃ phát điểm đặc biệt quan trọng vùng ITS2 muỗi Anopheles mục tiêu để phát triển kỹ thuật PCR phân loại loài Đầu tiên là, vùng t-ơng đối ngắn (th-ờnng ngắn 1kb) sản phẩm PCR nhân vùng xen ITS2 vùng rìa Vùng trình tự ITS2 ngắn đ-ợc tìm thấy An hermsi (305 bp) tìm thấy vùng ITS2 dài (khoảng 700 bp) số loài phức hợp An farauti Hơn nữa, biến đổi loài vùng ITS2 thấp biến đổi loài, điều cho phép phát triển phản ứng PCR chẩn đoán dựa vào vùng Ví dụ, có biến đổi đ-ợc quan sát thấy dòng ITS2 khác đ-ợc thu thập từ quần thể địa lý An freeborni [150] Mức độ biến đổi loài thấp nh- đ-ợc quan sát thấy trình tự ITS2 loài phøc hỵp An quandrimaculatus [62] Trong phøc hỵp An gambiae, mức độ biến đổi loài vùng ITS2 biến ®æi tõ 0,07% ë An arabiensis ®Õn 0,43% ë An gambiae biến đổi loài biến đổi từ 0,4 đến 1,6% [145] Mặt khác Frizt et al, (1994) [85] đÃ nhận thấy độ dài đoạn ITS2 biến đổi tới 2% vùng có nucleotide đôi lặp lại quần thể địa lý khác An.nuneztovari vùng Nam Mỹ Những quần thể có biểu đặc điểm loài đồng hình quần thể địa lý Năm 1993 Scott [175] đÃ thiết kế mồi để định loại loài nhóm loài đồng hình An gambiae có mồi chung cho tất loài mồi để phân biệt loài phức hợp Độ dài đoạn nucleotid đ-ợc nhân mồi chung đặc tr-ng cho loài nhsau: 153 nucleotid cho An quandriannulatus; 315 nucleotid cho An arabiensis vµ 464 nucleotid, 466 nucleotid cho An merus vµ An melas Hai loài sau, không vùng phân bố, sử dụng mồi để phân loại nh-ng đoạn ADN đặc tr-ng cho An merus dài An melas nucleotid Năm 1997, Jian Nong Xu Feng Yi Qu [191] đÃ tiến hành kỹ thuật PCR chẩn đoán để phân loại loài An dirus phức hợp An dirus Trung Quốc dựa vào khác đoạn trình tự ITS2 nhận thấy rằng: trình tự đoạn ITS2 loài An dirus Trung Quốc (loài A đảo Hải Nam loài D Vân Nam) có 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 22 khác biệt Đoạn trình tự ITS2 hai loài A D có chiều dài t-ơng ứng 716 nucleotid 710 nucleotid, dài đoạn trình tự phức hợp An punctulatus (khoảng 650 nucleotid), An gambiae (426 nucleotid), phøc hỵp An nuneztovari (363-369 nucleotid), phøc hỵp An quadrimaculatus (287-329 nucleotid) Tû lƯ GC cđa vïng ITS2 ë An dirus chiếm 69% cao loài đÃ đ-ợc ghi nhận tr-ớc (50-60%) phức hợp loài Anopheles đ-ợc nghiên cứu tr-ớc mức độ khác trình tự ADN loài phức hợp khoảng 0,4-1,6% An gambiae đến 18,5-28,7% An quadrimaculatus Sự khác hai loài An dirus A D 5,4% giống với khác biệt hai loài đồng hình An freeborni An.hermsi (4,9%) phức hợp An maculipennis Jian Nong Xu Feng Yi Qu đÃ tập trung vào nghiên cứu khác trình tự đoạn ITS2 loài An dirus Tỷ lệ khác biệt loài đoạn ITS2 5,4% tỷ lệ biến đổi loài D 0,14% Dựa vào khác biệt trình tự ITS2 loài đÃ phát triển kỹ thuật ADN chẩn đoán để phân biệt loài: nhân đoạn gen đặc biệt có tính chất bảo thủ có khác biệt loµi dùa vµo måi (mét måi chung vµ mồi riêng sử dụng cho loài) Kết thu đ-ợc đoạn ADN đặc tr-ng cho loài A có kích th-íc 374 nucleotid vµ loµi D lµ 663 nucleotid Ma Yajun, Qu Fengyi, Xu Jiannong vµ Zheng Zheming (1998) [126] đÃ nghiên cứu khác biệt trình tự đoạn ITS2 dựa để xây dựng kỹ thuật PCR chẩn đoán phân biệt An sinensis An anthropopharus Trung Quốc Các tác giả đÃ nhận thấy: đoạn gen đ-ợc nhân An sinensis An anthropophagus có chiều dài t-ơng ứng 563 đôi bazơ nitơ (bp) 547 bp Trong chiều dài đoạn mÃ hoá tiểu đơn vị 5,8S 28S 73 bp 22bp Chiều dài đoạn ITS2 468 bp ë An sinensis vµ 452 bp ë An anthropophagus Tû lƯ GC vïng ITS2 ë An sinensis lµ 44,8% An anthropophagus 49,2% Tỷ lệ khác biệt trình tự đoạn ITS2 hai loài 28,8% Tỷ lệ biến đổi loài 0,22% Dựa khác biệt trình tự ITS2 đÃ thiết kế mồi để sử dụng PCR chẩn đoán, đoạn nhân có chiều dài 425 bp An sinensis vµ ë An anthropophagus lµ 253 bp Elizabeth P Torres, Desmond H Foley, Allan Saul (2000) đÃ nhận thấy đoạn trình tự ITS2 D3 dùng để phân biệt hai loài An dispar An.greeni phức hợp loài An maculatus Philippine Đoạn ITS2 An dispar vµ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 23 An.greeni cã chiỊu dµi t-ơng ứng 320 bp 318 bp có 13 biến đổi loài Tỷ lệ GC t-ơng đ-ơng (60 59%) Đoạn D3 hai loµi cã kÝch th-íc 367 bp cã (2,5%) biÕn đổi loài, không ghi nhận đ-ợc biến đổi loài tỷ lệ GC t-ơng đ-ơng (59,4 58,5%) [195] Sự khác trình tự đoạn ITS2 thành viên phức hợp An hyrcanus Hàn Quốc đÃ đ-ợc Ma Ya-jun, Qu Feng-yi vµ Song Guan-hong (2000) ghi nhËn nhsau: chiều dài đoạn ITS2 An sinensis 468 bp; 451 bp ë An lesteri vµ 453 ë An yatsushiroensis Tû lƯ GC vïng ITS2 t-¬ng øng 44,87%, 46,2%, 45,7% Sự khác biệt trình tự nucleotid đoạn từ 12,16% đến 30,97% Những biến đổi trình tự đoạn ITS2 loài xảy theo h-ớng khác nhau: chèn thêm, loại bỏ, đảo vị trí đảo đoạn Tỷ lệ khác biệt An sinensis An lesteri 12,6; An sinensis An yatsushiroensis là: 30,74%; An lesteri An yatsushiroensis 29,96% Biến đổi loài ghi nhận đ-ợc An yatsushiroensis Năm 2002, nhóm loài An funestus đÃ đ-ợc Koekemoer, L Kamau, R H Hunt M Coetzee phân loại ph-ơng pháp PCR Sau nhân đoạn ITS2 nhóm loài có chiều dài sản phẩm PCR nhsau: An funestus: 704 bp; An vaneedeni: 681 bp; An leesoni: 398 bp; An rivulium: 380 bp; vµ An parensis: 463 bp [117] Một nghiên cứu t-ơng tự đÃ đ-ợc tiến hành víi nhãm An funetus ë Cameroon (2003), Anna Cohuet, Frederic Simard ng-ời khác, đÃ thu đ-ợc kết giống với nghiên cứu nhóm thiết kế thêm mồi cho dạng giống nh- An rivulium có kích th-ớc sản phẩm PCR 313 bp Cùng ph-ơng pháp nghiên cứu này, tác giả Helge Kampen, Anja Sternberf ng-ời khác (2003) [97], đÃ phân biệt đ-ợc loài đồng hình An claviger An petragnati Một dạng ADN đ-ợc sử dụng nhiều nghiên cứu muỗi sốt rét ADN hƯ gen ty thĨ HƯ gen ty thĨ th-êng xuyªn đ-ợc sử dụng để nghiên cứu chủng loại phát sinh di truyền quần thể Trình tự cấu trúc hệ gen ty thể An gambiae đÃ đ-ợc công bố thập kỷ tr-ớc [38] Những thông tin nhanh chóng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 24 đ-ợc sử dụng nghiên cứu thực địa nh- phòng thí nghiệm dựa vào đoạn có mÃ hoá (nh- tiểu phần NADH dehydrogenase (ND5) tiểu phần I, II cytochrome oxidase (COI COII)) không mÃ hoá (nh- tiểu phần 12 S và16 S RNAs) th-ờng gen đích cho nghiên cứu Rất nhiều nghiên cứu đÃ sử dụng ADN ty thể để đ-a chủng loại phát sinh An gambiae s.l để trả lời câu hỏi cấu trúc di truyền thành viên phức hợp loài [44, 50, 119, 191] Những nghiên cứu lịch sử tiến hoá phức tạp nhóm loài tiếp tục Sự thiếu hụt số liệu ty thể quần thể loài phức hợp đÃ đ-a tới kết luận có trao đổi dòng gen vùng địa lý rộng lớn có trình trao đổi gen loài phức hợp Mặc dù kết luận phù hợp với số liệu gen ty thể thu đ-ợc từ An gambiae s.l nh-ng số liệu thu đ-ợc từ thị di truyền khác phức hợp loài (nh- vi vệ tinh rADN) lại cho kết luận trái ng-ợc hẳn ADN ty thể đ-ợc sử dụng t-ơng tự để phát biến đổi lớn muỗi Anopheles phức hợp loài Anopheles Foley et al, (1998) đÃ sử dụng gen COII để đ-a chủng loại phát sinh muỗi Anopheles úc [81] De Merida et al, (1999) [72] cịng sư dơng ADN ty thể (ND5) phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn SSCP để nghiên cứu cấu trúc quần thể cđa An albimanus Fairley et al, (2000) [77] sư dơng đoạn gen COI để tìm hiểu cấu trúc di truyền trao đổi giòng gen quần thể Anopheles punctipennis Vermont Nghiên cứu tìm thấy có khác biệt đáng tin cậy đa hình di trun mét qn thĨ cịng nh- cÊu tróc di truyền quần thể với Điều giải thích, phần thay đổi bất th-ờng kích cỡ quần thể giới hạn việc trao đổi dòng gen Ngoài cách nghiên cứu nhiều đoạn khác trªn hƯ gen ty thĨ, ta cã thĨ sư dụng toàn hệ gen để nghiên cứu quần thể Conn (1999) [65] sử dụng ph-ơng pháp RFLP ®Ĩ ph©n tÝch ADN ty thĨ cđa Anopheles darlingi ®Ĩ chứng minh quần thể bị cách ly theo khoảng cách địa lý cách ly cho phép quan sát đ-ợc thay đổi kiểu hình loài Trong ví dụ này, ADN ty thể đ-ợc chứng minh hữu ích cho việc nghiên cứu 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 25 phát sinh chủng loại cấu trúc quần thể vùng địa lý rộng lớn, nh-ng điều không cho tất loài Anopheles (ví dụ An gambiae s.l nh- đÃ nêu trên) ADN ty thể thất bại sử dụng để phân biệt loài đồng hình phức hợp An maculipennis [62] Kỹ thuật RAPD-PCR ứng dụng RAPD- PCR nghiên cứu đa hình muỗi Vào đầu thập kỷ 90 kỷ tr-ớc, kỹ thuật đời RAPD (random amplified polymorphic DNA- tính đa hình đoạn ADN đ-ợc nhân ngẫu nhiên) Kỹ thuật dựa nguyên tắc phản ứng PCR, nhiên mồi đ-ợc sử dụng phản ứng mồi oligonucleotit đơn kích th-ớc từ khoảng 6-10 nucleotit có trình tự ngẫu nhiên Sự đa hình sản phẩm RAPD thay đổi điểm gắn mồi phân tử ADN hệ gen Nguyên nhân t-ợng đột biến gen (đột biến điểm) đột biến nhiễm sắc thể (mất, đảo hay thêm đoạn) dẫn đến việc thay đổi trình tự nucleotit ADN Do việc nhân ADN có khác Chỉ thị RAPD th-ờng đ-ợc dùng để phân tích xác định mối quan hệ thân thuộc quần thể, loài sinh vật ĐÃ có nhiều báo việc sử dụng RAPD-PCR để phân loại dựa đa hình đoạn ADN (Williams et al, 1990) [216] Hầu hết tập trung vào việc trả lời câu hỏi có liên quan đến biến đổi di truyền quần thể côn trùng bao gồm nghiên cứu muỗi (Kambhampati et al, 1992) [108], rệp (Black et al, 1992) [46], ruồi trắng (Gawel Bartlett, 1993), ruồi (Haymer Mclnnis, 1994) Năm 1994, Haymer đÃ đ-a danh sách 55 mồi RAPD th-ờng đ-ợc sử dụng nghiên cứu côn trùng Wilkerson et al, (1993) [215] ®· sư dơng 57 måi kü tht RAPD-PCR ®Ĩ phân biệt loài muỗi đồng hình phức hợp Anopheles gambiae An gambiae An arabiensis Kết thu đ-ợc 377 băng điện di, có 295 băng thể khác biệt loài Dựa vào kết ban đầu đó, tác giả ®· lùa chän 15 måi cã sù kh¸c biÕt rõ rệt để tiến hành nghiên cứu sâu hơn, chọn mồi làm mồi chẩn đoán để phân biệt loài 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 26 Một phức hợp loài đồng hình đ-ợc coi trung gian truyền bệnh châu An dirus đ-ợc Sylvie Manguin ng-ời khác (2002) [129] ph©n biƯt nhê sư dơng kü tht RAPD Tỉng sè đÃ thử nghiệm 46 mồi (mỗi mồi có chiều dài 10 nucleotid), 42 måi RAPD vµ måi microsatellites Trong số 46 mồi, có mồi (20%) có băng đẹp, nhiªn chØ cã måi (9%) thĨ hiƯn sù đa hình loài A, B, C D Trong số 37 mồi lại, 31 mồi (67%) có tạo thành băng, nh-ng vạch không rõ nét mồi (13%) nhân gen Bốn mồi RAPD có -u điểm (A5, F6, F8, P14) đ-ợc lựa chọn để nghiên cứu số l-ợng mẫu lớn (63 mÉu An dirus A, mÉu An dirus B, 20 mÉu An dirus C vµ mÉu An dirus D) Với mồi A5 tạo băng đặc tr-ng loài An dirus A có độ lớn 1620 bp 1450 bp, loài An dirus B, C D có băng với chiều dài t-ơng øng lµ 290 bp, 700 bp vµ 880 bp Víi mồi F6 tất loài An dirus A, B, C D có băng có độ dài lµ 700 bp, 1014bp, 720 bp vµ 850 bp Måi F8 nhân băng loài A C với độ dài 1300 bp 890 bp, loài B D mồi loài có băng: loài B 1350 vµ 1830 bp; loµi D lµ 1530 bp vµ 1300 bp ë måi P14 ë loµi A vµ C có băng đặc tr-ng t-ơng ứng 950 bp 600 bp; loài B có băng (500 bp, 350 bp vµ 250 bp); loµi D cã băng (1070 bp 420 bp) Năm trăm năm m-ơi t- mồi oligonucleotit đÃ đ-ợc dùng để phân tích tính đa hình 119 mẫu ADN quần thể muỗi Anopheles nuneztovari Colombia, 104 mồi không tạo sản phẩm, lại 440 mồi thể đa hình 10 mồi tạo sản phẩm băng đa hình cao với tổng số 65 băng quần thể nghiên cứu, tần số băng lựa chọn biến thiên từ 7- 92% Các băng đa hình có kích th-ớc từ 396- 1782 cặp bazơnitơ Tiến hành nghiên cứu dạng Anopheles gambiae khác kiểu nhiƠm s¾c thĨ, Guido Favia et al, (1997) [78] chØ r»ng: måi RAPD lµ T1, T2, T3, T4 cho đa hình cao cho phép phân biệt đ-ợc dạng muỗi với Nghiên cứu đa hình di truyền loài đồng hình phức hợp Anopheles albitaris Paraguay, Argentina Brazil, tác giả đ-a nhận định sau: số 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 27 65 måi RAPD (cã chiỊu dµi 10 nucleotit) 12 mồi tạo 19 băng đa hình dùng để phân biệt loài băng đa hình để phân biệt cặp loài một.[42] Đại c-ơng PCR- RFLP ứng dụng PCR- RFLP nghiên cứu đa hình muỗi Phân tích thị PCR- RFLP dựa nguyên tắc đa hình vị trí giới hạn phân đoạn ADN đ-ợc nhân kỹ thuật PCR Số l-ợng kích th-ớc phân đoạn phản ánh phân bố vị trí cắt phân tử ADN Sự diện đoạn cắt mang tính đặc tr-ng cho tổ hợp ADN/enzym giới hạn Vì sử dụng mảnh cắt nh- dấu vân tay đặc trưng cho phân tử ADN (hoặc thể mang phân tử ADN đó) Ng-ời ta sử dụng PCR- RFLP để đánh giá trực tiếp tính biến dị di truyền sinh vật Sử dụng độ dài đoạn giới hạn (RFLPs) mà đích ADN ribosome ph-ơng pháp để nghiên cứu cấu trúc di truyền quần thể muỗi Anopheles H-ớng tiếp cận đÃ đ-ợc sử dụng phân tích đoạn IGS quần thể An gambiae Tây Phi, nơi ng-ời ta đÃ tìm thấy quần thể cách mặt địa lý khoảng vài trăm số đÃ có cách ly vỊ mỈt di trun [135] Collins, Pakerwitz 1996 [62] sử dụng đồ cắt giới hạn để minh hoạ đ-ờng giới hạn biến đổi loài trình tự IGS phức hợp An gambiae, nh-ng vùng trung gian tồn tính đa hình loài loài Phân loại ph-ơng pháp RFLP đ-ợc sử dụng để hoàn thiện đồ gen An gambiae (Kumar, 1999) Polynesia, RFLPs trình tự đoạn ITS2 đ-ợc phát triển thành công cụ để phân biệt thành viên nhóm loài An punctulatus [39] Những thị đ-ợc sử dụng để nghiên cứu phân bố loài nhóm nh- tính đa hình di truyền đa dạng đơn vị phân loại đơn [42] Ph-ơng pháp PCR- RFLP lần đ-ợc sử dụng để phân biệt loài phức hợp An maculipennis Anh Thực chất phức hợp Anh bao gồm loài An atropavus An messeae Chúng có vùng phân bố xen kÏ nh-ng An 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 28 messeae cã xu h-ớng phân bố kéo dài lên phía Bắc An atropavus loàtruyền bệnh nhiều vùng Châu Âu Đoạn ADN đ-ợc nhân ITS2 sau đ-ợc xử lý enzym MspI Enzym cắt đoạn ITS2 An atropavus điểm với An messeae điểm Các loài phức hợp loài An maculatus nhận biết đ-ợc dùng enzym HaeII cắt đoạn ITS2: An dispari đoạn đ-ợc cắt thành phân đoạn nhỏ có kích th-ớc 173bp 134bp, An greeni đoạn lại có chiều dài 263bp 173bp [195] Theo nghiên cứu G Favia et al, (1997), d¹ng An gambiae s.s (cã kiểu nhiễm sắc thể khác nhau) đ-ợc phân biệt với dùng enzym giới hạn Tru9I HeaII phân cắt đoạn ADN có kích th-ớc 1,3Kb (chứa phần mÃ hoá 28S phần ITS) [78] Trên đối t-ợng Anopheles funestus, nhà khoa học đÃ dùng enzym MspI phân cắt vùng D3 tạo dạng phổ băng M W để nhận biết nhóm loài An funestus Dạng M gồm mẫu thu thập Mandagascar, Kenya Uganda Dạng W có mẫu vùng Tây- Trung Phi từ Senegal, Bờ Biển Ngà Camơrun Dạng kết hợp M W thấy nhóm thứ gồm mẫu Angola, Malani, Mozambique Nam Phi Kü tht sư dơng mÉu dß ADN (DNA - probe) Cơ sở mẫu dò đặc tính bắt cặp bổ sung axít nucleic Để phát trình tự xác định, ban đầu ta cần trung thực trình tự ấy, đ-ợc đánh dấu để dễ nhận biết đ-ợc gọi mẫu dò Qua lai dò với trình tự bổ sung, ta phát hiện, định vị đ-ợc trình tự hỗn hợp axít nucleic Một ph-ơng pháp sử dụng mẫu dò để phân loại đ-ợc sử dụng phổ biến ph-ơng pháp Southern Blot Southern Blot dựa khả giữ lại đoạn ADN đÃ qua xử lý enzym giới hạn màng mỏng đặc biệt (th-ờng hybond-N) Màng mỏng sau đ-ợc ngâm dung dịch chứa gen đÃ cho dạng có đánh dấu (th-ờng P 32) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 29 Nếu có mặt gen đÃ cho ADN trải màng mỏng đoạn ADN gen bắt cặp (lai) theo chế bổ sung nhận biết đ-ợc qua phóng xạ tự ghi Ph-ơng pháp sử dụng mẫu dò ADN ph-ơng pháp đơn giản để phân loại loài vectơ sốt rét Ng-ời ta đÃ phát triển mẫu dò ADN để phân loại loài phức hợp Anopheles gambiae, phức hợp có loài vectơ sốt rét châu Phi Sáu loài phức hợp đÃ đ-ợc phân loại dựa vào tính bất hợp thành viên là: Anopheles gambiae s.s, An arabiensis, An quadriannularis, An melas, An merus vµ An bwambe Hai loµi đầu vectơ truyền sốt rét phân bố rộng rÃi khắp châu Phi Những khác biệt trình tự ADN loài phức hợp đ-ợc l-u giữ ngân hàng gen cho phép tạo dòng mẫu dò ADN để phân biệt đ-ợc loài thuộc phức hợp Anopheles gambiae [63] Kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (Single strand conformational polymorphismSSCP) Kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (SSCP) để phát điểm đột biến sản phẩm phản ứng PCR đ-ợc phát triển Orita et al, (1989) [142] Điểm kỹ thuật sản phẩm PCR đ-ợc làm nóng lên tới 950C hai sợi đơn tách ra, sau làm lạnh đột ngột mặt đá, sợi đơn tự cuộn lại, mức độ cuộn phụ thuộc vào trình tự ban đầu sợi đơn Sự linh động sợi ADN biến đổi theo cấu tạo ban đầu điện di ta thu đ-ợc băng cá thể đồng hợp tử băng cá thể dị hợp tử Mặc dù SSCP công cụ hữu dụng ®Ĩ ph¸t hiƯn ®iĨm ®ét biÕn nh-ng nã Ýt đ-ợc sử dụng để phân loại, công trình nghiên cứu SSCP để phân loại Hiss ng-ời khác tiến hành năm 1994 [101] Nh- đÃ nói có công trình nghiên cứu SSCP để phân loại, Sharpe et al, (1999) đÃ miêu tả kỹ thuật để phân loại loài thuộc series Myzomia An aconitus, An varuna vµ An minimus [177] Mét -u điểm ph-ơng pháp SSCP hầu hết thông tin đoạn đ-ợc nhân đ-ợc sử dụng ®Ĩ ph©n tÝch Hayashi (1991) [96] cho r»ng cã thĨ phát tới 99% đột biến bazơ nitơ sản phẩm PCR có kích th-ớc 100-300 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 30 bp 89% đột biến sản phÈm cã kÝch th-íc 300-450 bp Do ®ã cã thĨ dễ dàng phân biệt loài nhờ ph-ơng pháp Hơn nữa, cá thể lai đ-ợc phát nhờ xuất băng trung gian (kết hợp) bố mẹ Điểm bất lợi ph-ơng pháp yêu cầu phải điện di nhuộm gel acrylamide sau phản ứng PCR Kỹ thuật nhân alen đặc biệt (Alene-specific amplification-ASA) Kỹ thuật nhân alen đặc biệt (ASA) dựa vào thực tế Taq ADN polymerase không kéo dài mồi không t-ơng thích với ADN khuôn (Ugozzoli Wallace, 1991) Do ®ã ng-êi ta cã thĨ thiÕt kÕ nh÷ng måi bắt cặp với alen định alen đặc tr-ng cho loài Vì phải thiết kế mồi đặc biệt nh- nên việc phải biết đ-ợc thông tin trình tự ADN yêu cầu tối cần thiết ph-ơng pháp Lợi ích lớn ph-ơng pháp so với ph-ơng pháp SSCP hay RFLP quy trình kỹ thuật cần phản ứng PCR đơn lẻ ta phân biệt đ-ợc loài Nếu cần sử lý số l-ợng mẫu lớn ph-ơng pháp hữu hiệu ph-ơng pháp khác Ph-ơng pháp ASA đÃ đ-ợc Walton et al, (1999) [207], Manguin et al, (2002) [129] áp dụng để nghiên cứu phức hợp loài An dirus Thái Lan Đông Nam Bằng ph-ơng pháp đÃ phân biệt đ-ợc loài phức hợp loài An dirus, dựa vào chiều dài đoạn ADN đ-ợc nhân băng điện di ta nhận biết đ-ợc cá thể lai Năm loài An dirus An dirus A, B, C, D F Các mồi đặc biệt để phân biệt loài đ-ợc thiết kế dựa trình tự đoạn ITS2 Năm 1999, Sharp et al, đÃ sử dụng ph-ơng pháp để phân biệt loài series Myzomyia Họ đÃ thiết kế mồi dự đoạn trình tự D3, kết phân biệt đ-ợc loài An minimus A C, hai loài thu đ-ợc đoạn ADN có kích th-ớc khoảng 380 bp, khác biệt loài bp Ngoài thu đ-ợc đoạn nhân có chiều dµi 275 bp ë An minimus A vµ An minimus C 75 bp, An varuna An aconitus băng không đặc hiệu có dễ nhầm lẫn với An minimus A [177] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 31 Vi vệ tinh (Microsatellite ADN-SSR) Những đoạn ngắn lặp lại ADN, th-ờng đ-ợc biết đến d-ới tên gọi vi vệ tinh (microsatellite ADN), đÃ trở thành công cụ phổ biến việc nghiên cứu di truyền Anopheles Vi vệ tinh đÃ đ-ợc chứng minh đặc biệt hữu ích cho việc nghiên cứu di truyền quần thể lập đồ di truyền Ng-ời ta quan tâm nhiều đến khả đột biến vùng rìa tạo sai lệch xác định kích th-ớc đoạn gen [208] Mặc đầu đột biến nh- sảy ra, nh-ng tần số mong đợi thấp giải pháp cho việc phân tích quần thể giải mÃ alen không v-ợt mong đợi, giải pháp phân tích l-ợng lớn locut vi vệ tinh (N khoảng 10 locut) Những nghiên cứu vi vệ tinh đÃ đ-ợc tiến hành muỗi Anopheles vùng Cựu Tân giới Châu , Rongnoparus et al, (1996, 1999) [168, 169] đÃ giải trình tự phân tích tần số alen locut An maculatus ë Nam Mü, Conn et al, (1995) [65] đÃ mô tả tính chất locut đa hình muỗi An darlingi Châu Phi, Sharakhov et al, (2001) [176] đÃ mô tả tính chất 31 locut ë An funestus ®ã cã 27 locut ®a hình Trong phân giống Anopheles, vi vệ tinh đ-ợc sử dụng nhiều để nghiên cứu An gambiae s.l Đến đÃ có 150 locut đa hình đ-ợc mô tả tính chất cho loài thành viên phức hợp này, với nỗ lực lớn tËp trung chÝnh vµo An gambiae s.s vµ An arabiensis (Zheng et al, 1996) [221] RÊt nhiỊu çc chØ thị có tính đa hình cao đÃ đ-ợc xác định lập đồ hệ gen An gambiae s.s Công cụ cho phép ng-ời nghiên cứu dễ dàng lựa chọn đ-ợc thị vi vệ tinh đại diện cho toàn hệ gen muỗi hay tập trung vào vùng định hệ gen, bao gồm việc đo l-ờng khối l-ợng vµ tÝnh chÊt cđa hƯ gen (Wang et al, 2001) Rất nhiều nhà nghiên cứu đÃ sử dụng -u điểm có tính đa hình cao dấu chẩn để nghiên cứu cấu trúc quần thể phức hợp muỗi này, mức độ địa lý rộng hẹp Mục đích công việc nµy lµ tiÕp tơc tËp trung vµo An gambiae s.s dạng NST loài [107] Bên cạnh đó, có nhiều ng-ời đÃ công bố số liệu cấu trúc di truyền, ổn định quần thể, trao đổi dòng gen quần thể An arabiensis [73] Những báo chứng minh cã sù lai chÐo gen cđa loµi nµy qua ë vùng phân bố địa lý khác Hơn nữa, số liệu tập trung để 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 32 chØ cã sù kh¸c biƯt kh¸ râ rƯt cấu trúc quần thể An gambiae Đông Tây Phi Cũng giống nh- việc xác định phát sinh chủng loại động vật có vú, vi vệ tinh gần đÃ đ-ợc chứng minh hữu dụng để xác định quan hệ chủng loại An gambiae s.s [198] Một kết đáng tin cậy nghiên cứu đÃ tìm muỗi An gambiae s.s nh-ng chúng thụ tinh lần giao phối tự nhiên xảy dạng NST khác loài Kết tái tổ hợp trình di truyền quan sát ch-a đ-ợc nghiên cứu, nh-ng phát đÃ bác bỏ kết luận đÃ đ-ợc trì lâu dài muỗi thụ tinh lần Ph-ơng pháp giải trình tự Giải trình tự hay xác định trình tự ADN trình xác định trật tự nucleotit đoạn ADN định Trình tự ADN mÃ hoá thông tin cần thiết cho thể sống tồn tái sinh Việc xác định trình hữu ích với nghiên cứu nh- nghiên cứu ứng dụng Giải trình tự gen tìm trình tự xếp nucleotit đoạn gen đ-ợc quan tâm nhằm phát đột biến gen, thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng vectơ tạo protein tái tổ hợp có giá trị cao nh- vaccin, thuốc chữa bệnh, sinh phẩm phục vụ chẩn đoán bệnh nghiên cứu khoa học Tất nghiên cứu kỹ thuật PCR phân loại hay nghiên cứu đa hình muỗi b-ớc đầu đ-ợc dựa số liệu ph-ơng pháp giải trình tự Các đoạn gen th-ờng đ-ợc quan tâm nghiên cứu giải trình tự nhiều muỗi để phục vụ cho việc thiết kế mồi đặc hiệu th-ờng IST1, IST2, COI COII nh- D3 đoạn gen ty thể gen ribosome Việc xác định đ-ợc gen có liên quan đến miễn dịch muỗi với ký sinh trùng gây bệnh vô quan trọng, việc giải trình tự toàn hệ gen muỗi truyền bệnh yêu cầu thiêt yếu Đầu năm 1998, Genoscop với Khoa Sinh học phân tử, Sinh hoá Côn trùng thuộc Viện Pasteur Pháp đÃ đề xuất ch-ơng trình giải mÃ hệ gen muỗi Anopheles Nó đ-ợc thức bắt đầu vào năm 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 33 2001 với mục tiêu giải mÃ toàn hệ gen An gambiae vectơ truyền bệnh sốt rét Châu Phi Đến tháng năm 2002 đÃ có 14,000 gen đÃ đ-ợc xác định đến việc giải mÃ hệ gen loài muỗi đÃ gần đ-ợc hoàn thiện Tháng 5/2007 thông báo tạp chí ScienDirect cho biết nhà khoa học đÃ phác thảo xong trình tự gen muỗi Aedes aegypti loài muỗi trun çc bƯnh quan träng nh- sèt dengue, dengue xt huyết, sốt vàng Qua phần trình bày trên, nhận thấy có nhiều ph-ơng pháp dùng để phân loại loài đồng hình Một ph-ơng pháp quan trọng, tin cậy đ-ợc sử dụng phổ biến di truyền tế bào Hầu hết, tất loài muỗi Anopheles có nhiễm sắc thể khổng lồ với băng phân biệt với cách rõ ràng Ph-ơng pháp cung cấp nhiều thông tin có giá trị không cho việc phân loại mà cho việc phân tích cấu trúc quần thể giúp xác định đ-ợc tồn loài mà tr-ớc ch-a đ-ợc biết nhtrong phức hợp An gambiae châu Phi (Coluzzi et al, 1979) An dirus Đông Nam (Baimai, 1988) Tuy nhiên, kỹ thuật đòi hỏi chuẩn bị mẫu vật giai đoạn có nhiễm sắc thể khổng lồ, thực tế chúng tồn muỗi bán chửa bọ gậy tuổi khả áp dụng ph-ơng pháp diện rộng khó khăn Ph-ơng pháp sinh học phân tử phân tích allozym hay ADN có thuận lợi chúng sử dụng mẫu vật tất giai đoạn phát triển nh- giới tính khác Mặc dù ph-ơng pháp điện di allozym đÃ đ-ợc sử dụng thành công số phức hợp loài nh- An gambiae (Miles, 1978) vµ An dirus (Green et al, 1992), mÉu vËt sử dụng cho điện di phải giữ t-ơi bảo quản điều kiện lạnh sau thu thập Ph-ơng pháp điện di đ-ợc thay ph-ơng pháp phân loại dựa cấu trúc ADN, với ph-ơng pháp điều kiện bảo quản mẫu yêu cầu nghiêm ngặt hơn, mẫu vật cần giữ khô bảo quản cồn Một ph-ơng pháp nghiên cứu ADN đ-ợc sử dụng phân tích trình tự lặp lại, đoạn có số l-ợng trình tự khác loài khác sử dụng đoạn làm mẫu dò để thử nghiệm lai ADN Ph-ơng pháp có số nh-ợc nh- xảy việc lai chéo ADN (DNA cross-hybridzation), hay thay đổi số l-ợng lặp lại loài 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 34 địa lý, nh-ng -u điểm ph-ơng pháp giá thành rẻ, sử dụng để phân loại điều kiện thực địa Đây ph-ơng pháp đÃ đ-ợc áp dụng thành công phức hợp loài An gambiae [99, 100] Gần hơn, với phát triển kỹ thuật PCR có độ tin cậy, khả nhậy cao nên ph-ơng pháp phân loại đ-ợc dựa kỹ thuật Độ nhạy phản ứng PCR cao ta cần l-ợng mẫu nhỏ ví dụ chân muỗi để phân loại [175, 207], phần lại mẫu vật sử dụng cho ph-ơng pháp phân tích khác Do mức độ biến đổi cao nên, vi vệ tinh dấu hiệu tốt để phân biệt loài có quan hệ gần gũi với Tuy nhiên, biến đổi đa dạng, cá thể khác có biểu khác nhau, khó phân tích kết Không giống nh- vi vệ tinh, đa hình đoạn nhân ngẫu nhiên (RAPD) có -u điểm lớn có thĨ sư dơng thµnh mét hƯ thèng vµ cho chóng ta thông tin hệ gen [214, 215], đÃ áp dụng thành công ph-ơng pháp để phân loại phức hợp An gambiae Các đoạn đ-ợc nhân phản ứng RAPD th-ờng vùng có độ lặp lại biến đổi nhiều hệ gen Điều không thuận lợi cho việc phân loại biến đổi biến đổi loài, nh-ng chúng lại thích hợp để phân loại loài có quan hệ gần gũi với Trong phân loại phức hợp An gambiae, thị RAPD phân biệt đ-ợc muỗi có dạng nhiễm sắc thể khác nhau, kiểu hình sinh th¸i (ecophenotype) ë An gambiae sensu stricto [78] Nh-ng thực tế điều ý nghĩa lớn Việc sử dụng thị phù hợp để phân loại loài điều quan trọng, Collins Paskewitz (1996) [62] đÃ đề nghị sử dụng ADN ribosome nh- thị để phân loại loài Anopheles đồng hình Ngày ADN ribosome đ-ợc sử dụng nhiều để phân loại loài đồng hình muỗi, khắc phục đ-ợc tất nh-ợc điểm thị đ-ợc sử dụng tr-ớc Cùng với phát triển kỹ thuật công nghệ sinh học để phân loại loài đồng hình, ch-ơng trình, phần mềm tin học đóng góp vai trò quan trọng nghiên cứu phân loại Nhờ có ch-ơng trình này, việc phân loại trở nên nhanh chóng, xác dễ dàng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 35 Tóm lại, để phân loại đ-ợc loài đồng hình không nên sử dụng ph-ơng pháp riêng biệt nào, nên kết hợp nhiều ph-ơng pháp tốt Khi phân tích mẫu vật nhiều ph-ơng pháp ta thu đ-ợc khối l-ợng thông tin lớn, kết phân tích đáng tin cậy 1.3 Những nghiên cứu vai trò truyền bệnh tính -a vật chủ vectơ 1.3.1 Những nghiên cứu vai trò truyền bệnh sốt rét muỗi Để chứng minh vai trò truyền bệnh vectơ ng-ời ta phải chứng minh đ-ợc chúng có mang vật gây bệnh Có nhiều ph-ơng pháp để chứng minh điều nh- mổ muỗi để chứng minh có vật ký sinh gây nhiễm thực nghiệm Ra đời từ năm 1901, sau Ronal Ross đÃ phát thoa trùng sốt rét muỗi Anopheles đ-ợc coi ph-ơng pháp để phát ký sinh trùng sốt rét muỗi, nhiên, kü tht mỉ tun n-íc bät ph¸t hiƯn thoa trïng t-ơi có số nh-ợc điểm nh- phải sử dụng mẫu vật t-ơi, không phân biệt đ-ợc xác loài ký sinh trùng sốt rét muỗi, không xác định đ-ợc tr-ờng hợp nhiễm phối hợp hai hay nhiều loại ký sinh trùng Để khắc phục nh-ợc điểm gần đÃ áp dụng kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA) phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để xác định ký sinh trùng sốt rét muỗi 1.3.2 Xác định tính -a vật chủ vectơ Ph-ơng pháp mổ muỗi tìm ký sinh trùng sốt rét muỗi lúc dễ tiến hành Một biện pháp để chứng minh đ-ợc loài muỗi có truyền bệnh hay không, phải chứng minh đ-ợc muỗi có hút máu ng-ời hay không Nếu xác định đ-ợc loài muỗi có tính -a thích vật chủ ng-ời có chứng để nghĩ tới loài muỗi có khả truyền bệnh cho ng-ời nhiều loài khác không thích đốt máu ng-ời Để xác định máu vật chủ muỗi, sử dụng ph-ơng pháp truyền thống, đơn giản nh- ph-ơng pháp miễn dịch, xác định kết hợp kháng nguyên kháng thể máu vật chủ thạch Năm 1986, Bukort cộng đÃ áp 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 36 dụng kỹ thuật ELISA để xác định máu vật chủ muỗi Gần với phát triển khoa học kỹ thuật, phản ứng PCR đa mồi đÃ đ-ợc sử dụng để xác định máu vật chủ 1.4 Những nghiên cứu nhóm loài An maculatus Loài muỗi Anopheles (Cellia) maculatus đ-ợc Theobald phát Hồng Kông Trung Quốc vào năm 1901 [191] Sau loạt loài khác đ-ợc phát ấn Độ, Đài Loan đ-ợc coi tên đồng vật Anopheles maculatus [22, 156, 157, 160] Đây loài muỗi phân bố rộng rÃi vùng Đông ph-ơng Từ năm 1901 đến năm 1925, nhóm loài Anopheles maculatus đÃ có loài đ-ợc đặt tên [18] Năm 1986, Rattanarithikul Green đÃ phát thêm loài Thái Lan Năm 1990, hai loài Philippine đ-ợc Rattanarithikul Harbach đặt tên An greeni An dispar Nh- nay, phức hợp An maculatus gồm 12 loài thành viên: An maculatus Theobald, 1901; An willmori (James, 1903), An indicus (Theobald, 1907); An dudgeonii (Theobald, 1907); An pseudowillmori (Theobald, 1910); An maculosa (James and Liston, 1911); An dravidicus Christophers, 1924; An hanabusai Yamada, 1925; An sawadwongporni Rattanarithikul and Green , 1986; An notanandai Rattanarithikul and Green, 1986; An greeni Rattanarithikul and Harbach, 1990 vµ An dispar Rattanarithikul and Harbach, 1990 Nhiều thành viên nhóm đÃ đ-ợc xác định có vai trò truyền bệnh ë Malaysia, Th¸i Lan, Nepal [74, 88, 89, 102, 122, 151, 157] Việt Nam, tr-ớc đây, muỗi Anopheles maculatus đ-ợc xác định loài đơn, phân bố rộng rÃi vùng rừng núi toàn quốc Những nghiên cứu gần cho thấy phức hợp loài gồm 10 loài thành viên [6-10, 20] Toumanoff, 1936 đÃ mỉ An maculatus thÊy nhiƠm ký sinh trïng sèt rÐt [196, 197 ] Cho đến đ-ợc coi vectơ truyền bệnh thứ yếu n-ớc ta Mặc dù năm gần đây, nhiều ph-ơng pháp nghiên cứu, có kỹ thuật sinh học phân tử đ-ợc ứng dụng để nghiên cứu xác định vị trí phân 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37 loại, phân bố, sinh học, vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài nh-ng nhiều thắc mắc ch-a đ-ợc giải thấu đáo 1.4.1 Những nghiên cứu n-ớc Từ loài muỗi Anopheles maculatus đến nhóm loài An maculatus Năm 1901, chuyên khảo muỗi Culicidae, phân tích mẫu muỗi tr-ởng thành (đực, cái) thu thập từ Hồng Công, Theobald đÃ phát loài muỗi Anopheles maculatus Theobald, 1901 [191] MÃi đến năm 1931, Christophers bổ sung đặc điểm trứng loài muỗi đến năm 1933, ông đÃ mô tả đầy đủ đặc điểm trứng, bọ gậy, muỗi tr-ởng thành (đực, cái) [55, 56] Về sau Reid đÃ bổ sung đầy đủ đặc điểm pha phát triĨn cđa An maculatus [160, 161] Sau nµy, mét sè loài khác đÃ đ-ợc phát nh- An willmori (Jame, 1903); An.indicus (Theobald, 1907); An.dugeonii (Theobald, 1907); An pseudowillmori (Theobald 1910); An.maculosa (James and Liston,1911); An dravidicus Christophers, 1924 vµ An.hanabusai Yamada, 1925 Hầu hết loài muỗi đ-ợc mô tả đặc điểm muỗi tr-ởng thành cách tóm tắt chúng đ-ợc xếp vào loài phụ hc biÕn thĨ cđa An maculatus (Knight, Ston, 1977; Reid, 1968) [114, 160] Năm 1986, Rattanarithikul Green nghiên cứu muỗi Thái Lan đÃ mô tả hai loài An notanandai An sawadwongporni [156] Muỗi tr-ởng thành trứng loài thuộc nhóm loài An maculatus đ-ợc hai tác giả mô tả công trình Năm 1990, Rattanarithikul Harbach mô tả thêm hai loài cho nhãm loµi An maculatus ë Philippine lµ An greeni An dispar nâng tổng số loài đÃ định tên nhóm loài lên 12 loài [150] Vấn đề xác định thành viên nhóm loài An maculatus Hầu hết nhà nghiên cứu phân loại động vật nói chung phân loại thành viên nhóm loài An maculatus nói riêng tuân theo quy định Luật danh pháp động vật quốc tế [104] Những Nguyên tắc phân loại động vật tuân thủ thống với với khái niệm loài sinh học, loài đồng hình, đơn vị phân loại nh- nêu tài liệu Mayr [25, 26] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 38 - Định loại thành viên nhóm loài An maculatus dựa dấu hiệu hình thái Dấu hiệu hình thái kiểu dấu hiệu dễ nhận biết đ-ợc sử dụng phân loại sinh vật muỗi, bốn pha phát triển (trứng, bọ gậy, quăng muỗi tr-ởng thành) dựa vào dấu hiệu hình thái để phân loại chúng Riêng với nhóm loài An maculatus, mô tả ban đầu thành viên nhóm tr-ớc th-ờng dựa vào dấu hiệu muỗi tr-ởng thành [55, 56, 160, 161] Ngay gần (1986), mô tả hai loài muỗi Thái Lan: An notanandai vµ An sawadwongporni, Rattanarithikul vµ Green cịng chØ mô tả hai pha muỗi tr-ởng thành trứng [156] Mô tả hai loài An.dispar An.greeni Philippine Rattanarithikul Harbach (1990) nói mô tả đầy đủ tác giả công bố loài cho nhóm kể từ năm 1901 đến [157] - Định loại dựa vào dấu hiệu di truyền tế bào điện di enzym Những ng-ời nghiên cứu di truyền tế bào để định loại thành viên nhóm loài An maculatus Green Baimai [32, 91] Năm 1993, Baimai et al, [32] đÃ mô tả đầy đủ kiểu nhân (Karyotype) thành viên nhóm loài An maculatus vùng Đông Nam Dựa vào đặc điểm nhiễm sắc thể giới tính, tác giả đÃ xếp thành nhãm: Nhãm I gåm cã An sawadwongporni, An dravidicus vµ An pseudowillmori có nhiễm sắc thể giới tính tâm cận mút tâm mút Nhóm II có An notanandai có cấu trúc nhiễm sắc thể X đồng với phần dị nhiễm sắc, tâm động nhỏ Bốn thành viên lại An.dispar, An maculatus, An willmori vµ An.greeni thc vỊ nhãm III, cã cÊu tróc nhiễm sắc thể giới tính tâm cận mút, tâm cận tâm giữa, An maculatus có dạng B, E, K [33] Công trình nghiên cứu điện di enzym để định loại thành viên nhóm loài An maculatus không nhiều Điển hình nghiên cứu Tan et al, 1986 [187] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 39 Định loại dựa phân tích ADN Những năm gần đây, đÃ có số công trình nghiên cứu sử dụng dấu hiệu ADN để định loại thành viên nhóm loài An maculatus Có thể kể đến số công trình Foley et al, (1996) [82] Torres et al, (2000) [195] nghiªn cøu hai loài muỗi An dispar An greeni Philippine [82, 195] Li Shi- Zhu et al, (2003) [121]; Ma Ya- Jun et al, (2002) [127] định loại thành viên nhóm loài An maculatus Trung Quốc phân tích ADN Năm 2007, nghiên cứu Walton, C et al, sư dơng dÊu hiƯu vïng ITS2 cđa rADN để định loại thành viên nhóm An maculatus [209] Nghiªn cøu cđa Ma Ya-Jun et al, (2006) [127], đÃ sử dụng dấu hiệu dựa kết giải trình tự đoạn ITS2, D3, COI để thành lập chủng loại phát sinh loài nhóm loài An maculatus Phân bố thành viên nhóm loài An maculatus Nhóm loài An maculatus phân bố rộng rÃi vùng Đông Ph-ơng từ ấn Độ, qua Miến Điện, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Nam Trung Quốc; phía Đông Bắc đến Đài Loan, Trung Quốc; phía Tây Nam đến bán đảo MÃ Lai, phía Đông đến quần đảo Philippine [20, 156, 157, 160] Một số loµi nh- An maculatus, An willmori, An pseudowillmori, An sawadwongporni, An dravidicus có mặt nhiều nơi vùng đất liền Có loài thấy số địa ph-ơng định nh- An.dispar, An.greeni phát đ-ợc Philippine [157]; An.indicus, An.dudgeonii, An.maculosa thấy có số địa điểm thu mẫu ấn Độ [160, 161] An.hanabusai đ-ợc Yamada phát năm 1925 đảo Đài Loan, Trung Quốc [156] Đặc điểm sinh học thành viên nhóm loài An maculatus Cho đến năm gần đây, việc phân loại thành viên nhóm loài An maculatus đ-ợc tiến hành mạnh mẽ, kết nghiên cứu sinh học loài An maculatus s.l (theo nghĩa rộng) đặc điểm thành viên nhóm Theo tổng kết Lindsay et al, 2004, muỗi An maculatus tất cao nguyên Malaysia thích đốt máu ng-ời máu trâu bò chuồng trâu bò sát cạnh nhà Bọ gậy chúng tìm thấy suối, mạch n-ớc, suối nhỏ có ánh 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 40 sáng rọi trực tiếp không trực tiếp nơi nh- vậy, An maculatus vectơ sốt rét đảo Borneo nơi khác, An maculatus cịng cã ỉ bä gËy gièng nh- ë vïng cao nguyên Malaysia nh-ng muỗi -a công trâu bò đốt ng-ời vectơ sốt rét [122] Năm 1988, Loong et al, [123] nghiên cứu hun Pakchong tØnh Nakhon Ratchasima vµ hun Sadao, tØnh Songkla Thái Lan từ tháng năm 1984 đến tháng năm 1985 cho thấy: Pakchong, An maculatus A chiÕm -u thÕ nhÊt, tiÕp theo lµ An maculatus B, E thấp An maculatus C Mật độ loài A dạng F loài B cao vào thời gian từ tháng đến tháng 11, đỉnh cao tháng 10 Muỗi đốt ng-ời suốt đêm nh-ng chủ yÕu tõ chËp tèi ®Õn 21 giê ë Sadao, chØ bắt đ-ợc dạng F loài B mật độ cao vào khoảng thời gian từ tháng giêng đến tháng Việc đốt máu mạnh vào tháng mùa m-a liên quan đến ẩm độ nhiệt độ Tất loài muỗi phức hợp An maculatus thích đốt máu súc vật đốt máu ng-ời th-ờng đốt máu ng-ời nhà nhà [123, 124] Trung Quốc, theo Lục Bảo Lân (1997), phức hợp loµi An maculatus cã loµi lµ: An maculatus, An dravidicus, An pseudowillmori, An sawadwongporni, An willmori Các loài chủ yếu phân bố khu Hoa Nam (Vân Nam, Tứ Xuyên, Quảng Đông, Quảng Tây) Muỗi chủ yếu đốt máu súc vật Bọ gâỵ sống ao n-ớc nhỏ, hốc n-ớc, vũng n-ớc mạch, lòng sông suối cạn có tích n-ớc [125] Vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài An maculatus Anopheles maculatus s.l từ lâu đÃ đ-ợc coi vectơ sốt rét quan trọng bán đảo Malaysia (Reid, 1968) [160, 161] Những nghiên cứu hình thái Loong et al, 1988, cđa Baimai et al, 1993 vỊ di trun tÕ bào đÃ cho thấy An maculatus bán đảo Malaysia An maculatus dạng E [32, 123] Thái Lan, theo nghiên cứu Upatham ng-ời khác, 1988, có 0,23% muỗi nhóm An maculatus có nang trùng dày tổng số 4430 muỗi mổ Tuy nhiên, không phát tr-ờng hợp có thoa trùng tổng số 4472 muỗi đ-ợc mổ, thời điểm đó, thành viên nhóm loài ch-a đ-ợc coi vectơ sốt rét Thái Lan [12, 63, 132] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 41 Năm 1991, kỹ thuật ELISA, Green et al, đÃ phát thấy 1/5 muỗi An pseudowillmori bắt đ-ợc ph-ơng pháp mồi ng-ời Mae- Tao- Keo, miền Bắc Thái Lan d-ơng tính với kháng thể đơn dòng P falciparum [24, 90] Cũng kỹ thuật ELISA, năm 1996, Rattanarithikul et al, đÃ báo cáo kết nghiên cứu làng phía Nam Thái Lan giai đoạn 1992- 1993 cho thấy muỗi truyền bệnh chủ yếu vùng bán đảo phía Nam An minimus, vectơ thứ yếu An maculatus, An sawadwongporni An dirus Riêng làng Khen Kon tỷ lệ nhiƠm chung P.falciparum vµ P.vivax ë An minimus lµ 0,6%, An sawadwongporni lµ 1,1% vµ cđa An maculatus lµ 1,5% [159] Muỗi An maculatus s.l đÃ đ-ợc ghi nhận nhiễm KST Plamodium Assam tiểu lục địa ấn Độ, Nepal, Miến Điện (Rao, 1984) [155] Gần đây, có thông báo cộng đồng châu Âu việc An maculatus s.l vectơ sốt rét Lào [74, 122] Trong loài muỗi thuộc phức hợp An maculatus đ-ợc phát hiƯn t¹i Trung Qc chØ cã An pseudowillmori cã thĨ vectơ sốt rét vùng núi, bán sơn địa ®é cao 1600m trë xng cđa tØnh V©n Nam (Lơc Bảo Lân, 1997) [125] 1.4.2 Nghiên cứu n-ớc Những nghiên cứu liên quan đến sinh học, sinh thái học muỗi An maculatus Nghiên cứu Toumanoff, 1936 Bắc Kỳ Trung Kỳ cho thấy muỗi An maculatus bắt đ-ợc quanh năm nh-ng có đỉnh cao vào tháng tháng 10, tỉ lệ muỗi đốt máu ng-ời 5% Bọ gậy bắt đ-ợc m-ơng n-ớc ruộng bậc thang, mạch n-ớc, hốc đá bể xi măng công trình xây dựng cầu ven sông [197] Nghiên cứu Nguyễn Đức Mạnh, 1988 Tây Nguyên cho thấy: An maculatus loài phân bố rộng Nó vừa loài -u rõng rËm, võa lµ loµi -u thÕ cđa vïng bìa rừng phân bố mở rộng đến vùng trảng cỏ, savan Tây Nguyên vùng bìa rừng, trảng cỏ, savan khu dân c- có súc vật, loài muỗi đốt máu súc vật chủ yếu Tỷ lệ muỗi đốt ng-ời so với muỗi bắt đ-ợc chuồng gia súc 1/ 2,38 Muỗi đốt máu ng-ời trời gấp 24,66 lần so với muỗi mồi ng-ời nhà Nh-ng vùng rừng sâu, súc vật, muỗi An maculatus -a đốt 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 42 máu ng-ời An maculatus loài muỗi hoang dại, trú ẩn tiêu máu nhà chủ yếu An maculatus phát triển mạnh vào mùa m-a Bọ gậy bắt đ-ợc suối ven rừng, có ánh sáng nhiều, bắt đ-ợc ruộng lúa, giếng ven suối [17] Những nghiên cứu vai trò truyền bệnh An maculatus Năm 1936, Toumanoff đÃ tổng kết kết mổ muỗi 34 điểm miền Bắc Việt Nam cho thấy tổng số 90 An maculatus đ-ợc mổ có muỗi có oocysts (1,11%) muỗi có sporozoites (1,11%), số muỗi mổ Lào Cai có muỗi có oocysts (20%) số 42 muỗi mổ Vĩnh Tuy, Tuyên Quang có muỗi có Sporozoites (0,38%) [196, 197] Năm 1966, Đặng Văn Ngữ đÃ mổ An maculatus Vĩnh Linh thấy muỗi nhiễm KSTSR 1,9% Tây Nguyên, Parish (1969) cho rằng, sè vïng nã cã thĨ trun sèt rÐt cho qu©n đội Mỹ (theo Nguyễn Đức Mạnh, 1988) [17] Bằng kỹ thuật ELISA, năm 2004, Đoàn Hạnh Nhân et al, đÃ tổng kết kết nghiên cứu Khánh Vĩnh, Khánh Hoà thấy xÃ Khánh Nam có 0,08% muỗi An maculatus nhiễm KSTSR (6/676) Trong tr-ờng hợp d-ơng tính kháng nguyên bề mặt thoa trùng có P.falciparum, P.vivax phối hợp P.falciparum + P.vivax Khánh Phú có 1/150 (0,7%) muỗi An maculatus d-ơng tính với kháng thể đơn dòng P.falciparum [27] Nghiên cứu gần nhất, năm 2006-2007 khoa Côn trùng Viện Sèt rÐt – Ký sinh trïng – C«n trïng Trung -ơng muỗi An maculatus có tỷ lệ d-ơng tính cao thử nghiệm ELISA Ninh Thuận Cho đến nay, muỗi An maculatus s.l đ-ợc xác định vectơ truyền sốt rét thứ yếu ë ViÖt Nam [6-10, 20 ] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 43 Ch-ơng : Đối t-ợng ph-ơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối t-ợng nghiên cứu Đối t-ợng nghiên cứu loài muỗi thuộc nhóm loài Anopheles maculatus có mặt ë ViƯt Nam Cho ®Õn ë ViƯt Nam nhãm loài đÃ xác định đ-ợc loài đÃ định tên là: An maculatus, An willmori, An pseudowillmori, An notanandai, An dravidicus An sawadwongporni Các loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus có đặc điểm chung nh-: bờ tr-ớc cánh có điểm đen, L6 có 23 điểm đen (th-ờng điểm đen), đùi cẳng chân có đốm vẩy trắng, đốt bàn chân sau hoàn toàn trắng Bọ gậy với lông môi lông môi chia nhánh nhỏ hai bên; c«ng thøc l«ng bê ngùc: kÐp, kÐp, kÐp; l«ng đ-ờng nối th-ờng đơn; lông số đốt bụng IV-VI có 5-6 nhánh Hệ thống phân loại loài nhsau: - Ngành chân khớp: Anthropoda - Lớp côn trùng: Insecta - Bộ hai cánh: Diptera - Họ muỗi: Culicidae - Phân họ muỗi sốt rét: Anophelinae - Giống: Anopheles - Phân giống: Cellia - Nhóm loài: Anopheles maculatus * Anopheles (Cellia) maculatus Theobald, 1901 (theo nghÜa réng) 2.2 Thời gian nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu đ-ợc tiến hành từ tháng 10- 2001 đến tháng 12- 2006, mẫu vật đ-ợc thu thập toàn quốc 2.3 Ph-ơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu đ-ợc tiến hành theo ph-ơng pháp quan sát, mô tả thực địa phân tích mẫu vật phòng thí nghiệm 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 44 Hoạt động thực địa Thu thập, định loại sơ bộ, xử lý sơ bộ, bảo quản, vận chuyển muỗi phòng thí nghiệm (Muỗi, quăng, bọ gậy, ổ trứng) Hoạt động phòng thí nghiệm Nuôi cung cấp tiêu bản, vật mẫu cho thí nghiệm phòng thí nghiệm Di truyền tế bào Định loại hình thái Trứng Bọ gậy tuổi Bọ gậy Quăng Tr-ởng thành Điện di enzym Bọ gậy Tr-ởng thành Phân tích ADN Bọ gậy Tr-ởng thành Đa hình di truyền xác định vị trí phân loại Bảng định loại Phân bố Vai trò truyền bệnh - Sinh học - Sinh thái học - Đề xuất biện pháp phòng chống Hình 2.1: Thiết kế nghiên cứu đa hình di truyền vai trò truyền bệnh nhóm loài An maculatus Việt Nam z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 45 2.3.1 Ph-ơng pháp thu thập xử lý mẫu vật thực địa Muỗi đ-ợc thu thập ph-ơng pháp chuẩn Tổ chức Y tÕ ThÕ giíi vµ ViƯn Sèt rÐt, Ký sinh trïng, Côn trùng (1975, 1987) [35, 190] Mồi ng-ời (trong nhà, nhà) từ tối đến sáng hôm sau Soi chuồng gia súc ban đêm từ đến 11 tối Bẫy đèn ban đêm từ tối đến sáng hôm sau Soi nhà ban ngày từ đến 11 Mẫu vật đ-ợc định loại hình thái b-ớc đầu thực địa Những muỗi no máu đ-ợc giữ cho đẻ trứng nuôi theo dòng gia đình Muỗi sống đ-ợc bảo quản dung dịch nitơ lỏng đem phòng thí nghiệm để phân tích tiếp (điện di izozym xác định vị trí phân loại) Các mẫu vật bị chết, đặc biệt mẫu vật thu thập ph-ơng pháp mồi ng-ời, bẫy đèn nhà, soi nhà ban ngày đ-ợc bảo quản ống nghiệm nhỏ có silicagen hút ẩm để mang phòng thí nghiệm làm ELISA xác định thoa trùng muỗi xác định tính -a vật chủ Bọ gậy đ-ợc thu thập từ loại ổ n-ớc đ-ợc giữ sống nuôi phòng thí nghiệm ngâm cồn Ethanol 90% để phân tích hình thái 2.3.2 Nghiên cứu phòng thí nghiệm - Nuôi muỗi Việc nuôi muỗi phòng thí nghiệm nhằm mục đích có tiêu đồng từ trứng đến tr-ởng thành để phân tích dấu hiệu hình thái phân tích dấu hiệu di truyền theo dòng gia đình Muỗi no máu từ thực địa đ-ợc chuyển phòng thí nghiệm cho đẻ trứng nuôi riêng theo lô Mỗi lô gia đình có ký hiệu riêng để tránh nhầm lẫn Tuỳ mục đích khác mà mẫu vật đ-ợc xử lý bảo quản theo ph-ơng pháp riêng Tất lô mẫu vật nuôi theo gia đình đ-ợc làm tiêu đồng giai đoạn trứng, bọ gậy, quăng muỗi tr-ởng thành Ngoài bọ gậy đ-ợc bắt từ ổ tự nhiên đ-ợc chuyển để nuôi cho nở thành muỗi, để phân loại (xác bọ gậy, quăng đ-ợc giữ lại để phân tích dấu hiệu hình thái) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 46 - Phân loại muỗi dựa dấu hiệu hình thái Dấu hiệu hình thái từ pha trứng đến pha tr-ởng thành đÃ đ-ợc phân tích Ngoài phân tích dấu hiệu hình thái quan sinh dục muỗi đực Mỗi loài phân tích 20 tiêu đồng 10 tiêu quan sinh dục đực Các dấu hiệu hình thái đ-ợc sử dụng phân loại muỗi Anopheles dùa vµo tµi liƯu cđa R.E Harbach, K Knight 1980 R.C Wilkerson, E.L Peyton, 1990 Phân loại An maculatus tham khảo tài liệu R.Rattanarithikul C A Green, 1986 [156], R.Rattanarithikul vµ R.E Harbach, 1990 [157], Rattanarithikul et al, 2006 [158], J A Reid, 1968 [161], Lôc Bảo Lân, 1997 [125] - Phân tích đặc điểm di truyền tế bào Làm tiêu nhiễm sắc thể tõ tÕ bµo n·o bä gËy ti theo ph-ơng pháp: + Ph-ơng pháp 1: Các b-ớc tiến hành dựa ph-ơng pháp V Baimai (1997) có sửa đổi: Bắt bọ gậy tuổi 4, thấm khô n-ớc, ngâm vào dung dịch cochicine 0,4% vòng giờ, vớt ra, thấm khô, cho vào n-ớc cất Bắt bọ gậy ra, thấm khô, cho lên lam kính đÃ có sẵn 1-2 giọt carnoy 1/20 Quá trình mổ thực d-ới kính lúp VE3 Dùng kim mổ cắt đầu bọ gậy, ấn nhẹ cho nÃo bung ra, tách riêng thuỳ n·o lín Chun th n·o lín sang lam kÝnh lâm chøa tõ 1-2 giät natri citrat 1%, ng©m khoảng 8-10 phút Dùng micropipet hút hết dung dịch natri citrat 1% (lúc thuỳ nÃo đÃ tr-ơng phồng, trắng, trong) Thay vào dung dịch axit acetic 60% Dùng micropipet đÃ tráng silicon để làm tan khối nÃo axit acetic Các lam kính đ-ợc đặt sẵn sấy (ở 37oC) Dung dịch lam lõm đ-ợc chuyển lên lam kính Dàn mỏng dung dịch, đợi khô, lấy ủ tiêu vòng 24h 37oC Sau nhuộm giemsa 28% từ 1,5-2h tối Tiêu nhuộm xong, rửa n-ớc cất Để khô tự nhiên đ-ợc tiến hành quan sát kính hiển vi độ phóng đại x10, x20, x40 x100 Các tiêu đẹp đ-ợc lựa chọn để phân tích chụp ảnh ảnh đ-ợc chụp d-ới vật kính dầu với độ phóng đại x100 (độ phóng đại 500 lần) + Ph-ơng pháp 2: Dựa theo ph-ơng pháp Frank (1962) có cải tiến 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 47 B-ớc giống ph-ơng pháp Chuyển thuỳ nÃo lớn lên lamen tráng silicon đÃ có sẵn 1-2 giọt natri citrat 1% Ngâm 8-10 Dïng micropipet hót hÕt dung dÞch natri citrat 1% ra, thay vào axit acetic 60%, ngâm phút Sau hút hết dung dịch axit acetic 60% Nhm b»ng ocein Phđ lam lên lamen Đặt lam vào giấy thấm, dùng ngón tay ép tiêu bản, dùng đầu tẩy bút chì gõ Tiêu đọc d-ới kính hiển vi ë vËt kÝnh x10, x 20, x40 vµ x 100 Các tiêu đẹp dùng để phân tích chụp ảnh d-ới vật kính dầu x100 (độ phóng đại 500 lần) Mỗi loài tiến hành làm 30 tiêu nhiễm sắc thể, 15 mẫu vật đực 15 mẫu vật + Phân tích tiêu nhiễm sắc thể: Phân tích đặc điểm tiêu nhiễm sắc thể nguyên phân theo Baimai et al, 1993 [40] Phân tích đo đạc nhiễm sắc thể đ-ợc thực trực tiếp kính hiển vi Olympus độ phóng đại 15x40 nhờ trắc vi vật kính trắc vi thị kính Các nhiễm sắc thể giai đoạn trung kì đ-ợc đo đạc, chiều dài nhiễm sắc thể đ-ợc tính micromet (m) Dựa vào phép toán thống kê để tính giá trị trung bình nhiễm sắc thể tính độ lệch chuẩn (s) theo c«ng thøc: x1+x2+ + xn X= n n x)2 ( xi   n i 1 n S2 = Với Xi : số đo nhiễm sắc thể; i=1, n X: độ dài trung bình N: số nhiễm sắc thể đÃ đo S: độ lệch chuẩn Tính chiều dài t-ơng đối theo công thức: Chiều dài tuyệt đối NST X Chiều dài t-ơng đối NST X = Tổng số chiều dài tuyệt đối NST X + II + III 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 48 - Điện di enzym phân tích kết điện di Điện di enzym đối t-ợng nghiên cứu trªn gel cellullose acetate (Titan III, Helana Laboratories, U.K) theo ph-ơng pháp Smith et al, 1996 Các hệ enzym đ-ợc nghiên cứu là: - Lactate dehydrogenase (LDH, E.C: 1.1.1.27) - Malate dehydrogenase (MDH, E.C: 1.1.1.37) - Glucose phosphate isomerase (GPI, E.C: 5.3.1.9) - Phosphate glucomutase (PGM, E.C: 2.7.5.1) - Mannose phosphate isomerase (MPI, E.C: 5.3.1.8) - Isocitrate dehydrogenase (IDH, E.C: 1.1.1.42) - 6- Phosphogluconate dehydrogenase (6- PGD, E.C: 1.1.1.44) - Glucose phosphate dehydrogenase (- GPD, E.C: 1.1.1.49) - Glutamate oxaloacetate transminase (GOT, E.C: 2.6.1.1) - Octanol dehydrogenase (ODH, E.C: 1.1.1.73) - Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH, E.C: 1.1.1.49) Tiến hành điện di: sử dụng điện di HELENA tiến hành điều kiện c-ờng độ dòng điện 80mA Thời gian điện di tuỳ thuộc vào loại enzym Nhuộm, phân biệt enzym: Sau điện di gel khác thu đ-ợc tiểu phần điện di không mầu Muốn nhận biết phải dùng ph-ơng pháp nhuộm đặc hiệu loại enzym Thông th-ờng, mn nhËn biÕt mét enzym cịng nh- mét izozym nµo ta cần có chất tương ứng, coenzym như: NAD, NADP, NADH, chất tạo mầu NBT, MTT, Fast Blue, Fast Garnet chất truyền điện tử PMS Các dung dịch đệm thích hợp cho nhuộm mầu tuỳ theo enzym t-ơng ứng Đọc kết điện di đặt tên cho locut, elen kiểm soát phổ hoạt tính enzym Cách đọc kết điện di dựa nguyên tắc sau: Giả thiết gen- chuỗi polypeptit: Cơ chế phân tử xuất hiện t-ợng đa hình enzym điện di Hiện t-ợng đa hình di truyền có đ-ợc 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 49 nhiều nguyên nhân có chất di truyền không di truyền Trong nguyên nhân có chất di truyền gây nên t-ợng đa hình th-ờng gặp là: Sản phẩm gen hình thành dạng lai invivo Sản phẩm gen không hình thành dạng lai invivo Các sản phẩm gen hình thành hay không hình thành dạng invivo gen không alen gây nên Có nhiều nghiên cứu cấu trúc phân tử enzym thể khác điện di đồ Cách đọc điện di đồ: Tr-ờng hợp enzym đ-ợc kiểm soát gen, tr-ờng hợp việc xác định tần số alen dễ dàng Dựa vào số cấu tử quan sát đ-ợc, kiểu hình điện di quan sát thấy trình nghiên cứu để đ-a mô hình di truyền alen sau đ-ợc kiểm tra định luật Hardy-Weinberg Tr-ờng hợp enzym đ-ợc kiểm soát nhiều gen việc đọc điện di đồ phức tạp dựa vào số đặc điểm sau: Dựa vào tốc độ chuyển động t-ơng đối, c-ờng độ bắt màu băng tính chuyển hoá chất vùng có hoạt tính enzym Dựa vào phổ điện di sau nhuộm để xác định số gen kiểm soát enzym Sau xác định số alen locut gen, tính tần số alen kiểm tra chuẩn bình ph-ơng (2) Ta tóm tắt kiểu điện di đồ chính: Phân tử enzym có cấu trúc monomer (1 chuỗi polypeptit tạo nên ph©n tư) mét locut gen cã hai alen đồng trội cá thể đồng hợp tử có băng cá thể dị hợp tử có hai băng ®iƯn di + + + + -+ + th¸i điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định alen Hình 2.2: Hình đồng trội 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 50 Theo cách nhận biết t-ơng tự, locut gen có alen trở lên số tổ hợp tăng lên t-ơng ứng Ví dụ locut gen cã alen th× sÏ cã dạng đồng hợp dạng dị hợp + + _+ Hình 2.3: Hình thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định alen đồng trội Đối với phân tử enzym có cấu trúc dimer thể điện di đồ dạng băng thể đồng hợp tử băng cá thể dị hợp tử Trong ba băng băng có mức độ di chuyển trung gian kết kết hợp hai chuỗi polypeptit hai alen ®ång tréi cđa mét locut gen + + _+ Hình 2.4: Hình thái điện di enzym có cấu trúc dimer đ-ợc quy định alen đồng trội Tr-ờng hợp phân tử enzym có cấu trúc tetramer (4 chuỗi polypeptit tạo nên phân tử enzym) locut gen có alen đồng trội xác định cá thể đồng hợp có băng cá thể dị hợp tử có băng chuyển động khác tổ hợp chuỗi polypeptit a4, a3b, a2b2, ab3, ab4 + + _+ H×nh 2.5: Hình thái điện di enzym có cấu trúc tetramer đ-ợc quy định alen đồng trội 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 51  Ph©n tư enzym cã cÊu tróc monomer locut gen có alen trội lặn (gọi alen không- null alen ) cá thể đồng hợp tử trội có băng màu đậm, cá thể dị hợp có băng điện di nhạt màu cá thể đồng hợp tử lặn không nhuộm màu + + _+ Hình 2.6: Hình thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định alen trội lặn Đặt tên locut alen kiểm soát phổ hoạt tính điện di enzym Việc đặt tên locut, alen dựa vào tốc độ di chuyển băng điện di Tên enzym locut đ-ợc ghi theo quy định quốc tế tr-ờng hợp có nhiều gen kiểm soát tổng hợp enzym chữ số ả rập đ-ợc dùng để ký hiệu cho loạt gen theo chiều chuyển động từ cực âm đến cực d-ơng Với alen locut chữ th-ờng đ-ợc dùng để ký hiệu cho alen khác gen, trật tự chữ bảng Chữ để alen t-ơng ứng theo tốc độ di chuyển chậm dần Đo khoảng cách chuyển động băng điện di đặt tên cho băng điện di dựa vào tốc độ dịch chuyển t-ơng đối (Rf) Phân tích kết điện di: Theo tài liệu Futuyma, D.J 1986 [86] Trong lấy muỗi An maculatus lectotype Rattanarithikul 1986 [156] làm loài chuẩn để tính hệ số t-ơng đồng di truyền (IN) khoảng cách di truyền (DN) cho loài khác phức hợp An maculatus Sử dụng phần mềm TFPGA version 1.3 (Mark P Miller, 1997) để xử lý số liệu thu đ-ợc Xác định tÇn sè alen: p = (2a + b) / (2N) Trong đó: a: số cá thể đồng hợp theo A q = (2c + b) / (2N) b: sè ç thể dị hợp AA1 c: số cá thể đồng hợp theo A1 N: số cá thể nghiên cứu 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 52 Kiểm định 2 = (O - E)2/E BËc tù = sè kiÓu gen thu đ-ợc số alen Trong đó: O: tần số thực nghiệm E: tần số lý thuyết Hệ số t-ơng ®ång di truyÒn (I): tÝnh theo Nei (1972, 1978) xi.yi I= xi2 yi2 Trong đó: xi tần số alen thứ i loài x yi tần số alen thứ i loài x Khoảng cách di truyền (D) D = - ln I - Ph-ơng pháp tách chiết ADN muỗi Tách chiết ADN theo ph-ơng pháp Collin et al, (1987) có sửa đổi Lấy chân muỗi cho vào ống eppendorf, sau thêm 50l dung dịch tách nghiền chày chuyên dụng ủ ống 65oC vòng 30 phút Thêm 7l Kac 8M để kết tủa phức hợp protein SDS Chuyển ống vào đá 30 phút Ly tâm vòng 20 phút tốc độ 12000g, chuyển dịch sang tube Thêm vào ống100l cồn tuyệt đối lạnh, sau chuyển vào đá vòng phút Ly tâm vòng 20 phút tốc độ 16000g, nhẹ nhàng loại bỏ dịch Rửa ống 150l ethanol 70%, ly tâm vòng phút loại bỏ dịch Thêm 150l cồn tuyệt đối vào ống, ly tâm, loại bỏ dịch Để ống khô tự nhiên không khí chân không Hoà tan lại ADN tách đ-ợc ống với 25l dung dịch TE - Ph-ơng pháp PCR- RFLP Các enzym tham gia phản ứng giới hạn đ-ợc trình bày bảng 2.1 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 53 Bảng 2.1: Các enzym giới hạn trình tự cắt t-ơng ứng Số tt Tên enzym Alul Trình tự cắt 5’-3’ EcoRI GAATTC BamHI GGATCC HindIII AAGCTT XbaI TCTAGA MspI CCGG Cfr13l GGNCC HaeII RGCGCY HindII GTYRAC 10 HeaIII GGCC AGCT Çc b-ớc tiến hành Quy trình chạy PCR nhân đoạn ITS2: tiến hành trộn hỗn hợp với tổng thể tích 50l/1phản ứng Bảng 2.2: Thành phần chất tham gia phản ứng PCR Thành phần PCR buffer dNTPs Måi ITS2A Måi ITS2B Taq polymerase MgCl2 H2 O ADN khuôn Nồng độ gốc 10X 2mM 25pM 25pM 5u/l 25mM L-ợng cần dùng (l) 5 0.5 0.5 0.1 34,9 Tổng số Chu trình nhiệt phản ứng nhsau: 50 B-íc1: 940C Sau ®ã lµ 35 chu kú :940C phót, 550C phót, 720C vµ ci cïng lµ 720C 10 phút Xử lý đoạn ITS2 vừa đ-ợc nhân enzym giới hạn 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 54 Bảng 2.3: Thành phần chất tham gia vào phản ứng giới hạn enzym Cfr131, Alul, XbaI, BamHI Thành phần L-ợng cần dùng (l) 10X Buffer Tango 2,5 Enzym đơn vị/1l 0,5 H2O khử ion 17 ITS2-ADN Tổng số 20 Điều kiện phản ứng ủ 370C vòng đồng hồ Bảng 2.4: Thành phần chất tham gia vào phản ứng giới hạn enzym Msp1 EcoRI, HindII, HaeII, HeaIII, HindIII Thành phần L-ợng cần dùng (l) 2,5 0,5 16,75 0,25 20 Enzym buffer Enzym đơn vị/1l H2 O ITS2-ADN BSA Tổng số Điều kiện phản ứng ủ 370C vòng đồng hồ + Tiến hành điện di sản phẩm: Điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% hệ đệm TBE 0,5X 100V 30 phút Điện di sản phẩm cắt gel agarose 3% hệ đệm TBE 0,5X 50V 60 phút Sau chạy điện di xong, soi gel d-ới đèn tử ngoại để phát băng chụp ảnh hệ thống chụp ảnh kỹ thuËt sè Imaging systems SDS8000 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 55 - Ph-ơng pháp RAPD- PCR Bảng 2.5: Trình tự mồi ngẫu nhiên sử dụng cho phản ứng RAPD- PCR Tên mồi Trình tự mồi Kích th-ớc mồi (bazơ nitơ) A1 A5 F2 F4 OPL1 OPA4 OPA10 5’ CAGGCCCTTC 3’ 5’ AGGGGTCTTG 3’ 5’ GAGGATCCCT 3’ 5’ GGTGATCAGG 3’ 5’ GGCATGACCT 3’ 5’ AATCGGGCTG 3’ 5’ GTGATCGCAG 3’ 10 10 10 10 10 10 10 Các b-ớc tiến hành Chu trình nhiƯt cđa ph¶n øng RAPD- PCR nhsau: B-íc1: 940C TiÕp theo lµ 45 chu kú 940C phót, 350C phót, 720C KÕt thóc b»ng 720C 15 * Quy trình phản ứng: Các chất tham gia vào phản ứng RAPD- PCR đ-ợc trình bày bảng 2.6 Bảng 2.6: Thành phần chất tham gia vào phản ứng RAPD- PCR Thành phần Nồng độ gốc PCR buffer dNTPs Mồi Taq polymerase MgCl2 H2 O ADN khu«n 10X 2mM 25pM 1u/l 25mM L-ợng cần dùng (l) 2,5 1,5 Tổng số 25 * Điện di sản phẩm gel agarose 1,75% hệ đệm TBE 0,5X Sau soi gel d-ới đèn tử ngoại để phát băng chụp ảnh Xử lý kết quả: Sử dơng phÇn mỊn TFPGA version 1.3 (Mark P Miller, 1997) để phân tích số liệu thu đ-ợc Hệ số t-ơng ®ång theo Nei: S = 2NAB/ NA + NB Trong đó: NAB số băng có mặt hai loài A B NA số băng có loài A NB số băng có loài B 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 56 - Ph-ơng pháp giải trình tự Chạy PCR theo chu trình chuẩn với mồi ITS2 nh-ng dùng mồi ITS2 có gắn thêm đuôi M13 Kiểm tra sản phẩm PCR với ladder 100, xác định nồng độ ADN sản phẩm theo thang đo Tinh khiết ADN b»ng bé kit Qiagent Pha lo·ng ADN s¶n phÈm tíi nồng độ ng Chạy PCR riêng rẽ với mồi M13 xuôi ng-ợc sử dụng kit Big dye với tổng thể tích 20 l cho nồng độ ADN khuôn đạt ng, nồng độ mồi M13là 3,2 pmol l-ợng Bigdye l Phản ứng PCR đ-ợc tiến hành máy AB 9700 theo chu trình nhiệt 960C phút Sau 25 chu kú 960C 10 gi©y, 500C gi©y, 600C phút sản phẩm PCR 40C ®Õn sư dơng + Tinh khiÕt s¶n phÈm PCR Làm màng lọc Sapodex (50g/1 lít H2O): cho vào Làn điện di 300 ml, ly tâm lần lần phút (200 vòng) Cho ADN vào Làn điện di Ly tâm phút với tốc độ 2000 vòng để thu dịch ADN + Chạy giải trình tự ADN: máy giải trình tự AB3730 với ch-ơng trình chuẩn Đọc phân tích kết qủa giải trình tự Sau có kết giải trình tự, sử lý phân tích kết phần mềm MEGA version 3.1 - Xác định ký sinh trùng muỗi ph-ơng pháp ELISA Theo ph-ơng pháp Wirtz et al, (1987) [217] Bé Kit ELISA cña Plasmodium falciparum (P.f Mabs), Plasmodium vivax 210 (P.v 210 Mabs), Plasmodium vivax 247 (P.v 247 Mabs) đ-ợc sử dụng thí nghiệm lµ CCD Entomology Branch, Atlanta, Hoa Kú cung cÊp Các b-ớc tiến hành Muỗi khô mang từ thực địa đ-ợc tiến hành định loại hình thái Tách phần đầu ngực muỗi cho vào ống eppendoft (mỗi mẫu ống) Sắp xếp ống eppendoft vào giá theo trình tự sau (bảng 2.7) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 57 Bảng 2.7: Trình tự xếp mẫu thử nghiệm ELISA A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 - GiÕng A1 đến H1: đối chứng trắng (hoàn toàn hoá chất mẫu muỗi) - Giếng A2: đối chứng d-ơng - Giếng B2 đến H2: đối chứng âm (muỗi nuôi phòng thí nghiệm thoa trùng) - Giếng B3 đến H12: mẫu Cho vào ống 50 l dung dịch đệm BB-NP40 Sử dụng chày nghiền nghiền muỗi thành khối dịch đồng nhất, rửa chày lần dịch BB lần 75l ủ qua đêm 370C Pha 10 l đến 40 l kháng thể đơn dòng KST (tuỳ loại KST) vào ml dung dịch PBS Nhỏ vào giếng đĩa 96 lỗ 50 l dung dịch vừa pha trªn, đ giê ë 370C Sau giê loại bỏ dịch làm khô, thêm vào going 50 l dung dịch đối chứng trắng, đối chứng d-ơng, đối chứng âm mẫu theo miêu tả phía ñ giê ë 370C Sau giê lo¹i bá dịch làm khô Rửa lần PBS-Tween 20 Pha 10 l kháng thể đơn dòng có gắn peroxidase KST 10 ml dung dịch BB, nhỏ vào giếng 100 l dung dịch ủ làm khô Sau rửa lần dung bịch PBS-Tween 20 Nhỏ vào Làn điện di 100 μl dung dÞch theo tû lƯ 1:1 (dung dÞch ABTS: dung dịch peroxidase) Đọc kết sau 15 đến 30 phút máy đọc ELISA với b-ớc sóng 490 nm Những mẫu có kết qủa OD 3lần trung bình cộng chứng âm đ-ợc coi d-ơng tính Những mẫu ELISA d-ơng tính đ-ợc kiểm tra PCR 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 58 - Kiểm tra lại mẫu ELISA d-ơng tính ph-ơng pháp PCR Các cặp mồi G.Snousnou, Viện Y học nhiệt đới Hoàng Gia Anh thiết kế tổng hợp có trình tự nhsau: Bảng 2.8: Trình tự mồi để xác định thoa trùng muỗi Kiểu phản ứng Ký hiệu Trình tự Kích th-ớc sản phẩm Plasmodium Nest P.falciparum Nest PLU5 PLU6 FAL1 FAL2 5’ CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC3’ 5’TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG3’ 5’TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT3’ 5’ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGCT3’ 1.2kb P.vivax Nest P.malariae Nest VIiV1 VIV2 MAL1 MAL2 5’CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC3’ 120bp 5’ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGCAAGTCCTTA3’ 5’ TAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC3’ 144bp 5’AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA3’ P.ovale Nest OVA1 OVA2 5’ ATCTCTTTTGCTATTTTTTAGTATTGGAGA3’ 5GGAAAAGGACACATTTGTATCCTAGTG3 205bp 800bp Các b-ớc tiến hành Tách chiết tinh khiết ADN Hiện có nhiều ph-ơng pháp tách chiết, tinh khiết ADN D-ới hai ph-ơng pháp th-ờng dùng cho phản ứng PCR nghiên cứu KSTSR * Ph-ơng pháp tách ADN Chelex-100 10%: Theo ph-ơng pháp Kains Lannar et al, năm 1992 * Phản ứng PCR lồng (Nested PCR) Phản ứng PCR để nhân gen đặc hiệu Plasmodium gọi Nested1 Hai mồi đ-ợc sử dụng cho phản ứng lần Plus Plus có trình tự nh- bảng Thành phần phản ứng tổng thể tích 25l nhsau: PCR buffer 10X 2.5l dNTPs 2mM 2.5l Måi Plus 1,25M 1.0l Måi Plus 1,25M Taq DNA polymerase 1.0l ADN mÉu 3.0l H2 O 14.0l 1.0l 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 59 Điều kiện tối -u cho phản ứng lần là: B-ớc 1: 950C- phút Sau ®ã lµ 25 chu kú 940C- phót, 580C- phút, 720C- phút, giữ 720C- phút hạ nhiệt độ nhiệt độ phòng Phản ứng PCR để nhân gen đặc hiệu cho loài P.falciparum, P.vivax, P.malariae, P.ovale đ-ợc gọi phản ứng lần 2 Trình tự đôi mồi đặc hiệu cho loài KSTSR, lặp lại 30 chu kỳ Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% với điện 110V, điện áp 75mA khoảng 30 phút - Đọc kết điện di d-ới ánh đèn tử ngoại: + Mẫu đối chứng âm băng điện di + Mẫu đối chứng d-ơng có băng điện di đặc hiệu t-ơng ứng với kích th-ớc thang đo sau: P.falciparum: 205 bp; P.vivax: 120bp; P.malariae: 144bp; P.ovale: 800bp 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 60 Ch-ơng : Kết nghiên cứu Đa hình dấu hiệu kiểu hình thành viên nhóm loài An maculatus 3.1.1 Đa hình dấu hiệu hình thái thành viên nhóm loài An maculatus Để có mẫu vật sử dụng nghiên cứu đa hình di truyền thành viên nhóm loài An maculatus, 43 gia đình đÃ đựơc nuôi cho 1487 mẫu muỗi, có 855 mẫu đồng (bảng 3.1) Bên cạnh đó, thu thập tự nhiên đ-ợc 4071 mẫu muỗi tr-ởng thành 4025 mẫu bọ gậy, nâng tổng số mẫu vật sử dụng để nghiên cứu 9583 (bảng 3.2) Bảng 3.1: Số l-ợng mẫu vật thu đ-ợc từ dòng gia đình để cung cấp dấu hiệu phân loại thành viên nhóm An maculatus Tên muỗi Số gia Số mẫu đình muỗi Đực Số tiêu đồng Cái Đực Cái An dravidicus 14 12 12 10 An notanandai 27 25 17 18 An maculatus 15 205 278 148 162 120 127 64 79 12 149 237 52 67 An willmori 46 58 30 42 Các dạng khác 82 107 71 83 43 643 844 394 461 An pseudowillmori An sawadwongporni Tỉng céng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 61 B¶ng 3.2: Số l-ợng mẫu vật đÃ thu thập giai đoạn 2001-2005 Stt Tên muỗi Muỗi bắt Muỗi nuôi tự nhiên theo gia Bọ gậy Tổng cộng đình An maculatus 1161 483 1450 3544 An dravidicus 18 26 19 63 An notanandai 28 52 595 675 An pseudowillmori 104 247 247 598 An sawadwongporni 1950 386 1187 3523 An willmori 36 104 249 389 Các dạng khác 324 189 278 791 4071 1487 4025 9583 Tổng cộng Nh- vậy, đÃ có đ-ợc số l-ợng mẫu đủ lớn để phân tích đa hình di truyền thành viên nhóm loài - Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành thành viên nhóm loài An maculatus Theo nghiên cứu thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam đa dạng chia tới 14 dạng đ-a đa hình thành viên đÃ đ-ợc định tên số dạng điển hình - An maculatus: Muỗi có kích th-ớc trung bình, dễ dàng nhận biết loài muỗi với thành viên khác nhóm loài đặc điểm: l-ng đốt bụng II-IV vẩy trắng Từ đốt bụng V-VIII đặc biệt đốt bụng VII-VIII th-ờng tập trung nhiều vẩy trắng hình thìa Không có vẩy đen chỗ chia nhánh gân cánh L2 phần thân L2 An maculatus ngắn so với An pseudowillmori Gân L3 điểm đen dài 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 62 Ngoài An maculatus có đặc điểm trên, ta bắt gặp dạng An maculatus khác: - An maculatus dạng 3: Đặc điểm hình thái chủ yếu giống với An maculatus nh-ng khác cấu tạo vẩy đốt bụng V-VII hình thìa mà hình liềm, nhọn, có màu ánh vàng - An maculatus dạng 4: Rất giống với muỗi An maculatus nh-ng đốt bụng từ II-IV có vảy trắng hình thìa rải rác - An maculatus dạng 5: Muỗi có kích th-ớc nhỏ An maculatus có đặc điểm giống với An pseudowillmori chỗ đa số muỗi có vẩy trắng cuối đốt bụng VII đốt bụng VIII nh-ng thân gân L2 loài ngắn so với An pseudowillmori - An maculatus dạng 6: gần giống với An willmori nh-ng kích th-ớc nhỏ - An dravidicus: Muỗi có kích th-ớc trung bình, giống muỗi An maculatus đặc điểm chỗ chia nhánh gân L2 ngắn nh-ng khác đặc điểm đốt bụng II-VIII có phủ vẩy trắng hình thìa Loài muỗi khác tất thành viên khác nhóm loài đặc điểm: gân L3 điểm đen gốc ngọn, có băng đen dài vài băng đen nhỏ bên cánh - An notanandai: Đây loài muỗi có kích th-ớc nhỏ nhÊt nhãm loµi nµy Nã rÊt gièng víi An sawadwongporni đặc điểm: tất l-ng đốt bụng II- VIII phủ vảy trắng, chỗ chia nhánh gân L2 cánh có đám vảy đen Tuy vậy, phân biệt loài muỗi với An sawadwongporni đặc điểm phần cuối l-ng đốt bụng IV-VII An notanandai có hàng vẩy đen ®ã An sawadwongporni chØ cã vÈy ®en ë hai bên cuối l-ng bụng - An pseudowillmori: Đây loài muỗi kích th-ớc trung bình Đặc điểm dễ nhận dạng loài muỗi so với tất thành viên nhóm l-ng đốt bụng II- VII vảy trắng, có vảy trắng đốt bụng VIII Phần thân L2 ngắn tạo ô tr-ớc cánh dài Có hai dạng An pseudowillmori khác đặc điểm điểm trắng phụ sector gân L1 subcosta costa 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 63 - An sawadwongporni: Muỗi có kích th-ớc trung bình đến nhỏ Các l-ng đốt bụng II- VIII phủ đầy vảy trắng hình thìa, có vài vảy đen bên mép Chỗ chia nhánh gân L2 th-ờng có đám vảy đen bên cánh Những đặc điểm An sawadwongporni giống với An notanandai nh-ng khác với loài muỗi đặc điểm An sawadwongporni cuối l-ng ®èt chØ cã mét chïm vÈy ®en ë hai bên không xếp thành hàng Những đặc điểm mô tả thấy đ-ợc An sawadwongporni điển hình (dạng 1) Ngoài có dạng An sawadwongporni An sawadwongporni dạng An sawadwongporni dạng - An sawadwongporni dạng 2: có trứng hầu hết đặc điểm muỗi tr-ởng thành giống An sawadwongporni dạng nh-ng th-ờng chỗ chia nhánh gân L2 đám vẩy đen - An sawadwongporni dạng 3: có đặc điểm muỗi tr-ởng thành giống với An sawadwongporni dạng nh-ng trứng có khoang trứng gián đoạn - An willmori: Đây loài muỗi có kích th-ớc lớn nhóm An maculatus Đặc điểm bật loài muỗi l-ng đốt đốt bụng II- VII phủ đầy vảy trắng, chỗ chia nhánh gân L2 chùm vẩy đen Có hai dạng An willmori - Dạng điển hình đ-ợc gọi An willmori dạng 1: Vẩy đốt bụng hình thìa có màu ánh bạc Các điểm đen cánh nhỏ - An willmori dạng 2: Vẩy đốt bụng vẩy hình thìa nhỏ xen lẫn vẩy hình liềm có ánh vàng Các điểm đen gân cánh lớn so với An willmori dạng An maculatus An maculatus d¹ng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 64 An maculatus d¹ng An pseudowillmori An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An willmori d¹ng An willmori dạng An notanandai An dravidicus Hình 3.1: Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành thành viên thuộc nhóm loài An maculatus - Đa hình hình thái quan sinh dục đực nhóm loài An maculatus Không dấu hiệu hình thái muỗi đa hình nh- đÃ nói mà cấu tạo quan sinh dục đực muỗi đa hình vµ lµ mét kiĨu dÊu hiƯu rÊt tèt cho viƯc phân loại loài gần gũi D-ới mô tả tóm tắt đặc điểm quan sinh dục đực thành viên nhóm loài An maculatus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 65 - An maculatus: Thuú l-ng gåm mét côm hình chuỳ, thuỳ bụng có gai mập gai mảnh Lá phụ gai giao cấu gồm 4- đôi Các có nhỏ từ gốc đến ngän - An maculatus d¹ng 4: Th l-ng cơm hình chuỳ, chẻ đến ngọn, thuỳ bụng có gai cứng Lá phụ gai giao cấu gồm 7- đôi, mặt bên có gai gốc - An dravidicus: thuỳ l-ng cã mét cơm h×nh ch, th bơng cã gai cứng lông nhỏ Lá phụ gai giao cấu 5- đôi, mặt bên c-a - An notanandai: Th l-ng cã mét cơm h×nh ch mập, nhánh gắn chặt với Thuỳ bụng có gai cứng, ngắn mập Lá phụ gai giao cấu gồm đôi lớn đan xen với đôi nhỏ, có hình mũi mác, bên không cã gai - An willmori d¹ng 1: Thuú l-ng cã mét cơm h×nh ch, th bơng cã mét gai lín gai nhỏ Lá phụ gai giao cấu 5- đôi, mặt bên lớn có gai thô th-a - An willmori d¹ng 2: Th l-ng cã cơm hình chuỳ gắn chặt gốc nh-ng 1/3 có xu h-ớng tách đôi Thuỳ bụng có gai mập gai nhỏ Lá phụ gai giao cấu 8- 10 - An sawadwongporni d¹ng 1: Thuú l-ng gåm cụm hình chuỳ kết cấu chặt chẽ, thuỳ bụng có gai mËp L¸ phơ gai giao cÊu cã 5- đôi, hai lớn, mặt bên có c-a dầy - An sawadwongporni dạng 3: Thuỳ l-ng gồm cụm hình chuỳ Thuỳ bụng có gai mập gai nhá L¸ phơ gai giao cÊu cã 4- đôi, lớn có gai nhỏ mặt bên, nhỏ có gai to cứng gốc - An pseudowillmori d¹ng 1: Th l-ng cã mét cơm hình chuỳ Thùy bụng có gai mập gai nhỏ Lá phụ gai gai cấu có đôi, cạnh lớn có c-a nhỏ - An pseudowillmori dạng 2: Thuỳ l-ng có cụm hình chuỳ t¸ch biƯt Th bơng cã gai cøng L¸ phơ gai giao cấu đôi, mút lớn có c-a nhỏ, gốc c-a Thuỳ l-ng Th bơng L¸ phơ gai giao cÊu An maculatus An maculatus d¹ng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 66 An pseudowillmori d¹ng An sawadwongporni d¹ng An notanandai An pseudowillmori d¹ng An sawadwongporni d¹ng An maculatus d¹ng An willmori dạng An willmori dạng Hình 3.2: Đa hình quan sinh dục đực thành viên thuộc nhóm loài An maculatus - Đa hình hình thái quăng Các dấu hiệu hình thái chủ yếu dùng để phân tích tính đa hình giai đoạn quăng gồm số bánh lái (chiều dài bánh lái/chiều rộng), độ dài gai bên đốt bụng IV, phân bố gai cứng bờ cong bánh lái D-ới tóm tắt đặc điểm hình đa hình thái quăng thành viên nhóm loài An maculatus An maculatus: Chỉ số bánh lái quăng 1, 4; bờ gai cứng 1/3 bờ cong bánh lái 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 67 A B C D Hình 3.3: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An maculatus A: Phiến đỉnh C: Bánh lái đực B: Gai bên đốt bụng IV D: Bánh lái A B C D Hình 3.4: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An maculatus dạng A: Phiến đỉnh B: Gai bên đốt bụng IV C: Bánh lái đực D: Bánh lái A B 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 68 C D Hình 3.5: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An maculatus dạng A: Phiến đỉnh B: Gai bên đốt bụng IV C: Bánh lái đực D: Bánh lái A B D C Hình 3.6: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An maculatus dạng - A: Phiến đỉnh B: Gai bên đốt bụng IV C: Bánh lái đực D: Bánh lái An dravidicus: Gai bên đốt bụng IV khoảng 1/6-1/7 gai bên đốt bụng V, số bánh lái quăng 1, 4; bờ gai cứng 1/3 bờ cong bánh lái 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 69 A B C D Hình 3.7: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An dravidicus A: Phiến đỉnh C: Bánh lái đực - B: Gai bên đốt bụng IV D: B¸nh l¸i çi An notanandai: ChØ sè b¸nh lái 1/2, bờ gai cứng gần 1/2 bờ cong A B C D Hình 3.8: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An notanandai A: Phiến đỉnh C: Bánh lái đực - B: Gai bên đốt bụng IV D: Bánh lái An pseudowillmori: Chỉ số bánh lái quăng 1,6, gai bên ®èt bơng IV rÊt dµi b»ng 1/3- 2/5 chiỊu dµi gai bên đốt bụng V 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 70 A B C D Hình 3.9: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An pseudowillmori A: Phiến đỉnh C: Bánh lái đực - B: Gai bên đốt bơng IV D: B¸nh l¸i çi An sawadwongporni: ChØ số bánh lái quăng 1,4, bờ gai cứng 2/5 bờ cong bánh lái A B C D Hình 3.10: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An sawadwongporni dạng A: Phiến đỉnh B: Gai bên đốt bụng IV C: Bánh lái đực D: B¸nh l¸i çi 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 71 A B C D Hình 3.11: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An sawadwongporni dạng A: Phiến đỉnh C: Bánh lái đực B: Gai bên đốt bơng IV D: B¸nh l¸i çi A B C D Hình 3.12: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An sawadwongporni dạng A: Phiến đỉnh C: Bánh lái đực B: Gai bên đốt bụng IV D: B¸nh l¸i çi 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 72 - An willmori: Gai bên đốt bụng IV dài vừa khoảng 1/4 - 1/3 gai bên đốt bụng V A B C D Hình 3.13: Hình ảnh số đặc điểm hình thái quăng An willmori A: Phiến đỉnh C: Bánh lái đực B: Gai bên đốt bụng IV D: Bánh lái + Đa hình hình thái bọ gậy Bọ gậy thành viên nhóm loài đa hình có nhiều dấu hiệu gối (đồng hình) Một số dấu hiệu th-ờng dùng để phân tích đa hình hình thái giai đoạn bọ gậy là: cấu trúc lông cọ (lông số 1) hình thể kitin đốt bụng, số l-ợng nhánh lông số đốt ngực Trong số thành viên nhóm loài này, bọ gậy An willmori (dạng dạng 2) có lông cọ đốt bụng II phát triển tạo thành hình cọ có roi Lông cọ đốt bụng II An dravidicus phát triển nh-ng không phát triển An willmori Độ rộng kitin l-ng đốt bụng khác hẹp An willmori An notanandai, An maculatus dạng 5, An sawadwongporni chiều ngang kitin l-ng rộng Lông số đốt ngực loài An sawadwongporni, An dravidicus, An notanandai nhiều nhánh so với loài An maculatus, An willmori, An pseudowillmori Có thể tóm tắt đặc ®iĨm chÝnh cđa mét sè loµi nhsau: 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 73 - An maculatus: Ngọn lông cọ đốt bụng II roi, khánh đốt bụng III-VII nhỏ, phần cọ 1/3 thân A B C D Hình 3.14: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An maculatus A: Đầu C: Lông cọ đốt bụng B: Lông số ngực D: Tấm kitin đốt bụng A B C D Hình 3.15: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An maculatus dạng A: Đầu C: Lông cọ đốt bụng B: Lông số ngực D: Tấm kitin đốt bơng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 74 A B C D H×nh 3.16: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An maculatus dạng A: Đầu C: Lông cọ đốt bụng B: Lông số ngực D: Tấm kitin đốt bụng A B C D Hình 3.17: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An maculatus dạng A: Đầu C: Lông cọ đốt bụng B: Lông số ngực D: Tấm kitin đốt bơng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 75 - An dravidicus: L«ng sè 1-II có hình cọ, lông cọ đốt bụng có roi rõ, Phần roi lông cọ đốt bụng II-VII 1/3 thân, lông cọ có sắc tố A B C D Hình 3.18: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An dravidicus - A: Đầu B: Lông số ngực C: Lông cọ đốt bụng D: Tấm kitin đốt bụng An notanandai: Lông cọ đốt bụng II roi, khánh đốt bụng II- V to, chiều ngang 2,5 lần chiều dọc, lông số ngực thẳng có nhánh A B C D Hình 3.19: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An notanandai A: Đầu B: Lông số ngực C: Lông cọ đốt bụng D: Tấm kitin đốt bụng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 76 - An pseudowillmori: Đặc ®iĨm bä gËy gÇn gièng víi bä gËy An notanandai, nh-ng th-ờng lông cọ đốt bụng II có roi, phần roi lông cọ đốt bụng II- V tù, 1/4 chiều dài thân A B C D Hình 3.20: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An pseudowillmori A: Đầu B: Lông số ngực C: Lông cọ đốt bụng D: Tấm kitin đốt bụng - An sawadwongporni: Bä gËy gièng bä gËy An notanandai nh-ng l«ng số ngực thẳng có 3-4 nhánh A B C D Hình 3.21: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An sawadwongporni dạng A: Đầu B: Lông số ngực C: Lông cọ đốt bụng D: Tấm kitin đốt bơng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 77 A B C D H×nh 3.22: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An sawadwongporni dạng A: Đầu B: Lông số ngực C: Lông cọ đốt bụng D: Tấm kitin đốt bụng A B C D Hình 3.23: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An sawadwongporni dạng A: Đầu C: Lông cọ đốt bụng B: Lông số ngực D: Tấm kitin đốt bụng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 78 - An willmori: Lông cọ đốt bụng II có roi dài, kitin l-ng rÊt hĐp ngang A B D C H×nh 3.24: Hình ảnh số đặc điểm hình thái bọ gậy An willmori A: Đầu C: Lông cọ đốt bụng B: Lông số ngực D: Tấm kitin đốt bụng - Đa hình hình thái trứng Các dấu hiệu dễ nhận biết tính đa hình hình thái pha trứng thành viên nhãm loµi lµ cÊu tróc khoang trøng, cÊu tróc, sè l-ợng rẻ phao Cấu trúc điển hình trøng An maculatus khoang trøng nèi liỊn, h¬i réng ë có mấu chia khoang trứng làm mút tr-ớc mút sau (hình 3.25a) Phao tập trung vùng trứng gồm từ 15-21 rẻ phao Các loài có khoang trứng t-ơng tự nh- An maculatus An notanandai, An maculatus d¹ng Khoang trøng cđa An willmori có phần phình rộng Khoang trứng An pseudowillmori có khoang trứng phình rộng méo mó Riêng loài An sawadwongporni có khoang trứng hẹp thẳng kéo dài từ đầu tr-ớc đầu sau trứng Cấu trúc khoang trứng kiểu có An sawadwongporni dạng dạng Riêng An sawadwongporni dạng có khoang trứng gián đoạn Trứng An maculatus dạng An dravidicus gần giống với trứng An maculatus nh-ng bờ l-ợn phần khoang trứng tù Khoang trứng An maculatus dạng gần nh- tạo thành đ-ờng thẳng nh-ng rộng ngang nhiỊu so víi An sawadwongporni (h×nh 3.25) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 79 Khoang trøng Phao nỉi A Trøng An sawadwongporni d¹ng B Trøng An notanandai C Trøng An sawadwongporni D Trøng An maculatus d¹ng E Trøng cđa An maculatus d¹ng F Trøng cđa An maculatus d¹ng G Trøng cđa An maculatus H Trøng cđa An maculatus d¹ng I Trøng cña An pseudowillmori K Trøng cña An willmori Hình 3.25: Đa dạng hình thái trứng số thành viên nhóm loài An maculatus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 80 Tóm lại: giai đoạn trứng, bọ gậy, quăng, muỗi tr-ởng thành thể tính đa hình dấu hiệu hình thái cao muỗi tr-ởng thành dấu hiệu thể phân bố vẩy l-ng bụng, gân cánh giai đoạn quăng thể số bánh lái, gai cứng mặt bánh lái, gai bên đốt bụng IV bọ gậy thể đặc điểm lông cọ, cấu trúc khánh đốt bụng trứng có đa hình cấu tạo khoang trứng, số rẻ phao 3.1.2 Đa hình di truyền dấu hiệu sinh học, sinh thái học thành viên nhóm loài An maculatus - Đa hình dấu hiệu sinh học, sinh thái học giai đoạn tr-ớc tr-ởng thành Nghiên cứu dấu hiệu sinh học sinh thái học giai đoạn tr-ớc tr-ởng thành nhóm loài An maculatus tập trung vào nghiên cứu ổ bọ gậy thích hợp với thành viên nhóm loài muỗi An maculatus Có nhiều cách phân chia kiểu æ n-íc: æ n-íc lín, æ n-íc nhá, æ n-íc ®Ỉc biƯt, ỉ n-íc mỈn, ỉ n-íc ngät, ỉ n-íc trong, ổ n-ớc đục, ổ n-ớc có bóng râm che phđ, ỉ n-íc cã ¸nh s¸ng chiÕu räi trùc tiÕp… Căn vào nhận xét chung tác giả đÃ nghiên cứu tr-ớc đây, ổ bọ gậy thích hợp với muỗi An maculatus nơi có n-ớc ngầm chẩy ra, nhiều có ánh sáng chiếu rọi trực tiếp, khe suối, ao nhỏ, vết chân, đáy sông cạn kết hợp với kết thu thập bọ gậy địa ph-ơng, tạm chia lµm kiĨu ỉ bä gËy chÝnh lµ: kiĨu ỉ n-íc chÈy (gåm cã çc si lín, si nhá, r·nh thoát n-ớc ven đ-ờng) kiểu ổ n-ớc đứng (gồm có vũng n-ớc mạch, giếng cạn, hố đào vàng ven suối, vũng n-ớc đáy suối cạn, ao nhỏ, ruộng bậc thang) Khái niệm ổ n-ớc chảy n-ớc th-ờng xuyên l-u thông, không ứ đọng tạo thành vũng, có dòng chảy mạnh nh- suối lớn, suối nhỏ (kể mùa m-a n-ớc chảy mạnh), rÃnh thóat n-ớc ven đ-ờng mức độ chảy có chậm Khái niệm ổ n-ớc đứng t-ơng đối kiểu ổ n-ớc không tạo thành dòng chảy nh-ng ổ n-ớc tù, nhiều chất hữu mà ổ có n-ớc trong, l-u thông th-ờng xuyên theo mạch ngầm Số l-ợng bọ gậy loài thu thập đ-ợc đ-ợc trình bày bảng 3.3 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 81 Bảng 3.3: Số l-ợng bọ gậy thành viên nhóm loài An maculatus thu thập đ-ợc kiểu ổ n-ớc khác Loài muỗi ổ n-ớc chảy Suối Suối lớn nhỏ RÃnh ổ n-ớc đứng (không tù) Cộng Vũng Giếng Hố Đáy Ao n-ớc đào suối nhỏ mạch vàng cạn Tổng Ruộng Cộng cộng bậc thang An.draividicus 0 0 10 19 An maculatus 15 248 266 472 256 316 48 36 56 1184 1450 An notanandai 237 126 75 438 84 46 27 0 157 595 An pseudowillmori 52 48 101 102 19 12 146 247 An sawadwongporni 467 115 36 618 236 32 298 0 569 1187 An willmori 48 52 104 24 15 17 18 19 197 249 Các dạng khác 17 21 42 143 32 41 9 236 278 Tæng céng 715 328 476 1519 1145 289 463 443 67 99 2506 4025 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 82 Cã thĨ thÊy r»ng çc kiĨu ổ n-ớc thích hợp cho thành viên nhóm An maculatus đẻ trứng phong phú đa dạng Trong ổ n-ớc đứng có l-u thông có nhiều bọ gậy hơn: 62,26% (2506/4025) Trong số loại ổ n-ớc đứng muỗi thích đẻ trứng vào vũng n-ớc mạch nhất: 45,69% (1145/2506), hố đào vàng, đáy suối cạn (18,48%) (17,68%) Có thể bắt đ-ợc bọ gậy tất loài muỗi kiểu ổ n-ớc chảy nh-ng với tỷ lệ thấp (37,74%) Hai loài muỗi An sawadwongporni An notanandai chiÕm tû lƯ cao nhÊt ë kiĨu n-íc chảy (40,68% 28,53%) Bọ gậy chúng lẩn trốn vào đám rong rêu, thực vật thủy sinh khe kẽ đá sỏi tránh dòng n-ớc chảy mạnh (hình 3.26 ) Hình 3.26: ổ bọ gậy An notanandai An sawadwongporni suối lớn Đặc điểm ổ bọ gậy An maculatus Đây loài phân bố rộng, đẻ trứng tất kiểu ổ n-ớc đặc tr-ng cho nhóm, đặc biệt nhiều ổ n-ớc đứng l-u thông, n-ớc trong, có nhiều ánh sáng nh- vũng n-ớc mạch, hố đào vàng ven suối Nó có mật độ cao rÃnh thoát n-ớc hai ven đ-ờng quốc lộ khe suối n-ớc chảy gặp bọ gậy An maculatus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 83 Hình 3.27: Vũng n-ớc đáy suối cạn có sỏi ổ bọ gậy thích hợp loài nhóm An maculatus Đặc điểm ổ bọ gậy An dravidicus Đây loài muỗi gặp muỗi tr-ởng thành bọ gậy Trong số bọ gậy bắt đ-ợc có ổ n-ớc đứng ổ n-ớc chảy Ninh Thuận, đÃ bắt đ-ợc bọ gậy loài suối lớn, đáy đá lớn, có n-ớc chảy nh-ng vào mùa khô (hình 3.28) Hình 3.28: ổ bọ gậy An dravidicus suối có đáy đá lớn Đặc điểm ổ bọ gậy An notanandai Ngoài đặc điểm chung nhóm thích ổ n-ớc đứng có n-ớc mạch, bọ gậy loài chiếm -u suối n-ớc chảy (28,83%) (hình 3.28) nh÷ng kiĨu 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 84 ỉ nh- vËy bä gậy chúng lẩn tránh dòng n-ớc chảy cách ẩn d-ới rong rêu, thực vật thủy sinh khe đá sỏi ven bờ Đặc điểm kiểu ổ bä gËy cña An pseudowillmori Bä gËy cña An pseudowillmori gặp nhiều thủy vực khác nhau, ổ n-ớc đứng, n-ớc mạch chủ yếu Tại Quảng Bình, bọ gậy loài muỗi đÃ bắt đ-ợc khe suối đáy đá bằng, chảy chậm, với bọ gậy An dirus An minimus (hình 3.29) Vào mùa khô, Mộc Châu, tỉnh Sơn La, số l-ợng ổ n-ớc nên gặp bọ gậy loài muỗi vũng n-ớc ruộng bậc thang Hình 3.29: ổ bọ gậy thích hợp An dirus, An minimus đồng thời bắt đ-ợc An pseudowillmori Đặc điểm ổ bọ gậy An sawadwongporni An sawadwongporni phân bố chủ yếu tỉnh phía Nam Đây loài muỗi mà bọ gậy sống ổ n-ớc chảy suối lớn suối n-ớc chảy tỉnh Quảng Bình Bình Ph-ớc, bä gËy cđa nã chiÕm 41,84% tỉng sè bä gËy bắt đ-ợc kiểu thủy vực Cùng bắt đ-ợc bä gËy An sawadwongporni víi bä gËy An notanandai vµ cách tránh n-ớc chảy hai loài muỗi nh- (hình 3.28) Đặc điểm ổ bọ gậy An willmori Bọ gậy loài muỗi bắt đ-ợc tất kiểu thủy vực, nhiên thủy vực n-ớc đứng có l-u thông (79,12%) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 85 - Đa hình dấu hiệu sinh học, sinh thái học giai đoạn tr-ởng thành Bảng 3.4 đến 3.6 trình bày kết thu thập muỗi tr-ởng thành tỉnh Sơn La, Hoà Bình, Quảng Bình giai đoạn 2001- 2005 Có thể thấy rằng, điểm , loài muỗi chủ yếu bắt đ-ợc chuồng trâu (từ 83,5% đến 95,21%) Tỷ lệ muỗi bắt đ-ợc ph-ơng pháp mồi ng-ời thấp (måi ng-êi nhµ tõ 0,7 - 1,32%; måi ng-êi nhà từ 0,94- 4,49%) Bắt đ-ợc loài muỗi tró Èn nhµ lµ An maculatus, An pseudowillmori vµ An willmori nh-ng tû lÖ rÊt thÊp (0,15- 0,5%) Nh- vậy, muỗi thuộc nhóm An maculatus chủ yếu trú ẩn nhà -a đốt máu súc vật 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 86 Bảng 3.4: Số l-ợng tỷ lệ loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus thu thập Quảng Bình giai đoạn 2001-2005 Ph-ơng pháp An maculatus An dravidicus An notanandai An pseudowillmori An sawadwongporni An willmori Çc dạng khác 0 Tổng cộng thu thập Mồi ng-êi nhµ (4,49%) Måi ng-êi 12 (13,48%) 0 (0,94%) 0 ngoµi trêi nhµ ngày (1,12%) 48 (53,93%) gia súc đêm Bẫy đèn 11 (12,36%) 0 0 12 468 (100%) (100%) (87,80%) (100%) 0 26 (4,88) 13 (14,61%) 0 17 (3,19) 89 (13,07%) 29 (4,26%) (100%) ngoµi nhµ Tỉng céng 0 (0,15%) nhà Bẫy đèn (3,19%) Soi Soi chuång 17 (1,32%) 12 (1,76%) (0,29) 533 (0,29%) (78,26) (0,15) z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 36 (85,71%) 569 (83,55%) 41 (9,52%) (6,02%) 32 (4,76%) (4,70%) 42 (6,17%) 681 (100%) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 87 Bảng 3.5: Số l-ợng tỷ lệ loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus thu thập Sơn La giai đoạn 2001-2005 Ph-ơng pháp An maculatus An dravidicus An notanandai 0 An pseudowillmori An sawadwongporni An willmori thu thËp Måi ng-êi nhµ (0,66%) Måi ng-êi ngoµi trêi (1,97%) Soi nhµ ngµy (0,33%) (1,96%) 0 10 0 287 12 35 14 (100%) (100%) (68,63%) (6,66%) (82,35%) BÉy ®Ìn 0 0 nhµ (1,97%) Tỉng céng 305 (76,06%) 18 (4,49%) 12 (100%) (5,88%) (0,50%) (94,10%) (0,98%) (1,96%) gia súc đêm nhà Tổng cộng (100%) (11,76%) Soi chuồng Bẫy đèn (5,88%) (19,61%) Các dạng khác 363 (90,52%) (2,24%) 1 (1,96%) (3,33%) 12 51 (2,91%) (0.25%) (12,72%) (0,75%) 0 (1,25%) 17 (4,24%) z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 12 (2,99%) 401 (100%) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 88 Bảng 3.6: Số l-ợng tỷ lệ loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus thu thập Hoà Bình giai đoạn 2001-2005 Ph-ơng pháp An maculatus An dravidicus An notanandai An pseudowillmori An sawadwongporni An willmori thu thËp Måi ng-êi nhµ (0,52%) Måi ng-êi ngoµi trêi (1,03%) Soi nhµ ngµy (0,26%) 0 374 (100%) Bẫy đèn nhà (0,77%) Tæng céng 388 (91,29%) 0 0 0 (20,00%) (0,47%) (96,39%) (1,03%) (0,94%) gia súc đêm nhà Tổng cộng (0,70%) Soi chuồng Bẫy đèn Các dạng khác (0,24%) (100%) (100%) 0 0 0 (60,00%) 24 () (20,00%) (0,47%) (0,24%) (1,18%) z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 405 (95,29%) () (0,94%) () (1,65%) 28 (6,59%) 425 (100%) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 89 3.2 Đa hình di truyền tế bào dấu hiệu kiểu gen thành viên nhóm loài An maculatus 3.2.1 Đa hình dấu hiệu di truyền tế bào thành viên nhóm loài An maculatus Đặc điểm chung tất thành viên nhóm có nhiễm sắc thể nguyên phân 2n = có nhiễm sắc thể giới tính dị hình - An maculatus: Các dạng 3, có phần nhiễm sắc thể nãi chung lµ gièng Ba kiĨu NST X vµ hai kiểu NST Y đÃ đ-ợc tìm thấy tổ hợp khác kiểu Nh- vậy, dạng thấy kiểu X3, Y1 Y2, dạng thể kiểu X1, X3 Y1, dạng biểu hiƯn kiĨu X2, X3 vµ Y2 NST kiĨu X1 chØ thấy dạng 4, kiểu tâm cận mút nhỏ, vai ngắn có phần đồng nhiễm sắc khối nhỏ dị nhiễm sắc trung tâm NST X2 tìm thấy dạng 5, có cấu trúc cận tâm, vai hoàn toàn dị nhiễm sắc vai có phần đồng nhiễm phần dị nhiễm sắc trung tâm có độ dài xấp xỉ NST X3 phổ biến dạng muỗi NST lớn cận tâm Vai ngắn X3 gồm phần đồng nhiễm khối lớn dị nhiễm sắc trung tâm giống với phần X2 Vai dài dị nhiễm sắc lớn so với X2, cã thĨ lµ sù tÝch l mét khèi bỉ sung dị nhiễm sắc NST Y1 dạng tâm cận mút cận tâm nhỏ Y2 NST cận tâm lớn Không có khác biệt khối dị nhiễm sắc trung tâm NST th-ờng dạng - An dravidicus: Bộ nhiễm sắc thể loài nhìn chung giống với An sawadwongporni ngoại trừ có khối dị nhiễm sắc trung tâm lớn Đặc điểm đ-ợc dùng để phân biệt hai loài gần gũi Hơn nữa, hai kiểu NST X hai loài có số l-ợng khối dị nhiễm sắc khác - An notanandai: Nhiễm sắc thể X loài khác hẳn so với loài khác nhóm loài Chúng kiểu tâm cận giữa, vai ngắn hầu hết phần đồng nhiễm vai dài đ-ợc ghi nhận toàn dị nhiễm Đây tr-ờng hợp NST X dÞ th-êng nhãm An maculatus An notanandai cã kiĨu NST X NST kiĨu X2 kh¸c víi X1 có khối dị nhiễm phía mút vai dài NST Y tâm cận rõ NST th-ờng có phần dị nhiễm quanh tâm động 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 90 - An willmori d¹ng 1: NST giíi tÝnh loài lớn bất th-ờng so với loài khác thuộc nhóm An maculatus NST X cận tâm vai ngắn có phần đồng nhiễm xấp xỉ phần dị nhiễm vai dài dài gồm toàn dị nhiễm Một vai nhiễm sắc thể th-ờng có khối dị nhiễm sắc trung tâm rõ đối lập với nhánh khác mang đặc điểm NST th-ờng - An willmori dạng 2: nhìn chung NST dạng gần giống với An willmori d¹ng nh-ng kÝch th-íc cđa NST giíi tính không lớn NST có dạng tâm cận mút - An sawadwongporni: NST X tâm cận mút gồm có khối dị nhiễm sắc tâm động NST Y tâm cận mút xẫp xỉ độ lớn khối dị nhiễm sắc NST X Những khối dị nhiễm sắc xung quanh tâm động th-ờng thấy rõ loài - An pseudowillmori dạng 2: loµi nµy cã kiĨu NST X NST kiĨu X1 tâm giữa, vai gồm khối dị nhiễm sắc trung tâm phần lại đồng nhiễm ng-ợc lại vai hoàn toàn đồng nhiễm NST kiểu X2 NST lớn tâm cận giữa, vai ngắn giống X1, nhiên vai dài dị nhiƠm s¾c gåm Ýt nhÊt mét khèi chÝnh bỉ sung phần dị nhiễm sắc vùng mút vai NST Y NST tâm cận mút lớn gần chiều dài phần dị nhiễm sắc NST X Phần dị nhiễm sắc nhiễm sắc thể th-ờng khó nhìn thấy - An pseudowillmori dạng 1: Cả NST X Y loài có dạng tâm cận lín; NST X h¬i lín h¬n NST Y Cịng gièng nh- loài khác nhóm An maculatus, vai ngắn NST X gồm có phần đồng nhiễm dị nhiễm trung tâm, vai dài hoàn toàn dị nhiễm sắc Một vai NST th-ờng có khối dị nhiễm sắc trung tâm Hình ảnh đại diện NST nguyên phân loài dạng nhóm loài An maculatus đ-ợc mô tả ë h×nh 3.30 X X X Y NST An maculatus ®ùc NST An maculatus çi 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 91 NST An maculatus dạng NST An maculatus dạng đực NST An maculatus dạng NST An maculatus dạng đực NST An maculatus dạng NST An maculatus dạng đực NST An pseudowillmori dạng NST An pseudowillmori dạng đực NST An pseudowillmori dạng NST An pseudowillmori dạng đực NST An willmori dạng NST An willmori dạng đực NST An willmori dạng NST An willmori dạng đực Hình 3.30: Hình ảnh nhiễm sắc thể kiểu nhân thành thành viên nhóm loài An maculatus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 92 3.2.2 Đa hình di truyền đặc điểm điện di enzym thành viên nhóm loài An maculatus Điện di 11 hƯ isozymes trªn gel cellulose acetate gåm: + Octanol dehydrogenase (ODH, E.C: 1.1.1.73) + L-Lactate dehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27) + Malate dehydrogenase (MDH, E.C: 1.1.1.37) + Glutamate oxaloacetate transminase (GOT, E.C: 2.6.1.1) + 6- Phosphogluconate dehydrogenase (6- PGD, E.C:1.1.1.44) + Isocitrate dehydrogenase (IDH, E.C: 1.1.1.42) + Phosphoglucomutase (PGM, EC: 5.4.2.2) + Glucose phosphate dehydrogenase (- GPD, E.C: 1.1.1.49) + D-2- Hydroxy-acid dehydrogenase ( HAD, E.C: 1.1.6 99 ) + Manose phosphate isomerase (MPI, E.C: 5.3.1.8) + Glucose phosphate isomerase (GPI, E.C: 5.3.1.9) Sau tiến hành điện di 11 hệ izozym, thu đ-ợc 14 locut gen kết nhsau - Kết điện di đa hình di truyền hệ izozym ODH Enzym ODH enzym đ-ợc sử dụng phổ biến nghiên cứu đa hình di truyền phân biệt loài muỗi, đặc biệt với nhóm loài An minimus thể tính ®a h×nh rÊt râ nÐt Sau ®iƯn di, nhm hoá tổ chức với enzym nhận thấy với nhóm loài An maculatus hệ izozym đ-ợc kiểm soát alen ®ång tréi cđa cïng mét locut, enzym cã cấu trúc dimer, đồng hợp tử băng dị hợp tử băng Các alen đ-ợc ký hiệu nhsau: Odha, Odhb, Odhc,Odhd với Rf t-ơng ứng là: 96, 100, 109, 116 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 93 10 11 12 + _ Hình 3.31: Hình ảnh điện di enzym ODH thành viên nhóm loài An maculatus Làn điện di 1-4: An sawadwongporni Làn điện di 6: An maculatus dạng Làn điện di 7,8: An dravidicus Làn điện di 5: An maculatus Làn điện di 10-12: An willmori Trên sở phân tích băng điện di enzym ODH, đÃ tiến hành tính tần số alen enzym thành viên nhóm loài An maculatus Bảng 3.7: Tần số alen mÃ hóa enzym ODH thành viên nhóm An maculatus Loµi N An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An pseudowillmori d¹ng An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng 110 34 91 35 36 36 83 26 21 31 56 25 27 31 a 96 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Alen/Rf b c 100 109 0,97 0,02 1.00 0,00 1.00 0,00 0,00 1.00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,97 0,02 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 Ho d 116 0,01 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 He 2 6,9 0,10 5,9 0,09 Ghi chó: Ho: Sè çc thể dị hợp tử quan sát He: Số thể dị hợp tử lý thuyết N: số cá thể nghiên cøu Sau tÝnh tÇn sè alen cđa enzym ODH loài trên, tiến hành tính tần số kiểu gen kiểm định tiêu chuẩn Kết kiểm định tần số 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 94 kiểu gen locut gen ODH quần thể, loài thành viên nhóm loài An maculatus đ-ợc trình bày bảng phụ lục Trong 14 loài dạng nghiên cứu có hai loài An maculatus An maculatus dạng giống với An pseudowillmori có biểu tính đa hình 12 loài khác thể tính đơn hình Loài An dravidicus phân biệt đ-ợc với loài khác dựa vào alen đặc tr-ng Odha với Rf = 96 Alen Odhd đặc tr-ng cho dạng An willmori (An willmori An willmori dạng 2) Hai dạng An pseudowillmori đặc tr-ng alen Odhc, alen Odhb lại đại diện cho dạng An maculatus An sawadwongporni - Kết điện di đa hình di truyền hệ izozym LDH T-¬ng tù nh- izozym ODH, hƯ izozym LDH chØ locut gen quy định, locut có len đồng trội Ldha, Ldhb,Ldhc,Ldhdd t-ơng ứng với Rf 83, 91, 100 109 Kiểm tra tần số alen phân bố tần số alen thấy phù hợp với định luật Hardy Weinberg Các bảng sau thể tần số alen loài nghiên cứu kết kiểm định tính phù hợp với định luật Hardy Weinberg: Bảng 3.8: Tần số alen mÃ hóa enzym LDH thành viên nhóm An maculatus Loµi N An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An pseudowillmori d¹ng An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng 110 34 91 35 36 36 83 26 21 31 56 25 27 31 a 83 0,05 0,00 0,06 0,99 0,00 0,00 0,04 0,00 0,00 0,00 0,73 0,00 0,00 0,00 Alen/Rf b c 91 100 0,03 0,87 0,00 1,00 0,03 0,88 0,00 0,01 0,99 0,00 0,00 1,00 0,02 0,94 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,06 0,19 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 Ghi chú: Ho: Số thể dị hợp tử quan sát N: số cá thể nghiên cứu d 109 0,05 0,00 0,03 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,02 0,00 0,00 0,00 Ho He 2 28 26,5 1.86 21 1 19,5 1 1.48 0,00 0,00 10 9,58 0,31 24 24,2 1,09 He: Số thể dị hợp tử lý thuyÕt 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 95 10 11 12 + _ Hình 3.32: Hình ảnh điện di enzym LDH thành viên phức hợp An maculatus Làn điện di 1, 5, 6, 7, 8, 10: An maculatus Làn điện di 2, 3, 4, 11, 12; An sawadwongporni Làn điện di 9: An.w2illmori Víi hƯ izozym LDH, cã 50% (7/14) quần thể nghiên cứu có đa hình alen Alen Ldhd alen hiếm, không đại diện cho quần thể nghiên cứu An pseudowillmori An pseudowillmori đ-ợc đặc tr-ng alen Ldha; Các dạng An willmori đ-ợc phân biệt alen Ldhb Dạng alen chiếm đa số loài nghiên cứu Ldhc với Rf = 100 alen điển hình quần thể lại - Kết điện di đa hình di truyền hệ izozym MDH Đây hệ izozym có tính đa hình cao, hai phần ba quần thể nghiên cứu thể tính đa hình Sau tiến hành điện di nhuộm hoá tổ chức phân tích phổ điện di thành viên nhãm loµi thÊy cã thĨ chia thµnh vïng dựa theo tốc độ di chuyển nhanh dần phía cực d-ơng Đó vùng Mdh1 Mdh2, vùng gen riêng biệt kiểm soát Đi sâu vào phân tích vùng, nhận thấy - Vùng 1: Vùng đ-ợc kiểm soát alen ®ång tréi cđa cïng mét locut, enzym cã cÊu trúc dimer Các alen đ-ợc ký hiệu nhsau Mh1a, Mdh1b, Mdh1c víi Rf t-¬ng øng nhsau 60, 100, 140 - Vùng 2: Vùng đ-ợc kiểm soát alen Mdh2a, Mdh2b, Mdh2c, Rf t-ơng ứng là: 90, 100, 110 Phân tích băng điện di, ta đ-ợc kết tần suất phân bố alen bảng sau: 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 96 Bảng 3.9: Tần số alen mÃ hóa enzym MDH thành viên nhóm An maculatus Mdh1 Loài N Alen/Rf b 100 a 60 An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An pseudowillmori d¹ng An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng 110 34 91 35 36 36 83 26 21 31 56 25 27 31 0,08 0,00 0,00 0,00 0,15 0,00 0,07 0,00 0,00 0,00 0,00 0,12 0,00 0,00 0,85 1,00 1,00 1,00 0,75 1,00 0,87 1,00 1,00 1,00 1,00 0,76 1,00 1,00 Ho He 2 29 30,2 0,61 15 14,8 0,47 21 19,9 0,81 11 10,1 0,76 Ho He 2 25 25,3 0,36 19 23 18,7 2,9 22,8 0,02 0,00 0,44 0,00 0,31 13 13,1 0,00 1,9 0,02 c 140 0,07 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00 0,00 0,12 0,00 0,00 Mdh2 Loµi N Alen/Rf b 100 a 90 An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An pseudowillmori d¹ng An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng 110 34 91 35 36 36 83 26 21 31 56 25 27 31 0,09 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,87 1,00 0,88 0,99 0,96 0,99 0,84 1,00 1,00 1,00 0,87 1,00 1,00 0,97 Ghi chó: Ho: Sè çc thĨ dị hợp tử quan sát N: số cá thể nghiên cøu c 110 0,04 0,00 0,12 0,01 0,04 0,01 0,12 0,00 0,00 0,00 0,13 0,00 0,00 0,03 He: Sè çc thể dị hợp tử lý thuyết 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 97 + 10 11 12 Mdh-1 Mdh-2 _ Hình 3.33: Hình ảnh điện di enzym MDH thành viên nhóm loài An maculatus Làn điện di 1-4: An sawadwongporni Làn ®iƯn di 5: An maculatus Lµn ®iƯn di 6: An maculatus dạng Làn điện di 9: An willmori dạng Làn điện di 7,8: An dravidicus Làn điện di 10-12: An willmori Kết phân tích tần số alen tất loài nghiên cứu phù hợp với định luật Hardy Wenbeirg, nh-ng sử dụng để phân biệt loài với - Kết điện di đa hình di truyền hệ izozym GOT Gièng nh- hƯ izozym MDH, phỉ ®iƯn di hệ izozym GOT đ-ợc chia làm hai vùng, đại diện cho locut gen Got1 Got2 Cả hai locut gen có cấu trúc dimer, locut Got1 cã alen lµ: Got1a, Got1b, Got1c; locut Got2 có alen Got2a, Got2b, Got2c, Got2d Tần số alen quần thể nghiên cứu đ-ợc thể bảng 3.10 Bảng 3.10: Tần số alen mÃ hóa enzym GOT thành viên nhóm An maculatus Got1 Loµi N a 91 An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An pseudowillmori d¹ng An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng 110 34 91 35 36 36 83 26 21 31 56 25 27 31 0,02 0,00 0,00 0,00 0,18 0,00 0,02 0,19 0,00 0,00 0,00 0,40 0,00 0,06 Alen/Rf b 100 0,91 0,81 0,90 1,00 0,82 0,85 0,87 0,81 1,00 0,98 0,85 0,60 1,00 0,89 Ho He 2 17 11 17 17,7 10,7 17,1 0,93 0,03 0,00 11 19 10,8 9,5 18,8 8,20 0,01 0,09 0,40 0,02 15 12 14,5 12,2 0,00 0,05 0,01 4,5 0,70 c 109 0,07 0,19 0,10 0,00 0,00 0,15 0,11 0,00 0,00 0,02 0,15 0,00 0,00 0,05 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 98 Got Loµi N Alen/Rf b c 100 160 0,08 0,80 Ho He 2 d 220 0,05 39 39,4 2,06 An maculatus 110 a 40 0,07 An notanandai 34 0,00 0,18 0,82 0,00 10 10 0,00 An sawadwongporni 91 0,02 0,09 0,88 0,01 19 19,9 0,44 An pseudowillmori 35 0,01 0,00 0,99 0,00 1,00 0,00 An willmori 36 0,00 0,24 0,76 0,00 13 13,2 0,01 An dravidicus 36 0,06 0,00 0,94 0,00 3,8 0,09 An maculatus d¹ng 83 0,00 0,05 0,84 0,11 24 23,7 0,75 An maculatus d¹ng 26 0,00 0,23 0,71 0,06 12 11,6 0,27 An sawadwongporni d¹ng 21 0,00 0,10 0,83 0,07 6,3 0,70 An sawadwongporni d¹ng 31 56 An pseudowillmori d¹ng 0,00 0,00 0,81 0,19 10 9,8 0,10 0,03 0,11 0,86 0,00 14 14,2 0,57 An willmori d¹ng 25 0,00 0,18 0,82 0,00 7,5 0,14 An maculatus d¹ng 27 0,00 0,00 1,00 0,00 An maculatus d¹ng 31 0,00 0,05 0,93 0,02 2,9 0,10 Ghi chú: Ho: Số thể dị hợp tử quan sát N: số cá thể nghiên cứu He: Số thể dị hợp tử lý thuyết Dựa vào tần số alen thu đ-ợc, tiến hành tính toán tần số kiểu gen kiểm định , kết phân bố alen tuân theo định lt Hardy Weinberg ë hai locut cđa hƯ enzym GOT, locut có alen chiếm -u thế, có tần xuất cao tất loài Got1b víi Rf = 100 vµ Got2c víi Rf = 160 Trong hệ izozym alen đặc tr-ng cho loài, tính đa hình thể tần số khác alen - Kết điện di đa hình di truyền hệ izozym 6PGD Qua phân tích kết phổ điện di hệ izozym 6PGD, nhận thấy hệ izozym nghiên cứu thể tính đa hình cao Cấu trúc enzym dimer, dị hợp tử ba v¹ch 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 99 10 11 12 + H×nh 3.34: Hình ảnh điện di enzym 6PGD thành viên nhóm loài An maculatus Làn điện di 1, 2, 3, 6, 10, 11: An sawadwongporni Làn điện di 4,7: An maculatus dạng Làn điện di 5: An maculatus dạng Làn điện di 8: An willmori Làn ®iƯn di 12: An pseudowillmori Lµn ®iƯn di 9: An maculatus Kết phân tích tần suất alen của hệ izozym 6PGD thể rõ tính đa hình hƯ enzym nµy HƯ izozym 6PGD võa thĨ hiƯn tÝnh đa hình cao vừa hệ enzym có khả phân biệt thành viên nhóm loài An maculatus cách rõ ràng Với alen ®ång tréi mét locut gen ký hiƯu lµ 6Gpda (Rf = 83), 6Gpd (Rf = 86), 6Gpd (Rf = 89), 6Gpdd (Rf = 100), 6Gpde (Rf = 110), 6Gpdf (Rf = 114), 6Gpdg (Rf = 117), 6Gpdh (Rf = 123) có alen đặc tr-ng cho loài An notanandai đ-ợc đại diện alen 6Gpda (Rf = 83), alen 6Gpd (Rf = 86) lại đặc tr-ng cho dạng An pseudowillmori Các dạng An sawadwongporni có alen 6Gpdf (Rf = 114) chiÕm -u thÕ, An dravidicus cã alen 6Gpdd (Rf = 100) chiếm -u thế, dạng An maculatus phân biệt dựa vào alen nh-ng chúng có tần suất alen khác Tất quần thể nghiên cứu có tần xuất alen nghiên cứu phù hợp với tần suất lý thuyết theo định luật Hardy Weinberg 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 100 Bảng 3.11: Tần số alen mÃ hóa enzym 6PGD thành viên nhóm An maculatus Loài N b 86 0,02 c 89 0,00 Alen/Rf d e 100 110 0,87 0,00 f 114 0,11 g 117 0,00 h 123 0,00 He 2 26 24,9 0,63 Ho An maculatus 110 a 83 0,00 An notanandai 34 0,94 0,00 0,00 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 2,04 0,00 An sawadwongporni 91 0,00 0,07 0,00 0,07 0,00 0,86 0,00 0,00 23 21,7 0,83 An pseudowillmori 35 0,00 0,00 0,82 0,00 0,17 0,00 0,01 0,00 11 11,9 0,21 An willmori 36 0,00 0,00 0,00 0,63 0,11 0,00 0,00 0,26 19 19,3 0,81 An dravidicus 36 0,00 0,00 0,00 0,83 0,00 0,17 0,00 0,00 10 10,1 0,01 An maculatus d¹ng 83 0,01 0,00 0,95 0,00 0,04 0,00 0,00 0,00 8,6 0,24 An maculatus d¹ng 26 0,00 0,00 0,00 0,62 0,00 0,38 0,00 0,00 12 12,5 0,05 An sawadwongporni d¹ng 21 0,09 0,00 0,05 0,00 0,86 0,00 0,00 0,00 5,5 0,48 An sawadwongporni d¹ng 31 0,18 0,00 0,05 0,00 0,77 0,00 0,00 0,00 7,2 1,67 An pseudowillmori d¹ng 56 0,00 0,79 0,00 0,13 0,00 0,08 0,00 0,00 20 19,6 0,47 An willmori d¹ng 25 0,00 0,00 0,76 0,00 0,00 0,00 0,24 0,00 10 9,3 0,15 An maculatus d¹ng 27 0,93 0,00 0,07 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3,8 0,13 An maculatus d¹ng 31 0,00 0,00 0,82 0,00 0,18 0,00 0,00 0,00 9,2 0,02 Ghi chú: Ho: Số thể dị hợp tử quan sát N: số cá thể nghiên cứu He: Số thể dị hợp tử lý thuyết z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 101 - Kết điện di đa hình di truyền hƯ izozym IDH Mét hƯ izozym cịng thĨ hiƯn tÝnh đa hình cao có khả phân biệt thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam IDH Dựa vào tốc độ chuyển động băng điện di chia phổ điện di hệ izozym thành vùng đại diện cho hai locut gen Idh1 Idh2 Trong Idh1 gồm có alen Idh1a, Idh1b, Idh1c, Idh1d với Rf t-ơng øng lµ 88, 100, 112, 128, vµ Idh2 cã alen Idh2a, Idh2b, Idh2c, Idh2d cã Rf b»ng 90, 100, 110 + 10 11 12 Idh-1 Idh-2 H×nh 3.35: : H×nh ảnh điện di enzym IDH thành viên nhóm loài An maculatus Làn điện di 1, 2, 3, 4, 9, 10, 12: An maculatus Làn điện di 5: An dravidicus, Làn điện di 6, 7, 8, 11: An sawadwongporni Kết phân tích tần xuất alen đ-ợc thể bảng 3.12: Bảng 3.12: Tần số alen mÃ hóa enzym IDH thành viên nhóm An maculatus Idh1 Loµi N An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An pseudowillmori d¹ng An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng 110 34 91 35 36 36 83 26 21 31 56 25 27 31 a 0,02 0,00 0,11 0,99 0,15 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00 0,62 0,22 0,00 0,00 Alen/Rf b c 100 112 0,82 0,16 0,93 0,07 0,70 0,19 0,00 0,00 0,42 0,43 0,00 0,15 0,98 0,02 0,79 0,21 0,64 0,31 0,79 0,21 0,24 0,00 0,36 0,42 0,81 0,19 0,92 0,08 d 128 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,85 0,00 0,00 0,00 0,00 0,14 0,00 0,00 0,00 Ho He 2 32 43 23 9 10 11 31 16 33 4,7 41,9 1,00 22,5 9,5 2,9 8,8 10,5 10,4 30,6 16,5 8,3 4,7 0,23 0,17 0,35 0,00 0,27 0,09 0,02 0,01 0,37 0,09 0,02 0,96 0,04 0,19 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 102 Idh2 Loµi N Alen/Rf b (100) 0,82 c (110) 0,12 Ho He 2 36 34,5 0,72 An maculatus 110 a (90) 0,06 An notanandai 34 1,00 0,00 0,00 An sawadwongporni 91 0,89 0,11 0,00 18 17,9 0,00 An pseudowillmori 35 0,96 0,04 0,00 2,9 0,05 An willmori 36 0,17 0,83 0,00 10 10,1 0,01 An dravidicus 36 0,00 1,00 0,00 An maculatus d¹ng 83 0,01 0,95 0,04 8,64 0,24 An maculatus d¹ng 26 0,04 0,96 0,00 1,9 0,02 An sawadwongporni d¹ng 21 0,76 0,24 0,00 7,8 0,01 An sawadwongporni d¹ng 31 0,79 0,21 0,00 11 10,4 0,09 An pseudowillmori d¹ng 56 0,79 0,21 0,00 19 18,4 0,05 An willmori d¹ng 25 0,00 1,00 0,00 An maculatus d¹ng 27 1,00 0,00 0,00 An maculatus d¹ng 31 0,02 0,96 0,02 1,9 0,02 Ghi chú: Ho: Số thể dị hợp tử quan sát N: số cá thể nghiên cứu He: Số thể dị hợp tử lý thuyết Kết kiểm tra tính phù hợp tần số alen theo định luật Hardy Weinberg đ-ợc thể bảng 7.6 phụ lục Nhận thấy tất loài nghiên cứu hệ izozym thể tính đa hình cao, tần suất phân phối alen phù hợp với định luật Hardy Weinberg với độ tin cậy 99% Có thể phân biệt An sawadwongporni với thành viên khác nhóm loài dựa vào alen Idh1a - Kết điện di đa hình di truyền hệ izozym PGM Enzym PGM đ-ợc kiểm soát alen ®ång tréi Pgma (Rf = 85), Pgmb (Rf = 100), Pgmc (Rf = 120) CÊu tróc cđa enzym lµ monomer Có thể phân biệt thành viên nhóm loài dựa vào tần suất alen 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z - 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 103 Bảng 3.13: Tần số alen mÃ hóa enzym PGM thành viên nhóm An maculatus Loài N An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An pseudowillmori d¹ng An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng 110 34 91 35 36 36 83 26 21 31 56 25 27 31 a (85) 0,07 0,24 0,28 0,00 0,00 0,15 0,00 0,23 0,31 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Alen/Rf b (100) 0,84 0,76 0,36 0,50 0,39 0,85 1,00 0,77 0,69 0,82 0,71 0,28 0,19 0,84 Ghi chú: Ho: Số thể dị hợp tử quan sát N: số cá thể nghiên cứu c (120) 0,09 0,00 0,36 0,50 0,61 0,00 0,00 0,00 0,00 0,18 0,29 0,72 0,81 0,16 Ho He 2 29 12 62 17 18 30,2 12,4 60,6 17,8 17,4 9,4 0,74 0,04 0,17 0,06 0,05 0,09 10 9 23 10 8 9,4 9,2 9,2 23,5 10,3 8,3 8,5 0,11 0,01 0,02 0,02 0,02 0,04 0,13 He: Sè çc thể dị hợp tử lý thuyết - Kết điện di đa hình di truyền hệ izozym GPI GPI nhóm loài An maculatus alen đồng tréi thc mét locut gen kiĨm so¸t Enzym cã cÊu trúc dimer alen t-ơng ứng với Rf 91, 100 109 An willmori phân biệt với loài khác nhóm loài dựa vào alen Gpic Bảng 3.14: Tần số alen mÃ hóa enzym MPI thành viên nhóm An maculatus Loài N An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An pseudowillmori d¹ng An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng 110 34 91 35 36 36 83 26 21 31 56 25 27 31 a (91) 0,15 0,00 0,00 0,00 0,00 0,18 0,11 0,19 0,00 0,18 0,00 0,00 0,00 0,02 Alen/Rf b (100) 0,85 1,00 1,00 0,99 0,00 0,82 0,89 0,81 1,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,98 Ghi chú: Ho: Số thể dị hợp tử quan sát N: số cá thể nghiên cứu c (109) 0,00 0,00 0,00 0,01 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 1,00 1,00 0,00 Ho He 2 28 27,5 0,04 1,00 0,00 11 17 10,8 16,0 8,2 0,01 0,00 0,02 9,2 0,02 1,00 0,00 He: Sè çc thể dị hợp tử lý thuyết 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 104 10 11 12 + Hình 3.36: Hình ảnh điện di enzym GPI thành viên nhóm loài An maculatus Làn điện di 1,2: An maculatus Làn điện di 3-5: An pseudowillmori Làn điện di 6-8: An willmori Làn điện di 10, 11: An notanandai Làn điện di 9: An dravidicus Làn điện di 12: An sawadwongporni Tần số phân bố alen phù hợp với định luật phân bố chuẩn - Kết điện di đa hình di trun hƯ izozym - GPD Enzym nµy cã cÊu tróc monomer, alen ®ång tréi thuéc cïng mét locut kiểm soát Đó alen: -Gpda (Rf= 63), -Gpbd (Rf= 77), -Gpcd (Rf= 90), Gpdd (Rf= 100), Gpde (Rf= 140) Sự vắng mặt hay có mặt alen cho phép phân biệt loài nhóm loài An maculatus Dựa vào tần số alen thu đ-ợc, tiến hành tính toán tần số kiểu gen kiểm định 2, kết phân bố alen tuân theo định luật Hardy Weinberg Enzym có tính đa hình cao, 100% quần thể nghiên cứu thể tính đa hình Tính đa hình thể tỷ lệ khác tần xuất alen quần thể nghiên cứu Tần số alen locut - GPD thành viên nhóm loài An maculatus đ-ợc trình bày bảng sau: 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 105 Bảng 3.15: Tần số alen mÃ hóa enzym -GPD thành viên nhóm An maculatus Loµi N Ho He 2 Alen/Rf b c d 77 90 100 0,07 0,03 0,57 e 140 0,03 63 63,8 2,39 An maculatus 110 a 63 0,30 An notanandai 34 0,00 0,18 0,48 0,00 0,34 21 21,3 0,03 An sawadwongporni 91 0,30 0,06 0,00 0,64 0,00 46 45,3 0,44 An pseudowillmori 35 0,16 0,16 0,00 0,68 0,00 16 17 0,27 An willmori 36 0,00 0,39 0,00 0,61 0,00 18 17,4 0,05 An dravidicus 36 0,00 0,31 0,22 0,32 0,15 29 26,7 2,90 An maculatus d¹ng 83 0,26 0,00 0,07 0,63 0,04 45 44,2 1,10 An maculatus d¹ng 26 0,21 0,19 0,29 0,31 0,00 19 19,6 0,57 An sawadwongporni d¹ng 21 0,12 0,19 0,48 0,21 0,00 15 14,5 1,04 An sawadwongporni d¹ng 31 56 An pseudowillmori d¹ng 0,00 0,00 0,52 0,37 0,11 19 18,4 0,43 0,44 0,04 0,00 0,52 0,00 31 29,9 0,17 An willmori d¹ng 25 0,00 0,34 0,00 0,66 0,00 11 11,4 0,04 An maculatus d¹ng 27 0,00 0,32 0,26 0,22 0,20 21 20,4 1,28 An maculatus d¹ng 31 0,00 0,00 0,61 0,36 0,03 16 15,7 1,24 Ghi chó: Ho: Số thể dị hợp tử quan sát He: Số thể dị hợp tử lý thuyết N: số cá thể nghiên cứu - Kết điện di đa hình di truyền hệ izozym MPI Tổng số alen cđa locut enzym nµy lµ 4: Mpia, Mpib, Mpic, Mpid (Rf t-ơng ứng là: 75, 780, 90, 100),có cấu trúc monomer Đây enzym cho đa hình cao, loài đÃ đ-ợc đặt tên alen Mpid chiếm tần số cao, dạng ch-a đ-ợc đặt tên thức tần số lại cao alen Mpia Kết kiểm định tính phù hợp với định luật Hardy Weinberg thể bảng 10 phụ lục Các quần thể có tần xuất alen khác nh-ng tuân theo định luật cân di truyền Một số loài nghiên cứu có sù biĨu hiƯn cđa mét kiĨu alen nhAn sawadwongporni d¹ng 3, An willmori dạng An maculatus dạng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 106 Bảng 3.16: Tần số alen mÃ hóa enzym MPI thành viên nhóm An.maculatus Loµi N An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An pseudowillmori d¹ng An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng 110 34 91 35 36 36 83 26 21 31 56 25 27 31 a 75 0,14 0,00 0,00 0,00 0,19 0,75 0,09 0,81 1,00 0,68 0,01 0,00 1,00 1,00 Alen/Rf b c 78 90 0,10 0,21 0,00 0,66 0,00 0,10 0,00 0,01 0,00 0,81 0,10 0,01 0,01 0,25 0,00 0,19 0,00 0,00 0,00 0,32 0,00 0,13 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 d 100 0,55 0,34 0,90 0,99 0,00 0,14 0,65 0,00 0,00 0,00 0,86 0,00 0,00 0,00 Ho He 2 69 15 17 12 14 41 68,8 15,4 17,1 1,00 11,4 14,9 42,3 8,2 0,1 0,02 0,00 0,00 0,09 2,25 1,35 0,02 14 14 13,8 13,9 0,01 0,16 Ghi chó: Ho: Số thể dị hợp tử quan sát He: Số thể dị hợp tử lý thuyết N: số cá thể nghiên cứu - Kết điện di đa hình di truyền hệ izozym HAD HAD hệ enzym đa hình hệ enzym nghiên cứu, enzym alen đồng trội quy định Hada (Rf = 89) Hadb (Rf = 100) Hầu hết quần thể nghiên cứu đơn hình với enzym trừ An maculatus dạng vµ An willmori 10 11 12 + - H×nh 3.37 H×nh ảnh điện di enzym HAD thành viên nhóm loài An maculatus Làn điện di 1,2: An maculatus Làn điện di 3-5: An pseudowillmori Làn điện di 6-8: An willmori Làn điện di 10, 11: An notanandai Làn ®iƯn di 9: An dravidicus Lµn ®iƯn di 12: An sawadwongporni 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 107 Bảng 3.17: Tần số alen mÃ hóa enzym HAD thành viên nhóm An maculatus Loµi N Alen/Rf a 89 An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An pseudowillmori d¹ng An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng 110 34 91 35 36 36 83 26 21 31 56 25 27 31 0,00 1,00 1,00 1,00 0,85 0,00 0,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Ghi chú: Ho: Số thể dị hợp tử quan sát Ho He 2 b 100 1,00 0,00 0,00 0,00 0,15 1,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5,4 0,73 He: Số thể dị hợp tử lý thuyết N: số cá thể nghiên cứu Qua phân tích hệ enzym nói nhận thấy 100% hệ enzym thể tính đa hình nội loài thể 14 locut gen tần xuất alen chúng, loài tính đa hình hệ enzym t-ơng đối cao Có thể nhận thấy hầu nh- locut gen thành viên nhóm loài Anopheles maculatus đa hình Các số liệu phân tích, đủ lớn tất phù hợp với công thức Hardy- Weinberg Số liệu điện di chứng minh đ-ợc nhóm loài An maculatus Việt Nam bao gồm nhiều thành viên nhóm loài gồm phức hợp loài đồng hình Một số izozym có khả để phân biệt thành viên nhóm loài An maculatus cao enzym khác nh6PGD, LDH, PGM Mối quan hệ di truyền (Hệ số t-ơng đồng di truyền: I khoảng cách di truyền: D) thành viên phức hợp An maculatus đ-ợc tổng kết bảng 3.18, 3.19 hình 3.38, 3.39 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 108 Bảng 3.18: Hệ số t-ơng đồng di truyền (I) khoảng cách di truyền (D) thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích izozym Hệ số t-ơng đồng di truyÒn (I) An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus **** 0,71 0,76 0,53 0,57 0,80 An notanandai 0,35 **** 0,85 0,61 0,50 0,54 An sawadwongporni 0,28 0,17 **** 0,72 0,52 0,56 An pseudowillmori 0,64 0,50 0,33 **** 0,50 0,46 An willmori 0,57 0,70 0,65 0,70 **** 0,52 An dravidicus 0,23 0,61 0,58 0,78 0,66 **** Khoảng cách di truyền (D) D An sawadwongporni An notanandai An pseudowillmori An maculatus An dravidicus An willmori Hình 3.38: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích izozym Đối với loài đÃ định tên khoảng cách di truyền loài biến động từ khoảng 0,46 đến 0,85 Gần An sawadwongporni vµ An notanandai 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 109 (I = 0,85; D = 0,17), xa nhÊt lµ lµ An pseudowillmori vµ An dravidicus (I = 0,46; D= 0,78) An dravidicus loài có quan hệ gần gũi với bốn loµi An pseudowillmori (I = 0,46; D = 0,78), An willmori (I = 0,52; D = 0,66), An notanandai (I = 0,54; D = 0,61) vµ An sawadwongporni (I = 0,56; D = 0,59) nh-ng l¹i cã mèi quan hƯ gần với An maculatus so với loài (I = 0,80; D = 0,23) Hệ số t-ơng đồng di truyền loài thể chúng loài họ hàng gần gũi, khác biệt di truyền An maculatus với loài thành viên khác không lớn, xa với An pseudowillmori (I = 0,53, D = 0,64) gần An dravidicus Tuy sáu loài loài độc lập nh-ng thể sơ đồ hình chúng tạo nên nhánh rõ: (1) An sawadwongporni An notanandai, (2) An pseudowillmori, (3) An maculatus vµ An dravidicus, (4) An willmori nhánh An willmori tách xa nhÊt so víi çc nh¸nh 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 110 Bảng 3.19: Hệ số t-ơng đồng di truyền khoảng cách di truyền thành viên toàn nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tÝch izozym 10 11 12 13 14 ** 0,01 0,35 0,24 0,31 0,28 0,28 0,65 0,66 0,57 0,64 0,23 0,53 0,18 0,99 ** 0,36 0,25 0,35 0,30 0,31 0,68 0,68 0,60 0,66 0,24 0,58 0,18 0,71 0,70 ** 0,24 0,17 0,13 0,17 0,51 0,54 0,70 0,77 0,61 0,32 0,26 0,79 0,78 0,79 ** 0,13 0,13 0,26 0,63 0,61 0,53 0,60 0,38 0,32 0,08 Hệ số t-ơng đồng di truyÒn (I) 0,73 0,75 0,76 0,52 0,51 0,70 0,74 0,74 0,51 0,51 0,84 0,88 0,85 0,60 0,58 0,88 0,88 0,77 0,53 0,54 ** 0,97 0,88 0,59 0,56 0,03 ** 0,89 0,60 0,59 0,13 0,11 ** 0,72 0,66 0,52 0,50 0,33 ** 0,89 0,58 0,53 0,41 0,12 ** 0,67 0,59 0,65 0,71 0,48 0,79 0,68 0,71 0,77 0,54 0,42 0,45 0,58 0,79 0,82 0,22 0,20 0,30 0,63 0,45 0,11 0,11 0,26 0,64 0,66 10 0,57 0,55 0,50 0,59 0,51 0,55 0,52 0,49 0,62 ** 0,02 0,66 0,49 0,52 11 0,53 0,52 0,46 0,55 0,45 0,51 0,49 0,46 0,59 0,98 ** 0,75 0,59 0,56 12 0,80 0,79 0,54 0,69 0,66 0,64 0,55 0,45 0,44 0,52 0,47 ** 0,68 0,29 13 0,59 0,56 0,73 0,73 0,80 0,82 0,74 0,53 0,63 0,61 0,55 0,51 ** 0,30 Khoảng cách di trun (D) Ghi chó: 1: An maculatus 4: An maculatus d¹ng 7: An sawadwongporni d¹ng 10: An willmori 13: An maculatus d¹ng 2: An maculatus d¹ng 5: An sawadwongporni 8: An pseudowillmori 11: An willmori d¹ng 14: An maculatus d¹ng 3: An notanandai 6: An sawadwongporni d¹ng 9: An pseudowillmori d¹ng 12: An dravidicus z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 14 0,84 0,83 0,77 0,92 0,89 0,89 0,77 0,53 0,52 0,60 0,57 0,75 0,74 ** 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 111 D An maculatus s.s An maculatus d¹ng An dravidicus An willmori An willmori d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni An notanandai An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus dạng An pseudowillmori An pseudowillmori dạng Hình 3.39: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên toàn nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích izozym Đối với 14 thành viên đầy đủ nhóm loài An maculatus, An maculatus An maculatus dạng gần gòi nhÊt (I = 0,99; D = 0,01), An dravidicus An pseudowillmori dạng gần gũi (I = 0,44; D = 0,82) Những dạng khác đ-ợc tách từ loài dựa vào dấu hiệu hình thái có hệ số t-ơng đồng gần Hệ số t-ơng đồng di truyền (D) ba dạng An sawadwongporni khoảng từ 0,88 đến 0,97 I từ 0,03 đến 0,13 Hệ số t-ơng đồng di truyền dạng An willmori 0,9844, khoảng cách di truyền 0,02 Hệ số t-ơng đồng hai dạng An pseudowillmori 0,89, D = 0,12 Hệ số t-ơng đồng di truyền An maculatus với dạng An pseudowillmori lµ xa nhÊt (I = 0,51 vµ 0,52; D = 0,66 vµ 0,65); tiÕp theo lµ víi nhãm An willmori (I = 0,53 vµ 0,57; D = 0,64 0,57), gần gũi nhóm dạng An sawadwongporni (I = 0,73; 0,75 vµ 0,76; D = 0,31; 0,28 0,28) An maculatus có quan hệ gÇn gịi víi An notanandai (I = 0,80; D = 0,35) vµ An dravidicus (I = 0,84; D = 0,23) Đối với dạng tách từ An maculatus, An maculatus dạng gần gũi với An maculatus (I = 0,99, D = 0,01), An maculatus d¹ng xa giống nh- loài tách biệt (I = 0,59; D = 0,53) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 112 C©y quan hƯ di trun cịng cho thÊy hai nhãm An pseudowillmori An willmori tách khỏi thành viên khác sớm Sau An maculatus, An maculatus dạng vµ An dravidicus häp thµnh nhãm Trong An maculatus An maculatus dạng gần Một cụm đ-ợc tách sớm đ-ơc chia thành nhánh nhỏ: An maculatus dạng tách thành nhánh riêng, nhánh gồm dạng gần gũi An maculatus dạng An maculatus d¹ng 6; nhãm cuèi cung gåm An notanandai dạng An sawadwongporni, An notanandai cách xa so với dạng An sawadwongporni 3.2.3 Kết phân tích đa hình dựa vào thị PCR-RFLP nhóm loài An maculatus Sau tách chiết, ADN mẫu thu thập đ-ợc nhân lên cặp mồi ITS2A ITS2B Đoạn đ-ợc nhân (ITS2) tất thành viên nhóm loài có kích th-ớc khoảng 500bp Đoạn ITS2 sau đ-ợc đem xử lý với 10 enzym cắt giới hạn - Enzym HaeIII 10 11 12 500 bp 350 bp 200 bp 150 bp Hình 3.40: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus enzym HeaIII Làn điện di 1: Thang chuẩn 50 bp Làn điện di 3: An maculatus Làn điện di 5: An notanandai Làn điện di 7: An willmori dạng Làn điện di 9: Đối chứng âm Làn điện di 11: An dravidicus Làn điện di 2: An sawadwongporni Làn điện di 4: An sawadwongporni dạng Làn điện di 6: An maculatus dạng Làn điện di 8: An willmori Làn điện di 10: An pseudowillmori Làn điện di 12: An maculatus d¹ng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 113 Qua kết enzym HeaIII cắt sản phẩm PCR đoạn ITS2 cđa nhãm loµi An maculatus cã thĨ chia thµnh nhãm nhá, nhãm thø nhÊt gåm An sawadwongporni, An maculatus An pseudowillmori, An notanandai, An willmori dạng An maculatus dạng thành nhóm thể không bị phân cắt enzym Nhóm thứ bị cắt thành băng rõ rệt 350 bp 150 bp An sawadwongporni dạng An dravidicus - Enzym HindII 10 11 12 500 bp 250 bp Hình 3.41: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus enzym HindII Làn ®iƯn di 2: An sawadwongporni Lµn ®iƯn di 4: An pseudowillmori Làn điện di 1: Thang chuẩn 50 bp Làn ®iƯn di 3: An maculatus Lµn ®iƯn di 5: An dravidicus Làn điện di 6: An notanandai Làn điện di 7: An maculatus dạng Làn điện di 8: An willmori Làn điện di 9: Chứng âm Làn điện di 10: An maculatus dạng Làn điện di 11: An sawadwongporni dạng Làn điện di 12: An sawadwongporni dạng Sản phẩm ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus hầu nhkhông bị phân cắt enzym HindII, trõ mét tr-êng hỵp cđa An dravidicus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 114 - Enzym Cfr131 T-ơng tự với tr-ờng hợp cđa enzym HindII, Cfr131 chØ cã thĨ ph©n biƯt An notanandai với thành viên khác nhóm loài - Enzym HindIII An notanandai cịng cã thĨ ph©n biƯt víi thành viên khác nhóm loài nhờ enzym HindIII nh-ng kết không đ-ợc rõ ràng - Enzym HeaII 10 11 12 350 bp 200 bp Hình 3.42: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus enzym HeaII Làn điện di 1: Thang chuẩn 50 bp Làn điện di 2: An sawadwongporni Làn điện di 3: An maculatus Làn điện di 4: An.sawadwongporni dạng Làn điện di 5: An notanandai Làn điện di 6: An maculatus dạng Làn điện di 7: An willmori dạng Làn điện di 8: An willmori Làn điện di 9: Đối chứng âm Làn điện di 10: An pseudowillmori Làn điện di 11: An dravidicus Làn điện di 12: An maculatus dạng Enzym HeaII phân biệt An willmori dạng với thành viên khác nhóm loài - Enzym MspI Các thành viên nhóm loài An maculatus đ-ợc phân biệt rõ ràng enzym MspI Sản phẩm đoạn ITS2 dạng An sawadwongporni đ-ợc enzym MspI cắt thành hai băng có kích th-ớc khoảng 330 bp 170 bp, đoạn ITS2 An maculatus đ-ợc cắt thành băng có kích th-ớc 330 bp, 200 bp, 170 bp 100 bp Đoạn ITS2 An willmori đ-ợc cắt thành băng có kích th-ớc 300 bp, 150 150bp 10 11 12 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 115 Hình 3.43: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus enzym MspI Làn điện di 1: Thang chuẩn 50 bp Làn điện di 2: An sawadwongporni Làn điện di 3: An maculatus Làn điện di 4: An sawadwongporni dạng Làn điện di 5: An notanandai Làn điện di 6: An maculatus dạng Làn điện di 7: An willmori dạng Làn điện di 8: An willmori Làn điện di 9: Đối chứng âm Làn ®iƯn di 10: An pseudowillmori Lµn ®iƯn di 11: An dravidicus Làn điện di 12: An maculatus dạng - Enzym XbaI 10 11 12 350 bp 200 bp 150 bp Hình 3.44: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus enzym XbaI Làn ®iƯn di 1: Thang chn 50 bp Lµn ®iƯn di 3: An maculatus Làn điện di 5: An notanandai Làn điện di 7: An willmori dạng Làn điện di 9: Đối chứng âm Làn điện di 11: An dravidicus Làn điện di 2: An sawadwongporni Làn điện di 4: An sawadwongporni dạng Làn điện di 6: An maculatus dạng Làn điện di 8: An willmori Làn điện di 10: An pseudowillmori Làn điện di 12: An maculatus dạng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 116 Một số thành viên nhóm loài phân biệt đ-ợc với dựa vào phân cắt enzym XbaI, nh-ng phân biệt không hoàn toàn mang tính tuyệt đối - Enzym AluI Enzym AluI cắt An sawadwongporni An willmori giống nhau, cắt An maculatus thành băng không cắt sản phẩm PCR đoạn ITS2 dạng loài khác Trong số 10 enzym sử dụng, nhận thấy hai enzym EcoRI, BamHI không cắt đoạn ITS2 Các enzym lại Cfr13l, MspI, Alul, HindII, HindIII, HaeII, HaeIII XbaI có khả cắt đoạn ITS2 tạo băng đa hình thành viên nhóm loài An maculatus mức độ khác 3.2.4 Kết đánh giá đa hình di truyền thành viên nhóm loài An maculatus dựa vào thị RAPD Tiến hành phản ứng PCR với mồi đơn ngẫu nhiên ADN khuôn thành viên nhóm loài Anopheles maculatus, thu đ-ợc kết nhsau: - Mồi A1 Mồi A1 cho kết băng rõ nét đa hình cao, băng nhân có kích th-ớc khoảng từ 0,15 đến 1,5 kb Mồi A1 tạo tất 26 băng đa hình thành viên nhóm loài An maculatus Có vùng có khả phân biệt loài nhóm loài vùng có kích th-ớc từ 0,6 đến Kb vùng có kích th-ớc từ 0,15 đến 0,4 Kb Trong vùng có kích th-ớc 0, 15 đến 0,4 kb vùng chứa 12 băng đa hình có khả phân biệt loài nhóm loài An maculatus râ rÖt nhÊt 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 117 10 11 12 13 14 15 16 17 1,5 Kb Kb 1,0 Kb 0,5 Kb 0,5 Kb 0,2 Kb 0,15 Kb Kb 0,1 Kb Hình 3.45: Sản phẩm phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi A1 Làn điện di 1: Thang chuẩn 50 bp Làn điện di 2: Đối chứng âm Làn điện di 3, 16: An maculatus Làn điện di 4: An maculatus dạng Làn điện di 5: An notanandai Làn điện di 6: An sawadwongporni Làn điện di 7: An sawadwongporni dạng Làn điện di 8: An sawadwongporni dạng Làn điện di 9: An maculatus dạng Làn điện di 10: An pseudowillmori dạng Làn điện di 11: An pseudowillmori dạng Làn điện di 12: An willmori Làn điện di 13: An willmori dạng Làn điện di 14: An dravidicus Làn điện di 15: An maculatus dạng Làn điện di 17: Thang chuÈn 100 bp - Måi A5 Måi A5 nh©n 23 băng đa hình có kích th-ớc 0,12 đến 1,4 Kb, 17 băng có kích th-ớc 0,25 đến 0,9 Kb cho phép phân biệt loài nhãm loµi An maculatus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 118 10 11 12 13 14 15 16 17 1,5 Kb Kb 1,0 Kb 0,5 Kb 0,5 Kb 0,2 Kb 0,15 Kb Kb 0,1 Kb Hình 3.46: Sản phẩm phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi A5 Làn điện di 1: Thang chuẩn 50 bp Làn điện di 2: Đối chứng âm Làn điện di 3, 16: An maculatus Làn điện di 4: An maculatus dạng Làn điện di 5: An notanandai Làn điện di 6: An sawadwongporni Làn điện di 7: An sawadwongporni dạng Làn điện di 8: An sawadwongporni dạng Làn điện di 9: An maculatus dạng Làn điện di 10: An pseudowillmori dạng Làn điện di 11: An pseudowillmori dạng Làn điện di 12: An willmori Làn điện di 13: An willmori dạng Làn điện di 14: An dravidicus Làn điện di 15: An maculatus dạng Làn điện di 17: Thang chuẩn 100 bp - Mồi F2 T-ơng tự nh- mồi trên, mồi F2 nhân băng có kích th-ớc từ 0,1 đến 1,8 Kb Đây mồi tạo nhiều băng đa hình nhất, tổng số băng đa hình tới 26 băng, có tới 20 băng nằm khoảng từ 0,1 đến 1,1 Kb thể khác biệt loài nhóm loài An maculatus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 119 10 11 12 13 14 15 16 17 1,5 Kb 1,0 Kb Kb 0,5 Kb 0,5 Kb 0,2 Kb 0,1 Kb 0,1 Kb Kb H×nh 3.47: S¶n phÈm cđa ph¶n øng RAPD- PCR sư dơng mồi F2 Làn điện di 1: Thang chuẩn 50 bp Làn điện di 2: Đối chứng âm Làn điện di 3, 16: An maculatus Làn điện di 4: An maculatus dạng Làn điện di 5: An notanandai Làn điện di 6: An sawadwongporni Làn điện di 7: An sawadwongporni dạng Làn điện di 8: An sawadwongporni dạng Làn điện di 9: An maculatus dạng Làn điện di 10: An pseudowillmori dạng Làn điện di 11: An pseudowillmori dạng Làn điện di 12: An willmori Làn điện di 13: An willmori dạng Làn điện di 14: An dravidicus Làn điện di 15: An maculatus dạng Làn điện di 17: Thang chuẩn 100 bp - Mồi OPL1 Mồi OPL1 cho băng rõ nét, băng nhân có kích th-ớc từ 0,1 đến 1,6 kb Các thành viên nhóm loài đ-ợc nhận biết 12 băng đa hình nằm khoảng kích th-ớc từ 0,1 đến 0,6 Kb Điều đ-ợc thể hình 3.55 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 120 10 11 12 13 14 15 16 17 1,5 Kb Kb 1,0 Kb 0,5 Kb 0,5 Kb 0,2 Kb 0,1 Kb 0,1 Kb Kb Hình 3.48: Sản phẩm phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi OPL1 Làn điện di 1: Thang chuẩn 50 bp Làn điện di 2: Đối chứng âm Làn điện di 3, 16: An maculatus Làn điện di 4: An maculatus dạng Làn điện di 5: An notanandai Làn điện di 6: An sawadwongporni Làn điện di 7: An sawadwongporni dạng Làn điện di 8: An sawadwongporni dạng Làn điện di 9: An maculatus dạng Làn điện di 10: An pseudowillmori dạng Làn điện di 11: An pseudowillmori dạng Làn ®iƯn di 12: An willmori Lµn ®iƯn di 13: An willmori dạng Làn điện di 14: An dravidicus Làn điện di 15: An maculatus dạng Làn điện di 17: Thang chn 100 bp - Måi OPA10 Sè l-ỵng băng đa hình mồi OPA10 tạo t-ơng đối lớn tới 25 băng có kích th-ớc từ 0,2 đến 1,5 kb Nh-ng số l-ợng băng đa hình để phân biệt loài lại nhỏ có băng nằm vùng từ 0,2 đến 0,5 kb 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 121 - Måi F4 vµ måi OPA4 Hai mồi nhân băng rõ nét nhiên tính đa hình băng đ-ợc nhân thấp khó việc phân loại thành viên nhãm loµi An maculatus 10 11 12 13 14 15 16 17 1,5 Kb Kb 1,0 Kb 0,5 Kb 0,5 Kb 0,2 Kb 0,1 Kb 0,1 Kb Kb H×nh 3.49: S¶n phÈm cđa ph¶n øng RAPD- PCR sư dơng mồi F4 Làn điện di 1: Thang chuẩn 50 bp Làn điện di 2: Đối chứng âm Làn điện di 3, 16: An maculatus Làn điện di 4: An maculatus dạng Làn điện di 5: An notanandai Làn điện di 6: An sawadwongporni Làn điện di 7: An sawadwongporni dạng Làn điện di 8: An sawadwongporni dạng Làn điện di 9: An maculatus dạng Làn điện di 10: An pseudowillmori dạng Làn điện di 11: An pseudowillmori dạng Làn điện di 12: An willmori Làn điện di 13: An willmori dạng Làn điện di 14: An dravidicus Làn điện di 15: An maculatus dạng Làn điện di 17: Thang chuẩn 100 bp 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 122 - NhËn xÐt chung: + TÊt mồi cho băng nhân rõ nét + Các băng ADN đ-ợc nhân mồi cho mức độ đa hình khác ®ã cã måi cã møc ®é ®a h×nh cao phân biệt loài rõ ràng måi A1, A5, F2, OPL1, OPA10 cßn hai måi F2 OPA4 có mức độ đa hình thấp khó phân biệt đ-ợc loài với Từ việc phân tích băng đa hình, áp dụng phần mềm TFPGA 3.1 để xử lý kết đ-a bảng ma trận t-ơng đồng di truyền quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus (Bảng 3-20, 3-21; Hình 3-50 3.51) Bảng 3.20: Hệ số t-ơng đồng di truyền(I) khoảng cách di truyền (D) thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa số liệu RAPD-PCR Hệ số t-ơng đồng di truyền (I) An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus **** 0,67 0,69 0,54 0,64 0,72 An notanandai 0,40 **** 0,72 0,64 0,72 0,61 An sawadwongporni 0,37 0,32 **** 0,67 0,70 0,56 An pseudowillmori 0,62 0,45 0,40 **** 0,62 0,60 An willmori 0,44 0,33 0,36 0,47 **** 0,57 An dravidicus 0,32 0,49 0,57 0,52 0,56 **** Kho¶ng çch di trun (D) D 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 123 An maculatus An dravidicus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori Hình 3.50: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR Đối với thành viên đÃ đ-ợc định tên, hệ số t-ơng đồng di truyền nằm khoảng từ 0,54 đến 0,72; khoảng cách di truyền biến đổi từ 0,32 đến 0,62 Các loài xa An maculatus vµ An pseudowillmori (I = 0,54; D = 0,63); Các loài có hệ số t-ơng đồng di truyền gần nhÊt lµ An maculatus vµ An dravidicus, An sawadwongporni An notanandai có hệ số t-ơng đồng I = 0,72 , D = 0,32 Sơ đồ hình thể rõ mối quan hệ này, chia thµnh nhãm: nhãm gåm An maculatus vµ An dravidicus, nhãm gåm An notanandai, An sawadwongporni vµ An pseudowillmori, An notanandai gần gũi với An sawadwongporni so với An pseudowillmori, nhóm An willmori tách riêng thành nhóm 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 124 Bảng 3.21: Hệ số t-ơng đồng di truyền khoảng cách di truyền thành viên toàn nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích RAPD-PCR 10 11 12 13 14 ** 0,19 0,33 0,28 0,36 0,38 0,30 0,44 0,44 0,46 0,41 0,47 0,29 0,26 0,83 ** 0,37 0,33 0,40 0,38 0,27 0,42 0,44 0,50 0,49 0,54 0,38 0,37 0,72 0,69 ** 0,33 0,32 0,328 0,36 0,40 0,40 0,46 0,45 0,45 0,42 0,41 Hệ số t-ơng đồng di truyền (I) 0,76 0,70 0,68 0,74 0,64 0,72 0,67 0,68 0,77 0,65 0,72 0,72 0,72 0,69 0,67 ** 0,75 0,78 0,74 0,66 0,29 ** 0,79 0,75 0,69 0,26 0,25 ** 0,778 0,66 0,30 0,29 0,26 ** 0,69 0,42 0,37 0,41 0,37 ** 0,46 0,45 0,41 0,49 0,26 0,53 0,43 0,39 0,45 0,43 0,47 0,40 0,34 0,38 0,40 0,52 0,40 0,36 0,48 0,62 0,34 0,35 0,31 0,35 0,43 0,33 0,38 0,32 0,32 0,46 0,64 0,64 0,67 0,63 0,64 0,66 0,61 0,77 ** 0,43 0,40 0,60 0,41 0,40 10 0,63 0,60 0,63 0,59 0,65 0,68 0,64 0,65 0,65 ** 0,12 0,42 0,43 0,44 11 0,66 0,61 0,64 0,62 0,67 0,71 0,68 0,67 0,67 0,89 ** 0,41 0,36 0,41 12 0,62 0,58 0,64 0,60 0,67 0,69 0,62 0,54 0,55 0,66 0,66 ** 0,36 0,41 Khoảng cách di truyền (D) Ghi chú: 1: An maculatus 4: An sawadwongporni 7: An dravidicus 10: An willmori 13: An maculatus d¹ng 2: An maculatus d¹ng 5: An sawadwongporni d¹ng 8: An pseudowillmori 11: An willmori d¹ng 14: An maculatus d¹ng 3: An notanandai 6: An sawadwongporni d¹ng 9: An pseudowillmori d¹ng 12: An maculatus d¹ng z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 13 0,75 0,68 0,66 0,71 0,70 0,73 0,70 0,65 0,66 0,65 0,70 0,70 ** 0,14 14 0,77 0,69 0,66 0,72 0,68 0,72 0,72 0,63 0,67 0,64 0,66 0,66 0,87 ** 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 125 D An willmori An willmori d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus An maculatus d¹ng An dravidicus An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni An notanandai An pseudowillmori An pseudowillmori dạng Hình 3.51: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR Hệ số t-ơng đồng di truyền 14 thành viên nhóm loài An maculatus biến động khoảng từ 0,54 đến 0,89, khoảng cách di truyền biến đổi từ 0,12 đến 0,62 An pseudowillmori An maculatus dạng có hệ số t-ơng đồng di truyền thấp (I = 0,54; D = 0,62) Các thành viên có quan hệ gần gũi An willmori An willmori dạng (I = 0,89; D = 0,12); An maculatus dạng An maculatus dạng (I = 0,87; 0,36) Hệ số t-ơng đồng di truyền dạng An sawadwongporni dao động khoảng từ 0,75 0,79, khoảng cách di truyền 0,24 đến 0,29 Hệ số t-ơng đồng di truyền dạng An pseudowillmori lµ 0,77, D = 0,26 XÐt mèi quan hƯ di truyền An maculatus với thành viên khác nhãm loµi thÊy r»ng: An maculatus cã quan hƯ xa nhÊt víi d¹ng An pseudowillmori (I = 0,64; D = 0,44), gần với với dạng An willmori (I = 0,63 0,66; D = 0,46 0,41) Hệ số t-ơng đồng di truyền An 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 126 sawadwongporni d¹ng 3, An sawadwongporni dạng An sawadwongporni với An maculatus lần l-ợt 0,68; 0,70 0,76 Hệ số t-ơng đồng di trun cđa An maculatus vµ An dravidicus lµ 0,77 thĨ mối quan hệ gần gũi loài Trong nội dạng khác An maculatus An maculatus An maculatus dạng gần gũi nhÊt (I = 0,83; D= 0,19), sau ®ã ®Õn An maculatus d¹ng (I = 0,77, D = 0,26), An maculatus dạng (I = 0,75; D = 0,29) xa với An maculatus dạng (I = 0,62; D = 0,47) cã biĨu hiƯn cđa mét loµi độc lập Sơ đồ hình đÃ biểu đ-ợc mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài Đầu tiên tách nhánh lớn nhánh gồm dạng gần gũi An willmori An maculatus dạng 3, thành viên tách sớm chứng tỏ loài độc lập nhóm loài Nhánh thứ gồm thành viên lại đ-ợc chia thành cụm: cụm dạng gần gũi An pseudowillmori, cụm gồm dạng lại cđa An maculatus vµ An dravidicus, cơm gåm dạng An sawadwongporni An notanandai Sơ đồ hình dựa kết phân tích RAPD-PCR t-ơng tự nh- sơ đồ hình dựa kết phân tích điện di enzym 3.2.5 Định loại thành viên nhóm loài An maculatus PCR đa mồi Gần việc phân tích ADN thành viên nhóm loài đÃ đ-ợc tiến hành số nhà nghiên cứu đÃ lựa chọn mồi đặc hiệu, sử dụng ph-ơng pháp PCR đa mồi để định loại chúng Chúng b-ớc đầu áp dụng ph-ơng pháp PCR đa mồi theo C Walton et al, Ma Ya Jun (2002) để định loại thành viên nhóm loài C Walton đÃ thiết kế mồi cho loài An maculatus, An sawadwongporni, An maculatus dạng K, An dravidicus An pseudowillmori với mẫu thu thập Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, không cã måi cho hai loµi An notanandai vµ An willmori Ma Ya Jun et al, (2002) ®· thiÕt kÕ måi có loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus phát hiƯn ë Trung Qc lµ An maculatus, An willmori, An dravidicus An sawadwongporni 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 127 Kết thÝ nghiƯm PCR ®a måi sư dơng måi cđa C.Walton với loài muỗi đÃ định tên Việt Nam thĨ hiƯn ë h×nh 3.52 10 11 12 H×nh 3.52: KÕt định loại thành viên nhóm loài An maculatus ph-ơng pháp PCR đa mồi theo C.Walton Làn ®iƯn di 1: marker 50 bp Lµn ®iƯn di 2: An maculatus Làn điện di 3: An pseudowillmori Làn điện di 4: An willmori Làn điện di 5: An dravidicus Làn điện di 6: An maculatus Làn điện di 7: An pseudowillmori Làn điện di 8: An notanandai Làn điện di 9: An maculatus Làn điện di 10: An sawadwongporni Làn điện di 11:An sawadwongporni Làn điện di 12: marker 100 bp Trong loài muỗi thử nghiệm với mồi C.Walton có loài bắt vị trí thiết kế An maculatus có kích th-ớc băng 180 bp, An sawadwongporni: 242 bp, An dravidicus: 477 bp vµ An pseudowillmori: 203 bp Muỗi An notanandai bắt mồi vào vị trí An maculatus dạng K kích th-ớc băng 301 bp An willmori bắt vào vị trí An sawadwongporni bắt vào vị trí An maculatus Khi sư dơng hƯ thèng måi cđa Ma Ya Jun có loài bắt vị trí loµi An maculatus, An dravidicus, An pseudowillmori vµ An willmori Trong mẫu An sawadwongporni không bắt vào vị trí mồi Ma Ya Jun thiết kÕ cho An sawadwongporni ë Trung Quèc Nh÷ng sù sai khác đ-ợc thảo luận kỹ phần bàn luận 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 128 3.2.6 Kết đánh giá đa hình di truyền thành viên nhóm loài An maculatus dựa vào kết giải trình tự đoạn ITS2 Do kết nghiên cứu điện di enzym, thị ADN nh- PCRRFLP, RAPD-PCR thể tính đa hình cao, kết hợp với kết thử nghiệm phức hợp đa mồi để phân loại nhóm loài An maculatus có điểm không thống nhất, tiến hành giải trình tự đoạn gen ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam nhằm tìm hiểu kỹ tính đa hình đoạn Đoạn gen ITS2 đ-ợc lựa chọn để giải trình tự, đoạn gen đ-ợc tập trung nghiên cứu nhiều loài côn trùng đặc biệt loài muỗi truyền sốt rét Đây đoạn gen đÃ đ-ợc tác giả tr-ớc nh- Y.J Ma (2002) C.Walton (2006) lựa chọn để thiết kế cặp mồi để phân loại loài nhóm loài An maculatus Với thành viên đÃ đ-ợc định tên nhóm loài giải trình tự 10 mẫu vật, dạng ch-a rõ dạng giải trình tự mẫu vật Kết giải trình tự đoạn giao gen ITS2 thành viên nhóm loài thu đ-ợc đoạn trình tù ADN cã kÝch th-íc tõ 507 ®Õn 519 bp, kết hoàn toàn phù hợp với kích th-ớc băng ADN chạy PCR để nhân đoạn gen lên Các đỉnh đồ thị thu đ-ợc rõ ràng, sắc nét, chồng chéo, chứng tỏ kết thu đ-ợc đáng tin cậy Hình 3.53: Hình ảnh giải trình tự đoạn gen ITS2 An maculatus d¹ng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 129 Sau thu đ-ợc trình tự tiến hành phân tích kết phần mềm MEGA 3.1 A B C D E F Hình 3.54: So sánh kết giải trình tự với mẫu đÃ đ-ợc l-u giữ ë Genebank A: mÉu An maculatus B: mÉu An notanandai C: mÉu An sawadwongporni D: mÉu An pseudowillmori E: mÉu An dravidicus F: mÉu An willmori 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 130 So sánh kết giải trình tự với trình tự đoạn ITS2 nhóm loài An maculatus tác giả tr-ớc đÃ công bố Genebank nhận thấy kết hoàn toàn phù hợp với kết tr-ớc đây, trừ tr-ờng hợp An notanandai lại có kết giải trình tự hoàn toàn giống với An maculatus dạng K đÃ công bố Genebank ch-a có trình tự An notanandai chuẩn Một điều nghi ngờ với tổ hợp mồi Y.J Ma (2002) không thu đ-ợc băng đặc tr-ng cho loài An sawadwongporni, muốn so sánh kết giải trình tự An sawadwongporni mà thu đ-ợc với trình tự An sawadwongporni Y.J Ma thu thập Vân Nam, Trung Quốc l-u giữ Genebank Kết cho thấy trình tù cña An sawadwongporni Ma Ya Jun thu thËp Vân Nam, Trung Quốc có điểm sai khác với trình tự An sawadwongporni thu thập Việt Nam nh- n-ớc Đông Nam khác (Hình 3.55) Nh-ng trình tự lại hoàn toàn trùng khíp víi tr×nh tù cđa An maculatus (H×nh 3.56) H×nh 3.5556: Sự khác biệt kết giải trình tự An sawadwongporni thu Vân Nam Trung Quốc với mẫu An sawadwongporni l-u giữ Genebank Hình 3.57: Kết t-ơng đồng trình tự An sawadwongporni thu Vân Nam Trung Quốc với mẫu An maculatus l-u giữ Genebank So sánh trình tự thành viên đÃ đ-ợc đặt tên nhóm loài nhận thấy chúng có độ sai khác từ đến 13% nucleotit (H×nh 3.57) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 131 H×nh 58: So sánh kết giải trình tự thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus Dựa sai khác trình tự nucleotit lập quan hệ di truyền thành viên nhóm loài Kết đ-ợc trình bày ë h×nh 3.58 An.notanandai 99 sawadwongporni VNQBP12-16 100 maculatus NA126 54 maculatus QN80 dravidicus Vietnam 36 willmori Vietnam pseudowillmori Vietnam 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 D Hình 3.59: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu giải trình tự đoạn ITS2 Có thể nhận thấy sơ đồ hình t-ơng tự nh- sơ đồ hình dựa số liệu phân tích từ điện di enzym RAPD-PCR Với dạng khác ch-a đ-ợc định tên sai khác trình tự ADN đoạn ITS2 so với loài đÃ đ-ợc đặt tên nhỏ, tỷ lệ t-ơng đồng lên tới 99%, trừ tr-ờng hợp An maculatus dạng Nghệ An, không liệt kê số liệu đây, cần có nghiên cứu sâu để có kết luận thức dạng Hình 3.59 hình ảnh so sánh trình tự nucleotit loài thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam với loài đÃ có số liệu l-u giữ genebank 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 132 Hình 3.60: So sánh kết giải trình tự thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus với trình tự nhóm loài đ-ợc l-u Genebank Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus đ-ợc trình bày hình 3.60 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 133 maculatus QN20 maculatus Malaysia (K) maculatus NA126 sawadwongporni China YN maculatus China (K) maculatus Thailand (K) 99 maculatus Viet Nam (K) maculatus China YN maculatus QN80 maculatus VN QN172 maculatus VN QN173 58 maculatus VN LS130 maculatus VN QN174 maculatus Cambodia (K) dravidicus Thailand 99 dravidicus China YN dravidicus Viet Nam sawadwongporni China2(K) 67 sawadwongporni Thailand(K) sawadwongporni Vietnam(K) 99 sawadwongporni VNQBP14-8 67 98 sawadwongporni Cambodia sawadwongporni VNQBP12-16 maculatus form K Cambodia maculatus form K Viet Nam 99 An.notanandai 28 maculatus form K Thailand willmori China YN 99 willmori Viet Nam 89 pseudowillmori China YN1 pseudowillmori Viet Nam 99 pseudowillmori Thailand(K) 97 pseudowillmori Vietnam(K) 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 D Hình 3.61: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu giải trình tự đoạn ITS2 số liệu đ-ợc l-u giữ Genebank 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 134 Qua số liệu hình ảnh phân tích nhận thấy sai khác trình tự nucleotit đoạn ITS2 loài thành viên nhóm loài An maculatus nhỏ d-ới 15% Trình tự loài thu thập từ Việt Nam trùng khớp với trình tự loài đ-ợc l-u giữ Genebank Tr-ờng hợp An sawadwongporni Y.J Ma (2002) thu thập Vân Nam Trung Quốc, trình tự trùng khớp với An maculatus, An maculatus dạng K theo C.Walton cộng (2006) có trình tự giống với An notanandai nghiên cứu Các vấn đề đ-ợc bàn kỹ phần bàn luận Bảng 3.22: So sánh dấu hiệu đa hình di truyền kiểu hình kiểu gen thành viên nhóm loài An maculatus Kiểu dấu hiệu Kiểu hình - Muỗi tr-ởng thành - Cơ quan sinh dục đực - Quăng - Bọ gậy - Trứng Di truyền tế bào Kiểu gen - Điện di enzym - RAPD-PCR - PCR-RFLP - PCR đa mồi - Trình tự đoạn ITS2 Các loài đÃ định tên Khác biệt rõ Kh¸c biƯt kh¸ râ Cã kh¸c biƯt Cã kh¸c biƯt Khác biệt rõ Khác biệt rõ Toàn 14 thành viên Nhiều dấu hiệu gối Có khác biệt NhiỊu dÊu hiƯu gèi NhiỊu dÊu hiƯu gèi Có khác biệt Nhiều dấu hiệu gối Các loài đồng hình Quần thể địa lý-bán loài(I = 0,46-0,84) phân loài (I = 0,78-0,99) Các loài đồng hình Bán loài - phânloài - loài (I = 0,54 0,72) đồng hình (I = 0,54-0,88) Các loài đồng hình (chỉ có Khác biệt không rõ ràng enzym) Các loài đồng hình Ch-a thể phân biệt đ-ợc, theo nhóm Các loài đồng hình Có khác biệt định 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 135 3.3 Thành phần loài phân bố thành viên nhóm loài An maculatus Căn vào dấu hiệu đa hình di truyền kiểu hình kiểu gen, đÃ xác định, Việt Nam nhóm loài An maculatus có 14 thành viên, có loài đÃ đ-ợc định tên là: An maculatus Theoblad, 1901; An dravidicus Christophers, 1924; An notanandai Rattanarithikul and Green, 1986; An pseudowillmori (Theobald, 1910), An sawadwongporni Rattanarithikul and Green, 1986; An willmori (James, 1903) Các thành viên khác ch-a đ-ợc định tên gồm: An maculatus dạng 3, An maculatus d¹ng 4, An maculatus d¹ng 5, An maculatus d¹ng 6, An pseudowillmori d¹ng 2, An sawadwongporni d¹ng 2, An sawadwongporni d¹ng 3, An willmori d¹ng D-íi bảng định loại dựa vào dấu hiệu hình thái pha phát triển phân bố thành viên đÃ đ-ợc định tên nhóm loài An maculatus Việt Nam 3.3.1 Bảng định loại thành viên đÃ xác định tên nhóm loài An maculatus - Bảng định loại muỗi tr-ởng thành nhóm loài An maculatus 1- Tấm l-ng đốt bụng II-IV có vẩy trắng - Tấm l-ng đốt bụng II-IV vẩy trắng 2- Chỗ chia nhánh gân L2 th-ờng có đám vẩy đen - Chỗ chia nhánh gân L2 đám vẩy đen 3- Cuối l-ng đốt bụng IV-VI th-ờng có hàng vẩy đen - Cuối l-ng đốt bụng IV-VI th-ờng hàng vẩy đen có vài vẩy đen mép bên 4- Muỗi lớn, gân L3 có điểm đen hai đầu mút. - Muỗi trung bình, gân L3 điểm đen hai đầu mút có băng đen lớn 5- Tấm l-ng đốt bụng V-VIII có vẩy trắng - Chỉ có vẩy trắng l-ng đốt bụng VIII. 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z An notanandai An sawadwongporni An willmori An dravidicus An maculatus An pseudowillmori 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 136 - Bảng định loại quăng nhóm loài An maculatus 1- Chỉ số bánh lái 1,2, bờ gai cứng gần 1/2 bờ cong - Chỉ số bánh lái từ 1,4 đến 1,6 2- Gai bên đốt bụng IV ngắn 1/8-1/10 gai bên đốt bụng V, (gai cứng bánh lái 2/5 bờ cong ngoài, số bánh lái: 1,6) - Gai bên đốt bụng IV không ngắn nh- 3- Chỉ số bánh lái 1,5; bê gai cøng b»ng 3/5 bê cong ngoµi, gai bên đốt bụng IV dài 1/3 đến 1/4 gai bên đốt bụng V - Chỉ số bánh lái 1,4; bê gai cøng b»ng 1/3-2/5 bê cong ngoµi, gai bên đốt bụng IV 1/5 gai bên đốt bụng V………… 4- Bê gai cøng b»ng 2/5 bê cong ngoµi b¸nh l¸i………………… - Bê gai cøng b»ng 1/3 bê cong bánh lái An notanandai An pseudowillmori An willmori An sawadwongporni An maculatus An dravidicus - B¶ng định loại bọ gậy nhóm loài An maculatus 1- Lông số đốt bụng II hình cọ có roi rõ - Lông số đốt bụng II hình cọ nh-ng roi 2- Lông số đốt bụng III-VII mảnh, phần roi dài 1/2 phần thân, lông cọ có sắc tố rõ toàn thân - Lông số đốt bụng III-VII to ngang, phần roi dài 1/3 thân, lông cọ có sắc tổ 3- Khánh đốt bụng III-VII nhỏ, chiều ngang 3,5 - lần chiều dọc; lông cọ đốt bụng III-VII có roi 1/3 thân - Khánh đốt bụng III-VII to, chiều ngang 2,5 lần chiều dọc; lông cọ đốt bụng III-VII có roi ngắn 1/4-1/5 thân 4- Roi lông cọ đốt bụng II-V tù, 1/4 chiều dài An willmori thân, sắc tố rải rác - Roi lông cọ đốt bụng II-V nhọn nh-ng ngắn 1/5 chiều dài thân, sắc tố lông cọ không rõ 5- Lông số IV ngực th-ờng nhánh, kitin sau hình củ lạc nằm sát mép sau kitin tr-ớc - Lông số IV ngực th-ờng nhánh, kitin sau hình tròn nhỏ, bị kitin tr-ớc ®Ì lªn…………………………… An pseudowillmori 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z An dravidicus An maculatus An notanandai An sawadwongporni 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 137 - Bảng định loại trứng nhóm An maculatus 1- Khoang trứng có chiều rộng tạo thành đ-ờng thẳng - Khoang trứng không tạo thành đ-ờng thẳng An sawadwongporni 2- Phần khoang trứng phình rộng sát màng film - Phần khoang trứng không phình rộng nh- An willmori 3- Số rẻ phao nỉi Ýt (13-15)………………………………… …… An notanandai - Sè rỴ phao th-ờng lớn 15 4- Số rẻ phao từ 18-23…………………………………… ……… - Sè rỴ phao 15 -21……………………………………………… An pseudowillmori An maculatus An dravidicus 3.3.2 Ph©n bè cđa thành viên nhóm loài An maculatus Phân bố thành viên nhóm loài An maculatus đ-ợc trình bày bảng 3.23, hình 3.70 Có thể thấy muỗi An maculatus loài phân bố rộng tìm thấy tất điểm điều tra Muỗi An sawadwongporni chiÕm -u thÕ ë miỊn rõng nói tõ tØnh Quảng Bình trở vào phía Nam Muỗi An willmori An pseudowillmori chủ yếu tìm thấy tỉnh phía Bắc, từ Quảng Bình trở Muỗi An notanandai An dravidicus gặp thấy vài địa điểm 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 138 Bảng 3.23: Phân bố loài thành viên nhóm loài An maculatus Stt Tªn tØnh An maculatus An dravidicus An notanandai An pseudowillmori An sawadwongporni An willmori Các dạng khác Tổng cộng Qu¶ng Ninh 46 0 0 50 Cao B»ng 37 0 1 17 66 Lạng Sơn 51 1 62 Bắc Cạn 67 0 0 13 81 Thái Nguyên 41 0 0 44 Lµo Cai 40 0 32 10 84 Yên Bái 35 46 Tuyªn Quang 27 0 1 35 Hµ Giang 18 0 30 10 Lai Ch©u 15 0 1 21 11 Điện Biên 10 0 0 11 12 S¬n La 305 12 51 17 12 401 13 Hoà Bình 388 28 425 14 Ninh B×nh 43 0 51 15 Hµ Nam 58 0 0 65 16 Thanh Ho¸ 17 0 30 17 NghÖ An 19 0 25 11 57 18 Hµ TÜnh 22 0 10 12 50 19 Qu¶ng B×nh 89 12 533 42 681 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 139 20 Quảng Trị 40 0 107 10 157 21 Thõa HuÕ 34 141 12 188 22 Qu¶ng Nam 10 0 51 0 61 23 Qu¶ng Ng·i 12 0 64 10 88 24 Bình Định 0 105 0 113 25 Phó Yªn 14 0 116 12 142 26 Khánh Hoà 45 0 125 15 185 27 B×nh ThuËn 12 0 41 60 28 Ninh ThuËn 14 98 125 29 KonTum 17 55 84 30 Gia Lai 22 96 13 135 31 Đắc Lắc 115 133 32 Đắc Nông 0 41 51 33 Lâm Đồng 12 0 67 84 34 B×nh Ph-íc 0 51 60 35 Bình D-ơng 11 0 48 62 36 §ång Nai 10 0 51 65 1611 18 28 104 1950 36 324 4071 Tỉng céng Thiªn z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 140 $$ Lai Chau V &Z $ Z V$ & Dien Bien Z$ $ V & Cao Bang $ V & Ha G iang $$ V & Z $ Z$ $ Lao Cai V & Tuyen Bac Kan Lang $$ Z Quang Son V & $ Yen Bai $ T hai Nguyen Phu $ Vi n h Tho Ph u c V & Bac G iang Son La Ha Quang Ninh Ha Bac N in h $% U Z& $ No i Ta y H a i V & $ Hu n g Du o ng $ Binh Ye n Ha i Pho n g Hoa V & Ha N am Ni$ n h Bin h $x z z x Thanh Hoa $x z Tha i Bin h Na m D i nh Nghe An $$ z Zx Ha T inh $ x z ' Z V $ & U % Quang Binh $ $x z Quang Tri U % $ x z Thua Thien - Hue Da Nang A n.m a c u la tu s z x A n.s a wa d w o ng p o r n i (X A n.n o ta n a n d a i U % A n.d r a vi d icu s 'W A n.w il lm o r i T $ A n.p s e u w il lm o ri $ z x Quang Nam $z x Kon T um x $ z Quang Ngai $ x z Gia Lai $ x z $z x Dak Nong $ x z Binh Phuoc Tay N inh Binh Duo ng Dak Lak $z x Binh Dinh $x z Phu Yen $x z Khanh Hoa $x z Lam D ong $x z U ' % Ninh Thuan Dong Na i $ z x $ x z Binh Thuan TP H o C hi Minh An Giang Dong Long A n Thap Tien G iang Ba Ria - Vung Tau Can Tho Vinh Ben T re Long Kien Hau Tra Giang Giang Vinh So c Trang Ca Mau Bac Lieu Hình 3.62: Phân bố loài nhãm loµi An maculatus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 141 3.4 Vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài An maculatus Chúng tiến hành kỹ thuật ELISA để đánh giá vai trò truyền bệnh nhóm loài An maculatus hai địa điểm có tỷ lệ sốt rét cao Khánh Phú, Khánh Vĩnh tỉnh Khánh Hoà Đắc Ơ, Ph-ớc Long, tỉnh Bình Ph-ớc Sau kiểm tra lại kỹ thuật PCR Kết thử nghiệm đ-ợc trình bày bảng 3.24, 3.25 hình 3.71 3.72 Bảng 3.24: Kết thử nghiệm ELISA đánh giá vai trò truyền bệnh muỗi nhóm loài An maculatus Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà Loài muỗi Số muỗi thử 348 P.f An sawadwongporni 417 Các loài khác 127 Tổng céng 912 (0,22%) P.v: Plasmodium vivax An maculatus Ghi chó: P.f: Plasmodium falciparum ELISA (+) P.v (0,57%) 0 Tỉng céng (0,57%) 0 (0,22%) B¶ng 3.25: Kết thử nghiệm ELISA đánh giá vai trò truyền bệnh muỗi nhóm loài An maculatus Đắc Ơ, Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc Loài muỗi Số muỗi thử 342 An sawadwongporni 218 P.f (0.58%) Các loài kh¸c 40 Tỉng céng 600 An maculatus EliSA (+) P.v 0 Tæng céng (0.58%) 0 (0,33%) (0%) Ghi chó: P.f: Plasmodium falciparum P.v: Plasmodium vivax 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z (0,33%) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 142 10 11 12 A B C D E F G H H×nh 3.63: Kết thử nghiệm ELISA xác định thoa trùng P.vivax muỗi An maculatus Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà - Giếng A2 đối chứng d-ơng - Giếng D6 G10: mẫu d-ơng tính với P.vivax Việc định loại loài muỗi loài KST đÃ đ-ợc kiểm tra lại b»ng kü thuËt PCR Hình 3.64: Kết kiểm tra mẫu muỗi nhiễm P.falciparum Đắc Ơ, Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc kỹ thuật PCR lồng - Làn điện di 1: Thang chuẩn Làn điện di 2, 6: P.falciparum Làn ®iƯn di 3,7: P.vivax Lµn ®iƯn di 4,8: P.malariae Lµn ®iƯn di 5,9: P.ovale 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 143 Hai loµi muỗi chiếm -u An maculatus An sawadwongporni thu thập ph-ơng pháp mồi ng-ời bẫy đèn đÃ đ-ợc dùng để thử nghiệm đánh gía vai trò truyền bệnh chúng hai địa ph-ơng sốt rét l-u hành nặng Kết cho thấy muỗi An maculatus có phản ứng d-ơng tính với kháng thể đơn dòng loài ký sinh trùng P.falciparum P.vivax Tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà có tổng số 348 muỗi thử nghiệm nhiễm KST P.vivax chiếm tỷ lệ 0,57% Tại Đắc Ơ, Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc cã An maculatus nhiÔm KST P.falciparum sè 342 muỗi thử nghiệm (chiếm tỷ lệ 0,58%) Nh- tính chung cho hai điểm, loài An maculatus nhiễm KST víi tû lƯ lµ 0,58%, (0,29% P.falciparum vµ 0,29% P.vivax) Cũng hai điểm có 635 muỗi An sawadwongporni 167 muỗi loài khác nhóm loài An maculatus đÃ đ-ợc kiểm tra nh-ng không thấy tr-ờng hợp d-ơng tính Chúng đÃ tiến hành thử nghiệm ELISA với 270 mẫu muỗi thuộc nhóm loài An maculatus thu thập ph-ơng pháp mồi ng-ời, soi nhà ngày bẫy đèn tỉnh Quảng Bình (112 muỗi), Sơn La (38 muỗi) Hoà Bình (20 muỗi) Kết cho thấy tr-ờng hợp nhiễm KST Có thể tình hình sốt rét tỉnh không nặng nề nh- hai tỉnh Khánh Hoà Bình Ph-ớc, khó gặp tr-ờng hợp nhiễm KST sốt rét loài muỗi nhóm loài có loài muỗi đ-ợc coi vectơ sốt rét thứ yếu 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 144 Ch-ơng 4: Bàn luận 4.1 Đa hình di truyền mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus 4.1.1.Đa hình dấu hiệu kiểu hình thành viên nhóm loài An maculatus - Đa hình di truyền dấu hiệu hình thái + Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành Mặc dù loài muỗi An maculatus đ-ợc Theobald phát mô tả lần vào năm 1901 Hồng Kông, Trung Quốc nh-ng hầu hết loài mô tả sau nh- An willmori James, 1903; An indicaus Theobald, 1907; An dudgeonii Theobald, 1907; An pseudowillmori Theobald, 1910; An maculosa James vµ Liston, 1911; An dravidicus Christophers, 1924 đ-ợc tìm thấy tiều lục địa ấn Độ (ấn Độ Pakistan) Năm 1925, Yamada tìm thấy An hanabusai đảo Đài Loan [156] Những mô tả loài nêu dựa vào dấu hiệu hình thái muỗi tr-ởng thành Các dấu hiệu đ-ợc sử dụng để xác định loài, loài phụ dạng thông th-ờng vẩy phân bố l-ng đốt bụng gân cánh Những dấu hiệu th-ờng có biến đổi gối loài nên nhiều chúng đ-ợc coi thứ (variant) dạng (form) An maculatus (Reid, 1968) [160] Vài thập kỷ gần đây, đÃ có nghiên cứu phân loại thành viên nhóm loài khu vực Đông Nam bên cạnh dấu hiệu hình thái kết hợp với dấu hiệu di truyền tế bào, điện di enzym Năm 1986, Rattanarithikul Green đÃ mô tả hình thái muỗi tr-ởng thành hình thái trứng loài muỗi thuộc phức hợp An maculatus Thái Lan có mô tả hai loài An sawadwongporni An notanandai [6, 10, 156] Rattanarithikul vµ Harbach (1990) cịng đÃ mô tả hình thái hai loài muỗi phát hiƯn ë Phillipine lµ An dispar vµ An greeni [6, 10, 157] Do dấu hiệu hình thái đ-ợc sử dụng để nhận dạng loài nhóm loài đa hình gối nên nhiều việc nhận dạng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 145 dựa vào dấu hiệu hình thái pha phát triển muỗi tr-ởng thành khó khăn Ngay sử dụng kiểu dấu hiệu để nhận dạng thành viên nhóm việc dễ dàng Sự đa hình mặt hình thái phân bố vẩy l-ng bụng gân cánh ví dụ minh chứng cho điều Khi nghiên cứu để mô tả xây dựng khoá định loại cho thành viên nhóm loài Thái Lan, Rattanarithikul Green (1986) [156] đÃ dựa vào hình thái vảy (hình liềm, hình thìa) phân bố vảy (độ lớn băng vảy đen trắng gân cánh, phân bố vẩy đen trắng l-ng đốt bụng) Tuy nhiên, tác giả không dám tin t-ởng chắn vào khoá định loại khoá định loại ch-a đ-ợc kiểm tra số mẫu vật thu thập toàn n-ớc Thái Lan nh-ng đảm bảo 98% giá trị trung bình dấu hiệu định loại [156] Chính đa hình dấu hiệu hình thái mà tác giả đÃ không xây dựng đ-ợc khoá định loại l-ỡng phân hoàn chỉnh đáng tin cậy cho thành viên nhóm Thái Lan Kết nghiên cứu đ-ợc trình bày ch-ơng cho thấy tính đa hình dấu hiệu hình thái giai đoạn muỗi tr-ởng thành thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam có nhiều điểm giống với muỗi Thái Lan Mặc dầu vậy, nhận thấy rằng: có dấu hiệu hình thái đa hình gối nh-ng hình thái, cấu tạo, màu sắc phân bố vảy l-ng đốt bụng nh- hệ thống gân cánh giúp ta phân biệt đ-ợc thành viên nhóm loài này, phân bố vảy đốt bụng yếu tố quan trọng để nhận biết loài Loài An pseudowillmori dễ dàng phân biệt với loài khác nhóm đặc điểm có vẩy trắng cuối đốt bụng VII đốt bụng VIII VỊ dÊu hiƯu nµy, An pseudowillmori gièng víi hai loµi An dispar An greeni phân bố Phillippine [157] Dấu hiệu có vẩy trắng đốt bụng IIVIII đặc điểm loài An willmori, An dravidicus, An sawadwongporni, An notanandai để phân biệt với An maculatus th-ờng có vẩy trắng từ đốt bụng V đến ®èt bơng VIII Tuy vËy, sè mÉu vËt cđa phân tích có dạng An maculatus có vẩy trắng rải rác từ đốt bụng II đến đốt bụng VIII, gọi An maculatus dạng thêm dạng An maculatus mà đa số mẫu vật có vẩy trắng đốt bụng VII VIII gọi An maculatus dạng Hình dáng màu sắc vẩy tạo nên khác biệt thành viên 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 146 nhóm Ví dụ: An maculatus dạng khác với dạng An maculatus khác đặc điểm vảy l-ng đốt bụng V-VIII có hình liềm ánh vàng T-ơng tự nh- có khác biệt cấu tạo màu sắc vảy An willmori dạng An willmori dạng Sự đa hình hình thái thấy ba dạng An sawadwongporni An sawadwongporni dạng có đặc điểm vảy l-ng bụng II-VIII giống với An sawadwongporni dạng nh-ng cánh lại có đặc điểm giống víi An maculatus Ngoµi sè mÉu vËt cđa có An maculatus dạng giống dạng muỗi giống An willmori mà Reid (1968) đÃ trích dẫn từ tài liệu Christophers [160] Tóm lại thành viên nhóm loài An maculatus có đặc điểm đa hình mặt hình thái đặc điểm có biến dị gối làm cho ta khó phân biệt loài gần gũi dựa vào đặc điểm hình thái pha phát triển + Về hình thái quan sinh dục đực thành viên nhóm loài An maculatus Cơ quan sinh dục đực dấu hiệu quan trọng để nhận biết loài đồng hình muỗi thuộc họ phụ Culicinae, việc phân tích đa hình hình thái quan sinh dục muỗi đực số giống (chi) quan sinh dục muỗi cung cấp dẫn liệu có giá trị cao phân loại chúng muỗi Anopheles, th-ờng dấu hiệu hình thái muỗi tr-ởng thành đÃ đủ để nhận biết loài nên nhiều dấu hiệu đa hình quan sinh dục đực đ-ợc quan tâm trừ số nhóm loài nh- An aikenii Riêng muỗi thuộc nhóm loài An maculatus, mẫu chuẩn bắt đ-ợc Hồng Kông muỗi đực [114] nh-ng mô tả quan sinh dục đực thành viên nhóm loài đÃ đầy đủ tài liệu Ngay tài liệu mô tả sáu loài muỗi nhóm loài Thái Lan Rattanarithikul Green (1986) viết chi tiết dấu hiệu hình thái muỗi đực muỗi nh-ng lại không mô tả cấu tạo quan sinh dục muỗi đực [156] Những nghiên cứu sau Rattanarithikul Harbach [157] với muỗi Philippine Lục Bảo Lân [125] với loài muỗi thuộc nhóm loài An maculatus có miêu tả quan sinh dục đực thành viên nhóm loài 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 147 Mô tả quan sinh dục đực An maculatus theo tài liệu khác t-ơng tự Christophers mô tả nắp gai giao cấu loài muỗi gồm có gai lông đỉnh dài thuỳ l-ng nhiều có 1-3 lông nhỏ, phụ gai giao cấu gồm có 5-7 nhỏ bên; lớn có gai c-a mặt bên (theo Reid, 1968) [160] Mô tả Rattanarithikul vµ Harbach (1990) víi mÉu vËt thu thËp ë Hång Kông nhsau: Nắp giao cấu có cụm hình chuỳ đ-ợc hình thành từ 2-4 nhánh thân riêng rẽ, bờ l-ng lông đỉnh mảnh dài cụm hình chuỳ, lông nhỏ bờ bụng, mặt bụng có nhiều gai nhá Gai giao cÊu hĐp, ngän cã hc nhánh dạng nhánh dạng mũi mác bên Ngọn nhánh có gai rải rác dọc cạnh bên Thuỳ hậu môn có màng, mép bên có c-a Cơ quan sinh dục đực An greeni An dispar đ-ợc mô tả t-ơng tự với An maculatus [156] Lục Bảo Lân (1997) đÃ mô tả quan sinh dục đực muỗi An maculatus, An dravidicus, An sawadwongporni, An pseudowillmori An willmori Trung Quốc giống giống với mô tả Christophers Rattanarithikul [125] Kết nghiên cứu thấy rằng, dấu hiệu quan sinh dục đực thành viên nhóm loài An maculatus đa hình có dấu hiệu gối nh-ng đ-ợc di truyền tách biệt loài với dựa vào phân tích chi tiết cấu tạo nắp gai giao cấu (cấu tạo thuỳ l-ng, thuỳ bụng), gai giao cấu (hình dạng gai giao cấu, số l-ợng cấu tạo phụ gai giao cấu), hậu môn v.v Kết hợp dấu hiệu quan sinh dục đực với dấu hiệu khác khẳng định vị trí phân loại thành viên nhóm loài Đây lần đầu tiên, đa hình di truyền dấu hiệu hình thái quan sinh dục đực thành viên nhóm loài An maculatus đ-ợc phân tích đầy đủ đ-ợc sử dụng phân loại nhóm loài + Về hình thái giai đoạn nhộng Nhộng An maculatus đ-ợc Reid (1968) dựa vào mô tả Christophers (1933) Crawford (1938) tóm tắt với đặc điểm nhsau: phễu thở đơn giản, có rÃnh cuống sâu, phần cuống ống thở 1/ chiều dài phễu thở, gai bên màu đen vừa phải, gai đốt bụng sau dài vuốt nhọn phía ngọn, gai bên đốt bụng VI dài khoảng 1/ chiều dài đốt bụng VII (trong khoảng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 148 0,44-0,73); gai bên đốt bụng IV 1/ dài chiều dài đốt bụng IV khoảng 1/ chiều dài gai bên đốt bụng V; gai bên đốt bụng IV khoảng 1/4 -1/2 chiều dài đốt bụng IV; gai bên đốt bụng VIII th-ờng có 11-16 nhánh nhánh Lông số đốt bụng V-VII mập, đơn, dài chiều dài đốt, lông ngắn chia nhánh đốt bụng IV trở lên Lông số V đốt bụng V-VII có khoảng 3-6 nhánh, đơn gần nh- đơn (thấy vài mẫu cao nguyên Cameron, Malaysia) Lông số đốt bụng VII th-ờng đơn chẽ đôi Bánh lái bao sinh dục th-ờng sáng đồng mầu, chiều rộng bánh lái khoảng 3/ chiều dài (chỉ số bánh lái 1,4 1,5) Diềm gai bánh lái nói chung chiếm khoảng 3/4 chiều dài bánh lái nh-ng có thay đổi th-ờng đoạn cuối gai nhỏ chuyển tiếp đến phần diềm Lông bánh lái mập uốn cong, kéo duỗi chiều dài khoảng 1/3 chiều dài bánh lái [160] Rattanarithikul Harbach (1990) mô tả nhộng An maculatus thu thập Hồng Kông t-ơng tự: phễu thở đơn giản với rÃnh ống thở sâu, chiỊu dµi 0,38 – 0,46 mm, chiỊu réng 0,08 – 0,11mm, lông 9, II-IV ngắn, tù, dạng sừng, lông số đốt bụng V-VII dài, nhọn đầu, có dạng gai, tỷ số 9-III/9-IV: ,26-0,67 (trung bình 0,41); 9-IV/9-V: 0,18-0,38 (trung bình 0,27); lông 9-VIII có -14 nhánh (trung bình 11 nhánh); lông số 1-V-VIII đơn, dài dài chiều dài đốt bụng sau Bánh lái: chØ sè b¸nh l¸i 1,4-2,0; diỊm b¸nh l¸i chiỊu réng khoảng 0,5 bờ bánh lái, thay đổi từ phần gờ có gai cứng đến phần diềm không gai cøng chiÕm 0,75 – 0,92 kÓ tõ gèc, cã khoảng 9-20 tơ diềm không hình gai phía tr-ớc lông bánh lái, bờ bánh lái có số tơ diềm gần với lông bánh lái Lông bánh lái mập, cong chiếm khoảng 0,33 0,54 chiều dài bánh lái; lông phụ bánh lái có từ 1-3 nhánh [157] Nh- dấu hiệu đa hình hình thái sử dụng nhiều việc nhận dạng quăng An maculatus gai bên đốt bụng (lông số 9); cấu tạo bánh lái (chỉ số bánh lái, số diềm bánh lái) Những dấu hiệu loài An maculatus có khoảng biến đổi lớn Trong nghiên cứu mình, dựa vào số để phân tích tính đa hình hình thái giai đoạn nhộng lựa chọn dấu hiệu điển hình để phân biệt thành viên nhóm Nhìn chung dấu hiệu gai bên đốt bụng IV số bánh lái nh- số diềm bánh lái dấu hiệu tốt để nhận dạng loài 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 149 Trong nghiên cứu chúng tôi, có điều khác rõ nét so với nghiên cứu Rattanarithikul Harbach (1990) là: muỗi An pseudowillmori (dạng dạng 2) có gai bên đốt bụng IV dài nhọn giống nh- An.greeni An dispar phân bố Philippine Theo hai tác giả trên, tất loài muỗi thuộc nhóm An maculatus (bao gồm An pseudowillmori) phân bố đất liền Thái Lan có gai bên đốt bụng IV nhộng ngắn tù Chính sai khác nên loài muỗi Philippine đÃ đ-ợc đặt tên loài An greeni An dispar [157] Tuy nhiên, theo trao đổi thông tin cá nhân gần với Harbach, tác giả đÃ công nhận rằng, gai bên đốt bụng IV nhộng loài An pseudowillmori Thái Lan dài nhọn giống kết nghiên cứu Tóm lại, giống nh- giai đoạn tr-ởng thành, dấu hiệu hình thái nhộng thành viên nhóm loài An maculatus đa hình biến đổi, có nhiều dấu hiệu gối Nh-ng dựa đặc điểm gai bên đốt bụng IV, số bánh lái, cố gai diềm bánh lái đ-a đặc điểm nhận dạng thành viên nhóm loài + Về hình thái giai đoạn bọ gậy Giai đoạn bọ gậy giai đoạn phức tạp ta lựa chọn dấu hiệu phân tích tính đa hình liên quan đến việc định loại loài thành viên phức hợp loài đồng hình Có khoảng 200 dấu hiệu cần phân tích định tính nh- định l-ợng Ví dụ: định tính phân tích hình dạng lông cọ, phân bố sắc tố lông cọ, hình dạng kitin l-ng v.v., định l-ợng cần phải đếm nhánh lông, số phần phần thân cọ v.v Do theo tác giả tr-íc, lùa chän mét sè dÊu hiƯu quan träng ®Ĩ phân tích Theo số tài liệu nghiên cứu An maculatus tr-ớc đây, tóm tắt đặc điểm bọ gậy An maculatus nhsau: Phần đầu: lông môi lông môi mập, vuốt nhọn có nhánh nhỏ hai bên, nhánh nhìn rõ nh-ng nhỏ quan sát độ phóng đại lớn đặc biệt với lông môi trong, lông môi sau đơn, chẻ đôi Lông đ-ờng nối đơn, chẻ đôi, lông đ-ờng nối có 2-5 nhánh ngắn 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 150 Phần ngực: lông vai mËp th-êng cã 20 nh¸nh (15-20) nh-ng çc mÉu vËt ấn Độ Philippine nhánh (12-24 14-21); lông vai mập có 14 -24 nhánh có gốc riêng với gốc lông vai lông bờ s-ờn có đặc điểm chung series: Ngực tr-ớc có lông chia nhánh lông đơn, ngực có lông chia nhánh, lông đơn, ngực sau có lông chia nhánh Phần bụng: Lông cọ đốt bụng nhỏ, không phát triển dạng nhỏ; lông cọ đốt bụng II phát triển nh-ng không đầy đủ kích th-ớc, phiến cọ có roi ngắn Lông cọ đốt bụng III-VII phát triển đầy đủ, phần chiếm từ 1/2 đến 3/4 chiều dài cọ, mút th-ờng có sắc tố Lông bên đốt bụng V-VI có từ 3-6 nhánh Lông 4-I có 6-8 nhánh; lông 5-II có 4-6 nhánh Tấm kitin l-ng có kích th-ớc từ nhỏ đến trung bình, từ đốt bụng II có thêm kitin nhỏ tròn phía sau L-ợc có 3-5 dài 8-11 nhỏ [156] Mô tả bọ gậy An maculatus mẫu vật thu thập Hồng Kông theo Rattanarithikul Và Harbach (1990) [157] t-ơng tự, tóm tắt nhsau: Đầu: lông 2-C mập, có 4-14 tơ bên nhỏ, đơn chẻ đôi ngọn, lông 3-C có 2-10 tơ bên, chẻ đôi ngọn; lông 4-C đơn Bụng: lông 1-I có 5-10 nhánh hình mũi mác (không hình lá), lông 1-II có 9-16 nhánh hình mũi mác có hình cọ phát triển không đầy đủ, có roi roi 0,2 chiều dài phiến cọ Lông 1-III-VII phát triển thành hình cọ với roi 0,15-0,33 chiều dài [157] Nh- vậy, giai đoạn bọ gậy tác giả trọng nhiều đến dấu hiệu hình thái lông cọ đốt bụng Trong mô tả giai đoạn bọ gậy loài muỗi Thái Lan, Rattanarithikul Green (1986) [139] cho loài An pseudowillmori có lông cọ đốt bụng phát triển Trong bảng định loại muỗi Anopheles Thái Lan năm 2006, Rattanarithikul cộng giữ quan điểm Quan điểm đ-ợc Lục Bảo Lân (1997) ủng hộ nghiên cứu muỗi Trung Quốc [125] Kết nghiên cứu có điểm sai khác với tác giả, phân tích dấu hiệu hình thái sử dụng mẫu vật đ-ợc nuôi theo dòng gia đình (từ trứng đến muỗi tr-ởng thành) Theo nghiên cứu chúng tôi, muỗi An willmori (dạng 2) loài muỗi có lông cọ đốt bụng phát triển Lông cọ loài muỗi phát triển từ đốt bụng II ®Õn ®èt bơng VII 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 151 víi cọ rõ ràng dài 1/2 -1/3 chiều dài cọ, thân lông cọ có sắc tố rõ Cùng với An willmori, loài An pseudowillmori An dravidicus có lông cọ đốt bụng II phát triển có roi lá, lông cọ có sắc tố, nh-ng lông cọ An dravidicus ngắn so với hai loài (khoảng 1/4 thân) chiều rộng phiến cọ lớn Rattanarithikul et al, (2006) đÃ sử dụng dấu hiệu độ dài phần thân lông số đốt ngực để tách nhóm phụ An sawadwongporni (gåm An sawadwongporni, An notanandai An maculatus K) khỏi thành viên nhóm [159] Kết nghiên cứu cho thấy đặc điểm không cố định, có mẫu vật bên dài, bên ngắn Ngoài ra, thấy dấu hiệu hình thái kitin l-ng đốt bụng phân bố sắc tố lông cọ đốt bụng dấu hiệu để nhận dạng thành viên dạng nhóm loài Nói tóm lại, dấu hiệu hình thái giai đoạn bọ gậy thành viên nhóm loài An maculatus đa hình biến đổi có gối nên khó có thĨ chØ dïng mét hai dÊu hiƯu mµ cã thĨ tách bạch chúng Tuy nhiên dấu hiệu đ-ợc di truyền nên loài có dấu hiệu đặc tr-ng Khi phân loại loài nhóm loài, cần sử dụng nhiều loại dấu hiệu để tránh đ-ợc nhầm lẫn + Về đa hình hình thái trứng thành viên nhóm loài An maculatus Đa hình hình thái pha trứng dễ nhận biết cấu tạo khoang trứng số l-ợng rẻ phao Đặc điểm nhận dạng sáu loại trứng thành viên phức hợp An maculatus Thái Lan đ-ợc Rattanarithikul Green (1986) vẽ mô tả [139] Kết nghiên cứu t-ơng tự kết hai tác giả thấy có biến đổi nội loài nh-ng dấu hiệu kiểu hình thái khoang trứng đặc điểm bật để nhận dạng thành viên nhóm loài An maculatus + Tổng kết đa hình dấu hiệu hình thái liên quan đến phân loại thành viên nhóm loài An maculatus Ngay từ năm 30 kỷ tr-ớc, nhà nghiên cứu đÃ nhận xét rằng, An maculatus loài có nhiều biến dị, muỗi tr-ởng thành thay đổi từ chỗ có l-ng đốt bụng trần đến chỗ phủ đầy vẩy trắng hai bên bờ sau 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 152 tÊm l-ng bơng cã thĨ có túm vẩy đen nhỏ Cũng đÃ có biến dị pan, cánh chân (Christophers, 1931) Những khác biệt đÃ làm cho tác giả đặt tên cho dạng khác thành loài, thực loài đa hình (Reid, Waltal Peters, 1966) Reid (1968) giữ quan điểm đÃ trích dẫn ví dụ nghiên cứu Christophers (1931) thảo luận nhsau: Christophers (1931) ®· chØ r»ng, däc theo vïng nói Himalaya, có hai dạng An maculatus đối lập nhau, dạng vẩy đốt bụng chiếm -u ë vïng cã ®é cao 2000 ft, ®ã vùng có độ cao lớn phần lớn mẫu vật có vẩy dầy l-ng bụng, hai dạng trùng vùng phân bố vài nơi nh-ng tìm thấy dạng lai Không thÊy cã bÊt kú mét sù kh¸c biƯt râ rƯt giai đoạn phát triển khác hai dạng hình nh- chúng đa hình cđa loµi An maculatus vµ An theobaldi cịng nh “loµi gần An jamesi Gater biến bị An maculatus với đốt bốn bàn chân sau hoàn toàn trắng Christophers ghi nhận d-ới loài An maculatus var willmori với đặc điểm đốt bụng phủ đầy vẩy, đ-ợc phát Himalaya có đặc điểm đối lập với dạng bụng vảy Theo đó, loài An pseudowillmori (dạng vảy), An dravidicus An.hanabusai tên đồng vật (synonyms) An maculatus, An indica, An dudgeonii vµ An maculosa tên đồng vật An maculatus var willmori [160] Kết ủng hộ ý kiến nghiên cứu Rattanarithikul Green (1986); Rattanarithikul Harbach (1990); Lục Bảo Lân (1997) rằng: dấu hiệu hình thái có đa hình biến ®ỉi, cã nhiỊu dÊu hiƯu gèi nh-ng vÉn cã thể xác định đ-ợc đặc điểm loài riêng biệt nhóm loài qua dấu hiệu giai đoạn phát triển Nhóm loài An maculatus gồm nhiều loài khác nhau, loài đ-ợc xếp vào synonyms An maculatus tr-ớc loài thức chí loài trở thành phức hợp loài đồng hình đÃ phát dạng khác An maculatus, An willmori, An sawadwongporni, An pseudowillmori 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 153 - Tính đa dạng dấu hiệu sinh học, sinh thái học thành viên nhóm loài An maculatus Không có tính đa hình di truyền dấu hiệu hình thái tạo nên phong phú thành viên phức hợp loài đồng hình thuộc nhóm loài An maculatus mà đặc điểm sinh häc, sinh th¸i häc cđa chóng cịng biĨu hiƯn tính đa dạng thống Trong đặc điểm chung nhóm loài có nét riêng cho thành viên nhóm + Đa dạng kiểu ổ bọ gậy Các tài liệu đÃ công bố tr-ớc nói sơ sài đặc điểm ổ bọ gậy An maculatus đặc điểm ổ bọ gậy thành viên nhóm loài Reid (1968) thấy bọ gậy loài bắt đ-ợc mạch n-ớc ngầm, khe n-ớc nhỏ [160, 161] Nguyễn Đức Mạnh, 1988 nghiên cứu An maculatus Tây Nguyên đÃ nhận xét: bọ gậy An maculatus bắt đ-ợc suối ven rừng có ánh sáng, nhiều bắt đ-ợc ruộng lúa, giếng ven suối [16, 17] Lục Bảo Lân, 1997 Động vật chÝ Trung Quèc ®· cho thÊy ë Trung Quèc cã loài muỗi thuộc nhóm An maculatus An maculatus, An dravidicus, An pseudowillmori, An sawadwongporni An willmori Tác giả đÃ mô tả ổ bọ gậy loài An maculatus, An dravidicus, An pseudowillmori An willmori gần giống mạch n-ớc, suối nhỏ, ao nhỏ, vết chân Riêng muỗi An sawadwongporni ch-a tìm thấy ổ bọ gậy [125] Những nghiên cứu muỗi An maculatus Lào cho thấy bọ gậy An maculatus bắt đ-ợc với bọ gậy An minimus kiểu ổ -a thích suối chảy chậm Thái Lan, bọ gậy hai loài An minimus An maculatus đÃ đ-ợc tìm thấy ë çc kiĨu ỉ kh¸c nh- bê si, çc vũng n-ớc đáy sỏi, vết chân động vật có n-ớc thấm Malaysia, muỗi An maculatus sinh sản nhiều khe suối n-ớc chảy chậm có ánh nắng mặt trời Dựa vào đặc điểm mà biện pháp quản lý môi tr-ờng để phòng chống loài muỗi đ-ợc đ-a làm che râm bề mặt ổ n-ớc tạo dòng chảy, khơi thông ổ bọ gËy (Linsay et al, 2004) [122] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 154 Trong nghiên cứu kiểu ổ bọ gậy thành viên nhóm loài có đặc điểm chung: nguồn n-ớc th-ờng trong, có ánh sáng, ổ n-ớc ngầm, đứng nh-ng có l-u thông phù hợp cho tất loài giống nh- nghiên cứu tác giả Riêng hai loài An notanandai An sawadwongporni có mật độ cao thuỷ vực n-ớc chảy, đặc điểm riêng hai loài muỗi lần phát kiểu ổ bọ gậy cho nhóm phụ An sawadwongporni mà ch-a tác giả đề cập tới Thực loài muỗi này, việc khơi thông dòng chảy để phòng chống chúng khó phát huy hiệu qủa [24] + Đa dạng sinh học, sinh thái học giai đoạn muỗi tr-ởng thành Kết nghiên cứu cho thấy muỗi thuộc nhóm loài An maculatus đốt máu súc vật (tỷ lệ đốt máu súc vật từ 83,55% đến 95,29%) Kết giống với nghiên cứu Toumanoff, 1936 Bắc Kỳ Trung Kỳ, tỷ lệ đốt máu ng-ời 5% [174], nghiên cứu Tây Nguyên Nguyễn Đức Mạnh, 1988 tỷ lệ muỗi đốt ng-ời so với muỗi bắt đ-ợc chuồng gia súc 1/ 2,38 [16] Tổng kết nghiên cứu tác giả Malaysia, Thái Lan, Lào Lindsay et al, đÃ cho thấy muỗi An maculatus s.l đốt máu súc vật chủ yếu [122] Tỷ lệ muỗi bắt đ-ợc chuồng gia súc Quảng Bình giai đoạn 20012005 chiếm 83,55%, nh-ng địa điểm thời gian chiến tranh (1971), súc vật nhóm muỗi An maculatus lại chiếm tới 47% (sau An dirus 49%) 100% muỗi bắt đ-ợc ph-ơng pháp mồi ng-ời [21] Nh- vậy, tuỳ vào hoàn c¶nh thĨ, viƯc tiÕp xóc lùa chän vËt chđ thành viên nhóm loài phụ thuộc vào diện loại vật chủ Nhìn chung, nơi có súc vật, muỗi -a đốt trâu, bò nh-ng vật nuôi muỗi công ng-ời Kết nghiên cứu Nguyễn Thuỵ Hùng (2001) lới An sawadwongporni Kon-Tum giống với nhận xét (số liệu riêng, không công bố) Muỗi thuộc nhóm An maculatus muỗi trú ẩn tiêu máu nhà Rất gặp muỗi trú ẩn tiêu máu nhà ban ngày Điều phù hợp với kết 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 155 nghiên cứu Nguyễn Đức Mạnh (1988), Reid (1968), Loong (1988), Lục Bảo Lân (1997), Toumanoff (1936), Lindsay et al, (2004) [16, 122-125, 197 ] Với đặc điểm sinh học muỗi tr-ởng thành nh- (lựa chọn vật chủ theo hoàn cảnh cụ thể, trú ẩn tiêu máu nhà) nên việc phòng chống loài muỗi gặp khó khăn định Dù sao, đặc điểm thành viên nhóm -a đốt máu súc vật nên việc lập hàng rào chng gia sóc quanh bu«n nh- mét sè vïng cđa Tây Nguyên có tác dụng cho việc phòng chống nhóm loài muỗi Vì thành viên nhóm chủ yếu loài trú ẩn tiêu máu nhà (exophilic) đốt máu nhà (exophagus) nên biện pháp phòng chống sử dụng hoá chất diệt tác dụng giống nh- thành viên phức hợp loài An dirus 4.1.2 Đa hình di truyền dấu hiệu kiểu gen thành viên nhóm loài An maculatus Việt nam - Đa hình di truyền dấu hiệu di truyền tế bào thành viên nhóm loài An maculatus Không đa hình dấu hiệu kiểu hình (phenotype) nh- đÃ nêu trên, dấu hiệu kiểu gen (genotype) thành viên nhóm loài An maculatus đa hình Đa hình di truyền đặc điểm kiểu nhân ví dụ Những kết nghiên cứu có điểm t-ơng đồng số khác biệt với kết nghiên cứu V.Baimai đặc điểm nhiễm sắc thể kiểu nhân (1993) [35] Bé nhiƠm s¾c thĨ cđa An dravidicus, An notanandai, An maculatus s.s., An sawadwongporni, An willmori hoµn toµn giống với nhiễm sắc thể loài Thái Lan An maculatus dạng giống với An maculatus dạng B Thái Lan, An maculatus dạng giống với An maculatus dạng E Thái Lan; An sawadwongporni dạng giống An maculatus dạng K An maculatus dạng giống với miêu tả nhiễm sắc thể An pseudowillmori Thái Lan Đặc biệt nghiên cứu nhiễm sắc thể An pseudowillmori nhận thÊy cã d¹ng : d¹ng ë ViƯt Nam nhiễm sắc thể nguyên phân giống với An.greeni; dạng Việt Nam giống với An.dispar, hai loài muỗi míi chØ thÊy ph©n bè ë Phillippine Nh- vËy rÊt An pseudowillmori phức hợp loài đồng hình Có thể dựa 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 156 sai khác cấu trúc phần đồng nhiễm dị nhiễm NST giới tính để phân biệt loài dạng An maculatus với nhau, có khác biệt tổ hợp NST giới tính X Y Sự khác biệt giữ kiểu tổ hợp cho thấy biến đổi loài, loài với Do cần phải có thêm nghiên cứu sâu cấu trúc ADN để có đ-ợc kết luận xác - Đa hình di truyền dấu hiệu điện di enzym thành viên nhóm loài An maculatus Điện di enzym ph-ơng pháp hữu ích nghiên cứu đa hình di truyền loài đồng hình Hàng loạt công trình nghiên cứu n-ớc đÃ sử dụng ph-ơng pháp để nghiên cứu muỗi côn trùng y học quan trọng [2-5, 13, 37, 48, 49, 52, 53, 75, 94, 105, 116, 139, 173, 180, 186] Kết điện di 11 hệ izozym cho thấy hầu hết locut gen thành viên nhóm loài An maculatus đa hình Các dấu hiệu đa hình nhiều có giá trị để phân biệt thành viên nhóm Tuy nhiên, đa hình enzym 6GPD có giá trị việc phân loại loài đồng hình Dựa vào phân tích đa hình di truyền hệ enzym này, ta xác định đ-ợc xác thành viên nhóm loài An maculatus Kết nghiên cứu phù với với nghiên cứu Tan, S.G cộng (1986) sư dơng enzym nµy cïng víi enzym esterase ®Ĩ nghiªn cøu di trun cđa nhãm An maculatus ë Thái Lan [187] Phân tích mối quan hệ chủng loại phát sinh thành viên nhóm loài dựa vào hệ số t-ơng đồng di truyền khoảng cách di truyền cho thấy loài đÃ định tên, quan hệ di truyền chúng thể tính gần gũi theo nhóm Đối với loài đÃ định tên An sawadwongporni An notanandai nhóm họ hàng gần, An maculatus gần gũi với An dravidicus, An pseudowillmori An willmori loài nhánh riêng Khi nghiên cứu phức hợp Drosophilla wiliston, Ayala et al, (1974) thÊy r»ng I = 0,970 biểu mối quan hệ quần thể địa lý, I = 0,873 biĨu hiƯn mèi quan hƯ b¸n loµi, I = 0,795 thĨ hiƯn mèi quan hƯ loµi phơ, I = 0,517 biĨu hiƯn mèi quan hƯ gi÷a loài đồng hình I = 0,352 quan hệ loài riêng biệt loài đồng hình (D.J.Futuyma, 1986) [86] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 157 đây, hệ số t-ơng đồng di truyền loài đÃ đ-ợc định tên giao động khoảng từ 0,46 (An dravidicus vµ An pseudowillmori) vµ 0,85 (An sawadwongporni An notanandai) thể loài loài đồng hình họ hàng gần gũi gần gũi An sawadwongporni An notanandai T-ơng tự nh- vậy, chủng loại phát sinh biểu mối quan hệ di truyền tất thành viên nhóm loài thấy An maculatus s.s., gần gũi với An maculatus dạng An dravidicus; An willmori, An willmori dạng An pseudowillmori An pseudowillmori dạng tạo nhánh riêng An sawadwongporni, An sawadwongporni d¹ng 2, An sawadwongporni d¹ng An notanandai tạo thành nhóm quan hệ họ hàng gần gũi An sawadwongporni dạng gần với An sawadwongporni dạng An maculatus dạng An maculatus dạng tạo thành nhóm họ hàng gần gũi An maculatus dạng nhánh ®éc lËp so víi çc nh¸nh cđa nhãm An maculatus s.s; An sawadwongporni, An maculatus dạng dạng Hệ số t-ơng đồng di truyền dạng tách từ loài dựa vào đa hình di truyền dấu hiệu hình thái chủ yếu nằm khoảng từ 0,78 (An maculatus An maculatus dạng 4) đến 0,99 (An maculatus An maculatus dạng 5) tức nằm khoảng quan hệ loài phụ bán loài - quần thể địa lý Riêng hệ số t-ơng đồng di truyền An maculatus dạng An maculatus 0,59, An maculatus dạng loài đồng hình độc lập nhóm loài Đây lần đầu tiên, dựa vào kết điện di enzym đÃ xây dung đ-ợc sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền đầy đủ thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam Kết điện di enzym phù hợp với phân tích đa hình hình thái đÃ có nhận xét phần - Phân tích đa hình di truyền dựa vào thị PCR-RFLP Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase phân tích đa hình độ dài đoạn phân cắt ngẫu nhiên sử dụng enzym cắt giới hạn đÃ đ-ợc áp dụng thành công nhiều nghiên cứu định loại loài đồng hình vectơ trun bƯnh [44, 146, 180] 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 158 M-êi enzym giới hạn đÃ đ-ợc sử dụng để phân tích sản phẩm nhân đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam Hai enzym EcoRI BamHI không cắt đoạn ITS2 Các enzym Cfr131, MspI, AluI, HindI, HindIII, HeaII, HeaIII vµ XbaI có khả cắt đoạn ITS2 tạo băng đa hình khác biệt thành viên nhóm loài mức độ khác Sử dụng enzym HeaIII phân biệt đ-ợc loài đồng hình An sawadwongporni, An sawadwongporni dạng An notanandai Enzym HindII dùng để tách An dravidicus khỏi thành viên khác nhóm Cfr131 HindIII tách đ-ợc An notanandai với thành viên khác Riêng enzym MspI phân biệt rõ ràng thành viên nhóm Một số thành viên nhóm loài phân biệt với không rõ ràng sử dụng enzym XbaI AluI - Phân tích đa hình di truyền dựa vào thị RAPD-PCR Phản ứng chuỗi polymerase sử dụng mồi đơn ngẫu nhiên đÃ đ-ợc sử dụng thành công nghiên cứu nhiều vectơ truyền bệnh đặc biệt loài muỗi [51, 78, 164, 185, 214, 215] Trong nghiên cứu sử dụng mồi đơn ngẫu nhiên có mồi cho mức độ đa hình cao phân biệt rõ ràng loài mồi A1, A5, F2, OPL1 OPA10 Mồi A5 nhân 23 băng ®a h×nh cã kÝch th-íc tõ 0,1 ®Õn 1,8 Kb, băng có kích th-ớc từ 0,2 đến 1,1 cho phép phân biệt loài nhóm loài An maculatus Mồi F2 OPL1 t-ơng tự nh- Dựa vào số liệu phân tích đa hình thành viên nhóm loài tính khoảng cách di truyền t-ơng đồng di truyền, lập chủng loại phát sinh xem xét mối quan hệ di truyền chúng thấy chúng tạo thành nhóm gần gũi T-ơng tự nh- kết phân tích điện di enzym, An willmori, An willmori dạng gần gũi tạo nhánh riêng Cũng nh- An pseudowillmori An pseudowillmori dạng tạo nhánh riêng An maculatus dạng tạo nhánh đọc lập với hai nhánh An maculatus d¹ng 4, An maculatus d¹ng 6, An maculatus s.s., An maculatus dạng An dravidicus tạo thành nhóm, An maculatus dạng gần với An maculatus dạng 6; An maculatus s.s gần gũi với An maculatus d¹ng 5; An dravidicus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 159 cïng nhóm nh-ng đứng nhánh riêng An sawadwongporni, An sawadwongporni dạng 2, An sawadwongporni dạng An notanandai hợp với thành nhóm, An notanandai nhánh nhỏ độc lập với An sawadwongporni Kết phù hợp với kết điện di enzym, nhiên hệ số t-ơng đồng di truyền không cách biệt rõ ràng nh- kết điện di enzym Đối với loài đÃ định tên hệ số t-ơng đồng di truyền giao động khoảng 0,54 (An maculatus vµ An pseudowillmori) vµ 0,72 (An maculatus vµ An dravidicus; An sawadwongporni vµ An notanandai) Quan hƯ di trun dạng tách từ loài, trừ An maculatus dạng 3, mức độ bán loài-loài phụ không thấy mức quan hệ quần thể địa lý Hệ số t-ơng đồng di truyền giao động từ 0,75 (An maculatus An maculatus dạng 4; An sawadwongporni An sawadwongporni dạng 2) đến 0,89 (An willmori An willmori dạng 2) Riêng An maculatus dạng có hệ số t-ơng đồng di truyền giao động khoảng 0,54 đến 0,70 so với loài dạng khác nên loài đồng hình độc lập - Kiểm định phân biệt loài nhãm b»ng PCR ®a måi Ma Ya Jun et al, (2002) đÃ giải trình tự đoạn ITS2 chọn mồi đặc hiệu cho loài An maculatus, An dravidicus, An pseudowillmori, An willmori vµ An sawadwongporni ë Trung Quèc [127] C.Walton et al, (2007) đÃ giải trình tự đoạn ITS2 chọn mồi đặc hiệu cho loài An maculatus đÃ giải trình tự đoạn ITS2 chọn mồi đặc hiệu cho loài An maculatus, An sawadwongporni, An dravidicus, An pseudowillmori An maculatus dạng K Thái Lan [209] Chúng đÃ sử dụng cặp mồi theo ph-ơng pháp hai tác giả ®Ĩ kiĨm tra sè mÉu vËt cđa chóng t«i HƯ thống mồi Walton, loài An maculatus, An sawadwongporni, An dravidicus chuẩn Riêng với mẫu An notanandai Việt Nam lại bắt mồi t-ơng ứng với vị trí An maculatus dạng K Thái Lan Chúng cho rằng, có nhầm lẫn xác định loài An maculatus dạng K Baimai (1986) gọi An maculatus dạng K gọi theo kiểu nhân K loài An maculatus không 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 160 phải muỗi có hình thái giống nh- An sawadwongporni nh- tác giả sau phân tích Hiện ch-a có kết giải trình tự An notanandai mẫu bắt đ-ợc địa điểm chuẩn Thái Lan nên cho mẫu gọi An maculatus dạng K nghiên cứu C.Walton et al, loài An notanandai Vì C.Walton et al, ch-a thiết kế mồi đặc hiệu cho An willmori nên chóng t«i kiĨm tra mÉu vËt cđa An willmori chúng bắt cặp t-ơng ứng vào vị trí An maculatus, lúc lại bắt vào vị trí An sawadwongporni Nh- vậy, mẫu vật Thái Lan, điều cần thiết phải giải trình tự chọn mồi đặc hiệu bổ sung cho hai loài An notanandai vµ An willmori Khi sư dơng måi theo nh- Ma Ya Jun et al, (2002) chóng t«i thÊy loài An maculatus, An willmori, An dravidicus An pseudowillmori bắt cặp vị trí thiết kế Riêng có ITS2 An sawadwongporni không bắt cặp víi måi cđa Ma Ya Jun thiÕt kÕ Do vËy, nghĩ mẫu vật thu thập Vân Nam Trung Quốc An sawadwongporni, theo nghiên cứu gặp An sawadwongporni dạng1 miền Bắc Việt Nam Rất mẫu vật thu Vân Nam, Trung Qc gièng víi An sawadwongporni d¹ng cđa dạng khác nhóm loài An maculatus - Phân tích đa hình di truyền giải trình tự ADN Tất loài dạng thành viên nhóm loài An maculatus đÃ đ-ợc giải trình tự đoạn ITS2 Đối chiếu với Genebank thấy loài đÃ đ-ợc định tên trùng khớp với trình tự đÃ đ-ợc l-u giữ trừ tr-ờng hợp An notanandai lại giống với An maculatus dạng K Thái Lan Tuy nhiên, việc giải trình tự ITS2 An notanandai Thái Lan lại ch-a có ch-a đăng ký Genebank Riêng muỗi An sawadwongporni thu thập Vân Nam Trung Quốc trình tự không trùng khớp với trình tự An sawadwongporni Thái Lan Việt Nam Các dạng loài An maculatus, An willmori, An pseudowillmori, An sawadwongporni tr×nh tù đoạn ITS2 sai khác nhiều, cần có nghiên cứu sâu số gen khác đặc biệt hệ gen ty thể 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 161 4.2 Thành phần loài phân bố thành viên nhóm loài An maculatus Mặc dù có đa hình dấu hiệu kiểu hình, dấu hiệu hình thái đa hình có gối nh-ng dựa vào dấu hiệu để xác định thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam Kết nghiên cứu đÃ khẳng định chắn sáu loài muỗi đÃ định tên Việt Nam là: An maculatus, An notanandai, An dravidicus, An pseudowillmori, An sawadwongporni vµ An willmori Ngoài dạng ch-a định tên gồm: An maculatus d¹ng 3, An maculatus d¹ng 4, An maculatus d¹ng 5, An maculatus d¹ng 6, An pseudowillmori d¹ng 2, An willmori d¹ng 2, An sawadwongporni d¹ng 2, An sawadwongporni dạng Nh- so với nghiên cứu Nguyễn Đức Mạnh et al, năm 2001 [27] có thay đổi bổ sung: khẳng định An maculatus dạng An pseudowillmori khẳng định nhộng An pseudowillmori có gai bên đốt bụng IV dài nhọn giống với đặc điểm An.greeni An.dispar Philippine (Rattanarithikul, Harbach, 1990) [157] ĐÃ bổ sung số dạng An maculatus, muỗi tr-ớc đÃ định loại An pseudowillmori chuyển thành An maculatus dạng 5, Riêng dạng An maculatus dạng (gân L6 có hai điểm đen theo Stanton) ch-a bắt lại đ-ợc mẫu giống nh- Có thể có nhầm lẫn với An karwari Tóm lại, dựa vào tiêu đồng bộ, sử dụng dấu hiệu hình thái pha phát triển thấy nay, nhãm loµi An maculatus ë ViƯt Nam cã Ýt nhÊt 14 thành viên, nhiều thành viên so với nghiên cứu Nguyễn Đức Mạnh ng-ời khác, năm 2001 4.2.1 Xây dựng bảng định loại thành viên đÃ đ-ợc định tên nhóm loài An maculatus Việt Nam Năm 1986, Rattanarithikul Green xây dựng bảng định loại muỗi tr-ởng thành cho thành viên nhóm loài An maculatus Thái Lan [156] Năm 2006, Rattanarithikul et al, xây dựng bảng định loại muỗi bọ gậy cho Anopheles Thái lan có nhóm An maculatus nh-ng khoá phân loại 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 162 hình không phân biệt đ-ợc tách bạch thành viên [159] Năm 1997, Lục Bảo Lân xây dựng bảng định loại muỗi tr-ởng thành bọ gậy cho thành viên nhãm loµi An maculatus ë Trung Quèc [125] Nh- vËy, ch-a có tài liệu đầy đủ bảng phân loại thành viên nhóm loài cho khu vực Việt Nam, công bố đ-ợc coi công bố đầy đủ bảng định loại bốn giai đoạn phát triển cho sáu thành viên đÃ định tên nhóm loài 4.2.2 Phân bố thành viên nhóm loài An maculatus Theo tác giả, An maculatus s.l phân bố rộng rÃi vùng đồi núi vùng rừng núi từ Swat (Tây Pakistan) phía Tây Bắc, h-ớng phía Đông dọc theo chân dÃy núi Himalaya đến Assam (ấn Độ), Miama, qua Thái Lan, n-ớc Đông D-ơng (Việt Nam, Lào, Campuchia), Nam Trung Quốc đến Đài Loan Phillippine; phía Nam qua ấn Độ, Srilanka, Malaya, Borneo, đảo Indonesia kéo dài sang phía đông nh- Timor nam Celebes [156] Cho đến nay, có 12 loài thành viên nhóm loài đÃ đ-ợc công bố An maculatus s.s phân bố rộng rÃi Một số loài phân bố vùng định nh- An greeni An dispar míi chØ thÊy ë Phillippine; An indicus, An dudgeonii, An maculosa phân bố ấn Độ; An hanabusai thấy Đài Loan [22, 156, 157] Trong số loài đÃ định tên, Việt Nam thấy có loài lµ An maculatus, An dravidicus, An notanandai, An pseudowillmori, An sawadwongporni An willmori 4-5 dạng An maculatus [27] Những nghiên cứu muỗi Thái Lan [139] thấy thành phần loài nhóm loài phong phú Có thể coi vùng đất liền Đông Nam trung tâm phân bố nhóm loài Việt Nam, An maculatus dạng gần gũi phân bố rộng miền đồi núi toàn quốc Muỗi An sawadwongporni dạng chiếm -u tỉnh phía Nam từ Quảng Bình trở vào An sawadwongporni dạng phân bố rải rác tới 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 163 miền Bắc, nh- đÃ nói An sawadwongporni dạng không phân bố đến Vân Nam Trung Quốc Muỗi An pseudowillmori An willmori phân bố nhiều tỉnh phía Bắc Nh- muỗi An pseudowillmori An willmori tỉnh phía Bắc Việt Nam với hai loài muỗi Vân Nam Trung Quốc giống Đây lần đầu tiên, thành viên đÃ đ-ợc định tên nhóm loài An maculatus đ-ợc lập đồ phân bố toàn quốc 4.3 Vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài An maculatus Muỗi An maculatus s.l đÃ đ-ợc xác định có vai trò truyền bệnh sốt rét Malaysia [102, 155], Thái Lan (An maculatus, An sawadwongporni, An pseudowillmori) [90, 122, 158]; Lµo, Campuchia [122], Nepal (An willmori) [151], Phillippine (An greeni) [157, 196] Kết thử nghiệm ELISA kiểm tra PCR khẳng định loài An maculatus hai điểm Khánh Phú, Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hoà Đắc ¥, Ph-íc Long, tØnh B×nh Ph-íc nhiƠm ký sinh trïng sèt rÐt P.vivax vµ P.falciparum víi tû lƯ 0,57 vµ 0,58% Tỷ lệ sai khác thống kê với kết nghiên cứu Đoàn Hạnh Nhân et al, 2004 (0,7% với P < 0,05) Điểm khác biệt nghiên cứu Đoàn Hạnh Nhân et al, không xác định đ-ợc loài muỗi cụ thể nhóm loài An maculatus muỗi d-ơng tính hoàn toàn P.falciparum [27] Toumanoff (1936) đÃ cho thấy muỗi An maculatus ë VÜnh Tuy (Tuyªn Quang) nhiƠm thoa trïng víi tỷ lệ 1,11% (1/99) vào tháng 12 Lào Cai nhiƠm Oocyst 1,11% (1/99) [197] Theo nghiªn cøu cđa chúng tôi, có loài muỗi thuộc nhóm An maculatus phân bố hai tỉnh An maculatus, An dravidicus, An pseudowillmori An willmori Vì vậy, loài muỗi đÃ nhiễm ký sinh trùng sốt rét vào năm 1936 mà Toumanoff đÃ mổ thấy Dù sao, xác định đ-ợc có thành viên nhóm loài có thĨ trun bƯnh sèt rÐt ®Ĩ đng ý kiÕn xác định An maculatus s.l vectơ sốt rét thứ yÕu ë ViÖt Nam 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 164 KÕt luËn Tất thành viên nhóm loài An maculatus biểu đa hình cao dấu hiệu hình thái, đa dạng đặc điểm sinh học, sinh thái học Tuy có đặc điểm hình thái đa hình gối nh-ng sử dụng dấu hiệu phân loại thành viên nhóm loài Đa hình di truyền tế bào nhóm loài An maculatus đ-ợc thể khác biệt hình dạng cấu trúc nhiễm sắc thể, đặc biệt nhiễm sắc thể giới tính Các locut hệ izozym nghiên cứu thể tính đa hình cao, hệ enzym 6GPD có giá trị việc phân loại thành viên nhóm loài Số liệu điện di isozym loài đÃ định tên thể chúng loài đồng hình dạng nằm mối quan hệ quần thể địa lý - bán loài phân loài Riêng An maculatus dạng loài đồng hình độc lập nhóm RFLP-PCR cho thấy tính đa hình di truyền cao nhãm loµi nh-ng ch-a cã mét enzym thư nghiƯm nµo phân biệt đ-ợc tất thành viên nhãm, enzym cã -u thÕ cao nhÊt lµ MspI Tất mồi đơn ngẫu nhiên phản ứng RAPD-PCR cho băng nhân rõ nét biểu mức độ đa hình khác nhau, mồi cho tính đa hình cao A1, A5, F2, OPL1, OPA10 hai mồi cho tính đa hình thấp F4 OPA4 Thử nghiệm PCR đa mồi khẳng định tồn loài đÃ đ-ợc định tên Việt Nam Số liệu giải trình tự ADN khẳng định tính đa hình vị trí phân loại thành viên đÃ xác định tên Sự sai khác dạng không rõ nét trừ An maculatus dạng Muỗi An maculatus Việt Nam nhóm loài đồng hình Cho đến nay, nhóm loài gồm 14 thành viên, có loài đÃ xác định tên An maculatus Theobald, 1901; An dravidicus Christophers, 1924; An notanandai Rattanarithikul et Green, 1986, An pseudowillmori (Theobald, 1910), An sawadwongporni Rattanarithikul et Green, 1986 vµ An willmori (James, 1903) Tám thành viên khác ch-a xác định xác vị trí phân loại là: An maculatus d¹ng 3, An maculatus d¹ng 4, An maculatus d¹ng 5, An maculatus dạng 6, An pseudowillmori dạng An willmori dạng 2, An sawadwongporni dạng An sawadwongporni dạng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 165 Muỗi An maculatus phân bố rộng rÃi vùng rừng núi toàn quèc An sawadwongporni chiÕm -u thÕ ë vïng rõng nói từ Quảng Bình vào phía Nam An pseudowillmori An willmori có mặt tỉnh phía Bắc An dravidicus An notanandai có mặt rải rác số địa ph-ơng Các loài muỗi thuộc nhóm An maculatus -a đốt máu súc vật, trú đậu tiêu máu nhà Các kiểu ổ bọ gậy thành viên nhóm loài có đặc điểm chung: nguồn n-ớc th-ờng trong, có ánh sáng; ổ n-ớc ngầm đứng nh-ng có l-u thông phù hợp cho tất loài Riêng hai loài An notanandai An sawadwongporni sống thuỷ vực n-ớc chảy Cã Ýt nhÊt mét loµi nhãm loµi (An maculatus s.s.) có khả truyền hai loại ký sinh trïng sèt rÐt P.falciparum vµ P.vivax víi tû lƯ nhiƠm thoa trùng 0,58% (P.falciparum: 0,29%; P.vivax: 0,29%), khẳng định vai trò vectơ thứ yếu An maculatus s.l 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 166 Đề nghị Tiếp tục giải trình tự ADN tập trung vào số gen đích nh- ITS2 gen ty thể (COI, COII, D3), so sánh để xác định xác vị trí phân loại thành viên nhóm loài An maculatus, thiết lập hệ thống PCR đa mồi để phân biệt thành viên nhóm loài Tiếp tục sử dụng kỹ thuật ELISA, PCR để xác định vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài, tập trung vào trọng điểm sốt rét miền Trung, Tây Nguyên Đông Nam Bộ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 167 Các công trình tác giả liên quan đến luận án đÃ công bố Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh (2005), Dấu hiệu hình thái xác định thành viên đÃ đ-ợc định tên thuộc nhóm loài An maculatus Việt Nam, Hội nghị Côn trùng toàn quốc lần thứ 5, tr 565- 570 Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Lê Xuân Hợi (2005), Một vài dấu hiệu đặc điểm ổ bọ gậy thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam, Hội nghị Côn trùng toàn quốc lần thứ 5, tr 571- 577 Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung, Trần Đức Hinh (2006), Đặc điểm cấu tạo quan sinh dục đực thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét çc bƯnh ký sinh trïng, (4), tr 35-40 Ngun Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung, Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Trần Đức Hinh (2006), Đặc điểm nhiễm sắc thể nguyên phân thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số 6, tr 35-42 Nguyễn Đức Mạnh, Nguyễn Thị H-ơng Bình, Trần Đức Hinh, Trịnh Đình Đạt (2005), Định loại thành viên nhóm loài Anopheles maculatus v-ờn Quốc Gia Phong Nha- Kẻ Bàng Cát Tiên PCR đa mồi, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2005 nghiên cứu khoa học sống, tr 1298- 1300 Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Nguyễn Thị H-ơng Bình (2005), Định loại Anopheles minimus s.l V-ờn Quốc Gia Phong Nha Kẻ Bảng kỹ thuật sinh học phân tử, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2005 nghiên cứu khoa học sống, tr 101-104 Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen Duc Manh, Vu Viet Hung, Ho Dinh Trung, Le Khanh Thuan, Toshihiko Sunahara, Masahiro Takagi (2006), “Genetic diversity of Anopheles maculatus species group, secondary vectors in Viet Nam”, The 4th international seminar on emerging and re-emerging Infectious Disease, Ha Noi, Viet Nam 4-6 December 2006, pp 36-37 Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen Duc Manh, Ho Dinh Trung, Nguyen Hong Ngoc, Tran Duc Hinh, Trinh Dinh Dat (2007), “Random amplified polymorphic DNA (RADP) analysis of Anopheles maculatus group (Diptera: Culicidae) in Vietnam", International colloquium Malaria control in the Mekong Region: Chalenges and opportunities, Hanoi 3-5 December 2007, pp 38 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 168 NHững đóng góp luận án 1- Lần đÃ phối hợp nhiều kiểu dấu hiệu từ dấu hiệu hình thái kiểu hình đến dấu hiệu di truyền tế bào, điện di enzym phân tích phân tử ADN để nghiên cứu nhóm loài đồng hình có vai trò truyền sốt rét Việt Nam xác định mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus 2- Lần đÃ xây dựng đ-ợc bảng định loại hình thái đầy đủ pha phát triển thành viên đÃ định tên nhóm loài An maculatus lập đồ phân bố chúng Việt Nam 3- ĐÃ bổ sung thêm đặc điểm đa hình sinh học, sinh thái học muỗi bọ gậy thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam 4- ĐÃ xác định đ-ợc khả truyền hai loài KST P falciparum P vivax muỗi An maculatus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 169 tài liệu tham khảo Tiếng Việt Nguyễn Thị H-ơng Bình, Trịnh Đình Đạt, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh ctv (2002), Dẫn liệu đa hình di truyền số hệ enzym loài muỗi sốt rét thuộc series Myzomyia (Diptera: Culicidae) Việt Nam, Báo cáo khoa học hội nghị côn trùng học toàn quốc lần thứ t-, Nhà xuất Nông Nghiệp, tr 33-40 Trịnh Đình Đạt (1986), Hệ thống đồng men muỗi sốt rét Anopheles, Công trình nghiên cứu khoa học tr-ờng ĐHTH-Hà Nội, tr 165-169 Trịnh Đình Đạt, Tr-ơng Quang Học, Ngô Giang Liên, Vũ Thị Loan (1992), Nghiên cứu số hệ izozym ứng dụng phân loại phức hợp loài Anopheles minimus Theobald (Diptera: Culicidae) Việt Nam, Tạp chí di truyền học ứng dụng, (2), tr 4-11 Trịnh Đình Đạt, Tào Minh Tn, Vị ThÞ Loan (1993), “Mèi quan hƯ chđng loại phát sinh số quần thể muỗi Culex quinquefaciatus Say, Tạp chí di truyền học ứng dụng, (2), tr 1-4 Trịnh Định Đạt (1995), Các ph-ơng pháp phân tích hoá sinh Di truyền chọn giống động vật, Nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội, 238 trang Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Nguyễn Thọ ViƠn vµ ctv (1983), “Mét sè dÉn liƯu vỊ khu hệ muỗi Anopheles Tây Nguyên, Công trình nghiên cứu khoa học Y D-ợc, tr 47 Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Vũ Khắc Đệ, Nguyễn Khắc Tân ctv (1983), Công tác điều tra khu hệ muỗi Anopheles Việt Nam năm 1983, Công trình nghiên cứu khoa học Y D-ợc, tr 47-48 Trần Đức Hinh, Nguyễn Thọ Viễn, Nguyễn Đức Mạnh ctv (1985), Điều tra muỗi Anophelinae Việt Nam, Công trình nghiên cứu khoa học Y D-ợc, tr 74 Trần Đức Hinh, Vũ Thị Phan, Nguyễn Thọ Viễn, Nguyễn Đức Mạnh, Phạm Huy Tiến ctv (1987), Muỗi Anopheles Meigen 1818 (Diptera: Culicidae), Việt Nam, Kỷ yếu công trình nghiªn cøu khoa häc, ViƯn Sèt rÐt - Ký sinh trùng Côn trùng, I (1981-1986), tr 199-206 10 Trần Đức Hinh, Nguyễn Thọ Viễn, Nguyễn Đức Mạnh ctv (1992), Nghiên cứu đặc điểm quần thể Anopheles spp trình toán sốt rét Việt Nam (1986-1990), Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Viện Sốt rÐt, Ký sinh trïng, C«n trïng, I (1986-1990), tr 121-140 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 170 11 Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung, Trịnh Đình Đạt ctv (1992), Một số dẫn liệu tính đa hình di truyền liên quan đến tập tính đốt mồi trú đậu An minimus miền Bắc Việt Nam, Tạp chí Y häc dù phßng, sè (36), tr 299- 304 12 Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung, Lê Xuân Hợi, Nguyễn Văn Quyết, Nguyễn Văn Nghiệp, Paul Verle ctv (1997), Một số đặc điểm sinh học, sinh thái học biến động quần thể Anopheles minimus Hoà Bình, Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng (3), tr 59- 70 13 Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung ctv (1997), Nghiên cứu điện di isozyme di trun tÕ bµo cđa An minimus vµ An dirus ë Việt Nam, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung -ơng (1991- 1996), tr 379- 386 14 Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung ctv (2002), Đặc tr-ng phân bố trao đổi dòng gen (gene flow) An minimus nhóm loài Anopheles leucosphyrus liên quan đến khả truyền bệnh chúng Việt Nam, Báo cáo khoa học hội nghị côn trùng học toàn quốc lần thứ t- Nhà xuất Nông Nghiệp, tr 187-196 15 Phạm Văn Lập (1993), Nghiên cứu di truyền tế bào học số loài truyền bệnh ng-ời, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Tr-ờng Đại học Tổng hợp Hà Nội 16 Nguyễn Đức Mạnh ctv (1977), Một số nhận xét muỗi truyền sốt rét Bắc Tây Nguyên, Công trình nghiên cứu khoa học Y D-ợc, tr 83 17 Nguyễn Đức Mạnh (1988), Khu hệ muỗi Anopheles Meigen (Diptera: Culicidae) vai trò truyền bệnh chúng Tây Nguyên Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Đại học Tổng hợp Hà Nội 18 Nguyễn Đức Mạnh, Nguyễn Thọ Viễn, Trần Đức Hinh (1991), Nghiên cứu muỗi Anopheles (Cellia) minimus Theobald, 1901 biện pháp phòng chống Việt Nam (giai đoạn 1986-1990), Hội nghị côn trïng häc qc gia ViƯt Nam lÇn thø nhÊt, tr 50- 55 19 Nguyễn Đức Mạnh (1996), ứng dụng số kỹ thuật phân loại muỗi truyền bệnh, Thông tin Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trïng, ViƯn SR-KST-CT, (1), tr 62-68 20 Ngun Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Lê Đình Công ctv (1996), Bổ sung dẫn liệu điều tra muỗi Anopheles thực trạng phân bố vectơ sốt rét Việt Nam giai đoạn 1991-1995, Thông tin Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, Viện SR-KST-CT, (3), tr 43-50 21 Nguyễn Đức Mạnh, Võ Văn Xy, Nguyễn Văn Quyết cs (2000), Định loại, phân bố, vai trò truyền bệnh sinh học vectơ sốt rÐt chñ yÕu ë mét sè vïng 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 171 sốt rét thuộc tỉnh Quảng Bình, Thông tin Phòng chống bệnh sốt rét bệnh KST, Viện SR-KST-CT, (6), tr 70- 79 22 Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Nguyễn Thị H-ơng Bình cvt (2001), Nghiên cứu loài đồng hình vai trò truyền bệnh muỗi An maculatus, An lesteri, An sp1 (thuộc nhóm loài An.hyrcanus) Việt Nam, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung -ơng (1996-2000), tr 388-398 23 Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Lê Đình Công ctv (2002), Bổ sung dẫn liệu khu hệ muỗi Anopheles Việt Nam giai đoạn 1996-2000, tr 304-313 Báo cáo khoa học Hội nghị côn trùng học toàn quốc lần thứ t- Nhà xuất Nông Nghiệp, tr 304- 313 24 Nguyễn Đức Mạnh, Lê Khánh Thuận, Hồ Đình Trung, Trần Đức Hinh, Nguyễn Thị H-ơng Bình (2006), Dẫn liệu phân loại, phân bố số loài muỗi vừa đ-ợc bổ sung vào thành phần loài Anopheles Việt Nam giai đoạn 2001-2005, Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trïng, ViƯn SR-KST-CT T¦, (3), tr 42-54 25 Mayer, E (1974), Những nguyên tắc phân loại động vật Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 348 trang 26 Mayer, E (1981), Quần thể, loài tiến hoá Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 468 trang 27 Đoàn Hạnh Nhân cs (2004), Phát thoa trùng muỗi sốt rét kỹ thuật ELISA (enzym linked immonosorbent assays), Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh KST, Viện SR-KST-CT TƯ, (4), tr 45- 51 TiÕng Anh 28 Avirachan T T., P L Seetharam and B N Chowdaiah (1969), “Karyotype studies in oriental anophelines” Cytologza (Tokyo) 34 pp: 418-422 29 Anthony J C , Rory D Mcabee, Jason Rasgon, et al (2003), “Differences in extent of genetic introgression between sympatric Culex pipiens and Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) in California and South Africa”, J Med Entomol, 40 (1), pp 36- 51 30 Anyawu G.I., Molyneux D.H., Philips A (2000), “Variation in curticular hydrocarbons among strains of the Anopheles gambiae sensu stricto by analysis of cuticular hydrocarbons using gas liquid chromatography of larvae” Mem Inst Oswaldo Cruz, 95, pp 295-300 31 Avise, A.J., (1974), “Systematic value of electrophoretic data”, Systematic zoology, 23(4), pp 465-481 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 172 32 Baimai V (1988), “Population cytogenetics of the malaria vector Anopheles leucosphyrus group”, Southeast Asia J Trop Med Pub Hlth, 19(4), pp 667679 33 Baimai V., Harbach R.E and Kijchalao U (1988), “Cytogenetic evidence for a fifth species within the taxon Anopheles dirus in Thailand”, J Am Mosq Control Assoc, (3), pp 333-338 34 Baimai V., Harbach R.E and Sukowati S (1988) “Cytogenetic evidence for two species within the current concept of the malaria vector Anopheles leucosphyrus in Southeast Asia” J Am Mosq Control Assoc, 4(1), pp 44-50 35 Baimai V., Kifchalao U., Rattanarithikull R., and Green C.A (1993), “Metaphase karyotypes of Anopheles of Thailand and Southeast Asia II Maculatus group, Neocellia series, subgenus Cellia”, Mosq Syst, 25(2), pp 116123 36 Baimai, V., C.A Green, R.G Andre, B.A Harrison and E.L Peyton (1984), “Cytogenetic studies of some species complexes of Anopheles in Thailand and Southeast Asia”, Southeast Asia J Trop Med Pub Hlth, (15), pp 536- 546 37 Barros Trindade D., Margarete Scarpassa (2002), “Genetic differentiation and diagnostic loci among Anopheles (Nyssorhynchus) rangeli, An (Nys) nuneztovari and An (Nys) duhami (Diptera: Culicidae) in the Brazillian Amazon”, Entomol Soc Am, 30 (4), pp 613- 620 38 Beard C B., Hamm D M., and Collins F.H (1993), “The mitochondrial genome of the mosquito Anopheles gambiae: DNA sequence, genome organization, and comparisons with mitochondrial sequences of other insects” Insect Mol Biol, 2, 103–124 39 Beebe N.W., and Allan Saul (1995), “Discrimination of all members of the Anopheles punctulatus complex by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis”, Am J Trop Med Hyg, 53(5), pp 478481 40 Beebe N.W., Desmond H Foley, Robert D Cooper, Joan H Bryan (1994), “DNA probes for identifying the members of the Anopheles punctulatus complex in Papua New Guinea”, Am J Trop Med Hyg, 50(2), pp 229-34 41 Beebe N.W., Desmond H Foley, Robert D Cooper, Joan H Bryan and Allan Saul (1996), “DNA probes for the Anopheles punctulatus complex”, Am J Trop Med Hyg, 54(4), pp 395-398 42 Beebe N.W., Robert D Cooper (2000), “Systematics of malaria vectors with particular reference to the Anopheles punctulatus group”, Insect J Parasitol 30(1), pp 1-17 Review 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 173 43 Besansky N.J., J.R Powell, A Caccone, D.M Hamm, J.A Scott, and F.H Collins (1994), “Molecular phylogeny of the Anopheles gambiae complex suggests genetic introgression between principal malaria vectors”, Proc Natl Acad Sci U S A, 19, 91(15), pp 6885-6888 44 Besansky N.J., and Faley G.T (1997), “Utility of the white gene in estimating phylogenetic relationships among mosquitoes”, Mol Biol Evol, 14, pp 442-454 45 Black, W C IV, and Lanzaro, G C (2001), “Patterns in the distribution of genetic variation among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s: Introgressive hybridization, adaptive inversions, or recent reproductive isolation?”, Insect Mol Bio, 10 pp 3-7 46 Black W.C and Musterman L E (1996), “Molecular Taxonomy and systermatics of Arthropod vector”, The biology of disease vectors University press of Colorado, pp 435-470 47 Brockhouse C.L., Vajime C.G, Marin R, Tanguay R.M., (1993), “Molecular identification of onchocerciasis vector sibling species in black flies (Diptera: Simuliidae)”, Biochem Biophys Res Commun, 30, 194(2), pp 628-634 48 Bullini L., (1992), “Enzym variance in the identification of parasites and their vectors: methodological aspects of the electrophoretic approach”, Trop Disea research Series (5) 53-69 49 Bullini L., Coluzzi M., (1973), “Electrophoretic studies on gene-enzym systems in mosquitoes (Diptera: Culicidae)”, Parasitologia, XV(3), pp 221248 50 Caccone A., B.A Garcosa, and J.R Powell (1996), “Evolution of the mitochondrial DNA control region in the Anopheles gambiae complex” J Insect Mol Biol, pp 51-59 51 Carmen E.P., Ranulfo G., Heiber C., Gerardo G., Myriam C.D., Marco F.S., (2003), “Random amplified polymorphic DNA analysis of Anopheles nuneztovari (Diptera: Culicidae) from Western and Northeastern Colombia”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 98 (4), pp 469- 476 52 Carvalho- pinto, Carlos Jose de and Lourenco de Oliveira, Ricardo (2004), “Isoenzymatic analysis of four Anopheles (Keitenszia) cruzzi (Diptera: Culicidae) populations of Brazil”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 99 (5), pp 471- 475 53 Chen B., Harbach R.E., Bultin R.K., (1997), “Molecular and morphological studies on the Anopheles minimus group of mosquitoes in southern China: taxonomic review, distribution and malaria vector status” Med Vet Entomol, 16(3), pp 253-265 54 Choochote W., Jitpakdi A., Rongsriyam Y., et al (1998), “Isoenzym study and hybridization of two forms of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae) in 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 174 Northern Thailand”, Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth 29(4), pp 841848 55 Christophers, S R., (1931), “Study on the Anopheline fauna of India (Parts IIV)”, Record of the malaria survey of India, 2, pp 305-332 56 Christophers, S.R, (1933), The fauna of Bristish India, including Ceylon and Burma Diptera Vol IV Family Culicidae Tribe Anophelini Taylor and Francis, London 371pp 57 Cockburn A F., (1994), “A critique of technique for detection identification, and classification of sibling species of mosquitoes”, Bull Soc Vect Ecol, 19(1), pp 37-42 58 Coluzzi M., and Adriana Sabatini (1969) “Cytogenetic observations on the salt water species Anopheles merus and Anopheles melas of the Gambiae complex” Parasitology, XI(3)pp.177-187 59 Coluzzi M., Sabatini A., Ptaca V., Di Deco M.A (1979), “Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex” Tran R Soc Trop Med Hyg, 73 pp 483-497 60 Coetzee, M., Estrada- Franco, J.G., Wunderlich, C.A., Hunt, R H., (1999), “Cytogenetic evidence for a species complex within Anopheles pseudopunctipennis Theobald (Diptera: Culicidae)”, Am J Trop Med Hyg, 60, pp 649-653 61 Cohuet A., Frederic S., Jean-Claude T., Pierre K., Maureen C., and Didier F., (2003), “Species identification within the Anopheles funestus group of malaria vectors in Cameroon and evidence for a new species”, Am J Trop Med Hyg, 69(2), pp 200-205 62 Collins F.H., S.M Paskewitz (1996), “A review of the use of ribosomal DNA (rDNA) to differentiate among cryptic Anopheles species”, Insect Mol Biol, 5(1), pp 1-9 Review 63 Collins F.H., Vincenzo P., Simbarashe M., A David B.B., J.B.O Were, Melissa O R., and Victoria F., (1988), “Comparison of DNA probe and cytogenetic methods for identifying field collected Anopheles gambiae complex mosquitoes” Am J Trop Med Hyg, 39(6), pp 545-550 64 Cong Li, Richard C Wilkerson (2005), “Identification of Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis complex species (Diptera: Culicidae) using rDNA internal transcribed spacer based polymerase chain reaction primer”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 100 (5), pp 495- 500 65 Conn J.E (1998), “Systematics and Population Level Analysis of Anopheles darlingi” Mem Inst Oswaldo Cruz, 93(5): 647-650 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 175 66 Coosemans M., Anouthchka Smiths and Patricia Roelants (1998), “Intraspecific isozym polymorphism of Anopheles gambiae in relation to enviroment, behavior, and malaria transmission in Southeastern Burkina Faso”, Am J Trop Med Hyg, 53 (1), pp 362- 377 67 Cornel A.J., and Collins F.H (1996), “PCR of the ribosomal DNA intergenic spacer regions as a method for identifying mosquitoes in the Anopheles gambiae complex”, Meth Mol Biol, 50, pp 321-332 68 Cornel A.J., Porter C.H., Collins F.H (1996), “Polymerase chain reaction species diagnostic assay for Anopheles quandrimaculatus cryptic species (Diptera: Culicidae) based on ribosomal DNA ITS2 sequences”, J Med Entomol, 33(1), pp 109-116 69 Cornel A.J., Porter C.H., Collins F.H (1997), “Ribosomal DNA-polymerase chain reaction assay discriminates between Anopheles quandrimaculatus and An merus (Diptera: Culicidae)”, J Med Entomol 34(5), pp 573-577 70 Crampton J.M., Hill S.M (1993), “DNA probes for the identification of malaria vectors”, Parasitologia, 35 Suppl, pp.31-34 71 Crawford, R (1938), Some anopheline pupae of Malaya with a note on pupal struture Goverment Printer, Singapore 110pp 72 De Merida A.M., M Palmieri, M Yurrita, A Molina, E Molina, and Black W.C 4th, (1999), “Mitochondrial DNA variation among Anopheles albimanus populations”, Am J Trop Med Hyg 61(2) pp 230-239 73 Donnelly M J., A Verardi, M Rowland and H Townson (2002), “Isolation and characterization of microsatellite loci in the mosquito Anopheles stephensi Liston (Diptera: Culicidae)”, Mol Ecol, 2(4), pp 488 – 490 74 EC Mekong malaria forum, 1999 30(4), pp 53-56 75 Elmary da Costa Fraga, Joselita Maria Mendes dos Santos and Juracy de Freitas Maia (2003), “Enzymatic variability in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) populations from Manuas- Am, Brazil”, Genet Mol Biol, 26( 2), pp 181- 187 76 Fanello C., F Santolamazza and A Della Torre (2002), “Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP”, Med Vet Entomol 16(4), pp 461-464 77 Fairley T L., T M Renaud, and J E Conn (2000) “Effects of local geographical barriers and latitude on population structure in Anopheles punctipennis (Diptera: Culicidae)” J Med Entomol 37 pp 754-760 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 176 78 Favia G., Adella torre, Bagayoko M., et al (1997), “Molecular identification of sympatric chromosomal forms of Anopheles gambiae and further evidence of their reproductive isolation”, Insect Mol Biol (4), pp 377 79 Favia G., G.Domopoulos, A Della Torre, Y.T Toure, M Coluzzi and C Louis (1994), “Polymorphisms detected by random PCR distinguish between different chromosomal forms of Anopheles gambiae” Proc Natl Acad Sci U S A 25, 91(22), pp 10315-10319 80 Fettene M., Temu Emmanual A (2003), “Species-specific primer for identification of Anopheles quandriannulatus sp B (Diptera: Culicidae) from Ethiopia using a multiplex polymerase chain reaction assay”, J Med Entomol 40(1), pp 112-115 81 Foley D.H., Joan H Bryan, David Yeates and Allan Saul (1998), “Evolution and systematics of Anopheles: insights from a molecular phylogeny of Australasian mosquitoes”, Mol Phylogenet Evol, 9(2), pp 262-275 82 Foley, D.H., Beebe, N., Torres, E and Saul, A., (1996), “Misidentification of a Philippine malaria vector revealed by allozyme and ribosomal DNA markers”, Am J Trop Med Hyg 54(1), pp 46- 48 83 Fontenille D.L., L Lochouarn, N diagne, C Sokhna and J.J Lemasson, (1997), “High annual and seasonal variations in malaria transmission by anophelines and vector species composition in Dielmo, a holoendemic area in Senegal” Am J Trop Med Hyg, 56 pp 247-253 84 French W.L., Baker R.H., and Kitzmiller J.B (1962), “Preparation of mosquito chromosomes”, Mosq News, 22(4), pp 377-383 85 Fritz G.N Corey L.B., Roberto R (1998), “Sequence analysis of the rDNA internal transcribed spacer of five species of South American human malaria mosquitoes”, DNA Seq 8(4), pp 215-221 86 Futuyma, D.J., (1986) Evolutionary Biology Sinauer associates Inc Publishers 600pp 87 Green C.A., Baimai V., Harrison B.A., and Andre R.G (1985), “Cytogennetic evidence for complex of species within the taxon Anopheles maculatus (Diptera: Culicidae) ”, Biol J Lin Soc 24, pp 321-328 88 Green C.A., Munstermann L E., Tan S.G., Panyim S., and Baimai V., (1992), “Population genetic envidence for species A, B, C and D of the Anopheles dirus complex in Thailand and enzym electromophs for their identification”, Med Vet Entomol 6, pp 29-36 89 Green C.A., Rattananarithikul R., and Charoensub A (1992), “Population genetic confirmation of species status of the malaria vectors Anopheles willmori 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 177 and An pseudowillmori in Thailand and chromosome phylogeny of the Maculatus group of mosquitoes”, Med Vet Entomol 6, pp 335-341 90 Green, C A., R Rattanarithikul, S Pongpasit, P Sawadwongporn and V Baimai (1991), “A new-recognized vector of human parasites in the oriental region, Anopheles (Cellia) pseudowillmori (Theobald, 1910)”, R Soc Trop Med Hyg 85, pp 35-36 91 Green, C.A and V Baimai (1984), “Polytene chromosomes and their use in species studies of malaria vectors as exemplified by the Anopheles maculatus complex”, Proc Int Congr Genet 3, pp 89-97 92 Guido Favia, George Dimopoulos et al (1994), “Polymophism detected by random PCR distinguish between different chromosomal forms of Anopheles gambiae”, Proc Natl Acad Sci USA, 91, pp 10315- 10319 93 Harback, R.E., Knight, K.L., (1980), Taxonomists’ Glossary of Mosquito’ Anatomy Plexus Publishing, Inc, 415pp 94 Harrison B.A., (1980), The Myzomyia series of Anopheles Cellia in Thailand, with emphasis on intra-interspecific variation (Diptera: Culicidae), Medical Entomology, 17, 198pp 95 Harrison, B.A (1972), “A new interpretation of affinities within the Anopheles hyrcanus Complex of Southeast Asia”, Mosq Syst, 4, pp 73-83 96 Hayashi K (1991), “PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutations in the genomic DNA”, PCR Meth Appl 1, pp 34–38 97 Helge K., Sternberg Anja, Proft Jana, Bastian Sandra, Schaffner Francis, Maier Walter A, Seitz Hanns M (2003), “Polymerase chain reaction-based differentiation of the mosquito sibling species Anopheles claviger s.s and Anopheles petragnani (Diptera: Culicidae)”, Am J Trop Med Hyg, 69 (2) pp 195-199 98 Hii J.L.K., Chew M., Sang V.Y., Munstermann L.E., Tan S.G., Panyim S., Yasothornsrikul S (1991) “Population genetic-analysis of hostseeking and resting behaviors in the malaria vector, Anopheles balabacensis (Diptera, Culicidae)”, J Med Entomol, 28, pp 675–684 99 Hill S.M., Crampton J.M (1994), “DNA-based methods for the identification of insect vectors”, Ann Trop Med Parasitol, 88(3), pp 227-250 100 Hill S.M., Rachel U., Teresa F.K., Crampton J.M (1991), “Synthetic DNA probes for the identification of sibling species in the Anopheles gambiae complex”, Med Vet Entomol 5(4), pp 455-463 101 Hiss R.H., Norris D.E., Dietrich C.H., Whitcomb R.F., West D.F., Bosio C.F., Kambhampati S., Piesman J., Antolin M.F., Black W.C 4th (1994) 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 178 “Molecular taxonomy using single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis of mitochondrial ribosomal DNA genes” Insect Mol Biol 3(3), pp 171-82 102 Hodgkin, E.P, (1956), The transmission of malaria in Malaya Stud Inst Med Res Malaya 27, viii + 1- 98 103 Hunt R.H., Green C.A (1980), “Interpretation of variation in ovarian polytene chromosomes of Anopheles funestus Giles, An parensis Gillies, and An aruni” Genetica, 51, pp 187-195 104 International code Zoological nomenclature, 1999 Fourth edition International Trust for Zoological Nomenlature, London 306 pp 105 Iongsujan Ypha, Jetpakdi Atchariya et al (1997), “One electromorphism evidence in discrimination of two forms Anopheles sinensis”, J Med Assoc Thai 80(9), pp 589- 602 106 James, S.P and W.G Liston, (1911), A monograph of the anopheline mosquitoes of India (2nd ED), Calcutta, 128 pp 107 Kamau L., Mukabana W.R., Hawley W.A., Lehmann T., Irungu L.W., Orago A.A., and Collins F.H (1999), “Analysis of genetic variability in Anopheles arabiensis and Anopheles gambiae using microsatellite loci” Insect Mol Biol, 8, pp 287–297 108 Kambhampati S., W.C Black IV and K.S Rai (1992), “RAPD of mosquito species and populations: Techniques, statistical analysis and applications” J Med Entomol 29, pp 939-945 109 Kanda T., Ogawa K., Sucharit S., Pratchyanusorn N., Lian C.G., and Harinasuta C (1984), “Cytogenetic and hybrydization studies among strains morphologically variated and belonging to Anopheles minimus Theobald from Japan and Thailand”, Cytologia, 865-881 110 Kazmer D.J., (1991), “Izoelectric focessing produces for the analysis of allozyme variation in minute Arthropods”, Ann Entomol Soc Am, 84, pp 322339 111 Kengne P., Trung H.D., Baimai V., Coosemans M., and Marguin S (2001), “A multiplex PCR - base method derived from random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers for the identification of species of the Anopheles minimus group in Southeast Asia”, Insect Mol Biol, 10 (5), pp 427 112 Kittayapong, P., J.M Clark, J.D Edman, B.K Lavine, J.R Marion and M Brooks (1993), “Survey of Anopheles maculatus complex (Diptera: culicidae) in Peninsular Malaysia by analysis of cuticular lipids”, J Med Entomol, 30, pp 969- 974 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 179 113 Kittayapong, P., J.M Clark, J.D Edman, T.L Potter, B.K Lavine, J.R Marion and M Brooks (1990), “Cuticular lipid differences between the malaria vector and non-vector forms of Anopheles maculatus complex”, Med Vet Entomol, 4, pp 405-413 114 Knight, K.l and A Stone, (1977), A catalog of the mosquitoes of the word (Diptera: Culicidae), The Thomas Say Foundation,VI, 611 pp 115 Knudson D.L., Zheng l., Gordon S.W., (1996), “Genome orgnization of vector”, The biology of Disease Vectors Unviversity Press of Colorado, pp 175215 116 Kochn R.K., Zera A.J., and Hall J.G., (1983), “Enzym polymorphism and natural selection”, In M Nei and Sunderland, MA; Sinuaer Associates, Inc, pp 115-136 117 Koekemoer L.L., L Kaumau, R.H Hunt and M Coetzee (2002), “A cocktail polymerase chain reaction assay to identify members of the Anopheles funestus (Diptera: Culicidae) group”, Am J Trop Med Hyg, 66(6), pp 804811 118 Krywinskiand J., Besansky N.J (2003), “Molecular systematics of Anopheles from subgenera to subpopulations”, Annu Rev Entomol, 48, pp 111139 119 Lehmann T., Hawley W.A., Kamau L., Fontenille D., Simard F and Collins F.H, (1996), “Genetic differentiation of Anopheles gambiae populations from East and West Africa: comparison of microsatellite and allozyme loci”, Heredity, 77, pp 192–200 120 Lewontin, R C., (1975) “The problem of genetic diversity” Harley Lecture series, 70, pp 1-20 121 Li Shi- Zhu, Ma Yajun, Zheng Zhemin (2003), “Molecular identification of Anopheles maculatus complex (Diptera: culicidae) from China: single-strand comformation polymorphism (SSCP) assay”, Entomotaxonomia (in Chinese), 25(2), pp 125- 130 122 Linsay S., M Kirby, E Baris and R Bos (2004), “Environmental namgement for malaria control in the east Asia and Pacific (EAP) region”, IBRD Wold Bank, 64 pp 123 Loong, K.P., G.L Chiang and H.H Yap (1988), “Field studies of bionomics of Anopheles maculatus and its role in malaria tranmission in Malaysia”, Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth, 19, pp 724 124 Lounibos L.P., & Conn J.E (2000), “Malaria vector heterogeneity in South America”, Am Entomol 46, pp 238-249 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 180 125 Lu Baolin et al [sic] (1997), Fauna Sinica, Insecta Vol 9, Diptera: Culicidae II Beijing: Science press 190pp 126 Ma Ya- jun, Qu Feng Yi, Dong Xue- Shu, Zhou Hong-ing, (2002), “Molecular identification of Anopheles maculatus complex from China”, Chin J Parasitol Parasit Dis Vol 20 (6), pp 321- 324 127 Ma Ya- jun, Shizhu Li, Jiannong Xu (2006), “Molecular identification and phylogeny of the Maculatus group of Anopheles mosquitoes (Diptera: Culicidae) based on nuclear and motochondrial DNA sequences”, Act Trop 99, pp 272280 128 Malafronte R.S., Marrelli M.T., Marinotti O (1999), “Analysis of ITS2 DNA sequences from Brazilian Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae)”, J Med Entomol, 36(5), pp 631-634 129 Manguin S., Kengne p., Sonnier L., Harbach R E., Baimai V., Trung H.D., Coosemans M (2002), “SCAR markers and multiplex PCR-based identification of isomorphic species in the Anopheles dirus complex in Southeast Asia”, Med Vet Entomol 16(1), pp 46-54 130 Manguin S., Mouchet J., Coosemans M (2001), “Molecular identification of sibling Anopheles species: example of the Anopheles minimus and Anopheles dirus complexes, major malarial vectors in Southeast Asia”, Med Trop 61(6), pp 463-469 131 Manguin S., R.C Wilkerson, J.E Conn, Y Rubio-Palis, J.A Danoff-Burg, and D R Roberts (1999), “Population structure of the primary malaria vector in South America, Anopheles darlingi, using isozyme, random amplified polymorphic DNA, internal transcribed spacer 2, and morphologic markers”, Am J Trop Med Hyg, 60(3), pp 364-376 132 Manonmani A., Nadan N., Jambulingam P., Sahu S., Vijayakumar T., Ramya Vani J., and Subbarao S.K (2003), “Comparison of polymerase chain reaction assay and cytotaxonomy for identification of sibling species of Anopheles fluviatilis (Diptera: Culicidae)”, Bull Entomol Res, 93(2), pp 169171 133 Manonmani A., Townson H., Adeniran T., Jambulingam P., Sachu S., Vijayakimar T (2001), “rDNA-ITS2 polymerase chain reaction assay for the sibling species of Anopheles fluviatilis”, Act Trop, 15, 78(1), pp 3-9 134 Marrelli, M T., Malafronte, R S., Flores-Mendoza et al (1999), “Sequence analysis of the second internal trancribed of ribosomal DNA in Anopheles oswaldoi (Diptera: Culicidae)”, J Med Entomol, 36, pp 679-684 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 181 135 McLain D.K., Collins F.H., Brandling-Bennett A.D., and Were J B.O (1989), “Microgeographic variation in rDNA intergenic spacers of Anopheles gambiae in western Kenya”, Heredity, 62, pp 257–264 136 Miler, M.P., (1997), Tools for Population genetic analyses (TFPGA), : 30pp 137 Miles B.J (1979), “A biochemical key to adult members of the Anopheles gambiae group of species (Diptera: Culicidae)”, J.Med Entomol, 15 (3), pp 297299 138 Mukabayire O, Boccolini D., Lochouarn L., Fontenille D., Bensansky N.J (1999), “Mitochondrial and ribosomal internal transcribed spacer (ITS2) diversity of the African malaria vector Anopheles funestus”, Mol Ecol, 8(2), pp 289-297 139 Narang S.K., Kaiser P.E., and Seawright J.A., (1989), “Identification of species D, A new member of the Anopheles quandrimaculatus complex: a biochemical key”, J Am Mosq Control Assoc, 5, pp 317-324 140 Narang S.K., Seawright J.A., Macro F., (1991), “Genetic structure of natural population of Anopheles albianus in Colombia”, J Am Mosq Control Assoc, 7(3), pp 437-448 141 Norris D.E (2002), “Genetic markers for study of the anopheline vectors of human malaria”, Intl J Parasitol, 32, pp 1607-1615 142 Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T (1989) “Detection of Polymorphisms of Human DNA by Gel Electrophoresis as SSCPs” Proc Natl Acad Sci U S A, 86, pp 2766-70 143 Panyim S., Yasothornsrikul S., Tungpradubkul S., Baimai V., Rosenberg R., Andre R.G and Green A.C (1988), “Identification of isomorphic malaria vectors using a DNA probe”, Am J Trop Med Hyg 38(1), pp 47-49 144 Paskewitz S.M., F.H Collins (1990), “Use of the polymerase chain reaction to identify mosquito species of the Anopheles gambiae complex”, Med Vet Entomol, 4(4), pp 367-373 145 Paskewitz S.M., N G.K., M Coetzee, R.H Hunt (1993), “Evaluation of the polymerase chain reaction method for identifying members of the Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) complex in southern Africa”, J Med Entomol, 30(5), pp 953-957 146 Perera O.P., Cockburn A.F., Mitchell S.E., Conn J., and Seawright J.A (1998), “Species-specific repeat units in the intergenic spacer of the ribosomal RNA cistron of Anopheles aquasalis Curry”, Am J Trop Med Hyg, 59(5), pp 673-678 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 182 147 Perez A.M., Conn J (1992), “A polytene chromosome study of four populations of Anopheles aquasalis from Venezuela” Genome, 35, pp 327-331 148 Petrarca V., A D Nugud, M A Elkarim Ahmed, A M Haridi, M A Di Deco and M Coluzzi (2000), “Cytogenetics of the Anopheles gambiae complex in Sudan, with special reference to An arabiensis: relationships with East and West African populations”, Med Vet Entomol, 14 (2), pp 149 – 164 149 Poopittayasataporn A., and Baimai V (1995), “Polytene chromosome relationships of five species of the Anopheles dirus complex in Thailand” Genome, 38, pp 426-434 150 Porter C.H., F H Collins (1991), “Species-diagnostic differences in a ribosomal DNA internal transcribed spacer from the sibling species Anopheles freeborni and Anopheles hermsi (Diptera: Culicidae)”, Am J Trop Med Hyg 45(2), pp 271-279 151 Pradhan, J N., Shrestha, S.L and Vaidya, R.G., (1970), “Malaria transmission in high moutain valleys of west Nepal including first record of Anophles willmori (James) as a third vector of malaria”, J Nepal Med Assoc, 8, pp 89-97 152 Proft J., Maier W.A., Kampen H (1999), “Identification of six sibling species of the Anopheles maculipennis complex (Diptera: Culicidae) by a polymerase chain reaction assay”, Parasitol Res; 85(10), pp 837-843 153 Puri, I.M., (1931), “Larvae of anopheline mosquitoes, with full description of those of the Indian species”, Indian Maed Res Mem 21, 227pp 154 Rahman, W.A.,Abuhassan, A., Adanan, C.R., Rashid, M.R., (1993), “The prevalence of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax in relation to Anopheles maculatus densities in a Malaysian village”, Act Trop, 55, pp 231235 155 Rao, T R (1984), The Anopheles of India, New Dehli Malaria Reseach Centre Indian of Medical Reseach, 397pp 156 Rattanarithikul, R and C A Green (1986), “Formal recognization of the species of the Anopheles maculatus group (Diptera: Culicidae) occurring in Thailand, including the descriptions of two new species and a preliminary key to female”, Mosq Syst, 18, pp 246-278 157 Rattanarithikul, R and R.E Harbach (1990), “Anopheles maculatus (Diptera: Culicidae) from the type locality of Hong Kong and two new species of the Maculatus Complex from the Philippines”, Mosq Syst, 22, pp 160-183 158 Rattanarithikul, R., B.A Harrison, R.E Harbach, Prachong Panthusin and Russell E Coleman (2006), “Illustrated key to the mosquitoes of Thailand IV Anopheles”, Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth, 37(2), pp 128 pp 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 183 159 Rattanarithikul, R., Konishi, E., K.J., (1996), “Detection of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in anopheline mosquitoes collected in Southern Thailand”, Am J trop Med Hyg, 54, pp 114121 160 Reid, J.A (1968), Anopheline mosquitoes of Malaya and Borneo, Stud Inst Med Res Malaya, 31,520 pp 161 Reid, J.A., B.L Wattal and W.Peters., (1966), “Notes on Anopheles maculatus and some related species”, Bull Indian Soc Malar Comm Dis, 3, pp 185- 197 162 Reinert J.E., Kaiser P.E., and Seawright J.A (1997), “Analysis of the Anopheles quadrimaculatus complex of sibling species (Diptera: Culicidae) using morphological, cytological, molecular, genetic, biochemical, and ecological techniques in an entegrated approach” , J Am Mosq Control Assoc, 13, pp 1-102 163 Reno H.E., Vodkin M.H., Novak R.J (2000), “Differentiation of Aedes triseriatus (Say) from Aedes hendersoni Cockerell (Diptera: Culicidae) by restriction fragment length polymorphisms of amplified ribosomal DNA”, Am J Trop Med Hyg, 62(2), pp 193-199 164 Richard C Wilkerson, Thomas J Raison, Terry A Klein, et al (1995), “Diagnosis by random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction of four cryptic species related to Anopheles (Nyssorhychus) albitarsis (Diptera: Culicidae) from Paraguay, Argentina, and Brazil”, J Med Entomol, 32 (5), pp 697- 704 165 Richardson B.J., Baverstock P.R., and Adams M., (1986), Allozym electrophoresis, A hanbdook for animal systematic and population structure Sysney Academic press, 200pp 166 Romi R., Boccoline D, Di Luca M, La Rosa G., Marinucci M (2000), “Identification of the sibling species of the Anopheles maculipennis complex by heteroduplex analysis”, Insect Mol Biol 9(5), pp 509-513 167 Rongnoparut, P., Rodpradit p., Kongsawadworakul P., Sithiprasasna R., Linthicum J (2006), “Population genetic structure of Anopheles maculatus in Thailand”, J Am Mosq Control Assoc, 22(2), pp 192-197 168 Rongnoparut, P., Yaicharoen, S., Sirichotpakorn, N., Rattanarithikul, R., Lanzaro, G.C., Linthicum, K.L., (1996), “Microsatellite polymorphism in Anopheles maculatus, a malaria vector inThailand”, Am J Trop Med Hyg, 55, pp 589- 594 169 Rongnoparut, P., Yaicharoen, S., Sirichotpakorn, N., Rattanarithikul, R., Linthicum, K.L., (1999), “Estimates of gene flow among Anopheles maculatus 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 184 populations in Thailand using microsatellite analysis”, Am J Trop Med Hyg, 60, pp 509- 515 170 Rutledge C.R., Cornel A.J., Lamar meek C., Collins F.H (1996), “Validation of a ribosomal DNA-polymerase chain reaction species diagnostic assay for the common malaria mosquito (Diptera:Culicidae) sibling species complex”, J Med Entomol, 33(6), pp 952-954 171 Rutledge C.R., Wesson D M., Meek C L (1999), “Polymerase chain reaction assay to identify all immature stages of two species of the Anopheles quandrimaculatus sibling species complex (Diptera: Culicidae)”, J Am Mosq Control Assoc 15(4), pp 573-575 172 Sallum M.A.M., Schultz R., Foster P.G., et al (2002), “Phynogeny of Anophelinea (Diptera: Culicidae) based on nuclear ribosomal and mitochrondial DNA sequences”, Syst Entomol, 27, pp 361-382 173 Sawabe K., Takagi M., Tang L, et al (1986), “Genetic differentiation among three populations of An minimus of GuangXi and Yunnan provinces in the people’s republic of China”, Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth, Vol 27 (4), pp 818- 827 174 Scarpassa V.M., and Tadel W.P (2000), “Enzymatic analysis in Anopheles nuneztovari GaBaldon (Diptera: Culicidae)”, Rev Brazil Biol, 60 (4), pp 539550 175 Scott, J.A., Brogdon, W.D., Collins, F.H., (1993), “Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction”, Am J trop Med Hyg, 49, pp 520- 529 176 Sharakhov I V., M V Sharakhova, C M Mbogo, L L Koekemoer, and G Yan (2001) “Linear and spatial organization of polytene chromosomes of the African malaria mosquito Anopheles funestus”, Genetics, 159, pp 211-218 177 Sharpe R.G., Hims M.M., Harbach R.E., Butlin R.K (1999), “PCR-based methods for identification of species of the Anopheles minimus group: allelespecific amplification and single-strand conformation polymorphism”, Med Vet Entomol, 13(3), pp 265-273 178 Shubi X., Fengyi Q (1991), “Studies on chromosomes of thirteen species of anopheline mosquitoes in China” , J Med Coll PLA, 613, pp 286-291 179 Singh O.P., Dinesh Chandra et al (2004), “Differentiation of members of the Anopheles fluviatilis species complex by an allelespecific polymerase chain reaction based on 28S ribosomal DNA sequences”, Am J Trop Med Hyg, 70 (1), pp 27- 32 180 Smiths A., Roelants P., Bostel W V., and Coosemans Mc, (1986), “Enzym polymorphism’s in the Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) complex relate 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 185 to feeding and resting behavior in the Imbo Valley, Brundi”, J Med Entomol 33(4), pp 545-553 181 Stegnii, V.N and V.M Kabanova, (1976), “Cytoecologycal study of indigenous populations of the malaria mosquito in the territory of the USSR I Identification of a new species of Anopheles in the Maculipennis complex by the cytodiagnostic method”, Mosq Syst, 10, pp 1- 12 182 Steiner W.W.M., Joslyn D.J., (1979), “Electrophoresis technique for the genetic studies of mosquitoes”, Mosq News, 39, pp 18-54 183 Stojanovich CJ, Scott, HG.(1965), Illutrated key to Anopheles mosquitoes of Vietnam Atlanta, Georgia: Department of Health, Education, and Welfare, Public health Service, Communicable Disease Centre 184 Stone, A., (1967), “A synoptic catalog of the mosquitoes of the word, suppl III (Diptera: Culicidae)”, Proc Entomol Soc Wash 69, pp 197- 224 185 Sucharit Supat, Komalamisra Nurumon (1999), “Differentiation of Anopheles minimus species complex by RAPD- PCR technique”, Med Vet Entomol, 80 (9), pp 598-60 186 Sukowati S., Baimai V., Harun S., Dasuki Y., Andri SH., and Efriuati M (1999) “Isozyme evidence for three sibling species in the Anopheles sundaicus complex from Indonesia”, Med Vet Entomol, 13, 408-414 187 Tan S.G., Green C.A., Andre, R.G Baimai, V and Pang, L.W (1986), “Genetics of esterases and 6-phosphogluconate dehydrogenase in the Anopheles maculatus complex”, Act Trop 43, pp 113-123 188 Taylor C.E., Toure Y.T., Coluzzi M., Petrarca V., (1993) “Effective population size and persistence of Anopheles arabiensis during the dry season in west Africa”, Med Vet Entomol, 7, pp 351-357 189 Taylor – Robinson A.W (2001), “Population migration and malaria: tems of reference”, Trends Parasitol, 17, pp 313 190 Thanaphun S., Green C.A., Baimai V., Gass R F and Gingrich J B., (1990), “Genetic linkage relationships of eight enzym/electromorph loci in Anopheles minimus”, Genetical, 82, pp 63-72 191 Thelwell N.J., Huisman R.A., Harbach R.E., Butlin R.K (2000), “Evidence for mitochondrial introgression between Anopheles bwambe, and Anopheles gambiae”, Insect Mol Biol, 9: 203–210 192 Theobald, F.V., (1901), A monograph of the Culicidae or mosquitoes, 1, Bristish Museum (Natural History), London 424 pp 193 Toma T., Miyagi I., Crabtree M.B., Miller B.R (2000) “Identification of Culex vishnui subgroup (Diptera: Culicidae) mosquitoes from the Ryukyu 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 186 Archipelago, Japan: development of a species-diagnostic polymerase chain reaction assay based on sequence variation in ribosomal DNA spacers”, J Med Entomol 37(4), pp 554-558 194 Toure Y.T., Dolo G., Petrarca V., Traore S.F., Boure M., Dao A., Carnahan J., Taylor C.E (1998) “Mark-release-recaptureexperiments with Anopheles gambiae s.l in Banambani Village, Mali, to determine population size and structure”, Med Vet Entomol, 12, pp 74-83 195 Torres, E.P., Foley, D.H., Saul, A., (2000), “Ribosomal DNA sequence markers differentiate two species of the Anopheles maculatus (Diptera: Culicidae) complex in the Philippines”, J Med Entomol, 37, pp 933- 937 196 Toumanoff C., (1936), Le Anopheline en Extreme Orient Coll Soc Pathol Exot Monog, IV, 432 pp 197 Toumanoff C., Hoang tich Try, (1937), “Nouvelle contribution a le connaissance de la faune Anophelience de la haute at situte du Tonkin”, Bull Soc Med Chiring Indochina, 15, pp 980- 911 198 Tripet F., Y T Toure´, C E Taylor, D E Norris, G Dolo et al (2001), “DNA analysis of transferred sperm gene flow between molecular forms of the Anopheles gambiae complex” Mol Ecol 10, pp 1725–1732 199 Ugozzoli, L., Wallace, R.B., (1991), “Allele-specific polymerase chain reaction” Methods: A companion to Methods in Enzymology, 2, pp 42- 48 200 Upatham, E.S., C Prasittisuk, S Ratanatham, C A Green, W Rojanasunan, P Setakana, N Theerasilp, A Tremongkol, V Viaynant, S Pantuwatana and R G Andre (1988), “Bionomics of Anopheles maculatus complex and their role in malaria transmission in Thailand”, Southeast Asian J Trop Med Pub.Health, 19, pp 259-269 201 Van Bortel W., Trung H D., Roelants P., Harbach R.E., Backeljau T., and Coosemans M (2000), “Molecular identification of Anopheles minimus s.l beyond distinguishing the members of the species complex”, Insect Mol Biol 9(3), pp 335-340 202 Van Bortel W., Sochantha T Harbach R.E., Socheat D., Roelants P., Backljau T., Coosemans M (2002), “Presence of Anopheles culicifacies B in Cambodia established by the PCR-RFLP assay developed for the identification of Anopheles minimus species A and C and four related species”, Med Vet Entomol 16(3), pp 329-334 203 Van Bortel W., Trung H D., Roelants P., Harbach R.E., Backeljau T., and Coosemans M (2001), “Confirmation of Anopheles varuna in Vietnam, previously misidentified and mistargeted as the malaria vector Anopheles minimus”, Am J Trop Med Hyg 65(6), pp 729-732 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 187 204 Van Rensburg A.J., Hunt R.H., Koekemoer L.L., Coetzee M., Shiff C.J., Minjas J (1996), “The polymerase chain reaction method as a tool for identifying members of the Anopheles gambiae complex (Diptera:Culicidae) in northeastern Tanzania”, J Am Mosq Control Assoc 12(2 Pt 1), pp 271-274 205 Vythilingam I., Phetsouvanh R., Keokenchanh K., Yengmala V., Vanisaveth V., Phomida., Hakim S.L (2003), “The prevalence of Anopheles (Diptera: Culicidae) mosquitoes in Sekong Province, Lao PDR in relation to malaria transmission”, Trop Med Intl Health, 8(6), pp 525-535 206 Wagner R.P., and Selander R.K (1974), “Isozymes in insects and their significance”, Ann R Entomol 19, pp 117-138 207 Walton C., Handley J.M., Kuvangkadilok C., Collins F.H., Harbach R.E., Baiai V., Butlin R.K (1999), “Identification of five species of the Anopheles dirus complex from Thailand, using allele-specific polymerase chain reaction”, Med Vet Entomol 13(1), pp 24-32 208 Walton C., Sharpe, R.G., Pritchard, S.J., Thelwell, N.J., Butlin, R.K., 1999 “Molecular identification of mosquito species”, Biol J Linn Soc., 68, pp 241- 256 209 Walton, C., P.Somboon, S.M.O Loughlin, S.Zhang, R.E.Harbach, Y.M linton, B.Chen, K.Nolan, S.Duong, M.Y Fong, et al (2007), “Genetic diversity and molecular identification of mosquito species in the Anopheles maculatus group using ITS2 region of rDNA” Infect Genet Evol.(1), pp 93102 210 Weber J.L and May P.E (1989), “Abudant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction”, Am J Hum Genet 44, pp 388-396 211 White G.B (1974), “Anopheles gambiae complex and disease transmission in Africa” Trans R Soc Trop Med Hyg 68, pp 278-301 212 White G.B (1982), “Malaria vector ecology and genetic”, British Med Bull 38(2), pp 207-212 213 White G.B and Muniss J.N (1972), “Taxonomic value of spermatheca size for distinguishing four members of the Anopheles gambiae complex in East Africa” Bull Wld Hlth Org 46, pp 793-799 214 Wilkerson R.C., Parson T.J., Klein T A., Gaffigan T.V., Bergo E., Consolim J (1995), “Diagnosis by random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction of four cryptic species related to Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis (Diptera: Culicidae) from Paraguay, Argentina, and Brazil”, J Med Entomol 32(5), pp 697-704 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 188 215 Wilkerson R.C., Parsons T.J., Albright D.G., Klein T.A., Braun M.J (1993), “Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers readily distinguish cryptic mosquito species (Diptera: Culicidae: Anopheles)”, Insect Mol Biol 1(4), pp 205-211 216 Williams J.G., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalsk J.A & Tingey S.V (1990), “DNA polymorphims amplified by arbitrary primers are useful as genetic makers” Nucleic Acids Res., 18, pp 6531-6535 217 Wirtz, R.A., Burrkot, T.R., Graves, P.M and Andre, R.A., (1987), “Field evaluation of ELISA for P.falciparum and P.vivax sporozoites in mosquitoes from Papua New Guinae”, J Med Entomol 124, pp 433-437 218 World health organization (1975), “Cytogenetics in studies of malaria vectors”, Manual on practical entomology in malaria, part pp 41-51 219 Xu J.N., Qu F.Y (1997), “Ribosomal DNA difference between species A and D of the Anopheles dirus complex of mosquitoes from China”, Med Vet Entomol 11(2), pp 134-138 220 Xu X., Xu J.N., Qu F.Y (1998), “A diagnostic polymerase chain reaction assay for species A and D of the Anopheles dirus (Diptera: Culicidae) species complex based on ribosomal DNA second internal transcribed spacer sequence”, J Am Mosq Control Assoc 14(4), pp 385-389 221 Zheng L., Benedict M.Q., Cornel A.J., Collins F.H., Kafatos F.C., (1996), “An integrated genetic map of the African human malaria vector mosquito, Anopheles Gambiae” Genetics 14, p 941-952 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 Phơ lơc B¶ng 1: KiĨm định 2cân quần thể hệ enzym ODH thành viên nhóm loài An maculatus An maculatus ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 103 103.0959 0.0001 -0.1917 bc 3.8904 0.0031 0.2222 cc 0.0274 0.0274 0.0000 bd 2.9178 0.0023 0.1667 cd 0.0548 0.0548 0.0000 dd 0.0137 0.0137 0.0000 ================================================== 2 : 0.101382 BËc tù do: P: 0.991671 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 77 77.0909 0.0001 -0.1817 ab 3.8788 0.0038 0.2462 bb 0.0364 0.0364 0.0000 ac 1.9394 0.0019 0.1231 bc 0.0485 0.0485 0.0000 cc 0.0061 0.0061 0.0000 ================================================== 2 : 0.096698 BËc tù do: P: 0.992231 Bảng 2: Kiểm định 2cân quần thể hệ enzym LDH thành viên nhóm loµi An maculatus An maculatus ======================================================= KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ======================================================= aa 0.3014 0.3014 0.0000 ab 0.3836 0.3836 0.0000 bb 0.0959 0.0959 0.0000 ac 11 10.4658 0.0273 1.0953 bc 6.1050 0.1312 1.9152 cc 82 82.8539 0.0088 -1.6989 ad 0.5479 0.3729 1.2032 bd 0.3196 0.3196 0.0000 cd 8.7215 0.0089 0.5659 dd 0.2055 0.2055 0.0000 ======================================================= 2 : 1.855050 BËc tù : P: 0.932535 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An sawadwongporni ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.3039 0.3039 0.0000 ab 0.3039 0.3039 0.0000 bb 0.0552 0.0552 0.0000 ac 11 9.7845 0.1510 2.5760 bc 4.4475 0.0686 1.1709 cc 70 71.1602 0.0189 -2.3014 ad 0.3039 0.3039 0.0000 bd 0.1381 0.1381 0.0000 cd 4.4475 0.0686 1.1709 dd 0.0552 0.0552 0.0000 ================================================== 2 : 1.467391 BËc tù do: P: 0.961631 An pseudowillmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 34 34.0000 0.0000 0.0000 ac 1.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.000000 BËc tù do: P: 1.000000 An willmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 35 35.0000 0.0000 0.0000 bd 1.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.000000 BËc tù do: P: 1.000000 An maculatus ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.1273 0.1273 0.0000 ab 0.1273 0.1273 0.0000 bb 0.0182 0.0182 0.0000 ac 6.6182 0.0220 0.7853 bc 2.8364 0.0094 0.3365 cc 73 73.2727 0.0010 -0.5444 ================================================== 2 : 0.305211 BËc tù do: P: 0.959045 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An pseudowillmori d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 30 29.9189 0.0002 0.1624 ab 5.1712 0.1328 1.7839 bb 0.1892 0.1892 0.0000 ac 14 14.7748 0.0406 -1.5082 bc 1.2613 0.0541 -0.4642 cc 1.7117 0.0486 0.6226 ad 2.2162 0.0211 -0.4106 bd 0.1892 0.1892 0.0000 cd 0.5405 0.3905 1.2304 dd 0.0270 0.0270 0.0000 ================================================== 2 : 1.093404 BËc tù do: P: 0.981822 Bảng 3: Kiểm định 2cân quần thể hệ enzym MDH thành viên nhãm loµi An maculatus An maculatus Locut: Mdh1 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.6986 0.1300 0.7173 ab 15 15.2877 0.0054 -0.5699 bb 79 78.5616 0.0024 0.8792 ac 1.3151 0.0755 -0.5478 bc 13 13.5890 0.0255 -1.1522 cc 0.5479 0.3729 1.2032 ================================================== 2 : 0.611825 BËc tù do: P: 0.893720 An willmori Locut: Mdh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.7746 0.0656 0.5107 ab 8.3662 0.0160 -0.7161 bb 20 20.1549 0.0012 -0.3087 ac 1.0845 0.0066 -0.1623 bc 5.3239 0.0858 1.4345 cc 0.2958 0.2958 0.0000 ================================================== 2 : 0.470985 BËc tù do: P: 0.925218 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An maculatus d¹ng Locut : Mdh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.4000 0.4000 0.0000 ab 11 10.4727 0.0265 1.0807 bb 62 62.4000 0.0026 -0.7974 ac 0.7273 0.1023 0.6369 bc 8.7273 0.0085 0.5539 cc 0.2727 0.2727 0.0000 ================================================== 2 : 0.812634 BËc tù do: P: 0.846443 An willmori d¹ng Locut : Mdh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.3061 0.3061 0.0000 ab 4.6531 0.0259 0.7191 bb 14 14.3469 0.0084 -0.6854 ac 0.7347 0.0958 0.6166 bc 4.6531 0.0259 0.7191 cc 0.3061 0.3061 0.0000 ================================================== 2 : 0.768176 BËc tù do: P: 0.857063 An maculatus Locut: Mdh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.8676 0.0202 0.2841 ab 17 17.5342 0.0163 -1.0520 bb 84 83.7260 0.0009 0.5488 ac 0.7306 0.0993 0.6278 bc 7.0137 0.0000 -0.0274 cc 0.1279 0.1279 0.0000 ================================================== 2 : 0.264610 BËc tù do: P: 0.966541 An sawadwongporni Locut: Mdh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 71 71.1602 0.0004 -0.3201 bc 19 18.6796 0.0055 0.6463 cc 1.1602 0.0221 -0.2972 ================================================== 2 : 0.027984 BËc tù do: P: 0.867147 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An pseudowillmori Locut: Mdh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 34 34.0000 0.0000 0.0000 bc 1.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.000000 BËc tù do: P: 1.000000 An willmori Locut: Mdh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 33 33.0423 0.0001 -0.0845 bc 2.9155 0.0024 0.1714 cc 0.0423 0.0423 0.0000 ================================================== 2 : 0.044757 BËc tù do: P: 0.832451 An dravidicus Locut: Mdh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 35 35.0000 0.0000 0.0000 bc 1.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.000000 BËc tù do: P: 1.000000 An maculatus d¹ng Locut : Mdh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0909 0.0909 0.0000 ab 5.0909 0.0016 -0.1802 bb 59 58.9697 0.0000 0.0606 ac 0.7273 0.1023 0.6369 bc 17 16.9697 0.0001 0.0607 cc 1.1515 0.0199 -0.2822 ================================================== 2 : 0.214811 BËc tù do: P: 0.975164 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An pseudowillmori d¹ng Locut : Mdh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 42 41.9459 0.0001 0.1082 bc 13 13.1081 0.0009 -0.2153 cc 0.9459 0.0031 0.1111 ================================================== 2 : 0.004050 BËc tù do: P: 0.949257 An maculatus d¹ng Locut : Mdh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 29 29.0164 0.0000 -0.0328 bc 1.9672 0.0005 0.0661 cc 0.0164 0.0164 0.0000 ================================================== 2 : 0.016949 Bậc tự do: P: 0.896417 Bảng 4: Kiểm định 2cân quần thể hệ enzym GOT thành viên nhóm loài An maculatus An maculatus Locut: Got1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0274 0.0274 0.0000 ab 3.6712 0.0294 0.6861 bb 92 91.7808 0.0005 0.4389 ac 0.2740 0.2740 0.0000 bc 13 13.7671 0.0427 -1.4907 cc 0.4795 0.5652 1.4702 ================================================== 2 : 0.939247 BËc tù do: P: 0.815948 An notanandai Locut: Got1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 22 22.1642 0.0012 -0.3271 bc 11 10.6716 0.0101 0.6667 cc 1.1642 0.0232 -0.3040 ====================================================== 2 : 0.034473 BËc tù do: P: 0.852704 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An sawadwongporni Locut: Got1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 73 72.9448 0.0000 0.1105 bc 17 17.1105 0.0007 -0.2203 cc 0.9448 0.0032 0.1137 ================================================== 2 : 0.003986 BËc tù do: P: 0.949657 An willmori Locut: Got1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 1.0986 0.0088 -0.1881 ab 11 10.8028 0.0036 0.3979 bb 24 24.0986 0.0004 -0.1968 ================================================== 2 : 0.012850 BËc tù do: P: 0.909745 An dravidicus Locut: Got1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 26 25.7746 0.0020 0.4527 bc 9.4507 0.0215 -0.8796 cc 0.7746 0.0656 0.5107 ================================================== 2 : 0.089021 BËc tù do: P: 0.765425 An maculatus d¹ng Locut : Got1 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0182 0.0182 0.0000 ab 2.6364 0.0502 0.7753 bb 63 63.2727 0.0012 -0.5443 ac 0.3273 0.3273 0.0000 bc 16 15.8182 0.0021 0.3657 cc 0.9273 0.0057 0.1510 ================================================== 2 : 0.404581 BËc tù do: P: 0.939295 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An maculatus d¹ng Locut : Got1 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.8824 0.0157 0.2503 ab 8.2353 0.0067 -0.4638 bb 17 16.8824 0.0008 0.2361 ================================================== 2 : 0.023229 BËc tù do: P: 0.878864 An sawadwongporni d¹ng Locut : Got1 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 30 30.0000 0.0000 0.0000 bc 1.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.000000 BËc tù do: P: 1.000000 An pseudowillmori d¹ng Locut : Got1 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 40 40.2252 0.0013 -0.4492 bc 15 14.5495 0.0139 0.9147 cc 1.2252 0.0414 -0.4062 ================================================== 2 : 0.056609 BËc tù do: P: 0.811939 An willmori d¹ng Locut : Got1 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 3.8776 0.0039 0.2487 ab 12 12.2449 0.0049 -0.4849 bb 8.8776 0.0017 0.2466 ================================================== 2 : 0.010454 BËc tù do: P: 0.918563 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An maculatus Locut: Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.5479 0.3729 1.2032 ab 1.2420 0.4626 1.9057 bb 0.6210 0.6210 0.0000 ac 11 12.7854 0.2493 -3.3090 bc 14 13.5845 0.0127 0.8436 cc 70 69.5205 0.0033 0.9622 ad 0.8767 0.0173 0.2632 bd 0.9315 0.0050 0.1419 cd 10 9.5890 0.0176 0.8393 dd 0.3014 0.3014 0.0000 ================================================== 2 : 2.063237 BËc tù do: P: 0.913792 An notanandai Locut: Got2 ====================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ====================================================== bb 0.9851 0.0002 0.0301 bc 10 10.0299 0.0001 -0.0596 cc 23 22.9851 0.0000 0.0299 ===================================================== 2 : 0.000325 BËc tù do: P: 0.985624 An sawadwongporni, Locut: Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0331 0.0331 0.0000 ab 0.3757 1.0375 1.9580 bb 0.7514 0.0823 0.5717 ac 3.5359 0.0812 -0.9862 bc 14 15.0276 0.0703 -1.9833 cc 71 70.2762 0.0075 1.4549 ad 0.0221 0.0221 0.0000 bd 0.0939 0.0939 0.0000 cd 0.8840 0.0152 0.2466 dd 0.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 1.443067 BËc tù do: P: 0.963186 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An pseudowillmori Locut: Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== ac 1.0000 0.0000 0.0000 cc 34 34.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.000000 BËc tù do: P: 1.000000 An willmori Locut: Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 1.9155 0.0037 0.1727 bc 13 13.1690 0.0022 -0.3358 cc 21 20.9155 0.0003 0.1694 ================================================== 2 : 0.006239 BËc tù do: P: 0.937043 An dravidicus Locut: Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0845 0.0845 0.0000 ac 3.8310 0.0075 0.3454 cc 32 32.0845 0.0002 -0.1688 ================================================== 2 : 0.092186 BËc tù do: P: 0.761416 An maculatus d¹ng Locut : Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 0.2182 0.2182 0.0000 bc 7.5818 0.0231 0.8590 cc 58 58.1273 0.0003 -0.2543 bd 0.9818 0.0003 0.0367 cd 15 15.1636 0.0018 -0.3255 dd 0.9273 0.0057 0.1510 ================================================== 2 : 0.249332 BËc tù do: P: 0.969258 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An maculatus d¹ng Locut : Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 1.2941 0.0668 -0.5157 bc 8.7059 0.0099 0.5981 cc 13 13.0588 0.0003 -0.1174 bd 0.7059 0.1225 0.6966 cd 2.1765 0.0143 -0.3382 dd 0.0588 0.0588 0.0000 ================================================== 2 : 0.272727 BËc tù do: P: 0.965073 An sawadwongporni d¹ng Locut : Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 0.1463 0.1463 0.0000 bc 3.4146 0.1003 1.2658 cc 14 14.5122 0.0181 -1.0061 bd 0.2927 0.2927 0.0000 cd 2.5610 0.0753 0.9493 dd 0.0732 0.0732 0.0000 ================================================== 2 : 0.705882 BËc tù do: P: 0.871819 An sawadwongporni d¹ng Locut : Got2 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== cc 20 20.0820 0.0003 -0.1636 cd 10 9.8361 0.0027 0.3306 dd 1.0820 0.0062 -0.1576 ================================================== 2 : 0.009276 BËc tù do: P: 0.923271 An pseudowillmori d¹ng Locut: Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0270 0.0270 0.0000 ab 0.3514 0.3514 0.0000 bb 0.7027 0.1258 0.7056 ac 2.5946 0.0633 0.8711 bc 11 11.2432 0.0053 -0.4812 cc 41 41.0811 0.0002 -0.1620 ================================================== 2 : 0.572925 BËc tù do: P: 0.902602 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An willmori d¹ng Locut : Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 0.7347 0.0958 0.6166 bc 7.5306 0.0374 -1.0229 cc 17 16.7347 0.0042 0.5348 ================================================== 2 : 0.137398 BËc tù do: P: 0.710881 An maculatus d¹ng Locut : Got2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 0.0492 0.0492 0.0000 bc 2.8525 0.0076 0.3026 cc 27 27.0984 0.0004 -0.1964 bd 0.0492 0.0492 0.0000 cd 0.9508 0.0025 0.1009 ================================================== 2 : 0.108893 Bậc tự do: P: 0.990749 Bảng 5: Kiểm định 2cân quần thể hệ enzym 6PGD thành viên nhóm loài An maculatus An maculatus ================================================== Kiểu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 0.0274 0.0274 0.0000 bd 3.5068 0.0693 1.0526 dd 83 83.7260 0.0063 1.4457 bf 0.4384 0.4384 0.0000 df 22 21.0411 0.0437 1.9609 ff 1.2603 0.0538 -0.4627 ================================================== 2 : 0.638851 BËc tù do: P: 0.887484 An sawadwongporni ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 0.3646 0.3646 0.0000 bd 0.7956 0.0525 0.4574 dd 0.3646 0.3646 0.0000 bf 11 10.4751 0.0263 1.0756 df 11 10.4751 0.0263 1.0756 ff 68 68.5249 0.0040 -1.0457 ================================================== 2 : 0.838423 BËc tù do: P: 0.840256 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An notanandai ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 30 30.0896 0.0003 -0.1788 af 3.8209 0.0084 0.3665 ff 0.0896 0.0896 0.0000 ================================================== 2 : 0.098214 BËc tù do: P: 0.753983 An pseudowillmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== cc 23 23.1304 0.0007 -0.2601 ce 10 9.9130 0.0008 0.1747 de 0.9565 0.0020 0.0889 cg 0.8261 0.0366 0.3821 eg 0.1739 0.1739 0.0000 ================================================== 2 : 0.214001 BËc tù do: P: 0.975298 An willmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== dd 14 13.9437 0.0002 0.1129 de 5.0704 0.1704 2.0200 ee 0.3944 0.3944 0.0000 dh 11 12.0423 0.0902 -1.9916 eh 2.1408 0.0093 0.0000 hh 2.4085 0.1453 1.3178 ================================================== 2 : 0.809782 BËc tù do: P: 0.847126 An dravidicus ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== dd 25 24.9296 0.0002 0.1410 df 10 10.1408 0.0020 -0.2797 ff 0.9296 0.0053 0.1461 ================================================== 2 : 0.007490 BËc tù do: P: 0.931033 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== ac 1.9030 0.0049 0.1988 cc 74 74.2182 0.0006 -0.4357 ae 0.0848 0.0848 0.0000 ce 6.6606 0.0173 0.6958 ee 0.1273 0.1273 0.0000 ================================================== 2 : 0.241058 BËc tù do: P: 0.970704 An sawadwongporni d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.1463 0.1463 0.0000 ac 0.1951 0.1951 0.0000 cc 0.0244 0.0244 0.0000 ae 3.5122 0.0678 1.0404 ce 1.7561 0.0339 0.5202 ee 15 15.3659 0.0087 -0.7229 ================================================== 2 : 0.476190 BËc tù do: P: 0.924090 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== dd 10 9.7255 0.0077 0.5567 df 12 12.5490 0.0240 -1.0737 ff 3.7255 0.0202 0.5688 ================================================== 2 : 0.051995 BËc tù do: P: 0.819628 An pseudowillmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 35 35.2793 0.0022 -0.5563 bd 11 11.2252 0.0045 -0.4459 dd 0.8198 0.0396 0.3973 bf 7.2162 0.0851 1.6498 df 1.1351 0.0161 -0.2535 ff 0.3243 0.3243 0.0000 ================================================== 2 : 0.471872 BËc tù do: P: 0.925026 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An willmori d¹ng ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== cc 14 14.3469 0.0084 -0.6854 cg 10 9.3061 0.0517 1.4383 gg 1.3469 0.0894 -0.5957 ================================================== 2 : 0.149489 BËc tù do: P: 0.699024 An maculatus d¹ng ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 23 23.1132 0.0006 -0.2259 ac 3.7736 0.0136 0.4662 cc 0.1132 0.1132 0.0000 ================================================== 2 : 0.127347 BËc tù do: P: 0.721199 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== cc 21 20.9016 0.0005 0.1972 ce 9.1967 0.0042 -0.3892 ee 0.9016 0.0107 0.2071 ================================================== 2 : 0.015401 BËc tù do: P: 0.901235 Bảng 6: Kiểm định 2cân quần thể hệ enzym IDH thành viên nhóm loµi An maculatus An maculatus, Locut: Idh1 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0457 0.0457 0.0000 ab 4.1324 0.0042 -0.2606 bb 75 74.3836 0.0051 1.2380 ac 0.7763 0.0645 0.5065 bc 27 28.1005 0.0431 -2.1572 cc 2.5616 0.0750 0.9478 ================================================== 2 : 0.237613 BËc tù do: P: 0.971300 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An notanandai, Locut: Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 29 29.1493 0.0008 -0.2977 bc 4.7015 0.0190 0.6156 cc 0.1493 0.1493 0.0000 ================================================== 2 : 0.168971 BËc tù do: P: 0.681028 An sawadwongporni, Locut: Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.9448 0.0032 0.1137 ab 14 13.4365 0.0236 1.1504 bb 44 44.9061 0.0183 -1.7937 ac 3.6740 0.1237 -1.2161 bc 26 24.7514 0.0630 2.5592 cc 3.2873 0.0251 -0.5487 ================================================== 2 : 0.256902 BËc tù do: P: 0.967919 An pseudowillmori, Locut: Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 34 34.0000 0.0000 0.0000 ad 1.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.000000 BËc tù do: P: 1.000000 An willmori, Locut: Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.7746 0.0656 0.5107 ab 4.6479 0.0903 -1.2009 bb 6.1268 0.0026 -0.2509 ac 4.8028 0.0081 0.4024 bc 14 13.0986 0.0620 1.8635 cc 6.5493 0.0461 -1.0512 ================================================== 2 : 0.274689 BËc tù do: P: 0.964716 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An dravidicus, Locut: Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== cc 0.7746 0.0656 0.5107 cd 9.4507 0.0215 -0.8796 dd 26 25.7746 0.0020 0.4527 ================================================== 2 : 0.089021 BËc tù do: P: 0.765425 An maculatus d¹ng 5, Locut : Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 80 80.0182 0.0000 -0.0364 bc 2.9636 0.0004 0.0732 cc 0.0182 0.0182 0.0000 ================================================== 2 : 0.018632 BËc tù do: P: 0.891426 An maculatus d¹ng 4, Locut : Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 16 16.0784 0.0004 -0.1565 bc 8.8431 0.0028 0.3165 cc 1.0784 0.0057 -0.1510 ================================================== 2 : 0.008869 BËc tù do: P: 0.924969 An sawadwongporni d¹ng 3, Locut : Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0244 0.0244 0.0000 ab 1.3171 0.0763 -0.5508 bb 8.5610 0.0225 0.9002 ac 0.6341 0.2111 0.9110 bc 8.5610 0.0368 -1.0844 cc 1.9024 0.0050 0.2000 ================================================== 2 : 0.376068 BËc tù do: P: 0.945141 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An sawadwongporni d¹ng 2, Locut : Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 19 19.2787 0.0040 -0.5533 bc 11 10.4426 0.0298 1.1440 cc 1.2787 0.0607 -0.4917 ================================================== 2 : 0.094519 BËc tù do: P: 0.758509 An pseudowillmori d¹ng 2, Locut : Idh1 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 21 21.1351 0.0009 -0.2694 ab 17 16.7838 0.0028 0.4352 bb 3.1622 0.0083 -0.3159 ad 10 9.9459 0.0003 0.1084 bd 3.8919 0.0030 0.2192 dd 1.0811 0.0061 -0.1559 ================================================== 2 : 0.021343 BËc tù do: P: 0.999176 An willmori d¹ng 2, Locut : Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 1.1224 0.0134 -0.2310 ab 4.0408 0.2681 -1.7870 bb 3.1224 0.2466 1.9814 ac 4.7143 0.3506 2.8939 bc 7.7143 0.0661 -1.3603 cc 4.2857 0.0190 -0.5519 ================================================== 2 : 0.963914 BËc tù do: P: 0.809983 An maculatus d¹ng 3, Locut : Idh1 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 18 17.8491 0.0013 0.3032 bc 8.3019 0.0110 -0.5927 cc 0.8491 0.0268 0.3273 ================================================== 2 : 0.039089 BËc tù do: P: 0.843273 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An maculatus d¹ng 6, Locut : Idh1 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 26 26.1639 0.0010 -0.3268 bc 4.6721 0.0230 0.6782 cc 0.1639 0.1639 0.0000 ====================================================== 2 : 0.187970 BËc tù do: P: 0.664612 An maculatus, Locut: Idh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.3562 0.3562 0.0000 ab 11 10.6849 0.0093 0.6393 bb 73 73.5616 0.0043 -1.1190 ac 1.6027 0.0985 0.8857 bc 23 22.1918 0.0294 1.6455 cc 1.6027 0.2267 -0.9434 ================================================== 2: 0.724316 BËc tù do: P: 0.867470 An sawadwongporni, Locut: Idh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 72 72.0497 0.0000 -0.0994 ab 18 17.9006 0.0006 0.1994 bb 1.0497 0.0024 -0.0971 ================================================== 2 : 0.002942 BËc tù do: P: 0.956743 An pseudowillmori, Locut: Idh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 32 32.0435 0.0001 -0.0869 ab 2.9130 0.0026 0.1765 bb 0.0435 0.0435 0.0000 ================================================== 2 : 0.046133 BËc tù do: P: 0.829934 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An willmori, Locut: Idh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.9296 0.0053 0.1461 ab 10 10.1408 0.0020 -0.2797 bb 25 24.9296 0.0002 0.1410 ================================================== 2 : 0.007490 BËc tù do: P: 0.931033 An maculatus d¹ng 5, Locut : Idh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0061 0.0061 0.0000 ab 1.9030 0.0049 0.1988 bb 74 74.2182 0.0006 -0.4357 ac 0.0848 0.0848 0.0000 bc 6.6606 0.0173 0.6958 cc 0.1273 0.1273 0.0000 ================================================== 2 : 0.241058 BËc tù do: P: 0.970704 An maculatus d¹ng 4, Locut : Idh2 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0196 0.0196 0.0000 ab 1.9608 0.0008 0.0792 bb 24 24.0196 0.0000 -0.0392 ================================================== 2 : 0.020408 BËc tù do: P: 0.886403 An sawadwongporni d¹ng 3, Locut : Idh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 12 12.0976 0.0008 -0.1943 ab 7.8049 0.0049 0.3951 bb 1.0976 0.0087 -0.1862 ================================================== 2 : 0.014337 BËc tù do: P: 0.904692 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An sawadwongporni d¹ng 2, Locut : Idh2 ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 19 19.2787 0.0040 -0.5533 ab 11 10.4426 0.0298 1.1440 bb 1.2787 0.0607 -0.4917 ================================================== 2 : 0.094519 BËc tù do: P: 0.758509 An pseudowillmori d¹ng 2, Locut : Idh2 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 35 35.2793 0.0022 -0.5563 ab 19 18.4414 0.0169 1.1339 bb 2.2793 0.0342 -0.5228 ================================================== 2 : 0.053349 BËc tù do: P: 0.867509 An maculatus d¹ng 6, Locut : Idh2 ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.0000 0.0000 0.0000 ab 0.9836 0.0003 0.0331 bb 29 29.0164 0.0000 -0.0328 ac 0.0164 0.0164 0.0000 bc 0.9836 0.0003 0.0331 cc 0.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.016949 BËc tù do: P: 0.999416 B¶ng 7: Kiểm định 2cân quần thể hệ enzym PGM thành viên nhóm loài An maculatus An maculatus ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.4795 0.5652 1.4702 ab 12 12.7397 0.0430 -1.4356 bb 79 78.5616 0.0024 0.8792 ac 1.3014 0.0698 -0.5268 bc 16 16.1370 0.0012 -0.2728 cc 0.7808 0.0615 0.4948 ================================================== 2 : 0.743042 BËc tù do: P: 0.863036 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An notanandai ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 1.7910 0.0244 0.4414 ab 12 12.4179 0.0141 -0.8216 bb 20 19.7910 0.0022 0.4201 ================================================== 2 : 0.040649 BËc tù do: P: 0.840218 An sawadwongporni ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 7.0442 0.0003 -0.0881 ab 18 18.3149 0.0054 -0.6244 bb 11 11.4917 0.0210 -0.9621 ac 19 18.5967 0.0087 0.8153 bc 25 23.7017 0.0711 2.6665 cc 11 11.8508 0.0611 -1.6391 ================================================== 2 : 0.167685 BËc tù do: P: 0.982629 An pseudowillmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 8.6232 0.0165 0.7699 bc 17 17.7536 0.0320 -1.4748 cc 8.6232 0.0165 0.7699 ================================================== 2 : 0.064922 BËc tù do: P: 0.798879 An willmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 5.3239 0.0197 -0.6278 bc 18 17.3521 0.0242 1.3197 cc 13 13.3239 0.0079 -0.6399 ================================================== 2 : 0.051777 BËc tù do: P: 0.819999 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An dravidicus ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.7746 0.0656 0.5107 ab 9.4507 0.0215 -0.8796 bb 26 25.7746 0.0020 0.4527 ================================================== 2 : 0.089021 BËc tù do: P: 0.765425 An maculatus d¹ng ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 1.2941 0.0668 -0.5157 ab 10 9.4118 0.0368 1.2125 bb 15 15.2941 0.0057 -0.5825 ================================================== 2 : 0.109266 BËc tù do: P: 0.740982 An sawadwongporni d¹ng ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 1.9024 0.0050 0.2000 ab 9.1951 0.0041 -0.3861 bb 10 9.9024 0.0010 0.1961 ================================================== 2 : 0.010105 BËc tù do: P: 0.919929 An sawadwongporni d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 21 20.9016 0.0005 0.1972 bc 9.1967 0.0042 -0.3892 cc 0.9016 0.0107 0.2071 ================================================== 2 : 0.015401 BËc tù do: P: 0.901235 An pseudowillmori d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 28 27.7568 0.0021 0.4886 bc 23 23.4865 0.0101 -0.9628 cc 4.7568 0.0124 0.4987 ================================================== 2 : 0.024647 BËc tù do: P: 0.875250 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An willmori d¹ng ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 1.8571 0.0110 0.2964 bc 10 10.2857 0.0079 -0.5634 cc 13 12.8571 0.0016 0.2873 ================================================== 2 : 0.020513 BËc tù do: P: 0.886114 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 0.8491 0.0268 0.3273 bc 8.3019 0.0110 -0.5927 cc 18 17.8491 0.0013 0.3032 ================================================== 2 : 0.039089 BËc tù do: P: 0.843273 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 22 21.7377 0.0032 0.5277 bc 8.5246 0.0323 -1.0162 cc 0.7377 0.0933 0.6084 ================================================== 2 : 0.128708 BËc tù do: P: 0.719776 Bảng 8: Kiểm định 2cân quần thể hệ enzym GPI thành viên nhóm loài An maculatus An maculatus ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 2.2648 0.0310 -0.4974 ab 28 27.4703 0.0102 1.0695 bb 80 80.2648 0.0009 -0.5288 ================================================== 2 : 0.042056 BËc tù do: P: 0.837512 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An pseudowillmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 34 34.0000 0.0000 0.0000 bc 1.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.00000 BËc tù do: P: 1.00000 An dravidicus ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 1.0986 0.0088 -0.1881 ab 11 10.8028 0.0036 0.3979 bb 24 24.0986 0.0004 -0.1968 ================================================== 2 : 0.012850 BËc tù do: P: 0.909745 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 1.0364 0.0013 -0.0714 ab 17 16.9273 0.0003 0.1458 bb 65 65.0364 0.0000 -0.0727 ================================================== 2 : 0.001609 BËc tù do: P: 0.968006 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.8824 0.0157 0.2503 ab 8.2353 0.0067 -0.4638 bb 17 16.8824 0.0008 0.2361 ================================================== 2 : 0.023229 BËc tù do: P: 0.878864 An sawadwongporni d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.9016 0.0107 0.2071 ab 9.1967 0.0042 -0.3892 bb 21 20.9016 0.0005 0.1972 ================================================== 2 : 0.015401 BËc tù do: P: 0.901235 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== ab 1.0000 0.0000 0.0000 bb 30 30.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.000000 BËc tự do: P: 1.000000 Bảng 9: Kiểm định 2cân quần thể hệ enzym -GPD thành viên nhãm loµi An maculatus An maculatus ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 10 9.4977 0.0266 1.0307 ab 4.4521 0.0459 -0.8566 bb 0.4795 0.5652 1.4702 ac 2.0776 0.0029 -0.1523 bc 0.4795 0.4795 0.0000 cc 0.0959 0.0959 0.0000 ad 37 37.3973 0.0042 -0.7903 bd 8.6301 0.0460 -1.2131 cd 4.0274 0.2349 2.1632 dd 36 35.9589 0.0000 0.0822 ea 2.0776 0.0029 -0.1523 be 0.4795 0.5652 1.4702 ce 0.2237 0.2237 0.0000 de 4.0274 0.0002 -0.0546 ee 0.0959 0.0959 0.0000 ================================================== 2 : 2.388918 BËc tù do: 10 P: 0.992397 An notanandai ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 0.9851 0.0002 0.0301 bc 5.9104 0.0014 0.1805 cc 7.8806 0.0018 0.2406 be 4.1194 0.0035 -0.2353 ce 11 11.3284 0.0095 -0.6471 ee 3.7761 0.0133 0.4608 ================================================== 2 : 0.029644 BËc tù do: P: 0.998655 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An sawadwongporni ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 7.9061 0.0011 0.1890 ab 3.2818 0.0242 -0.5386 bb 0.3039 0.3039 0.0000 ad 35 34.9061 0.0003 0.1881 bd 7.1105 0.1113 1.8859 dd 37 37.4917 0.0064 -0.9769 ================================================== 2 : 0.447151 BËc tù do: P: 0.930339 An pseudowillmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.7971 0.0516 0.4535 ab 1.7536 0.0346 0.5259 bb 0.7971 0.0516 0.4535 ad 7.6522 0.0556 -1.2471 bd 7.6522 0.0556 -1.2471 dd 17 16.3478 0.0260 1.3300 ================================================== 2 : 0.275092 BËc tù do: P: 0.964643 An willmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 5.3239 0.0197 -0.6278 bd 18 17.3521 0.0242 1.3197 dd 13 13.3239 0.0079 -0.6399 ================================================== 2 : 0.051777 BËc tù do: P: 0.819999 An dravidicus ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 3.2535 0.0198 -0.4868 bc 4.9577 0.2191 2.2897 cc 1.6901 1.6901 0.0000 bd 7.1268 0.0023 -0.2513 cd 5.1831 0.6369 4.2071 dd 3.5634 0.0891 -1.0326 be 3.4085 0.0489 -0.7659 ce 2.4789 0.1096 1.1448 de 3.5634 0.0891 -1.0326 ee 0.7746 0.0656 0.5107 ================================================== 2 : 2.970366 BËc tù do: P: 0.812557 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 5.2182 0.0091 -0.4271 ac 3.0545 0.0010 -0.1081 ad 27 26.7273 0.0028 0.5482 cd 7.6364 0.0173 0.7443 dd 33 33.0909 0.0002 -0.1816 ea 1.7818 0.0267 0.4621 ce 0.5091 0.4734 1.3503 de 4.4545 0.0464 -0.8610 ee 0.1273 0.1273 0.0000 ================================================== 2 : 1.104193 BËc tù do: P: 0.981352 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 1.0784 0.0057 -0.1510 ab 2.1569 0.0114 -0.3020 bb 0.8824 0.0157 0.2503 ac 3.2353 0.1807 1.6974 bc 2.9412 0.0012 0.1188 cc 2.0588 0.0017 -0.1160 ad 3.4510 0.0589 -0.8403 bd 3.1373 0.0060 -0.2684 cd 4.7059 0.1059 -1.3002 dd 2.3529 0.1779 1.4577 ================================================== 2 : 0.565168 BËc tù do: P: 0.996953 An sawadwongporni d¹ng ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.2439 0.2439 0.0000 ab 0.9756 0.0006 0.0494 bb 0.6829 0.1472 0.7627 ac 2.4390 0.1290 1.2421 bc 3.9024 0.0024 0.1975 cc 4.6341 0.0868 -1.1773 ad 1.0976 0.0087 -0.1862 bd 1.7561 0.3255 -1.1262 cd 4.3902 0.0847 1.3005 dd 0.8780 0.0169 0.2601 ================================================== 2 : 1.045806 BËc tù do: P: 0.983816 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An sawadwongporni d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== cc 8.1311 0.0021 -0.2602 cd 12 12.0656 0.0004 -0.1308 dd 4.1475 0.0052 -0.2898 ce 3.6721 0.0293 0.6842 de 2.6393 0.0493 0.7685 ee 0.3443 0.3443 0.0000 ================================================== 2 : 0.430539 BËc tù do: P: 0.933864 An pseudowillmori d¹ng ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 10 10.5946 0.0334 -1.1552 ab 1.7658 0.0311 0.4983 bb 0.0541 0.0541 0.0000 ad 27 26.0450 0.0350 1.9445 bd 2.1261 0.0075 -0.2446 dd 15 15.4144 0.0111 -0.8176 ================================================== 2 : 0.172133 BËc tù do: P: 0.981957 An willmori d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 2.7755 0.0182 0.4667 bd 11 11.4490 0.0176 -0.8801 dd 11 10.7755 0.0047 0.4536 ================================================== 2 : 0.040441 BËc tù do: P: 0.840620 An maculatus d¹ng ================================================== KiĨu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== bb 2.5660 0.0734 0.9375 bc 4.4906 0.0536 -0.9255 cc 1.7170 0.2994 -1.0811 bd 3.8491 0.0059 0.3077 cd 3.1698 0.2174 1.8610 dd 1.2453 0.0483 -0.4387 be 3.5283 0.0791 -0.9732 ce 2.9057 0.4122 2.5571 de 2.4906 0.0966 -0.8775 ee 1.0377 0.0014 -0.0741 ================================================== 2 : 1.287300 BËc tù do: P: 0.972353 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An maculatus d¹ng ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== cc 11 11.5246 0.0239 -1.0249 cd 14 13.7049 0.0064 0.5965 dd 3.7869 0.0120 0.4380 ce 1.2459 0.4564 1.8932 de 0.7213 0.7213 0.0000 ee 0.0164 0.0164 0.0000 ================================================== 2 : 1.236359 BËc tù do: P: 0.744298 Bảng 10: Kiểm định 2cân quần thể hệ enzym MPI thành viên nhóm loài An maculatus An maculatus ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 2.1233 0.0072 -0.2393 ab 2.9726 0.0003 0.0550 bb 0.9589 0.0018 0.0839 ac 6.6530 0.0181 0.7119 bc 4.5068 0.0570 -0.9544 cc 4.9361 0.0008 0.1287 ad 17 17.1279 0.0010 -0.2548 bd 12 11.6027 0.0136 0.8080 cd 26 25.9680 0.0000 0.0640 dd 33 33.1507 0.0007 -0.3007 ================================================== 2 : 0.100384 BËc tù do: P: 0.999980 An notanandai ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== cc 15 14.7761 0.0034 0.4511 cd 15 15.4478 0.0130 -0.8824 dd 3.7761 0.0133 0.4608 ================================================== 2 : 0.029644 BËc tù do: P: 0.863300 An sawadwongporni ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== cc 0.9448 0.0032 0.1137 cd 17 17.1105 0.0007 -0.2203 dd 73 72.9448 0.0000 0.1105 ================================================== 2 : 0.003986 BËc tù do: P: 0.949657 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 An pseudowillmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== cd 1.0000 0.0000 0.0000 dd 34 34.0000 0.0000 0.0000 ================================================== 2 : 0.000000 BËc tù do: P: 1.000000 An willmori ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 1.2817 0.0619 -0.4964 ac 12 11.4366 0.0278 1.1541 cc 23 23.2817 0.0034 -0.5600 ================================================== 2 : 0.093071 BËc tù do: P: 0.760309 An dravidicus ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 21 20.1549 0.0354 1.7251 ab 5.3239 0.0197 -0.6278 bb 0.2958 0.2958 0.0000 ac 0.7606 0.0754 0.5474 bc 0.0986 0.0986 0.0000 ad 7.6056 0.3390 -2.8456 bd 0.9859 1.0431 2.8293 cd 0.1408 0.1408 0.0000 dd 0.6338 0.2116 0.9120 ================================================== 2 : 2.259339 BËc tù do: P: 0.894370 An maculatus d¹ng ================================================== KiÓu gen Obs (O) Exp (E) (O-E)²/E 2*O*Ln(O/E) ================================================== aa 0.7273 0.1023 0.6369 ab 0.0970 0.0970 0.0000 ac 3.9758 0.2395 -1.6896 bc 0.2485 0.2485 0.0000 cc 4.9697 0.2136 2.2608 ad 11 10.4727 0.0265 1.0807 bd 0.6545 0.1823 0.8476 cd 26 26.8364 0.0261 -1.6464 dd 35 35.0182 0.0000 -0.0364 ================================================== 2 : 1.135749 BËc tù do: P: 0.979939 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 z 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99