(Luận văn) ứng dụng kĩ thuật metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện cưmgra tỉnh đăk lăk

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG lu an n va p ie gh tn to nl w ỨNG DỤNG KĨ THUẬT METAGENIMICS TRONG NGHIÊN CỨU oa HỆ VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÂY CÀ PHÊ TẠI HUYỆN CƯM’GRA d TỈNH ĐĂK LĂK oi lm ul nf va an lu z at nh LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm z m co l gm @ Mã số: 60 42 01 14 an Lu HÀ NỘI, 2017 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Phạm Bích Ngọc Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận văn lu Hồng Thị Huyền Trang an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn tới TS Phạm Bích Ngọc tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, làm việc hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn TS Vũ Huyền Trang, Ths Nguyễn Hồng Hà, Ths Nguyễn Khắc Hưng tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học cơng nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực luận văn lu an Xin chân thành cảm ơn đề tài : “Nghiên cứu metagenome vi sinh vật n va đất vùng rễ số trồng Việt Nam: thuốc có củ (cây nghệ), công tn to nghiệp (cà phê) nhằm tăng suất chất lượng trồng” PGS TS Lê gh Mai Hương chủ nhiệm hỗ trợ kinh phí trang thiết bị q trình thực p ie luận văn w Qua đây, xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô ban đào tạo viện oa nl Sinh thái tài nguyên sinh vật hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho d suốt thời gian học tập nghiên cứu lu va an Cuối xin cảm ơn đến bạn bè gia đình giúp đỡ, chia sẻ, ll u nf động viên suốt trình học tập thực luận văn m oi Hà Nội, tháng 11 năm 2017 z at nh Học viên z l gm @ m co Hoàng Thị Huyền Trang an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây cà phê tình hình sản xuất cà phê 1.1.1 Nguồn gốc,phân bố cà phê 1.1.2 Tình hình sản xuất cà phê Việt Nam 1.2 Hệ vi sinh vật đất ý nghĩa sinh trưởng, phát triển trồng 1.2.1 Giới thiệu hệ vi sinh vật lu 1.2.2 Vi sinh vật đất vùng rễ an n va 1.3 Công nghệ metagenomics ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền tn to hệ vi sinh vật đất gh 1.4 Các bước ứng dụng công nghệ Metagenomics nghiên cứu da dạng p ie khu hệ sinh vật từ môi trường w 1.5 Ứng dụng đọc trình tự gen hệ nghiên cứu metagenomics 14 oa nl 1.5.1 Cơng nghệ đọc trình tự bán dẫn ion 15 d 1.5.2 Cơng nghệ giải trình tự Illumina (Solexa) sequencing 17 lu va an 1.6 Các nghiên cứu metagenomics giới Việt Nam 21 u nf 1.6.1 Các nghiên cứu metagenomics giới 21 ll 1.6.2 Các nghiên cứu metagenomics Việt Nam 22 m oi CHƯƠNG VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 25 z at nh 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 z gm @ 2.2.1 Phương pháp thu mẫu 25 l 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 26 m co 2.2.4 Khuếch đại vùng 16S rRNA 28 an Lu 2.2.5 Tinh sản phẩm PCR 29 2.2.6 Gắn Index (Nextera XT Index kit) 29 n va ac th iii si 2.2.7 Tinh sản phẩm gắn Index 31 2.2.8 Đánh giá thư viện 31 2.2.9 Biến tính thư viện giải trình tự máy Miseq 31 2.2.10 Phân tích liệu 33 2.2.11 Phương pháp xác định tuyến trùng 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 lu an n va 3.1 Phân tính đặc điểm lý hóa sinh học chung mẫu 36 3.2 Kết tách chiết DNA tổng số 39 3.3 Chuẩn bị thư viện gắn adapter 40 3.4 Kết phân tích liệu trình tự 41 3.5 Kết phân tích mức độ đa dạng quần thể vi khuẩn đất vùng rễ 3.5.1 Kết đánh giá độ đa dạng mức phân loại nghành 43 gh tn to cà phê 42 p ie 3.5.2 Kết phân tích cấu trúc thành phần vi khuẩn chiếm ưu w đất vùng rễ mức độ phân loại lớp họ vi khuẩn 44 oa nl 3.5.3 Kết phân tích cấu trúc hệ vi khuẩn đất vùng rễ mức độ chi 47 d 3.5.4 Kết phân tích thành phần số loài vi khuẩn đặc trưng hệ lu va an vi sinh vật đất vùng rễ cà phê 49 u nf KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 Kết luận 51 Kiến nghị 51 ll oi m z at nh TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 z m co l gm @ an Lu n va ac th iv si DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Bảng thống kê thành phần hữu mẫu đất nghiên cứu 38 Bảng 3.2 Nồng độ độ tinh mẫu DNA tách từ đất 40 Bảng 3.3: Thống kê liệu trình tự thu sau bước giải trình tự 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ mơ tả hoạt động hệ thống giải trình tự Illumina 20 giai đoạn 1: tổng hợp 20 lu an Hình 1.2 Sơ đồ mơ tả hoạt động hệ thống giải trình tự Illumina 20 n va Hình 2.1 Vị trí tiến hành thu mẫu khu vực nghiên cứu 26 tn to Hình 2.2 Quy trình khuếch đại giải trình tự vùng 16S rRNA 28 gh Hình 2.3 Bố trí ống mẫu 30 p ie Hình 2.4 Quy trình phân tích sử dụng cơng cụ QIIME 34 w Hình 3.1: Hình ảnh cà phê tái canh bệnh cà phê kinh doanh khu vực oa nl thu mẫu thí nghiệm Cây cà phê tái canh bệnh (A) mẫu rễ (C); Cây cà phê d kinh doanh (B) mẫu rễ (D) 36 lu va an Hình 3.2 Biểu đồ thể thành phần loài tuyến trùng mẫu đất khu vực u nf nghiên cứu 37 ll Hình 3.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA tổng số 39 m oi mẫuđất nghiên cứu 39 z at nh Hình 3.4 Biểu đồ ghi lại tín hiệu đo kích thước sản phẩm khuếch đại cặp z mồi 16S 40 gm @ Hình 3.4 Biểu đồ ghi lại tín hiệu đo kích thước sản phẩm gắn index 41 l Hình 3.5: Rarefaction curve dựa liệu trình tự bốn hệ vi sinh vậtcác m co OTU 0,1 42 an Lu Hình 3.6: Cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ ngành 43 Hình 3.7 Cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ lớp 45 n va ac th v si Hình 3.8 Cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ họ 46 Hình 3.9 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có lợiở mức độ chi 47 Hình 3.10 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi 49 Hình 3.11 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ lồi 49 Hình 3.12 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ lồi 50 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT lu an n va TCT : Tái canh tốt TCB : Tái canh bệnh NSC : Năng suất cao NSTB : Năng suất trung bình OM : Hữu tổng số Nts : Nitơ tổng số Pts : Photpho tổng số Kts : Kali tổng số Pdt : Photpho dễ tiêu Kdt : Kali dễ tiêu p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si MỞ ĐẦU Quần thể sinh vật (archaeal, vi khuẩn, nấm, tuyến trùng) quanh hệ rễ thường tạo nên sinh thái điển hình đặc trưng cho lồi thực vật, đóng vai trị quan trọng sinh trưởng phát triển Các sinh vật cung cấp chất dinh dưỡng, chất kích thích cho việc tăng cường phát triển ngăn ngừa sâu bệnh giúp chống chịu với điều kiện bật lợi nóng, lạnh, muối hạn hán Cà phê công nghiệp dài ngày, chủ lực mang lại lu hiệu kinh tế cao cho ngượi trồng cho kinh tế chung cho nước Năm 2012 an Việt Nam vượt qua Brasil trở thành quốc gia đứng đầu giới xuất cà phê va Lượng cà phê xuất tăng liên tục hàng năm Năm 2016, Việt Nam xuất 1,78 n tn to triệu với kim ngạch 3,34 tỷ USD, tăng 32,8% khối lượng tăng 24,7% giá gh trị so với năm 2015 Tuy nhiên tập trung vào tăng sản lượng nên vùng đất trồng p ie cà phê bị khai thác mức, gây ô nhiễm nguồn nước, đất bị xói mịn, bạc màu, w phát sinh dịch bệnh, tạo điều kiện cho vi sinh vật kháng thuốc trừ sâu… Vấn đề oa nl nghiên cứu có tính hệ thống sinh vật (có lợi có hại, cộng sinh ký sinh…) d nguồn gen chúng đất trồng vùng canh tác hiệu an lu sở khoa học định hướng, xây dựng giải pháp cải tạo hiệu khu hệ sinh vật, góp u nf va phần thúc đẩy phát triển cà phê cách bền vững ll Hiện nay, metagenomics (phân tích DNA vi sinh vật mơi trường m oi mà không cần nuôi cấy) công nghệ mới, kết hợp kỹ thuật công nghệ sinh học z at nh khác từ công nghệ gen, giải trình tự đến đến tin sinh học để nghiên cứu thành phần, chức động học quần thể vi sinh vật Các liệu thu từ nghiên z cứu metagenomics cho phép phát đối tượng vi sinh vật gây bệnh, dự @ gm báo dịch bệnh để có biện pháp phòng trừ hiệu Việc đánh giá đa m co l dạng quần thể vi sinh vật đất canh tác, xác định nhóm vi sinh vật có lợi, có hại… làm sở để nghiên cứu chế phẩm sinh học nhằm cải tạo đất, an Lu kích thích vi sinh vật có lợi, tăng cường sức đề kháng chống chịu, tăng suất, chất lượng trồng n va ac th si Xuất phát từ phân tích tiến hành đề tài nghiên cứu “Ứng dụng kĩ thuật metagenomics nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cà phê huyện Cư M’gra tỉnh Đăk Lăk” Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá cấu trúc hệ vi khuẩn đất vùng rễ cà phê bước đầu khảo sát tác động hệ vi sinh vật đến sinh trưởng phát triển cà phê tỉnh Đăk Lăk Nội dung nghiên cứu lu - Tách chiết DNA tổng số từ mẫu đất nghiên cứu an - Giải trình tự phân đoạn 16S ribosome kỹ thuật metagenomics va n - Xác định so sánh thành phần nghành, lớp, họ, chi, loài hệ vi to gh tn khuẩn đất vùng rễ cà phê p ie Địa điểm nghiên cứu w Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện d oa nl Hàn lâm Khoa học Việt Nam ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si Xylella fastidiosa Các vi khuẩn ảnh hưởng đến trồng quan trọng nông nghiệp bao gồm cà chua, chuối, có múi, gạo, cà phê Tuy nhiên mẫu tái canh tốt họ chiếm số lượng ưu điều liên quan đến vấn đề tương tác hệ vi sinh vật mà chưa biết tới, cịn nhóm cà phê kinh doanh có suất cao hệ vi sinh vật tồn mẫu ổn định nên số lượng loài vi sinh vật thuộc họ Xanthomonadaceae chiếm ưu mẫu suất trung bình Chúng tơi tiếp tục tiến hành phân tích cấu trúc, thành phần hệ vi khuẩn đất vùng rễ cà phê mức độ chi (Genus) Kết phân tích cấu trúc hệ vi khuẩn đất vùng rễ mức độ chi lu 3.5.3 an n va Ở mức độ thấp mặt phân loại, nghiên cứu xác định 438 chi tồn liệu phân tích, chọn số chi quan trọng, cho có lợi hay hại to gh tn cà phê (Hình 3.10 3.11), để tập trung phân tích Các nhóm có tỉ lệ phần trăm thấp 0,1% phân vào nhóm khác Các trình tự cịn lại xếp ie p nhóm chưa phân loại d oa nl w ll u nf va an lu oi m B A z at nh Hình 3.10 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có lợi mức độ chi A Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ chi có lợi nhóm cà phê tái canh z @ B Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ chi có lợi nhóm cà phê kinh doanh gm Từ hình 3.10 cho thấy có 11 chi vi sinh vật có lợi đất quanh vùng rễ m co l cà phê Tuy nhiên số lượng loài chi phụ thược vào kiểu cảnh tác giai đoạn phát triển Kết hình 3.9A cho thấy, chi Sphingobium mẫu cà an Lu phê tái canh có số lượng cao gấp lần so với mẫu cà phê tái canh nhiễm bệnh Đây làchi bao gồm loài biết có khả phân huỷ loạt hóa chất gây n va ac th 47 si độc cho môi trường hợp chất thơm clo, phenol nonylphenol pentachlorophenol, thuốc diệt cỏ (RS)-2-(4-chloro-2-methylphenoxy) propionic acid hexachlorocyclohexane, hydrocacbon thơm đa vòng Chi Chitinophaga chiếm số có khả phân hủy chitin (vỏ tuyến trùng) cellulose chi vi sinh vật đất có ảnh hưởng đến sinh trưởng cà phê chúng có khả phân hủy vỏ chitin tuyến trùng đất Chi Streptomyces tìm thấy chủ yếu đất thảm thực vật mục nát Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, kết từ sản sinh geosmin trình chuyển hóa chất Streptomyces nghiên cứu rộng rãi biết đến nhiều chi họ xạ khuẩn (Actinomyces) Streptomyces thường sống đất có vai trị vi sinh vật phân hủy quan trọng Chủng lu an vi sinh sản xuất nửa số thuốc kháng sinh giới sản phẩm n va có giá trị lớn lĩnh vực y tế, có khả sinh kháng sinh nên mẫu cà phê tn to tái canh khỏe mạnh phân tích lượng Streptomyces gấp lần so với mẫu cà phê tái ie gh canh nhiễm bệnh p Từ hình 3.10 B cho thấy chi Sphingobium, Chitinophaga, Streptomyces w chiếm ưu mẫu cà phê kinh doanh suất cao Ngồi chi ta oa nl thấy Bacillus loài gần phổ biến tự nhiên, ví dụ đất, mà cịn xảy d mơi trường khắc nghiệt pH cao ( B alcalophilus), nhiệt độ cao ( B lu va an thermophilus ), muối cao ( B halodurans ) B thuringiensis tạo độc tố có u nf thể giết trùng sử dụng làm thuốc trừ sâu (Joan L Slonczewski & ll John W Foster (2011), loại vi sinh vật tồn đất, chúng có tác dụng lên m oi vật chủ giúp chủ tăng sức đề kháng với loại bệnh, nấm, côn trùng z at nh hại Chính qua số liệu thu đư Được nhận thấy nhóm cà phê kinh doanh suất cao có bacillus cao z m co l gm @ gấp lần so với nhóm cà phê kinh doanh có suất thấp an Lu n va ac th 48 si B A Hình 3.11 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi A Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi nhóm cà phê tái canh B Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi nhóm cà phê kinh doanh Số lượng phân bố chi có hại sinh trưởng phát triển lu cà phê hình 3.11 A 3.11 B, chi Burkholderia có số an lượng lớn Đặc biệt với nhóm tái canh bệnh, số lượng vi sinh vật cao gấp 13 lần so với n va nhóm cà phê tái canh tốt to Kết phân tích thành phần số lồi vi khuẩn đặc trưng hệ vi tn 3.5.4 ie gh sinh vật đất vùng rễ cà phê p Phân tích tồn liệu, chúng tơi xác định có mặt 155 lồi d oa nl w chọn số loài đặc trưng để phân tích (Hình 3.12 3.13) ll u nf va an lu oi m B z at nh A Hình 3.12 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ lồi z A Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ lồi nhóm cà phê tái canh gm @ B Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ lồi nhóm cà phê kinh doanh Trong số loài phát hiện, S wittichii chiếm số lượng ưu đặc biệt với l m co mẫu tái canh tốt có số lượng cao gấp lần so với mẫu tái canh bệnh Điều cho thấy S.wittichii ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển cà phê an Lu Các lồi S wittichii lồi có khả phân hủy dioxin Ngồi cịn có lồi tạo n va chất khác G fujikuroi sản xuất chất kích thích sinh trưởng thực vật, H ac th 49 si ochraceum chuyển hóa kháng nấm sinh kháng sinh; R leguminosarum có khả cố định đạm tự A B Hình 3.13 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ loài lu an A Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ lồi nhóm cà phê tái canh n va B Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ lồi nhóm cà phê kinh doanh to Trong số lồi phân tích, có lồi gây bệnh cà phê loài gh tn thực vật khác.Kết thể Hình 3.13 cho thấy, có lồi gây hại cho thực vật ie điển R solanacearum gây bệnh héo lá, Fastidiosa gây bệnh cháy, p Pseudomonas garcae gây bệnh đốm cà phê Đối với nhóm cà phê tai canh bị bệnh nl w suất thấp ta thấy có mặt lồi Fastidiosa, Pseudomonas garcae R d oa solanacearum cao nhóm tái canh tốt cà suất cao Điều phần cho ll u nf va phê an lu thấy chủng phần tác động tới phát triển suất cà oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 50 si KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Xác định 512.896 trình tự đoạn V3 V4 gen 16S rRNA, 133,661 trình tự cho cà phê tái canh bị bệnh,124,574 trình tự cho cà phê tái canh bị bệnh,122,816 trình tự cho cà phê kinh doanh suất cao 131,845 trình tự cho cà phê kinh doanh trung bình - Kết phân tích metagenomic cho thấy chiến đa số vi sinh vật vùng rễ cà phê thuộc ngành Proteobacteria, lớp Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria, Saprospirae, Actinobacteria, Actinobacteria-6, họ lu Sphingomonadaceae, Chitinnophagaceae, Xanthomonadaceae, Burkholderiaceae, an Chthonlobacteraceae, Streptomycetaceae (33,44%, 41,71%, 41,57% 40,49% lần va n lượt cho cà phê tái canh tốt, cà phê tái canh bệnh, cà phê kinh doanh suất cao gh tn to cà phê kinh doanh suất trung bình) - Chi Sphingobium thuộc họ Sphingomonadaceae, Chitinophaga thuộc họ p ie Chitinnophagaceae, Streptomyces thuộc họ Streptomycetaceae chiếm ứu w mẫu cà phê kinh doanh suất cao Chi Burkholderia thuộc họ Burkholderiaceae phê tái canh tốt) d oa nl phổ biến vùng rễ nhóm cá phê tái canh bệnh (cao gấp 13 lần so với nhóm cà lu an - Loài Sphingobium wittichii chiếm ưu rễ cà phê tái canh tốt (gấp u nf va lần so với tái canh bệnh) Các lồi gây bệnh điển hình cà phê R solanacearum gây bệnh héo lá, Fastidiosa gây bệnh cháy, Pseudomonas garcae ll Kiến nghị z at nh tái canh bệnh oi m gây bệnh đốm cà phê phát vùng rễ khác nhau, đặc biệt vùng z Từ kết thu nghiên cứu hướng phát triển sử dụng chế @ gm phẩm sinh học làm tăng vi sinh vật tự nhiên có lợi giảm vi sinh vật có hại, l trực tiếp gián tiếp lên sinh trưởng phát triển cà phê, nhằm mục tiêu m co phát triển bền vững, tăng suất chất lượng cà phê Việt Nam an Lu Tiến hành tiệp tục nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng hệ sinh vật tới khả sinh trưởng phát triển cà phê n va ac th 51 si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 52 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tài liệu Tiếng Anh Amann, R I., Ludwig, W., Schleifer, K H., (1995) “Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation” Microbiol Rev 59, 143–169 Atkinson, D and Watson, C A., (2000) “The beneficial rhizosphere: A dynamic entity” Appl Soil Ecol., 15, 99-104 lu an Aragon AD, Torrez-Martinez N, Edwards JS, (2012) “Genomic analysis of n va Saccharomyces cerevisiae isolates that grow optimally with glucose as the sole tn to carbon source” Electrophoresis 33(23): 3514-20 gh Azad AK, Curtis A, Papp A, Webb A, Knoell D, Sadee W, Schlesinger LS, p ie (2013) “Allelic mRNA expression imbalance in C-type lectins reveals a frequent w regulatory SNP in the human surfactant protein A (SP-A) gene” Genes Immun oa nl 14(2): 99-106 d Barns SM; Cain EC; Sommerville L; Kuske CR, (2007) “Acidobacteria lu the known within the phylum” Appl Environ ll Microbiol 73 (9):31136 diversity u nf expand va an phylum sequences in uranium-contaminated subsurface sediments greatly oi m z at nh Beja, O., Koonin, E V., Aravind, L., Taylor, L T., (2002) “Comparative genomic analysis of archaeal genotypic variants in a single population and in z two different oceanic provinces” Appl Environ Microbiol 68, 335–345 @ l gm Bomar, L , Maltz, M., Colston, S and Graf, J (2011) Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics MBio 2: e00012-0001 m co Breitbart M, Salamon P, Andresen B, Mahaffy JM, Segall AM, Mead D, an Lu Azam F, Rohwer F "Genomic analysis of uncultured marine viral communities" n va Proceedings of the National Academy USA 2002, 99 (22): 14250–14255 ac th 53 si Castro TL, Seyffert N, Ramos RT, Barbosa S, Carvalho RD, Pinto AC, Carneiro AR, Silva WM, Pacheco LG, Downson C, Schneider MP, Miyoshi A, Azevedo V, Silva A, (2013) “IonTorrent-based transcriptional assessment of a Corynebacterium pseudotuberculosis equi strain reveals denaturing highperformance liquid chromatography a promising rRNA depletion method” Microb Biotechnol 6(2): 168-177 10 Campos VP & Villain L, (2005) Nematodes parasites of coffee and cocoa In: Plant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture Luc M, Sikora A & Bridge J (Eds.) Pp: 529-579 CABI Publishing, Wallingford, lu an UK n va 11 Daniel R., (2005) “The metagenomics of soil” Nat Rev Microbiol.3(6): tn to 470-488 ie gh 12 Daves K (2010) It’s “Watson Meets Moore” as Ion Torrent Introduces Sequencing p Semiconductor Bio-IT World 2010 http://www.bio- nl w itworld.com/news/03/01/10/ion-torrent-semiconductor-sequencing.html oa 13 Delmont TO, Robe P, Clark I, Simonet P, Vogel TM, (2011) d “Metagenomic comparison of direct and indirect soil DNA extraction an lu u nf va approaches” J Microbiol Methods86(3):397–400 14 Edwards, RA; Rodriguez-Brito B, Wegley L, Haynes M, Breitbart M, ll oi m Peterson DM, Saar MO, Alexander S, Alexander EC, Rohwer F (2006) "Using 7: 57 z at nh pyrosequencing to shed light on deep mine microbial ecology" BMC Genomics z 15 EJ Chung, TS Park, CO Jeon, YR Chung, (2012) “Chitinophaga @ l gm oryziterrae sp nov., isolated from the rhizosphere soil of rice (Oryza sativa L.)”.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology m co 16 Ferla MP, Thrash JC, Giovannoni SJ, Patrick WM (2013) "New rRNA an Lu gene-based phylogenies of the Alphaproteobacteria provide perspective on n va major groups, mitochondrial ancestry and phylogenetic instability" ac th 54 si 17 Gams, W (2007) Biodiversity of soil-inhabiting fungi Biodivers Conserv 16, 69–72 18 Handelsman, J., (2004) “Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms” Microbiol Mol Biol Rev 68, 669-685 19 Hartwig B, James GV, Konrad K, Schneeberger K, Turck F, (2012) “Fast isogenic mapping-by-sequencing of ethyl methanesulfonate-induced mutant bulks” Plant Physiol 160(2): 591-600 20 Hardeman, F., and S Sjoling., (2007) “Metagenomic approach for the lu isolation of a novel low-temperature-active lipase from uncultured bacteria of an marine sediment” FEMS Microbiol Ecol.59:524-534 n va tn to 21 Hassan SS, Guimarães LC, Pereira Ude P, Islam A, Ali A, Bakhtiar SM, Ribeiro D, Rodrigues Dos Santos A, Soares Sde C, Dorella F, Pinto AC, gh p ie Schneider MP, Barbosa MS, Almeida S, Abreu V, Aburjaile F, Carneiro AR, w Cerdeira LT, Fiaux K, Barbosa E, Diniz C, Rocha FS, Ramos RT, Jain N, oa nl Tiwari S, Barh D, Miyoshi A, Müller B, Silva A, Azevedo V, (2012) “Complete d genome sequence of Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis strain lu an P54B96 isolated from antelope in SOTUh Africa obtained by rapid next u nf va generation sequencing technology” Stand Genomic Sci7(2): 189–199 ll 22 Hochmuth T, Niederkruger H, Gernert C, Siegl A, Taudien m oi S,Platzer M, Crews P, Hentschel U & Piel J (2010) Linking chemical z at nh and microbial diversity in marine sponges: possiblerole for Poribacteria as producers of methyl-branched fatty acids Chembiochem 11: 2572 – 2578 z gm @ 23 Howden BP, McEvoy CR, Allen DL, Chua K, Gao W, Harrison PF, Bell J, Coombs G, Bennett-Wood V, Porter JL, Robins-Browne R, Davies JK, l m co Seemann T, Stinear TP, (2011) “Evolution of multidrug resistance during Staphylococcus aureus infection involves mutation of the essential two an Lu component regulator WalKR” PLoS Pathog 7(11): e1002359 n va ac th 55 si 24 Hugenholz, P., (2002) “Exploring prokaryotic diversity in the genomic era” Genome Biology3 (2): 1–8 25 Iqbal, Z., Caccamo, M., Turner, I., Flicek, P and McVean, G., (2012)“De novo assembly and genotyping of variants using colored de Bruijn graphs” Nat Genet 44: 226–32 26 Jünemann S, Prior K, Szczepanowski R, Harks I, Ehmke B, Goesmann A, Stoye J, Harmsen D, (2012) “Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by ion torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing” PLoS One 7(8): e41606 lu an 27 Pace, N R., Stahl, D A., Lane, D J., Olsen, G J., The analysis of n va natural microbial populations by ribosomal RNA se-quences.Adv Microb Ecol to tn 1986,9, 1–55 ie gh 28 Pace, N.R.; Delong, EF (1991) Analysis of a marine picoplankton p community by 16S rRNA gene cloning and sequencing Journal of nl w Bacteriology 173 (14): 4371–4378 d oa 29 Parachin, Nádia Skorupa; Marie F Gorwa-Grauslund "Isolation of an lu xylose isomerases by sequence- and function-based screening from a soil va metagenomic library" Biotechnology for Biofuels (1): (2011) ll u nf 30 Purushothaman S, Toumazou C, Ou C-P (2006) Protons and single oi m nucleotide polymorphism detection: a simple use for the ion sensitive field z at nh effect transistor Sensors & Actuators: B Chemical 114 (2): 964-968 31 Perkel J (2011) Making contact with sequencing's fourth generation z Biotechniques 2011 @ gm 32 Poinar, HN; Schwarz, C, Qi, J, Shapiro, B, Macphee, RD, Buigues, B, Schuster, SC (2006) "Metagenomics to m co l Tikhonov, A, Huson, D, Tomsho, LP, Auch, A, Rampp, M, Miller, W, and Paleogenomics: Large-Scale an Lu Sequencing of Mammoth DNA" Science 311 (5759): 392–394 n va ac th 56 si 33 Kakirde, Kavita S.; Larissa C Parsley, Mark R Liles (1 November 2010) "Size Does Matter: Application-driven Approaches for Soil Metagenomics" Soil biology & biochemistry 42 (11): 1911–1923 34 Karow J., (2011) “At AGBT, Ion Torrent Customers Provide First Feedback” Life Tech OTUlines Platform's Growth In Sequence 35 Kennedy, A.C., (1999) “The rhizosphere and spermosphere In: Principles and applications of soil microbiology” (Eds.: Sylvia, D M., Fuhrmann, J J., Hartel, P G., and Zuberer, D A.) Prentice Hall, Upper Saddle River, NewJersy lu an 36 Kuske CR; Barns SM; Busch JD (1997) “Diverse uncultivated bacterial n va groups from soils of the arid southwestern United States that are present in many to tn geographic regions” Appl Environ Microbiol 63 ie gh 37 Lussier FX, Chambenoit O, Côté A, Hupé JF, Denis F, Juteau P, Beaudet p R, Shareck F, (2011)“Construction and functional screening of a metagenomic nl w library using a T7 RNA polymerase-based expression cosmid vector” J Ind oa Microbiol Biotechnol 38 (9): 1321-8 d 38 Lynch, J M., (1981) “Promotion and inhibition of soil aggregate an lu va stability by microorganisms” J Gen Microbiol 126, 371-375 ll u nf 39 Madigan, M J Martinko (eds.) (2005) Brock Sinh học vi sinh oi m vật (lần thứ 11 ed.) Prentice Hall ISBN 0-13-144329-1 z at nh 40 Mardis ER, (2008) “Next-generation DNA sequencing methods” Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387–402 z 41 Maplestone, P A and Campbell, R., (1989) “Colonization of roots of @ gm wheat seedlings by Bacilli proposed as biocontrol against take all” Soil Biol m co l Biochem 21, 543-550 42 Mellmann A, Harmsen D, Cummings CA, Zentz EB, Leopold SR, Rico an Lu A, Prior K, Szczepanowski R, Ji Y, Zhang W, McLaughlin SF, Henkhaus JK, n va Leopold B, Bielaszewska M, Prager R, Brzoska PM, Moore RL, Guenther S, ac th 57 si Rothberg JM, Karch H, (2011) “Prospective genomic characterization of the German enterohemorrhagic Escherichia coli O104:H4 OTUbreak by rapid next generation sequencing technology” PLoS One 11;6(7): e22751 43 Mendes, R cs (2011) Deciphering the rhizosphere microbiome for disease-suppressive bacteria Science 332, 1097–1100 44 Metzker M.L, (2005) “Emerging technologies in DNA sequencing” Genome Res 15(12): 1767-76 45 Metzker ML., (2010) “Sequencing technologies - the next generation” lu Nat Rev Genet 11(1): 31-46 doi: 10.1038/nrg2626 Epub 2009 Dec an 46 Perkel J, (2011) “Making contact with sequencing's fourth generation” n va Biotechniques 2011 gh tn to 47 Purushothaman S, Toumazou C, Ou C-P, (2006) “Protons and single p ie nucleotide polymorphism detection: a simple use for the ion sensitive field effect transistor” Sensors & Actuators: B Chemical114 (2): 964-968 oa nl w 48 Ramachandran C., Fonseca HB., Jhabvala P, Escalon EA., Melnick SJ (2002) Curcumin inhibits telomerase activity through human telomerase reverse d an lu transcriptase in MCF-7 breast cancer cell line Cancer Lett 184: 1–6 u nf va 49 Rappe, M S.; Giovannoni, S J., (2003) “The Uncultured Microbial Majority” Annual Review of Microbiology57: 369–394 ll oi m 50 Ramos RT, Carneiro AR, Soares Sde C, dos Santos AR, Almeida S, z at nh Guimarães L, Figueira F, Barbosa E, Tauch A, Azevedo V, Silva A, (2013) “Tips and tricks for the assembly of a Corynebacterium pseudotuberculosis z gm @ genome using a semiconductor sequencer” Microb Biotechnol 6(2): 150-6 l 51 Rothberg JM, Hinz W, Rearick TM, Schultz J, Mileski W, Davey M, m co Leamon JH, Johnson K, Milgrew MJ, Edwards M, Hoon J, Simons JF, Marran an Lu D, Myers JW, Davidson JF, Branting A, Nobile JR, Puc BP, Light D, Clark TA, Huber M, Branciforte JT, Stoner IB, Cawley SE, Lyons M, Fu Y, Homer N, n va ac th 58 si Sedova M, Miao X, Reed B, Sabina J, Feierstein E, Schorn M, Alanjary M, Dimalanta E, Dressman D, Kasinskas R, Sokolsky T, Fidanza JA, Namsaraev E, McKernan KJ, Williams A, Roth GT, Bustillo J, (2011) “An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing”.Nature 475(7356): 348-352 52 Rolf Daniel, (2005)“The metagenomics of soil” Nat Rev Microbiol.3(6):470-488 53 Rusch DB, Halpern AL, Sutton G, Heidelberg KB, Williamson S, et al lu The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Northwest Atlantic through an Eastern Tropical Pacific PLoS Biology 5: e77 (2007) va n 54 Rusk N, (2011) “Torrents of sequence” Nat Meth 8(1): 44-44 gh tn to 55 Slonczewski JL, Foster JW (2014) Microbiology: An Evolving Science (3rd ed.) W W Norton & Company pp 742–3 p ie S., 56 Tamilarasi, Nanthakumar, nl selected medicinal of plants K., root and and associated influence of d oa microorganismsof Karthikeyan, “Diversity (2008) w Lakshmanaperumalsamy, K., an lu rhizomicroorganisms on the antimicrobial property of Coriandrum sativum” J u nf va Environ Biol 29, 127-134 57 Thomas, T., J Gilbert, and F Meyer, (2012) “Metagenomics - a guide ll oi m from sampling to data analysis” Microb Inform Exp 2(1): p z at nh 58 Torsvik, V., Daae, F L., Sandaa, R.-A & Øvreås, L Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems Curr Opin Microbiol 5, 240– z gm @ 245 (2002) 59 Turnbaugh PJ, Ley RE, Hamady M, Fraser-Liggett CM, Knight R, et al l m co The Human Microbiome Project Nature 449: 804–810 (2007) an Lu n va ac th 59 si 60 Tringe SG, von Mering C, Kobayashi A, Salamov AA, Chen K, et al Comparative metagenomics of microbial communities Science 308: 554–557 (2005) 61 Tyson, GW; Chapman J, Hugenholtz P, Allen EE, Ram RJ, Richardson PM, Solovyev VV, Rubin EM, Rokhsar DS, Banfield JF () "Insights into community structure and metabolism by reconstruction of microbial genomes from the environment" Nature 2004, 428 (6978): 37–43 62 Schmeisser, C., Steele, H and Streit, W.R (2007) Metagenomics, biotechnology with nonculturable microbes Appl Microbiol Biotechnol 75, lu an 955–962 n va 63 Sylvia, D M and Chellemi, D O., (2001) “Interactions among root- tn to inhabiting fungi and their implications for biological control of root pathogens” ie gh Adv Agron 73, 1-33 p 64 Venter, JC; Remington K, Heidelberg JF, Halpern AL, Rusch D, Eisen nl w JA, Wu D, Paulsen I, Nelson KE, Nelson W, FOTUs DE, Levy S, Knap AH, d oa Lomas MW, Nealson K, White O, Peterson J, Hoffman J, Parsons R, Baden- an lu Tillson H, Pfannkoch C, Rogers Y, Smith HO (2004) "Environmental Genome va Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea" Science 304 (5667): 66–74 u nf 65 Visi DK, D'Souza N, Ayre BG, Webber Iii CL, Allen MS, (2013) ll “Investigation of the bacterial retting community of kenaf (Hibiscus oi m z at nh cannabinus) under different conditions using next-generation semiconductor sequencing” J Ind Microbiol Biotechnol 40(5): 465-475 z @ 66 Vogel U, Szczepanowski R, Claus H, Jünemann S, Prior K, Harmsen D, l gm (2012)“Iontorrent personal genome machine sequencing for genomic typing of Neisseria meningitidis for rapid determination of multiple layers of typing m co information” J Clin Microbiol.50(6): 1889-1894 an Lu 67 Whiteley AS, Jenkins S, Waite I, Kresoje N, Payne H, Mullan B, n va Allcock R, O'Donnell A, (2012) “Microbial 16S rRNA Ion Tag and community ac th 60 si metagenome sequencing using the IonTorrent (PGM) Platform”.J Microbiol Methods 91(1):80-88 68 Woese, C R., (1987) “Bacterial evolution” Microbiol Rev 51, 221– 271 69 Wolfgang, K., Erich, C., Brigitte, K., (2002) “Microbial contamination of medicinal plants: A review” Planta Medica 68, 5-15 70 Yergeau E, Lawrence JR, Sanschagrin S, Waiser MJ, Korber DR, Greer CW, (2012) “Next-generation sequencing of microbial communities in the lu Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities” an Appl Environ Microbiol 78(21): 7626-37 n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 61 si