(Luận văn) phân lập gen defensin liên quan đến khả năng kháng mọt ở cây đậu xanh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LƢƠNG THỊ TRANG lu an n va p ie gh tn to PHÂN LẬP GEN DEFENSIN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT Ở CÂY ĐẬU XANH d oa nl w u nf va an lu ll LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC oi m z at nh z an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN m co l gm @ THÁI NGUYÊN - 2015 ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LƢƠNG THỊ TRANG lu an n va PHÂN LẬP GEN DEFENSIN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT Ở CÂY ĐẬU XANH p ie gh tn to d oa nl w Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60.42.01.14 an lu ll u nf va LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC oi m z at nh Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ NGỌC LAN z m co l gm @ va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN an Lu THÁI NGUYÊN - 2015 ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi chưa cơng bố cơng trình Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, tháng năm 2015 Tác giả luận văn lu an Lƣơng Thị Trang n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN i ac th si LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Ngọc Lan định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt suốt q trình tơi tiến hành nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn GS.TS Chu Hoàng Mậu, TS Hoàng Phú Hiệp c c thầy cô Bộ môn Di truyền & Sinh học đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Th i Nguyên tạo điều kiện thuận lợi, tận tình bảo, giúp đỡ tơi q trình học tập hoàn lu thành luận văn an n va Cuối cùng, bày tỏ lời cảm ơn đến bạn bè tồn thể gia đình tn to giúp đỡ, động viên suốt thời gian học tập ie gh Thái Nguyên, tháng năm 2015 p Tác giả luận văn d oa nl w an lu ll u nf va Lƣơng Thị Trang oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTNii ac th si MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài lu an Mục tiêu nghiên cứu va n Nội dung nghiên cứu tn to Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU ie gh 1.1 Đặc điểm chung đậu xanh p 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu xanh nl w 1.1.2 Đặc điểm nông sinh vai trò đậu xanh oa 1.1.3 Đặc điểm hóa sinh hạt đậu xanh d 1.2 Mọt hại đậu xanh an lu va 1.2.1 Đặc điểm mọt hại hạt đậu xanh u nf 1.2.2 T c hại mọt đậu xanh 13 ll 1.2.3 Biện ph p phòng trừ mọt đậu C chinensis gây hại 13 oi m z at nh 1.3 Đặc điểm defensin gen defensin 19 1.3.1 Đặc điểm chung defensin thực vật 19 z 1.3.2 C c nghiên cứu defensin đậu xanh 22 @ gm Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 m co l 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu 26 2.1.1 Vật liệu 26 an Lu 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 26 va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTNiii ac th si 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Phương ph p nghiên cứu 27 2.2.1 Đ nh gi khả kh ng mọt c c giống đậu xanh 27 2.2.2 Phương ph p sinh học phân tử 27 2.2.3 Phương ph p x c định trình tự nucleotide 33 2.2.4 Phương ph p xử lý số liệu 34 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Đặc điểm c c giống đậu xanh nghiên cứu 35 3.2 Khả kh ng mọt c c giống đậu xanh nghiên cứu 36 lu 3.2.1 X c định khả kh ng mọt dựa tỷ lệ số lượng hạt bị hại 36 an 3.2.2 X c định khả kh ng mọt dựa tỷ lệ khối lượng hạt bị hại 38 va n 3.3 Kết phân lập gen defensin1 từ đậu xanh 41 tn to 3.3.1 Kết nhân gen defensin1 từ đậu xanh 41 ie gh 3.3.2 Kết biến nạp vector t i tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli 43 p 3.3.3 Kết giải trình tự cDNA DEF1 44 nl w 3.4 Phân tích đa dạng trình tự nucleotode trình tự amino acid suy d oa diễn gen defensin1 47 an lu KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 va Kết luận 50 ll u nf Đề nghị 50 oi m TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 z at nh z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTNiv ac th si DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid bp Cặp base cDNA Complementary DNA (Sợi DNA bổ sung tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngược) lu an n va Cộng DEF1 Defensin DEPC diethyl pyrocarbonate DNA deoxyribosenucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside ie gh tn to cs Kilo base p kb Kilogray mRNA messenger ribonucleic acid d Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) an lu PCR oa nl w kGy Ribonucleic Acid TAE Tris acetat Ethylen Diamin Tetraacetic Acid ll u nf va RNA oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTNiv ac th si DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách giống đậu xanh nghiên cứu 26 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 28 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi nhân gen DEF1 29 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nhân gen DEF1 29 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen DEF1 30 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pBT 31 Bảng 3.1 Một số đặc điểm hình thái 10 giống đậu xanh nghiên cứu 35 lu an Bảng 3.2 Tỷ lệ số hạt đậu xanh nghiên cứu bị hại 37 va n Bảng 3.3 Tỷ lệ khối lượng hạt bị hại 39 tn to Bảng 3.4 Sự sai khác trình tự nucleotide cDNA DEF1 giống ie gh đậu xanh DX16 trình tự có mã số AY437639 45 p Bảng 3.5 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein DEF1 nl w giống đậu xanh DX16 trình tự mang mã số AY437639 47 oa Bảng 3.6 Hệ số tương đồng sai khác di truyền trình tự cDNA d DEF1 giống đậu xanh 47 an lu va Bảng 3.7 Hệ số tương đồng hệ số sai khác giống đậu xanh dựa ll u nf trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen DEF1 48 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTNv ac th si DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cặp mọt trưởng thành (C chinensis) 11 Hình 1.2 Cấu trúc defensin thực vật 20 Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc defensin đậu xanh (VrD1) 22 Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT 31 Hình 3.1 Hình ảnh giống đậu xanh nghiên cứu 35 Hình 3.2 Đồ thị mơ tả tỷ lệ thiệt hại số lượng hạt 10 giống đậu xanh 37 Hình 3.3 Tỷ lệ khối lượng hạt bị hại 10 giống đậu xanh nghiên cứu 39 lu Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân cDNA DEF1 từ giống đậu an xanh DX123 DX16 42 va n Hình 3.5 So sánh trình tự nucleotide cDNA DEF1 giống đậu xanh to tn DX16 với trình tự gen Ngân hàng gen Quốc tế 45 p ie gh Hình 3.6 So s nh trình tự amino acid suy diễn protein DEF1 giống đậu xanh DX16 với trình tự mang mã số AY437639 46 nl w Hình 3.7 Sơ đồ hình mối quan hệ giống đậu xanh dựa d oa trình tự nucleotide gen DEF1 48 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTNvi ac th si MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] trồng có giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế cao Đậu xanh có thời gian sinh trưởng ngắn so với nhiều loại ăn hạt khác, chế độ chăm sóc đơn giản Đậu xanh cịn xem thứ dược liệu q có tác dụng giải độc, nhiệt, bớt sưng phù, điều hoà ngũ tạng, chữa bệnh cho người Hạt đậu xanh cịn mặt hàng nơng sản xuất có giá trị Ngoài ra, sản phẩm phụ đậu xanh dùng làm thức ăn cho gia súc Trồng đậu xanh cịn có tác dụng chống xói mịn, cải tạo lu đất Hệ rễ đậu xanh có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm Trồng đậu an n va xanh mang hiệu mặt kinh tế dinh dưỡng mà cịn có tác gh tn to dụng cải tạo đất Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới, đặc điểm khí hậu thường nóng p ie ẩm, điều kiện tốt để phát triển sản xuất nông nghiệp Tuy nhiên, w yếu tố thuận lợi cho sâu hại phát sinh phát triển gây tổn thất nghiêm trọng tới oa nl suất phẩm chất nông sản Đối với nhóm nơng sản hạt, d nguyên nhân gây tổn thất đến số lượng chất lượng hạt côn lu va an trùng, chủ yếu Bộ cánh cứng (thường gọi mọt) Mọt gây thành dịch u nf từ số lượng nhỏ cá thể, khả sinh sản lớn thời gian phát triển cá ll thể ngắn Sự tổn hại mọt gây lớn, cơng t c phịng trừ mọt đậu m oi nói chung mọt đậu xanh nói riêng vấn đề cần quan tâm z at nh nghiên cứu Vì vậy, cơng tác chọn tạo giống bên cạnh yếu tố suất cao chất lượng tốt khả chống chịu với điều kiện ngoại cảnh z l đỗ nói chung chọn giống đậu xanh nói riêng gm @ có khả kh ng mọt hạt vấn đề cần thiết lĩnh vực chọn giống đậu m co Hiện nay, có c c cơng trình nghiên cứu đậu xanh phương an Lu diện hình thái, suất, đ nh gi đa dạng kiểu gen, kiểu hình đa hình protein… giống đậu xanh địa phương Một số nghiên cứu bước đầu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN1 ac th si Tỷ lệ khối lượng hạt bị mọt qua bốn thời điểm theo dõi giống đậu xanh nghiên cứu trên, rút số nhận xét sau: Sau 20 ngày đầu giống đậu xanh bị mọt ăn, ăn mạnh giống đậu xanh DX22 (20,00%), ăn giống đậu xanh DX123 (3,46%) Sau 25 ngày giống bị ăn mạnh, mạnh giống DX22 bị ăn giống DX123 Sau 35 ngày giống bị ăn 50%, giống DX22 bị ăn nhiều gấp 1,73 lần so với giống DX123 Sự xếp giống đậu xanh nghiên cứu theo thứ tự giảm dần tỷ lệ khối lượng hạt bị hại giống đậu xanh sau: DX22 > DX5 > DX16 > DX6 > lu an DX2 > DX7 > DX17 > DX14 > DT > DX123 n va Ở phương ph p đ nh gi kh ng mọt trên, thấy rằng, thứ tự tn to xếp hạng khả kh ng mọt giống đậu xanh giống ie gh phương ph p nghiên cứu tỷ lệ thiệt hại giống đậu xanh nghiên cứu p tương đương Cụ thể là, tỷ lệ thiệt hại giống đậu xanh nl w nghiên cứu dần từ ngày nhiễm mọt thứ 20 đến 35 10 giống nghiên cứu d oa bị thiệt hại 50% an lu Từ kết trên, chia 10 giống đậu xanh nghiên cứu thành ba u nf va nhóm theo mức độ kháng mọt khác Nhóm có khả kh ng mọt gồm giống DX22, DX5, DX16 DX6 Nhóm có khả kh ng mọt ll oi m trung bình gồm giống DX2, DX7 DX17 Nhóm có khả kh ng mọt z at nh tốt gồm giống DX14, DT DX123 Trong phương ph p thấy, phương ph p đ nh gi theo tỷ z gm @ lệ số lượng hạt bị mọt hại xác dễ thực phương ph p đ nh gi l tỷ lệ khối lượng hạt bị hại Vì vây, tiến hành đ nh gi khả kh ng mọt va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN40 an Lu lượng hạt bị hại m co hạt đậu đỗ cần thực hiên theo phương ph p dựa tỷ lệ số ac th si 3.3 Kết phân lập gen defensin1 từ đậu xanh 3.3.1 Kết nhân gen defensin1 từ đậu xanh Chúng nhân gen DEF1 từ cDNA đậu xanh Vì vậy, tiến hành tách RNA giống đậu xanh DX16 DX123 RNA tổng số vật liệu khởi đầu nghiên cứu cấp độ phân tử Chất lượng RNA tổng số có vai trị quan trọng định thành cơng thí nghiệm Do RNA đại phân tử không bền, dễ bị phân hủy c c ribonuclease (RNase) Hơn RNase lại có mặt khắp nơi tế bào, có hoạt tính mạnh bền Vì thế, việc tách chiết RNA địi hỏi lu an phải thao tác thật cẩn thận để tránh tạp nhiễm chứa RNase từ môi trường, tất n va các dụng cụ phải xử lý DEPC 0,01% Và xử lý nhiệt trước tiến tn to hành thí nghiệm: cối chày sứ xử lý hấp khử trùng 1210C ie gh với dụng cụ ống eppendorf, đầu côn, để loại trừ RNase p Trong trình tách chiết, việc nghiền mẫu nito lỏng để phá vỡ nl w thành tế bào giải phóng thành phần tế bào đòi hỏi thao tác phải d oa nhanh Các thành phần bổ sung phenol, chloroform:isoamyl nhanh chóng an lu biến tính protein, polysaccharide có hỗn hợp, giúp tách pha tốt sau u nf va trình ly tâm Sản phẩm RNA tổng số hịa tan DEPC 0,01% có tác dụng ngăn cản trình RNase thủy phân RNA ll oi m Hạt giống đậu xanh DX16 DX123 xử lý abscisic acid z at nh (ABA) để cảm ứng hoạt động gen DEF1 Hạt đậu xanh xử lý cho nảy mầm sử dụng mầm đậu xanh ngày tuổi để làm nguyên liệu tách RNA z l (Invitrogen) gm @ tổng số Quy trình tách RNA tổng số thực với Trizol reagents va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN41 an Lu bảo cho việc tiến hành thí nghiệm m co Sau tách RNA tổng số, nhận thấy mẫu RNA tổng số đảm ac th si Từ RNA tổng số, phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA để tiến hành phản ứng RT - PCR nhân gen DEF1 Để x c định điều kiện tối ưu phản ứng PCR trình thí nghiệm chúng tơi tính to n nhiệt độ bắt mồi 58C tiến hành phản ứng RT - PCR gồm có 35 chu kì Kết nhân gen kiểm tra phương ph p điện di gel agarose 1,2% TAE 1X, với có mặt marker chuẩn chụp ảnh ánh sáng tia cực tím Hình ảnh điện di thể hình 3.4 lu an n va p ie gh tn to oa nl w d Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân cDNA DEF1 lu va an từ giống đậu xanh DX123 DX16 u nf 1- DX123; 2- DX16; M: Marker DNA 1kb Plus (Fermentas) ll Qua hình 3.4 cho thấy, giống đậu xanh nghiên cứu DX123 DX16 m oi xuất băng DNA sang rõ có kích thước khoảng 0,22kb, độ dài z at nh đoạn DNA vừa nhận phù hợp với tính tốn lý thuyết thiết kế mồi z dựa trình tự nucleotide đoạn mã hóa gen DEF1 mang mã số gm @ AY437639 Ngân hàng gen Quốc tế m co l Tuy nhiên, gen vừa nhân lên có gen DEF1 hay không độ tương đồng với trình tự gen DEF1 cơng bố ngân hàng va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN42 an Lu gen quốc tế vấn đề đặt cho phân tích ac th si Để phản ứng ghép nối đạt hiệu cao cần thiết phải có trình tinh sản phẩm PCR để loại bỏ thành phần khơng mong muốn Qui trình tinh sản phẩm PCR thực theo hướng dẫn Kit DNA extraction Kit K05013 hãng Fermentas Trong kit, cột thơi gel có màng chứa phân tử lực cao với DNA, cho dịch có chứa DNA qua cột, DNA giữ lại màng, thành phần khác qua màng loại bỏ Khi bổ sung nước vào màng, DNA hòa tan thu lại vào ống cách ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút 3.3.2 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli lu Sản phẩm PCR tinh bảo quản gắn vào vector tách dòng pBT an n va để tạo vector tái tổ hợp có mang gen DEF1 mong muốn (pBT- DEF1) Hỗn hợp toàn Vector tái tổ hợp pBT- DEF1 biến nạp vào tế bào khả biến E.coli gh tn to ủ 22oC với xúc tác T4 ligase cho phản ứng xảy hoàn p ie chủng DH5α cách sốc nhiệt 42 oC phút 30 giây Chọn lọc w khuẩn lạc mong muốn dựa vào kiểu hình ni E.coli môi trường LB đặc oa nl (pepton, cao nấm mem, NaCl, agarose) có bổ sung carbenicilin (100mg/l), X-gal d (40mg/l) IPTG (100µM) Sự có mặt DNA tái tổ hợp kiểm tra lu va an phản ứng colony - PCR hình thái khuẩn lạc thu u nf Hiệu suất biến nạp phụ thuộc vào yếu tố tế bào khả biến phải đảm ll bảo tốt c c bước tiến hành biến nạp phải tuân thủ nghiêm ngặt thời gian sốc m oi nhiệt, thời gian giữ đ , đảm bảo kĩ thuật z at nh Khi thu số lượng lớn khuẩn lạc xanh trắng mơi trường z LB đặc Các dịng khuẩn lạc mang vector có chứa gen kháng kháng sinh, @ gm mọc mơi trường LB đặc chọn lọc Thấy xuất khuẩn lạc màu m co l xanh khơng có đoạn gen ngoại lai chèn vào vector mà vector tự đóng vịng, hình thành cấu trúc gen lacZ hồn chỉnh, hoạt động bình thường Gen lacZ mã hóa an Lu β-galactosidase vi khuẩn E.coli Trên mơi trường LB có chất cảm ứng IPTG, va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN43 ac th si enzyme β-galactosidase tổng hợp, chuyển hóa chất X-gal từ khơng màu thành màu xanh lam nên khuẩn lạc có màu xanh Nếu đoạn cài DNA chèn vào gen lacZ tạo vector tái tổ hợp, làm gen lacZ hoạt tính, vùng promoter gen lacZ khơng thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã, đồng thời khơng thể dịch mã enzyme βgalactosidase chuyển hóa chất X-gal nên lạc khuẩn có màu trắng Tuy nhiên, khơng phải tất khuẩn lạc trắng thu thí nghiệm mang vector tái tổ hợp có chứa đoạn gen qui định trình tự gen DEF1 mà chứa đoạn gen sản phẩm phụ phản ứng PCR, đột biến lu promoter lacZ, đứt gãy bazơ thymin đầu 3’ vector làm cho an n va khuẩn lạc có màu trắng Do đó, cần thực q trình chọn dòng tế bào mang Các dòng khuẩn lạc sau chọn lọc phương ph p colony- gh tn to vector tái tổ hợp chứa đoạn DNA kích thước quan tâm p ie PCR trực tiếp từ khuẩn lạc, nuôi môi trường LB lỏng để tách chiết w plasmid Plasmid kiểm tra gel agarose 1,2% TAE 1X cho thấy oa nl đảm bảo cho phản ứng giải trình tự nucleotide cDNA d 3.3.3 Kết giải trình tự cDNA DEF1 lu va an Để x c định trình tự nucleotide gen DEF1 t ch dịng, chúng tơi u nf tiến hành x c định trình tự nucleotide gen DEF1 m y x c định trình ll tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analizer Kết giải trình tự m oi phân tích phần mềm BioEdit Trình tự cDNA DEF1 đậu xanh z at nh DX16 có kích thước 222 nucleotide z Chúng tơi tiến hành so sánh trình tự nucleotide cDNA DEF1 phân @ gm lập từ giống đậu xanh DX16 với trình tự nucleotide đoạn mã hóa gen DEF1 kết thể hình 3.5 m co l đậu xanh công bố Ngân hàng gen Quốc tế mang mã số AY437639, an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN44 ac th si lu an Hình 3.5 So sánh trình tự nucleotide cDNA DEF1 giống đậu xanh va n DX16 với trình tự gen Ngân hàng gen Quốc tế to gh tn Kết hình 3.5 cho thấy kích thước cDNA DEF1 giống đậu xanh ie DX16 trình tự mang mã số AY437639 222 bp Khi so sánh trình tự p cDNA DEF1 giống đậu xanh DX16 cho thấy cDNA DEF1 giống nl w DX16 AY437639 giống 94,6% Như vậy, khuếch đại, d oa t ch dịng thành cơng x c định trình tự nucleotide cDNA DEF1 từ an lu giống đậu xanh DX16 u nf va So sánh trình tự nucleotide cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 x c định 12 vị trí nucleotide sai khác so với trình tự gen DEF1 mẫu ll oi m đậu xanh sử dụng thiết kế cặp mồi mang mã số AY437639 công bố Ngân z at nh hàng gen Quốc tế (Bảng 4) Bảng 3.4 Sự sai khác trình tự nucleotide cDNA DEF1 z giống đậu xanh DX16 trình tự có mã số AY437639 41 54 60 87 112 200 201 206 207 217 AY437639 A T T T G T G G m co DX16 A C A T C C C A G C C T G A va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN45 C an Lu G l 16 Mẫu 13 gm @ Vị trí ac th si Bảng 3.4 cho thấy, vị trí nucleotide thứ 13 (cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 G cịn gen DEF1 cơng bố ngân hàng gen Quốc tế mã số AY437639 A), vị trí số 16, 54 217 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 A gen DEF1 có mã số AY437639 T), vị trí nucleotide 41và 87 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 C cịn gen DEF1 có mã số AY437639 T), vị trí nucleotide 60 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 T cịn gen DEF1 có mã số AY437639 G), vị trí nucleotide 87 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 C cịn gen DEF1 có mã số AY437639 T), vị trí nucleotide 112, 200 206 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 C lu cịn gen DEF1 có mã số AY437639 G), vị trí nucleotide 201 (trình tự cDNA an va DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 A cịn gen DEF1 cơng có mã số n AY437639 C) cịn vị trí nucleotide 207 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ Khi phân tích trình tự gen, ngồi trình tự nucleotide người ta cịn quan ie gh tn to giống đậu xanh DX16 G cịn gen DEF1 có mã số AY437639 C) p tâm đến đến trình tự amino acid suy diễn, phân tử protein sản phẩm nl w gen Sự sai khác nucleotide gen DEF1 làm thay đổi khơng d oa làm thay đổi amino acid protein Chúng sử dụng phần mềm DNAstar an lu để tạo phân tử protein suy diễn Kết so sánh trình tự amino acid va protein gen DEF1 giống đậu xanh DX16 với giống đậu xanh công bố ll u nf Ngân hàng gen Quốc tế với mã số AY437639 thể hình 3.6 oi m z at nh z l gm @ Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid suy diễn protein DEF1 m co giống đậu xanh DX16 với trình tự mang mã số AY437639 an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN46 ac th si Kết hình 3.6 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn protein gen DEF1 giống đậu xanh DX16 AY437639 có 73 amino acid có tương đồng 91,78% Tuy nhiên, hai trình tự có khác vài vị trí amino acid, cụ thể là: DX16 khác với AY437639 vị trí amino acid thứ (F → I), vị trí 14 (L → P), vị trí 38 (G → R), vị trí 68, 69 73 (C → S) (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein DEF1 giống đậu xanh DX16 trình tự mang mã số AY437639 Vị trí Mẫu lu an AY437639 14 38 68 69 73 F L G C C C n va (Phenylalanine) (Leucine) (Glycine) (Glycine) (Glycine) (Glycine) tn to I DX16 P (Isoleucine) R (Proline) (Arginine) S S S (Serine) (Serine) (Serine) gh p ie 3.4 Phân tích đa dạng trình tự nucleotode trình tự amino acid suy w diễn gen DEF1 oa nl Chúng tiến hành so sánh trình tự nucleotide cDNA DEF1 phân d lập từ giống đậu xanh DX16 với trình tự nucleotide gen DEF1 công bố lu va an Ngân hàng gen quốc tế, trình tự gen có hai trình tự Việt Nam u nf (VN6 DX16) trình tự phân lập từ Trung Quốc (AY437639) ll Sử dụng phần mềm DNAstar kết x c định hệ số tương đồng m oi hệ số sai khác di truyền gen DEF1 giống đậu xanh z at nh Bảng 3.6 Hệ số tƣơng đồng sai khác di truyền trình tự cDNA DEF1 giống đậu xanh z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN47 ac th si Kết nghiên cứu bảng 3.6 cho thấy, trình tự nucleotide giống DX16 có độ tương đồng với giống đậu xanh ngân hàng gen Quốc tế sau: Giống có mã số AY437639 hệ số tương đồng 94,6%; giống có mã số VN6 hệ số tương đồng 96,8% Như vậy, hệ số tương đồng giống đậu xanh cao Ở mức độ nucleotide, hệ số sai khác giống đậu xanh DX16 với giống AY437639 5,6 với giống VN6 3,2 Sơ đồ hình thiết lập dựa trình tự nucleotide gen DEF1 mẫu đậu xanh thể hình 3.7 lu an n va trình tự nucleotide gen Hình 3.7 cho thấy, giống đậu xanh chia làm nhóm với p ie gh tn to Hình Sơ đồ hình mối quan hệ gi a giống đậu xanh dựa w khoảng cách di truyền 2,2% Nhóm I gồm giống đậu xanh AY437639, VN6 oa nl nhóm II giống đậu xanh DX16 d Chúng tiếp tục so sánh trình tự amino acid suy diễn đoạn gen DEF1 lu an mẫu đậu xanh nghiên cứu nhằm x c định hệ số tương đồng, hệ số sai khác u nf va khoảng cách di truyền giống đậu xanh Kết x c định hệ số tương đồng ll hệ số sai khác phần mền DNAstar thể bảng 3.7 m oi Bảng 3.7 Hệ số tƣơng đồng hệ số sai khác giống đậu xanh z at nh dựa trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen DEF1 (%) z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN48 ac th si Kết cho thấy hệ số tương tương đồng trình tự amino acid suy diễn đoạn gen DEF1 giống đậu xanh phân tích có biên độ dao động nhỏ (91,9% - 94,6%), hệ số sai kh c dao động từ 5,6% đến 8,6% Sự sai khác trình tự nucleotide trình tự amino acid sở cho nghiên cứu nhiều giống đậu xanh so sánh với nhóm kháng mọt tốt nhằm tìm kiếm thay đổi vị trí nucleotide trình tự amino acid gen DEF1 giống đậu xanh Đây sở cho việc chọn tạo giống đậu xanh có khả kh ng mọt tốt lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN49 ac th si KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Các giống đậu xanh nghiên cứu có đa dạng đặc điểm hình thái hạt Dựa khả kh ng mọt chia giống đậu xanh nghiên cứu thành ba nhóm là: Nhóm có khả kh ng mọt gồm giống DX22, DX5, DX16 DX6; Nhóm có khả kh ng mọt trung bình gồm giống DX2, DX7 DX17; Nhóm có khả kh ng mọt tốt gồm giống DX123, DT DX14 1.2 cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 tách dịng lu an thành cơng x c định trình tự nucleotide cDNA DEF1 có kích thước n va 222 nucleotide, mã hóa phân tử protein gồm 73 amino acid tn to 1.3 Trình tự nucleotide gen DEF1 giống đậu xanh DX16 có độ gh tương đồng cao với trình tự nucleotide gen DEF1 giống đậu xanh p ie VN6, với hệ số tương đồng 96,8% Hệ số tương tương đồng trình tự amino w acid suy diễn đoạn gen DEF1 giống đậu xanh phân tích dao động từ d Đề nghị oa nl 91,9% đến 94,6% lu va an 2.1 Tiếp tục nghiên cứu, phân lập gen DEF1 giống kháng mọt tốt ll đậu xanh u nf so sánh với giống kháng mọt để xây dựng thị gen có tính kháng mọt m oi 2.2 Thiết kế vector mang gen DEF1 từ giống đậu xanh kháng mọt tốt z at nh phục vụ chuyển gen tạo giống kháng mọt tốt để tạo giống đậu xanh kháng mọt z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN50 ac th si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cường (2008), Trồng đậu xanh, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr: 3-9 Đường Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh Kỹ thuật thâm canh biện pháp tăng suất, chất lượng sản phẩm, Nxb Lao Động - Xã Hội, tr: 5-31 Nguyễn Lâm Giang (2009), Thành phần sâu mọt, đặc điểm sinh học, sinh thái phát sinh gây hại loài Callosobruchus maculatus F hạt đỗxanh, lu đỗ tương nhập từ Trung Quốc qua cửa Lạng Sơn (2008 - 2009) an va biện pháp phòng trừ, Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Trường Đại học n Nông nghiệp Hà Nội tn to Bùi Công Hiển (1995) Côn trùng hại kho Nxb Khoa học Kĩ thuật gh p ie Bùi Cơng Hiển, Phạm Chí Dũng (1989), Bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng tia w xạ Gamma mọt đậu xanh (C chinensis L.) Tạp chí sinh học 11 oa nl Nguyễn Mạnh Khải (2005), Giáo trình bảo quản nơng sản sau thu hoạch, d Nxb Giáo dục lu va an Kết nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991 – 1995 (1996), Viện Khoa học ll u nf Kỹ thuật Nông nghiệp, Việt Nam, Tr: 4-188 oi m Kết nghiên cứu khoa học nông nghiệp 2000 (2001), Nxb Nông Nghiệp z at nh Phạm Văn Lầm (1985), Biện pháp sinh học phịng chống dịch hại nơng nghiệp, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội z 10 Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây đậu xanh, NXB Nông nghiệp @ chọn giống trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên m co l gm 11 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại 12 Nguyễn Cao Sơn (2009), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh thái học, sinh an Lu vật học mọt Callosobruchus chinensis L hạt đậu bảo quản biện va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN51 ac th si pháp phòng trừ Hà Nội vùng lân cận, Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 13 Phạm Văn Thiều, (1997), Cây đậu xanh kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp Tài liệu tiếng Anh 14 Adler, C (2001), “Potential of phytochemical for prevention, detection and control of insect pests in integrated stored product protection”, Workshop on practice oriented results on use of plant extracts and pheremones in integrated and biological pests control, Cairo, Egypt February 10-1 lu an 15 CAB International (2007), Callosobruchus chinensi L.,Crop Protection n va Compendium, Wallingford, Oxon, UK biological functions and biotechnological properties Peptides 30(5): 1007 - gh tn to 16 Carvalho AO, Gomes VM, (2009) Plant defensins - Prospects for the p ie 1020 w 17 Chen G.H., Hsu M.P., Tan C.H., Sung H.Y., Kuo C.G., Fan M.J., Chen oa nl H.M., Chen S., Chen C.S (2005), “Cloning and characterization of a plant d defensins VaD1 from azuki bean”, Agric Food Chem, 53(4), pp:982-988 lu va an 18 Chen JJ, Chen GH, Hsu CH, LiSS, Chen CS (2004), “Cloning and u nf functional expression of a mungbean defensins VrD1 in Pichia pastoris”, ll Journal of agricultural and Food Chemistry, 52(13), pp: 4350 m oi 19 Chen K.C., Lin C.Y., Kuan C.C., Sung H.Y., Chen C.S (2002), “A z at nh Dovel DEF1 encoded by a mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against Bruchid”, Agricultural Food Chemistry, 50 (25), pp: 7258-7263 z gm @ 20 Christoph and Reichmuth (2000), “Biological control in stored product m co Vol.23(10), pp 11-23 l protection, integrated protection of stored product”, IOBC bulletin an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN52 ac th si 21 Farid Asif Shaheen (2006), Intergrated management of pulse beetle, Callosobruchus chinensis L attacking stored chickpea, the thesis submitted for doctor of phylosophy in entomology, p.17; 192 22 Gutierrez-Campos R, Torres-Acosta JA, Saucedo-Arias LJ, Gomez-Lim MA (1999), “The use of cysteine proteinase inhibitors to engineer resistance against potyviruses in transgenic tobacco plants”, Nat Biotechnol 17: 1223-1226 23 Henrik U.S, James G, Thonson and Yueju Wang (2009), “Plant defensins defense, development and application”, Plant singnaling & Behavior 4, 11, lu pp: 1010-1012 an 24 Lin Fenggang et al (2003), “New technology in grain silo in China, va n progress report of the ACIAR project in China”, Scientific Meeting of the tn to ACIAR project PHT 1998/137, April 07-08, 2003, Hanoi ie gh 25 Liu YJ, Cheng CS, Lai SM, Hsu MP, Chen CS, Lyu PC (2006), “Solution p structure of the plant defensin1- VrD1 from mung bean and its possible role nl w in insecticidal activity against bruchids”, Proteins, 63(4), pp: 777-786 d oa 26 Prasantha, B D Rohitha (2002), “Efficacy of burnt plant materials an lu smoke for protection of stored paddy against infestation of Sitophilus u nf va oryzae (L.)”, Integrated protection of stored products, IOBC Bulletin, Vol 25 (3), p 171-176 ll oi m 27 Sabah Forestry Department in Thailand (2001), “Development of lowinput z at nh technology for reducing postharvest losses of staples in Southeast Asia”, JIRCA 2001 annual report, p 30 -32 z 28 Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, @ l gm 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 29 Tavares L.S., Santos M de O., Viccini L.F., Moreira J.S., Miller R.N., m co Franco O.L (2008), “Biotechnological potential of antimicrobial peptides va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN53 an Lu from flowers”, Peptides, 29(10), pp: 51-142 ac th si 30 Thomma B.P., Cammue B.P., Thevissen K (2002), Plant defensins, Planta, 216(2), pp: 193-202 31 Zhanggui, Qin, Guo Daolin, Yan Xiaoping, Danggang, Wu Xiuqiong, Yan Xiaoping, P.J Collins, G.J Daglish and M.K Nayak (2003), “The fate of stored insects in phosphine fumigation in sealed horizontal storage”, Proceeding of the Scientific Meeting of the ACIAR project PHT 1998/137, April 07-08, 2003, Hanoi Internet 32 Callosobruchus chinensis L lu Http:/www.agri.ruh.ac.lk/biology/staff/academic/ an 33 Callosobruchus chinensis L.http.//www.idosi.org/wijas2(1)/13.pdf va n 34 Callosobruchus chinensis L gh tn to Http://www.avrdc.org/LC/mungbean/bruchids.html 35 Http:// www.ento.okstate.edu/ipm/stored products ie p 36 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va http://www.lrc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN54 ac th si