(Luận văn) phân lập gen cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HƯỜNG lu an n va KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ p ie gh tn to PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 LIÊN QUAN ĐẾN d oa nl w u nf va an lu ll LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC oi m z at nh z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN - 2015 n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HƯỜNG lu PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 LIÊN QUAN ĐẾN an n va KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ ie gh tn to p Chuyên ngành: Công nghệ sinh học d oa nl w Mã số: 60.42.02.01 nf va an lu z at nh oi lm ul LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN - 2015 n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, giúp đỡ cán Khoa Khoa học sống – Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các số liệu, kết luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác lu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu luận văn an n va gh tn to Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2015 p ie Tác giả luận văn d oa nl w nf va an lu NGUYỄN THỊ HƯỜNG z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, ngƣời hƣớng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài hồn chỉnh luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Khoa học sống – Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn cán bộ, kỹ thuật viên lu phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm an n va Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ tốt để tơi có gh tn to thể hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, p ie đồng nghiệp bạn bè ln động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn nl w tơi suốt q trình học tập nghiên cứu d oa Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2015 nf va an lu Tác giả luận văn lm ul Nguyễn Thị Hường z at nh oi z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN vi MỞ ĐẦU lu an Đ t vấn đề n va Mục tiêu nghiên cứu tn to Nội dung nghiên cứu gh CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU p ie 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY NGÔ w 1.1.1 Nguồn gốc phân loại ngô oa nl 1.1.2 Đ c điểm sinh học ngô d 1.1.3 Đ c điểm hóa sinh hạt ngơ lu nf va an 1.1.4 Giá trị kinh tế 1.1.5 Tình hình sản xuất ngơ giới lm ul 1.1.6 Tình hình sản xuất ngơ Việt Nam 10 z at nh oi 1.2 MỌT NGÔ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA MỌT NGÔ ĐẾN Q TRÌNH BẢO QUẢN NƠNG SẢN 11 z 1.2.1 Đ c điểm mọt hại ngô (Sitophilus zeamais Motschulsky) 11 gm @ 1.2.2 Côn trùng hại ngô q trình bảo quản nơng sản 14 l 1.3 CYSTEINE PROTEINASE VÀ CYSTATIN 16 m co 1.3.1 Cysteine proteinase 16 an Lu 1.3.2 Cystatin - chất ức chế Cysteine proteinase 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si iv 2.1 VẬT LIỆU 21 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Hóa chất 21 2.2.2 Thiết bị 21 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 22 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1 Phƣơng pháp sinh lí 22 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 22 2.3.3 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 30 lu an 2.3.4 Phƣơng pháp xử lí trình tự gen 30 n va 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý kết tính tốn số liệu 30 tn to CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 gh 3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG p ie NGÔ BẰNG NHIỄM MỌT NHÂN TẠO 31 w 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 33 oa nl 3.2.1 Kết tách chiết RNA tổng số 33 d 3.2.2 Kết tổng hợp cDNA nhân gen 33 lu nf va an 3.2.3 Kết tinh sản phẩm PCR 34 3.2.4 Kết tách dòng gen 35 lm ul 3.2.5 Kết tách plasmid tái tổ hợp 36 z at nh oi 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN 37 3.3.1 Kết so sánh trình tự gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG HG 38 z 3.3.2 Kết so sánh hai trình tự nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự gm @ đƣợc công bố (CB2, MX4) BN000514 GenBank 41 l KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 m co TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT lu an n va Abscisic acid bp base pair (c p bazơ) cDNA complementary DNA cs cộng DEPC diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribose nucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E coli Escherichia coli IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb kilo base ie gh tn to ABA kilo Dalton p kDa d oa nl w µg µl mRNA Microgam Microlite messenger ribonucleic acid an lu NCBI OD PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA Ribonucleic acid nf va National Center for Biotechnology Information Optical density z at nh oi lm ul UV X-gal Ultra violet 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside z TAE Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi phiên mã ngƣợc) Tris-acetate-EDTA RT- PCR m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si vi DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1 Tỉ lệ phận hạt ngơ thành phần hóa học chúng ….….6 Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngơ giới 10 năm gần Bảng 1.3 Tình hình sản xuất ngơ số quốc gia giới năm 20149 Bảng 1.4 Tình hình sản xuất ngơ Việt Nam từ 2006 - 2013 10 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 24 Bảng 2.2 C p mồi nhân gen Cystatin 10 25 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PT-PCR nhân gen Cystatin 10 25 lu Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen Cystatin 10 vào vector PBT 27 an Bảng 2.5 Thành phần phản ứng colony – PCR 28 va n Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt phản ứng colony – PCR 28 tn to Bảng 3.1 Lƣợng ngô hao hụt theo thời gian giống ngô nghiên cứu 31 ie gh Bảng 3.2 Giá trị tỉ lệ phổ hấp thụ A260/A280 hàm lƣợng RNA giống p ngô nghiên cứu 33 nl w Bảng 3.3 Sự sai khác giữ trình tự gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG, HG38 d oa Bảng 3.4 Hệ số tƣơng đồng trình tự gen hai mẫu ngô BG, HG 39 an lu Bảng 3.5 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin10 nf va hai giống ngô BG, HG 40 lm ul Bảng 3.6 Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid mẫu nghiên cứu 41 z at nh oi Bảng 3.7 Sự khác trình tự gen Cystatin 10 BG, HG với CB2, MX4 BN000514 GenBank 44 z Bảng 3.8 Hệ số tƣơng đồng trình tự gen mẫu nghiên cứu với @ gm CB2, MX4 BN000514 GenBank 45 co l Bảng 3.9 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin10 m hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank 47 an Lu Bảng 3.10 Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid mẫu nghiên http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN n va cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank 48 si vii DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1 Mọt ngô Sitophilus zeamais 11 Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt theo thời gian mẫu ngô nghiên cứu 32 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm RT - PCR nhân gen Cystatin 10 giống ngô nghiên cứu 34 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm tinh gen Cystatin 10 mẫu ngô nghiên cứu 35 lu Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen Cystatin 10 mẫu an ngô nghiên cứu 36 va n Hình 3.5 Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp 37 gh tn to Hình 3.6 So sánh trình tự gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG, HG 38 ie Hình 3.7 Trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin 10 hai mẫu p nghiên cứu 40 oa nl w Hình 3.8 So sánh trình tự gen Cystatin 10 BG, HG với CB2, MX4 BN000514 GenBank 42 d an lu Hình 3.9 Trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin 10 hai mẫu nf va nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank 46 z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si MỞ ĐẦU Đ t vấn ề Cây ngô (Zea mays L.) năm loại lƣơng thực giới Hạt ngơ chứa đầy đủ chất dinh dƣỡng cho ngƣời gia súc Ở Việt Nam, ngô lƣơng thực quan trọng thứ hai sau lúa gạo Trong năm gần đây, sản xuất ngô Việt Nam tăng nhanh nhờ thúc đẩy ngành chăn nuôi công nghiệp chế biến Ngô thức ăn chăn nuôi quan trọng nay, 70% chất tinh thức ăn tổng hợp gia súc từ lu ngô Gần đây, ngơ cịn thực phẩm; ngƣời ta dùng bắp ngô bao tử an va làm rau cao cấp có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao; ngô nếp, ngô n đƣờng (ngô ngọt) đƣợc dùng làm quà ăn tƣơi (luộc, nƣớng) ho c đóng hộp gh tn to làm thực phẩm xuất Ngơ cịn nguyên liệu ngành công nghiệp p ie lƣơng thực, thực phẩm công nghiệp nhẹ để sản xuất rƣợu, cồn, tinh bột, dầu, glucôzơ, bánh kẹo Trong y dƣợc, ngô đƣợc dùng để trị áp huyết, râu ngô oa nl w đƣợc dùng để làm thuốc [46] d Hiện nay, diện tích ngơ ngày đƣợc mở rộng có phát triển lu nf va an tiến công tác chọn tạo giống trồng nhằm tạo giống ngơ có suất cao, có khả kháng sâu bệnh hại, chống chịu hạn tốt Tùy lm ul theo mục đích sử dụng mà sản phẩm ngô phải đƣợc bảo quản điều kiện z at nh oi khác thời gian bảo quản khác Trong trình bảo quản sản phẩm ngơ theo thời gian có nhiều loại trùng phá hoại làm giảm phẩm chất, chất dinh dƣỡng nông sản,… Thành phần sâu mọt hại ngô tƣơng đối đa z gm @ dạng xuất kho bảo quản ngô nhƣ mọt gạo, mọt cƣa, mọt đục l thân, mọt thóc,… Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo giống ngơ có suất an Lu nói chung ngành chọn giống ngơ nói riêng m co cao khả kháng mọt tốt yêu cầu thực tiễn đ t cho ngành trồng trọt n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 40 3.3.1.2 So sánh trình tự amino acid protein suy diễn từ gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG HG Kết so sánh trình tự amino acid protein suy diễn từ gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG, HG đƣợc trình bày qua hình 3.7, bảng 3.5 bảng 3.6 lu an n va p ie gh tn to w Hình 3.7 Trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin 10 hai mẫu oa nl nghiên cứu d Kết thể hình 3.7 cho thấy chuỗi polypeptide hai mẫu an lu ngô BG, HG có chiều dài 148 amino acid, trình tự amino acid hai nf va chuỗi có khác 04 vị trí (64, 65, 72, 111) lm ul Bảng 3.5 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin10 Mẫu Vị trí z at nh oi hai giống ngô BG, HG BG E K an Lu 111 S m A co 72 D l E gm 65 P @ Q z 64 HG n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 41 Kết thể bảng 3.5 cho thấy trình tự amino acid vị trí 64 mẫu ngơ BG Q, HG P; trình tự amino acid vị trí 62 mẫu ngơ BG E, HG D; trình tự amino acid vị trí 72 mẫu ngơ BG A, HG S; trình tự amino acid vị trí 111 mẫu ngơ BG E, HG K Bảng 3.6 Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid mẫu nghiên cứu (%) Mẫu BG HG BG 100 97,2 100 HG lu an Kết thể bảng 3.6 cho thấy hệ số tƣơng đồng trình tự n va amino acid suy diễn protein cystatin 10 mẫu ngô BG HG 97,2% tn to Sự sai khác trình tự nucleotide amino acid suy diễn sở gh để so sánh khả kháng mọt hai giống ngô kháng mọt tốt kháng p ie mọt nhằm tìm kiếm tính quy luật thay đổi vị trí nucleotide w amino acid liên quan đến tính kháng mọt giống ngơ Đây tiền đề oa nl sở cho việc nghiên cứu chọn tạo giống ngơ có khả kháng mọt tốt, d suất cao, phục vụ sản xuất đời sống lu an 3.3.2 Kết so sánh hai trình t nghiên cứu (BG, HG) với hai trình nf va t công bố (CB2, MX4) BN000514 GenBank lm ul 3.3.2.1 So sánh trình tự gen Cystatin 10 hai mẫu nghiên cứu (BG, hàng gen z at nh oi HG) với hai trình tự công bố (CB2, MX4) BN000514 ngân z Chúng tơi tiến hành so sánh trình tự gen Cystatin 10 hai mẫu gm @ nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự đƣợc cơng bố CB2, MX4 (CB2 l giống ngô địa phƣơng tỉnh Cao Bằng, MX4 giống ngô lai) [10] m bảng 3.7 bảng 3.8 co BN000514 Ngân hàng gen NCBI, kết đƣợc trình bày hình 3.8, an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 42 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z co l gm @ m Hình 3.8 So sánh trình tự gen Cystatin 10 BG, HG với CB2, MX4 an Lu BN000514 GenBank n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 43 Kết thể hình 3.7 cho thấy trình tự gen đƣợc so sánh có khác 15 vị trí (30, 50, 108, 110, 168, 176, 204, 207, 226, 252, 255, 261, 327, 352, 411) Đ c biệt, bốn mẫu ngô Việt Nam BG, HG, CB2, MX4 bị 12 nucleotide (từ vị trí số 61 đến 72) so với trình tự gen Cystatin10 có mã số BN000514 Ngân hàng gen Hơn nữa, riêng hai mẫu nghiên cứu bị nucleotide (từ vị trí số 262 đến 270) so với trình tự gen Cystatin10 có mã số BN000514 Ngân hàng gen Do có nucleotide nên kích thƣớc gen Cystatin 10 bốn mẫu (BG, HG, CB2, MX4) ngắn so với kích thƣớc gen cystatin 10 lu an BN000514 Ngân hàng gen, cụ thể là: Kích thƣớc gen cystatin 10 n va BN000514 468 bp, BG HG 447 bp, CB2 MX4 453 bp Nhƣ tn to gen cystatin 10 BG HG có kích thƣớc ngắn gen cystatin 10 p ie gh CB2, MX4 BN000514 Kết thể hình 3.7 cịn cho ta thấy có sai khác giống nl w trình tự nucleotide bốn mẫu BG, HG, CB2, MX4 hai vị trí so với d oa trình tự nucleotide BN000514, cụ thể là: Tại vị trí 108, trình tự nucleotide an lu BN000514 T, trình tự nucleotide BG, HG, CB2, MX4 C; Tại vị lm ul HG, CB2, MX4 G nf va trí 176, trình tự nucleotide BN000514 C, trình tự nucleotide BG, z at nh oi Đ c biệt, hai giống ngơ có khả kháng mọt tốt (HG CB) có sai khác giống trình tự nucleotide ba vị trí so với trình tự nucleotide BN000514, cụ thể là: Tại hai vị trí 327, 352 trình tự nucleotide z gm @ BN000514 G, trình tự nucleotide HG, CB2 A; Tại vị trí 411, trình tự nucleotide BN000514 G, trình tự nucleotide HG, CB2 C m co l an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 44 Bảng 3.7 Sự khác trình tự gen Cystatin 10 BG, HG với CB2, MX4 BN000514 GenBank BN000514 HG CB2 BG MX4 30 G G C G G 50 C C C C G 108 T C C C C 110 G G A G G 168 G G C G G 176 C G G G G 204 A C A A A 207 G T G G G 226 G T G G G 252 A A C A A 255 T T C T T w C C G C C 327 G A A G G G A A G G an Mẫu C C G C Vị trí lu an n va p ie gh tn to 261 d lu 411 oa nl 352 G nf va lm ul Kết thể bảng 3.7 cho thấy trình tự nucleotide BG có z at nh oi sai khác với trình tự nucleotide BN000514 vị trí (108, 176), sai khác với trình tự nucleotide CB2 vị trí (30, 110, 168, 252, 255, 261, 327, 352, 411), sai khác với trình tự nucleotide MX4 vị trí (50, 411) z gm @ Trình tự nucleotide HG có sai khác với trình tự nucleotide l BN000514 vị trí (108, 176, 204, 207, 226, 327, 352, 411), sai khác với m co trình tự nucleotide CB2 vị trí (30, 110, 168, 204, 207, 226, 252, 255, 327, 352) an Lu 261), sai khác với trình tự nucleotide MX4 vị trí (50, 204, 207, 226, n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 45 Nhƣ vậy, sai khác trình tự nucleotide BG so với BN000514 (2 vị trí) sai khác trình tự nucleotide HG so với BN000514 (8 vị trí) Sự sai khác trình tự nucleotide BG so với CB2 (9 vị trí) với sai khác trình tự nucleotide HG so với CB2 (9 vị trí), nhiên vị trí sai khác khơng hồn tồn trùng Sự sai khác trình tự nucleotide BG so với MX4 (2 vị trí) sai khác trình tự nucleotide HG so với MX4 (6 vị trí) Do đó, hệ số tƣơng đồng trình tự có khác biệt (Bảng 3.8) Kết thể bảng 3.7 cho thấy điều đ c biệt hai vị trí lu an (327, 352) hai giống ngô kháng mọt tốt (HG, CB2) A, hai n va giống ngô kháng mọt (BG, MX4) G Điều chứng tỏ khả tn to kháng mọt tốt liên quan đến trình tự nucleotide hai vị ie gh trí p Bảng 3.8 Hệ số tƣơng đồng trình tự gen mẫu nghiên cứu với nl w CB2, MX4 BN000514 GenBank HG CB2 MX4 95,0 93,8 94,4 95,9 100 98,6 96,6 96,9 100 96,6 96,0 100 96,7 z at nh oi MX4 BG lm ul CB2 nf va HG an BG 100 lu BN000514 d oa BN000514 100 z Kết thể bảng 3.8 cho thấy hệ số tƣơng đồng mẫu BG với @ gm BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 95,0%, 96,6%, 96,9%; hệ số tƣơng đồng co l mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 93,8%, 96,6%, 96,0% m 3.3.2.2 So sánh trình tự amino acid protein suy diễn từ gen cystatin 10 an Lu hai mẫu ngô BG, HG với CB2, MX4 BN000514 n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 46 Kết so sánh trình tự amino acid protein suy diễn từ gen Cystatin 10 hai mẫu ngô BG, HG với CB2, MX4 BN000514 đƣợc trình bày qua hình 3.9, bảng 3.9 bảng 3.10 lu an n va p ie gh tn to oa nl w d Hình 3.9 Trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin 10 hai mẫu nf va an lu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank Kết thể hình 3.9 cho thấy trình tự chuỗi polypeptide có lm ul sai khác vị trí (17, 37, 59, 68, 69, 76, 84, 118) có đột biến z at nh oi amino acid số vị trí, cụ thể là: Tại vị trí 24, 25, 26, 27 bốn mẫu BG, HG, CB2, MX4 bị đột biến bốn amino acid (P, A, A, A) so với BN000514; Tại vị trí 88, 89, 90 có mẫu BG HG bị đột biến ba amino z gm @ acid (G, G, G) so với BN000514; Tại vị trí 90 có mẫu CB2 bị đột biến m co amino acid (G) so với BN000514 l amino acid (G) so với BN000514; Tại vị trí 122 có mẫu MX4 bị đột biến an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 47 Bảng 3.9 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein Cystatin10 hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank Mẫu Vị trí lu an n va HG CB2 BG MX4 17 A A A A G 37 G G E G G 59 P R R R R 68 Q P Q Q Q 69 E D E E E 76 A S D A E 84 E E D E E 118 E K K E E p ie gh tn to BN000514 Kết thể bảng 3.9 cho thấy trình tự amino acid protein oa nl w Cystatin 10 hai mẫu nghiên cứu (BG, HG) có sai khác so với mẫu CB2, d MX4 BN000514, cụ thể là: Trình tự amino acid BG sai khác với trình an lu tự amino acid BN000514 vị trí 59, sai khác với trình tự amino acid nf va CB2 vị trí (37, 76, 84, 118), sai khác với trình tự amino acid MX4 lm ul vị trí (17, 76) Trình tự amino acid HG sai khác với trình tự amino acid z at nh oi BN000514 vị trí (59, 68, 69, 76, 118), sai khác với trình tự amino acid CB2 vị trí (37, 68, 69, 76, 84), sai khác với trình tự amino acid MX4 vị trí (17, 68, 69, 76, 118) z gm @ Nhƣ vậy, sai khác trình tự amino acid BG với trình tự amino l acid BN000514, CB2, MX4 (7 vị trí sai khác) so với sai khác an Lu MX4 (15 vị trí sai khác) m co trình tự amino acid HG với trình tự amino acid BN000514, CB2, n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 48 Kết thể bảng 3.9 cho thấy điều đ c biệt vị trí 118, hai giống ngơ kháng mọt tốt (HG, CB2) có trình tự amino acid K, cịn hai giống ngơ kháng mọt (BG, MX4) có trình tự amino acid E Do đó, khả kháng mọt tốt liên quan đến trình tự amino acid vị trí Bảng 3.10 Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 BN000514 GenBank BN000514 BG HG CB2 MX4 BN000514 100 94,8 92,2 94,1 95,4 100 97,2 96,6 96,6 100 95,3 94,0 100 96,0 lu Mẫu an BG va n HG MX4 100 p ie gh tn to CB2 oa nl w Kết thể bảng 3.10 cho thấy hệ số tƣơng đồng mẫu BG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 94,8%, 96,6%, 96,6%; hệ số tƣơng d nf va 94,0% an lu đồng mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 92,2%, 95,3%, z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I Kết luận Đã xác định đƣợc mức độ kháng mọt giống ngơ nghiên cứu Trong đó, giống có khả kháng mọt tốt HG giống có khả kháng mọt BG Đã phân lập xác định đƣợc trình tự gen Cystatin 10 mẫu ngơ HG BG với kích thƣớc 447 bp Hệ số tƣơng đồng trình tự nucleotide gen Cystatin10 mẫu lu nghiên cứu 98,6% Hệ số tƣơng đồng trình tự nucletide mẫu BG với an BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 95,0%, 96,6%, 96,9%; hệ số tƣơng đồng va n mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 93,8%, 96,6%, 96,0% to gh tn Trình tự amino acid suy diễn từ protein Cystatin10 mẫu p ie nghiên cứu có độ tƣơng đồng 97,2% Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid suy diễn từ protein Cystatin10 mẫu BG với BN000514, CB2, MX4 oa nl w lần lƣợt 94,8%, 96,6%, 96,6%; hệ số tƣơng đồng mẫu HG với d BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt 92,2%, 95,3%, 94,0% nf va an lu II Đề nghị Tiếp tục thiết kế vector phục vụ chuyển gen để tạo đƣợc lm ul giống ngơ có khả kháng mọt tốt z at nh oi z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Văn Chƣơng (2000), Khảo sát trạng chất lượng ngô huyện vùng núi cao phía Bắc tỉnh Hà Giang số biện pháp thích hợp giảm tổn thất sau thu hoạch, Báo cáo kết nghiên cứu khoa học, Sở Khoa học Công nghệ Hà Giang Đƣờng Hồng Dật (2004), Cây ngô: kỹ thuật thâm canh tăng suất, NXB Lao động - Xã hội lu Đƣờng Hồng Dật (2006), Sâu bệnh hại ngô, lương thực trồng cạn an n va biện pháp phòng trừ, NXB Lao động - Xã hội tn to Lê Dỗn Diên (1995), Sử dụng kỹ thuật cơng nghệ sinh học để bảo Trƣơng Văn Đích, (2005), Kĩ thuật trồng ngô suất cao, NXB Khoa p ie gh quản, chế biến nông sản sau thu hoạch, NXB Nông nghiệp Nguyễn Xuân Hiển (1972), Một số kết nghiên cứu ngô, NXB d oa nl w học Kỹ thuật nf va an lu Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Mai Lề, Bùi Đức Hợi, Lƣơng Hồng Nga, Phạm Văn Hùng, (2009), Công lm ul nghệ bảo quản lương thực, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr: 28 – 36 Nội Bùi Công Hiển (1995), Côn trùng hại kho, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Hà Quang Hùng (2005), Giáo trình Kiểm dịch thực vật dịch hại nông z l gm sản sau thu hoạch, NXB Nông nghiệp @ z at nh oi co 10 Dƣơng Thị Hồng Khánh (2015), “Xác định trình tự gen Cystatin10 m giống ngơ có khả kháng mọt khác nhau”, Khóa luận tốt nghiệp an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 51 Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo 11 trình lương ngô, NXB Nông nghiệp Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, NXB ĐHQG 12 Hà Nội 13 Trần Văn Minh, (2008), Cây ngô nghiên cứu sản xuất, NXB nông nghiệp, Hà Nội lu 14 Ngơ Hữu Tình (1997), Cây ngơ, NXB nơng nghiệp 15 Ngơ Hữu Tình (2003), Cây ngơ, NXB Nghệ An 16 Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR ứng an n va dụng phân tích DNA, tập II, NXB Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ tn to Vì Thị Xn Thủy, Hồ Mạnh Tƣờng, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh 17 gh Thanh, Chu Hồng Mậu (2014), “Tách dịng gen Cystatin2 phân lập từ số p ie mẫu ngô địa phƣơng Việt Nam”, Tạp chí sinh học, 36(1): 110-117 Vũ Thị Thu Thủy (2011), “Tạo dòng chịu hạn phân lập gen Cystatin nl w 18 oa liên quan đến tính chịu hạn lạc”, Luận án tiến sĩ sinh học, Trƣờng Đại d học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên an lu Phòng Kiểm dịch thực vật - Cục Bảo vệ thực vật (2003), Thành phần nf va 19 lm ul côn trùng hại kho Việt Nam năm 1996 - 2000, số ứng dụng bảo vệ thực vật vào sản xuất nông nghiệp, NXB Nông nghiệp z at nh oi 20 Vũ Quốc Trung (1981), “Sâu hại nơng sản kho phịng trừ”, NXB Nơng Nghiệp Hà Nội z Nguyễn Thị Giáng Vân (1996), Thành phần côn trùng kho Việt Nam, gm @ 21 Nguyễn Kim Vũ (2000), Báo cáo tổng kết khoa học công nghệ đề tài an Lu KH 08-12, Bộ Khoa học Công nghệ m 22 co l Báo cáo kết nghiên cứu khoa học, Cục Bảo vệ thực vật n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 52 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Abe M., Arai S (1991), “Some properties of a cystein proteinase 23 inhibitor from corn endosperm’’, Agricultural and biological chemistry, 55(9), pp 2417- 2418 24 Adeniala S O., José X F., Sales M P.(2003), "Cysteine proteinases and cystatins", Braz arch biol technol, 46 (1), pp 99-104 25 Barrett, A J (1994) "Classification of peptidases", Methods Enzymol 244, pp 1–15 lu 26 Bode W., Engh R., Musil D., Thiele U., Huber R.,Karshnikov A., Brzin J., an Kos J & Turk V (1990), " Mechanism of interaction oF cysteine ptoteinases va n and their protein inhibitors as compared to the serine proteinase inhibitor tn to interaction", Biol Chem Hoppe-Seyler, 371, pp 111-118 gh Bolter C.J (1993), “Methyl jasmonate induces papain inhibitors in 27 ie p tomato leaves’’, Plant physiol, 103, pp 1347- 1355 Chou W.M., Shigaki j., Dammann C., Liu J Q., Bhattachamy M.K nl w 28 oa (2004), “Inhibiton of pathogenesis- related genes in soybean plant biology’’, d 6, pp 664- 672 an lu David R (2004), Insects stored products CSIRO Australia 30 Fernsndes K.V.S., Paolo a., sabelli P.a., Barratt D.H.P., Richardson., nf va 29 lm ul Xavier- Filho J., Shewry P.R (1993), “The resistance of coepea seeds to z at nh oi bruchid beetle is not related to levels of cystein protease inhibitors’’, Plant mlercular biology, 23(1), pp 215- 219 James A O., Adebayo A O (2012), "Rearing the Maize Weevil, z 31 @ 32 l gm Sitophilus zeamais, on an Artificial Maize - Cassava Diet", J Insect Sci, 12 Koiwa H, Shade RE, Zhu- Salzman K, Subramanian L, Murdock Ll, co m Nielsen SS, Bressan RA, Hasegawa PW (1998), “Phage display selection can 371- 379 an Lu differentiate insecticidal activity of soybean cystatin’’, Plant J, 14(3), pp n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 53 33 Kuschel G (1961), "On problem of synonymy in the Sitophyllus oryzae complex (30th contribution, Col Curculionidea)", Annals and Magazine of Nature History, 13(4), pp 241-244 34 Melo F.R., Rigden D.J., Franco O.L., Mello L.V., Ary M.B., Grossi de Sá M.F., Bloch C Jr (2002), "Inhibition of trypsin by cowpea thionin: characterization, molecular modeling, and docking", Proteins, 48(2), pp:311–319 35 Mikami A Y., Carpentieri P V., Ventura M U (2012), "Resistance of maize landraces to the maize weevil Sitophilus zeamais Motsch.(Coleoptera: lu Curculionidae)." Neotrop Entomol, 41 (5), 404-8 an n va 36 Mwololo J.K., Mugo S., Okori P., Tefera T., Otim M., Munyiri S.W., Tropical Maize”, Journal of Agricultural Science, 4(11): 206 – 215 gh tn to (2012), “Sources of Resistance to the Maize Weevil Sitophilus zeamains in Ojima A., Shiota H., higashi K., Shimma Y., Uwada M., Satoh S p ie 37 w (1997), “An extracularin soluble inhibitor of cysteine proteinase in cell oa nl cultrures and seed Carrot’’, Plant molecular biology, 34, pp 99- 109 RamanjuluS., Bartels D (2002), “Drought- and desiccation- induced d an lu 38 pp 141- 151 lm ul 39 nf va modulation of gene expression in plant’’, Plant cell and environment, 25(2), Rawlings, N D & Barrett, A J (1999) "MEROPS:The peptidase z at nh oi database", Nucleic Acids Res, 27, pp 325–331 40 Ryan S.N., Mc Manus M.J., Laiing W.A (2003), “Indentification and z gm @ characterization of proteinase inhibitor and their gen from seeds of apple (malus domestica)’’, Japanese Biochemical society, 134(1), pp 31- 42 l Sambrook J., Russel D.W (2001), Molecular cloning, A laboratory an Lu manual, Vol 2, Third edition, CSHL Press, pp:8.1-8.24 m co 41 n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 54 42 Shu-Guo FAN, WU G J (2005), "Characteristics of plant proteinase inhibitors and their applications in combating phytophagous insects", Bot Bull Acad Sin, 46, 273-92 43 Snelson J.T (1987), Grain protectants, ACIAR Monographs Series 3, Australian Centre for International Agricultural Research 44 Waldron C., Uwegrich L.M., Merlo P.A.O, Walsh J A (1993), Characterization of a genemic sequence coding for potato multicystatin, An eight- domain cysteine proteinase inhibitor”, Plant molecular biology, 23(4), lu pp.801- 812 an n va 45 Zhang X., Liu S., Takano T (2008), “Two cysteine proteinase inhibitors drought, oxidation and cold tolerance’’, Plant Moll Biol, 68(1-2) gh tn to from Arabidposis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, p ie TÀI LIỆU TRANG WEB 46 47 http://www.ctu.edu.vn d oa nl w www.cpv.org.vn lu nf va an 48 http://faostat.fao.org/ 49 www.mard.gov.vn lm ul 50 http://www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/AF45439 z at nh oi 51 http://old.padil.gov.au/pbt/index.php?q=node/70&pbtID= 217 z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si