(Luận văn) nghiên cứu tách chiết và xác định hoạt tính sinh học chlorogenic acid từ quả cà phê xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP TRỊNH TRÚC GIANG NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT lu an TÍNH SINH HỌC Chlorogenic acid va n TỪ QUẢ CÀ PHÊ XANH gh tn to p ie CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC d oa nl w MÃ NGÀNH: 8420201 an lu nf va LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC z at nh oi lm ul NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VIỆT PHƯƠNG z m co l gm @ TS VŨ KIM DUNG an Lu n va Hà Nội, 2020 ac th si i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực cơng trình nghiên cứu tơi nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo chân tình thầy cô, bạn bè quan Trước hết cho gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Việt Phương – Trung tâm Công nghệ sinh học, Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm TS Vũ Kim Dung – Bộ môn Công nghệ Vi sinhHóa sinh, Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn định hướng cho tơi suốt q trình lu an nghiên cứu để hồn thành luận văn n va Tôi xin cảm ơn tới ban lãnh đạo, thầy cô giáo thuộc Viện Công tn to nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ tạo Tôi xin cảm ơn giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ chủ tịch hội đồng, p ie gh điều kiện cho tơi nhiều q trình học tập nghiên cứu w phản biện, thư ký ủy viên hội đồng dành thời gian quý báu để đọc tham oa nl gia hội đồng chấm luận văn với góp ý cụ thể, gợi ý bổ ích, giúp d tơi hồn thiện tốt nội dung nghiên cứu luận văn lu nf va an Tôi vơ cảm ơn khích lệ, động viên giúp đỡ nhiệt tình gia đình, bè bạn dành cho tơi để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng z at nh oi lm ul nghiên cứu năm 2020 z @ m co l gm Trịnh Trúc Giang an Lu n va ac th si ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu thực cá nhân đuợc thực hướng dẫn TS Nguyễn Việt Phương, Trung tâm Công nghệ sinh học- Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm TS Vũ Kim Dung, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Các số liệu, kết nghiên cứu kết luận luận văn hoàn toàn trung thực, chưa công bố cơng trình khác trước Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích lu an dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo theo yêu cầu n va Tôi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu năm 2020 p ie gh tn to Hà Nội, ngày tháng d oa nl w Trịnh Trúc Giang nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Chlorogenic acid lu 1.1.1 Giới thiệu Chlorogenic acid an va 1.1.2 Công dụng Chlorogenic acid n 1.2.Tổng quan cà phê to 1.2.2 Cấu tạo cà phê xanh 10 p ie gh tn 1.2.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ cà phê Việt Nam 1.2.3 Thành phần hóa học cà phê 11 nl w 1.2.4 Cà phê xanh lợi ích sử dụng 13 d oa 1.3 Tổng quan enzyme pectinase 16 an lu 1.3.1 Giới thiệu Enzyme pectinase 16 nf va 1.3.2 Ứng dụng enzyme pectinase 17 lm ul 1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất Chlorogenic acid từ cà phê giới Việt Nam 17 z at nh oi Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 22 z 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 @ gm 2.3 Vật liệu nghiên cứu 22 co l 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.3.2 Hoá chất thiết bị 22 m an Lu 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 n va ac th si iv 2.4.1 Phương pháp xác định yếu tố ảnh hưởng tới trình chiết xuất CGA 23 2.4.2 Phương pháp tối ưu hố q trình chiết xuất CGA 30 2.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính CGA thu nhận 32 2.4.4 Phương pháp sấy chân không 33 2.4.5 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết xác định yếu tố ảnh hưởng tới trình chiết xuất CGA 35 3.1.1 Ảnh hưởng tỉ lệ chất : dung mơi đến q trình chiết CGA 35 lu 3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến trình chiết xuất CGA 37 an va 3.1.3 Ảnh hưởng pH đến trình chiết xuất CGA 39 n 3.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình chiết xuất CGA 40 to 3.1.6 Ảnh hưởng thời gian thuỷ phân đến trình chiết xuất p ie gh tn 3.1.5 Kết ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình chiết xuất CGA 42 CGA…………………………………………………………………………… 44 nl w 3.2 Kết mô hình hố tối ưu hố q trình chiết xuất CGA 45 d oa 3.2.1 Kết ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố 46 an lu 3.2.2 Phân tích phương sai 48 nf va 3.2.3 Phương trình hồi quy 49 lm ul 3.2.4 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân cà phê xanh enzyme pectinase 50 z at nh oi 3.2.5 Kết xác định hàm lượng CGA phương pháp sắc ký lỏng HPLC 52 z 3.3 Kết xác định hoạt tính kháng khuẩn kháng oxy hóa 54 @ gm 3.3.1 Kết xác định khả kháng khuẩn 54 co l 3.3.2 Kết xác định hoạt tính oxy hóa 56 3.4 Kết q trình sấy chân khơng 56 m an Lu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 n va ac th si v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hưởng tỉ lệ chất- dung mơi đến q trình chiết CGA 24 Bảng 2.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến trình chiết xuất CGA 24 Bảng 2.3 Ảnh hưởng pH đến trình chiết xuất CGA 25 Bảng 2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình chiết xuất CGA 26 Bảng 2.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình chiết xuất CGA 26 Bảng 2.6 Ảnh hưởng thời gian thuỷ phân đến q trình chiết xuất CGA 27 Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn CGA 28 Bảng 2.8 Thiết kế chế độ chạy hệ thống HPLC 29 lu an Bảng 2.9 Bố trí thí nghiệm xây dựng dường chuẩn CGA HPLC 30 n va Bảng 2.10 Các biến số khoảng chạy 30 tn to Bảng 2.11 Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố hàm lượng gh CGA thu điều kiện thuỷ phân khác 31 p ie Bảng 2.12 Lượng khuẩn lạc sau 24 nuôi môi trường lỏng 32 w Bảng 2.13 Thí nghiệm xác định điều kiện sấy chân không 33 oa nl Bảng 3.1 Giá trị nồng độ CGA đo bước sóng 324 nm 34 d Bảng 3.2 Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố hàm lượng CGA lu nf va an thu điều kiện thuỷ phân khác 47 Bảng 3.3 Kết phân tích phương sai mơ hình tối ưu phần mềm lm ul Design Expert 10.0.3 (Bảng Anova) 48 z at nh oi Bảng 3.4 Kiểm tra mơ hình thí nghiệm tối ưu hố tách chiết CGA 51 Bảng 3.5 Diện tích peak CGA nồng độ 52 z Bảng 3.6 Kết xác định hàm lượng CGA HPLC 54 gm @ Bảng 3.7 Ảnh hưởng CGA tới phát triển vi khuẩn có lợi vi l khuẩn gây hại 55 m co Bảng 3.8 Kết kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa 56 an Lu Bảng 3.9 Nhiệt độ thời gian sấy mẫu để thu nhận chế phẩm CGA 57 n va ac th si vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu trúc chlorogenic acid Hình 1.2 Một số sản phẩm thực phẩm chức chứa chlorogenic acid Hình 1.3 Cấu tạo cà phê 10 Hình 1.4 Tác động pectinase lên phân tử pectin .16 Hình 3.1 Quả cà phê xanh sau xử lý (A), sấy (B), nghiền rây (C) 34 Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn CGA 35 Hình 3.3 Đồ thị mối liên hệ tỷ lệ chất – dung môi hàm lượng chiết xuất lu CGA .36 an Hình 3.4 Sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu tới va n trình chiết xuất CGA 36 tn to Hình 3.5 Đồ thị mối liên hệ nồng độ enzyme tới hàm lượng chiết xuất CGA .37 p ie gh Hình 3.6 Sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ enzyme tới trình chiết xuất CGA 38 nl w Hình 3.7 Đồ thị mối quan hệ độ pH dung môi hàm lượng chiết xuất CGA 39 d oa Hình 3.8 Sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng pH tới trình chiết an lu xuất CGA 40 nf va Hình 3.9 Đồ thị mối quan hệ nhiệt độ hàm lượng chiết xuất CGA 41 lm ul Hình 3.10 Sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ tới trình chiết CGA .42 z at nh oi Hình 3.11 Đồ thị mối quan hệ tốc độ lắc hàm lượng chiết xuất CGA 43 Hình 3.12 Sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng tốc độ lắc tới z @ trình chiết xuất CGA 43 l gm Hình 3.13 Đồ thị mối quan hệ thời gian thuỷ phân hàm lượng chiết xuất CGA .44 co m Hình 3.14 Sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng thời gian thuỷ phân an Lu tới trình chiết xuất CGA .45 n va Hình 3.15 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu thuỷ phân cà phê xanh thu CGA 50 ac th si vii Hình 3.16 Bề mặt đáp ứng hàm lượng CGA 51 Hình 3.17 Sắc ký đồ kết trước sau tối ưu hoá 52 Hình 3.18 Đồ thị đường chuẩn CGA 53 Hình 3.19 Sắc ký đồ chất chuẩn CGA .53 Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu thử CGA 53 Hình 3.21 Chế phẩm CGA dạng bột 57 Hình 3.22 Quy trình thu nhận CGA từ cà phê xanh 58 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, nhu cầu sống ngày cao, loại sản phẩm chức đời với mục đích hỗ trợ, cải thiện, nâng cao sức khỏe người vấn đề xã hội đặc biệt quan tâm Nhiều nghiên cứu việc sử dụng bột chiết cà phê xanh có nhiều tác dụng sức khỏe người như: hạ huyết áp, ức chế tích tụ chất béo, hạn chế tăng trọng lượng thể điều chỉnh hàm lượng đường máu (Farah cộng sự, 2005) Các tác dụng tích cực bột chiết cà phê xanh có mặt Chlorogenic acid Chất có tác dụng kháng oxi hóa, kháng viêm, lu an kháng ung thư, chống béo phì, hạ huyết áp chống co giật (Santana-Gálvez, n va 2017) Đặc biệt nữa, nghiên cứu cho thấy tác dụng có lợi tn to Chlorogenic acid Hội chứng chuyển hóa (Metabolic syndrome) Hội gh chứng định nghĩa bao gồm loạt yếu tố sinh lý, hóa sinh, lâm p ie sàng chuyển hóa làm tăng nguy mắc bệnh tim mạch tiểu đường type Các biểu hội chứng bao gồm: rối loạn chuyển hóa lipid w oa nl máu (tăng cholesterol tổng số máu, tăng hàm lượng LDL - cholesterol, d triglycerid, giảm hàm lượng HDL - cholesterol), huyết áp cao, đường máu lu nf va an cao, dễ viêm, gan nhiễm mỡ ngưng thở ngủ Hội chứng coi hội chứng mang tính tồn cầu chi phí chữa trị cao số người mắc lm ul ngày tăng niên trẻ em (Santana-Gálvez, 2017) z at nh oi Cà phê xanh nguồn Chlorogenic acid quan trọng thực phẩm người với tổng lượng Chlorogenic acid lên đến 41 – 113 mg/g chất z khô tùy thuộc giống Việc thu nhận CGA từ cà phê xanh làm nguyên liệu gm @ sản xuất thực phẩm chức phòng hỗ trợ điều trị bệnh mãn tính đặc m co giá trị kinh tế cà phê l biệt hội chứng chuyển hóa giúp đa dạng hóa sản phẩm từ cà phê tăng an Lu Pectinase enzyme dùng không giới hạn thực phẩm khơng ảnh hưởng đến sức khỏe người Bằng ưu điểm dễ nuôi cấy, sinh n va ac th si trưởng phát triển nhanh, cho nhiều enzyme thời gian ngắn, vi sinh vật lựa chọn hàng đầu nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành, tăng suất sản xuất lên cao Sự sản xuất pectinase quy mô công nghiệp thực chủ yếu từ Aspergillus niger (Yogesh, 2009) Với nhiều kết khả quan tác dụng dược lý tiềm ứng dụng công nghiệp thực phẩm acid chlorogenic từ cà phê xanh, việc tách chiết axit chlorogenic từ nguyên liệu cung cấp chế phẩm hoạt chất tự nhiên quý, làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức lu an dùng phòng hỗ trợ điều trị bệnh mãn tính tăng huyết n va áp, tiểu đường đặc biệt hội chứng chuyển hóa, bệnh lý tăng tn to nhanh Từ lí trên, tiến hành thực đề tài: gh “Nghiên cứu tách chiết xác định hoạt tính sinh học Chlorogenic p ie acid từ cà phê xanh” d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 53 lu Hình 3.18 Đồ thị đường chuẩn CGA an n va Đường chuẩn CGA xác định là: Y = 4,6287x + 1307.4 R2 = 0,9938  Kết xác định hàm lượng CGA dịch thủy phân gh tn to p ie phương pháp HPLC d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul Hình 3.19 Sắc ký đồ chất chuẩn CGA z l gm @ m co Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu thử CGA an Lu Kết sắc ký đồ hình 3.20 cho thấy chất chuẩn sử dụng 5-CGA n va phân tích 29 phút, CGA xuất phút thứ 3, thời gian lưu ac th si 54 khoảng phút So sánh với kết mẫu thử hình 3.21, nhận thấy có trùng khớp phút thứ có đường sắc ký lên lưu lại đến qua phút thứ Điều rằng, mẫu thử tồn phân tử có cấu tạo giống với mẫu chuẩn Bảng 3.6 Kết xác định hàm lượng CGA HPLC Hàm lượng CGA (mg/g) Máy đo quang phổ (324nm) Hệ thống HPLC 37,44 35,07 63,81 61,40 58,25 56,19 61,83 59,03 lu TN an n va p ie gh tn to Chú thích: TN1- Dịch thủy phân từ thí nghiệm thứ ma trận thực nghiệm Box-Behnken; TN2- Dịch thủy phân từ thí nghiệm thứ 13 ma trận thực w sau tối ưu d oa nl nghiệm Box- Behnken; TN3- Dịch thủy phân trước tối ưu; TN4- Dịch thủy phân an lu Kết bảng 3.6 cho thấy hàm lượng CGA dịch thủy phân xác nf va định phương pháp HPLC cho kết thấp phương pháp đo lm ul máy quang phổ Điều tương tự với kết Abebe Belay A.V.Gholap (2009) nghiên cứu cho thấy lượng CGA thu đo z at nh oi máy quang phổ (6,05-6,25%) cao so với phương pháp đo HPLC (5,6 – 6,1%) z 3.3 Kết xác định hoạt tính kháng khuẩn kháng oxy hóa @ gm 3.3.1 Kết xác định khả kháng khuẩn l Nghiên cứu ảnh hưởng CGA đến phát triển chủng vi m co khuẩn có lợi thực Bacillus clausii vi khuẩn gây hại E coli diễn bảng 3.7 an Lu môi trường chứa glucose CGA 1% (w/v) Kết thu biểu n va ac th si 55 Bảng 3.7 Ảnh hưởng CGA tới phát triển vi khuẩn có lợi vi khuẩn gây hại Chủng thử nghiệm STT Số lượng khuẩn lạc sau 24 ni (Tính theo LgCFU/ml) Môi trường + 1% Glucose Môi trường + 1% CGA 8,16 ±0,09 Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 6,72 ± 0,09 6,85 ± 0,08 Lactobacillus plantarum 299V 7,02 ± 0,09 7,18 ± 0,08 Lactobacillus bulgaricus CH-3 6,57 ± 0,08 6,63 ± 0,09 Lactobacillus casei Shirota 7,14 ± 0,09 7,28 ± 0,09 Bacillus clausii 7,08 ± 0,09 7,13 ± 0,08 Escherichia Coli 9,23 ± 0,09 7,31 ± 0,08 7,91 ± 0,09 6,58 ± 0,09 n va 7,88 ± 0,08 an Lactobacillus acidophilus ATCC4356 ie lu gh tn to p oa nl w Staphylococcus aureus ATCC 25923 d Kết bảng 3.7 cho thấy CGA gần không ảnh hưởng đến sinh lu nf va an trưởng phát triển vi khuẩn probiotic Sau 24 nuôi cấy môi trường lỏng chứa 1% CGA, số lượng khuẩn lạc không khác biệt nhiều so với lm ul nuôi môi trường lỏng chứa 1% glucose z at nh oi Ngược lại, chủng vi khuẩn có hại E.coli hay S.aureus, CGA thể khả ức chế nhẹ đến sinh trưởng phát triển chúng Mật độ vi khuẩn sau 24 nuôi môi trường chứa 1%CGA giảm z @ so với nuôi môi trường đối chứng chứa 1% glucose l gm Theo nghiên cứu Bajko cộng (2016), CGA có khả ức co chế sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn gây hại Khả m kháng vi sinh vật probiotic CGA nghiên cứu, kết cho n va đạt đến 10mg/ml an Lu thấy CGA khơng kìm hãm phát triển lợi khuẩn nồng độ ac th si 56 3.3.2 Kết xác định hoạt tính oxy hóa Dịch chiết CGA sau cô đặc 20 lần cô chân không đem xác định hoạt tính chống oxy hóa Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Kết thu sau: Bảng 3.8 Kết kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa Khả trung hịa gốc tự (SC,%) SC50 (µg/ml) Chứng (+) [ascorbic acid] 86,53 ± 0,30 12,6 µg/ml 0,0 ±0,0 - 26,31 ± 0,90 ≥ 1000 µg/ml lu Mẫu an n va Chứng (-) [DPPH/EtOH+DMSO] Theo kết trên, nhận thấy mẫu CGA tách chiết chưa biểu hoạt p ie gh tn to CGA tách chiết w tính chống oxy hóa khử thử nghiệm phương pháp DPPH tới nồng độ oa nl thử nghiệm 1000µg/ml d 3.4 Kết quá trình sấy chân khơng an lu Sấy chân không phương pháp sấy môi trường áp suất cực thấp, gần nf va chân không Trong môi trường này, nước sôi nhiệt độ thấp lm ul nhiều so với nhiệt độ sôi thông thường Khi nước sôi, phân tử nước hoạt z at nh oi động mạnh đồng nghĩa với bốc diễn nhanh làm tăng tốc độ sấy lên nhiều lần so với sấy khơ thơng thường Sấy chân khơng có nhiều ưu điểm giữ nguyên màu sắc, z gm @ hương vị, chất dinh dưỡng tính chất đặc trưng sản phẩm, không làm biến đổi tính chất vật lý, hóa học vật sấy, sản phẩm l m lâu co sấy chân khơng có độ ẩm thấp (khoảng - 3%) nên bảo quản an Lu Vì sản phẩm chế phẩm CGA hướng tới cho mục đích phục vụ sức n va khỏe nên sấy chân không phương pháp lựa chọn thích hợp Nhiệt độ sấy ac th si 57 quan trọng thí nghiệm khảo sát điều kiện nhiệt độ sấy dịch chiết cô đặc để thu sản phẩm chứa CGA có hàm lượng cao Thí nghiệm xác định điều kiện sấy chân không thu nhận chế phẩm CGA cho kết biểu diễn bảng 3.9 Bảng 3.9 Nhiệt độ thời gian sấy mẫu để thu nhận chế phẩm CGA Nhiệt độ sấy Chế độ sấy mẫu lu Chân không an 50 13 6,9 9,15 43,21 ± 1,45 60 10 6,52 9,34 43,51 ±1,82 70 4,19 9,61 46,01 ± 1,32 Độ ẩm Khối lượng mẫu Hàm lượng CGA (%) thu (g) (mg/g) n va (oC) Thời gian sấy (giờ) to gh tn Ở chế độ sấy chân không, nhiệt độ 50 60oC độ ẩm sản phẩm thu p ie đạt 6,5%, hàm lượng chế phẩm chứa CGA đạt 43,21 ± 1,45 mg/g 43,51 ±1,82 mg/g, thời gian sấy từ 10 - 13 Ở 70oC, sau sản oa nl w phẩm đạt độ ẩm theo yêu cầu (4,41 – 5%), khối lượng mẫu thu d 9,61g hàm lượng CGA vượt hẳn so với sấy nhiệt độ thấp lu an (46,01 ± 1,32 mg/g) nf va Vì chọn nhiệt độ sấy 70oC để sấy tạo sản phẩm CGA Trong điều đẹp, dễ dàng thu hồi chế phẩm z at nh oi lm ul kiện sấy chân không, chế phẩm thu hồi có độ xốp mịn, màu xanh vàng sáng z m co l gm @ an Lu n va Hình 3.21 Chế phẩm CGA dạng bột ac th si 58 Sơ đồ thu nhận CGA từ cà phê xanh Sau tiến hành nghiên cứu điều kiện thủy phân cà phê xanh, đưa quy trình cơng nghệ thu nhận chế phẩm CGA pectinase hình 3.22 sau Quả cà phê xanh Xử lý (Sấy khô, nghiền bột) lu an n va Chiết CGA (Tỷ lệ chất- dung môi – 60, pH 5,5; nồng độ o enzyme 44 U/g, 50 C, 80 vòng/phút, 55 phút) ie gh tn to p Lọc oa nl w d Cô đặc o (Cô chân không 20 lần, 50 C) nf va an lu z at nh oi lm ul Sấy chân không o (70 C, giờ) Chế phẩm CGA z gm @ an Lu Bước 1: Xử lý nguyên liệu m Quy trình cụ thể sau: co l Hình 3.22 Quy trình thu nhận CGA từ cà phê xanh n va ac th si 59 Quả cà phê sau thu hái loại bỏ tạp chất, rửa với nước đem sấy nhiệt độ 50oC tới độ ẩm 15% Nghiền nhỏ cà phê thành bột mịn bảo quản lạnh (nhiệt độ 4oC) Bước 2: Chiết CGA từ cà phê xanh pectinase Bột cà phê hòa vào dung dịch đệm phosphate pH 5,5 có bổ sung 44U/g pectinase Đem ủ hỗn hợp tủ lắc nhiệt độ 50oC với tốc độ lắc 80 vòng/phút Sau 55 phút, dừng phản ứng cách gia nhiệt hỗn hợp lên 100oC phút Bước 3: Thu nhận dịch cô đặc lu an Hỗn hợp dịch sau thủy phân lọc bỏ bã, thu dịch CGA thô tiến n va hành cô đặc 20 lần phương pháp cô quay chân không 50C p ie gh tn to Bước 4: Sấy thu chế phẩm CGA dạng bột Đóng gói bảo quản d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận lu an n va p ie gh tn to Sau thời gian nghiên cứu, luận văn đưa số kết luận sau: Kết nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới trình thu nhận CGA từ cà phê xanh: - Tỷ lệ chất – dung môi: – 50 - pH dung dịch đệm: 5,5 - Nồng độ enzyme: 40 U/g - Nhiệt độ: 50oC - Tốc độ lắc: 80 vòng/phút - Thời gian: 60 phút Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất CGA cà phê xanh phương pháp quy hoạch bậc Box-Behnken Với tỷ lệ chất – dung môi: – 60, nồng độ enzyme 44 U/g thời gian 55 phút, hàm lượng CGA thu 62,3077 mg/g Xác định dịch chiết CGA sử dụng với nồng độ 1% thể hoạt tính kháng khuẩn yếu với chủng vi khuẩn E.coli không gây ức chế đến lợi khuẩn Bacillus clausii Điều kiện sấy chân khơng thích hợp là: nhiệt độ 70oC, cho sản phẩm đạt độ ẩm 4,41 – 5%, khối lượng mẫu thu 9,61g hàm lượng CGA đạt 46,01 mg/g d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul Kiến nghị - Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi tách chiết khác tách chiết CGA - Chứng minh hoạt tính sinh học CGA số loại vi khuẩn khác - Kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa CGA tách chiết nồng độ cao - Thực tinh CGA z m co l gm @ an Lu n va ac th si 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Biên Cương, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Huyền, Đặng Thị Thu (2010) Nghiên cứu chuyển hóa bã cơm dừa tạo prebiotic Mannooligosacharit Endo-β-1,4-mannanase từ Aspergillus niger BK01 Tạp chí Khoa học Công nghệ, 46(3): 43-49 Lê Hồng Phú, Nguyễn Đức Lượng, Đỗ Đại Nghĩa (2008) Nghiên cứu chế tạo chế phẩm Biocoffee-1 từ Aspergilus niger ứng dụng lên men loại cà phê Tạp chí phát triển KH&CN, tập 11, số 12 lu an Lê Thị Thu Hiền (2010) Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic n va từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc Luận văn thạc sĩ tn to dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội gh Lê Tự Hải, Nguyễn Thị Lan Anh, Lưu Vũ Diễm Hằng (2011) Nghiên cứu p ie chiết tách xác định thành phần hóa học hợp chất Polyphenol nhóm w Tanin từ vỏ keo tràm Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Đà Nẵng, oa nl 44(3): 142-149 d Nguyễn Hồng Ly (2014), Nghiên cứu chuyển hóa pectin tạo Pectic lu nf va an oligosaccharide (POS) Endo-polygalacturonase khảo sát số hoạt tính sinh học Luận văn thạc sĩ Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Bách lm ul khoa Hà Nội z at nh oi Nguyễn Việt Phương Vũ Kim Dung (2017) Tuyển chọn Aspergillus Niger sinh tổng hợp Pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic từ hạt cà phê z xanh Vietnam Biological Industries gm @ Trần Phương Thảo (2019) Chiết xuất cao chlorogenic acid từ hạt cà phê m co TP Hồ Chí Minh l xanh Luận văn thạc sĩ ngành Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa an Lu n va ac th si 62 Vũ Kim Dung (2015) Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo endopolygalacturonase Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Abebe Belay and A V Gholap (2009) Characterization and determination of chlorogenic acids (CGA) in coffee beans by UV-VIS spectroscopy African Journal of Pure and Applied Chemistry, 3(11): 234-240 10 Ae-Sim Cho, Seon Min Jeon, Myun Joo Kim, Jiyong Yeo (2010) Chlorogenic acid exhibits anti obesity property and improves lipid lu an metabolism in high fat diet induced obese mice Food and Chemical n va Toxicology tn to 11 Agnan Marie Michel Combo, Mario Aguedo (2012) Enzymatic gh production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with p ie commercial pectinase preparations Food and Bioproducts Processing, 90: 588-596 w oa nl 12 Alonso-Salces, R M., Serra, F., Reniero, F., Héberger K (2009) d Botanical and geographical characterization of green coffee (Coffea Arabica canephora): Chemometric evaluation of phenolic and nf va an Coffea lu and methylxanthine contents Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57: lm ul 4224-235 z at nh oi 13 Alves R c., Almeida I M c., Casal s., Oliveira M B (2010) Isoflavones in coffee: Influence of species, roast degree, and brewing method z Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58: 3002-3007 @ 14 Attila Hunyadi, Ana Martins, Tusty-Jiuan (2012) Chlorogenic Acid and gm l Rutin Play a Major Role in the InVivo Anti-Diabetic Activity of Morus alba m co Leaf Extract on Type II Diabetic Rats PLOS ONE vol an Lu n va ac th si 63 15 Barnes, H M., Feldman, J R.; White, W V (1950) Isochlorogenic Acid Isolation from Coffee and Structure Studies Journal of the American Chemical Society, 72: 4178-4182 16 Belitz, H.-D., Grosch, w., & Schieberle (2009) Coffee, tea, cocoa Food Chemistry, 4: 938-951 17 Brand-Williams, W., Cuvelier, M E and Berset C (1995) Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity Lebensm.-Wiss u.Technol., 28: 25-30 18 C.Campa et al (2005) Diversity in bean Caffeine content among wild lu an Coffea species: Evidence of a discontinuous distribution Food Chemistry, 91: n va 633-637 tn to 19 Carlos Tello, PhD (2020) Health Benefits of Chlorogenic Acid + Side gh Effects Molecular Biology, pp: 20-26 p ie 20 Carmen M Topala, Lavinia D Tataru, Targu d.Vale (2015) Infrared Spectra of Green Arabica Coffee Extraction using Supercritical Carbon w Clifford, M N (1999) Chlorogenic acids and other cinnamates – d 21 oa nl Dioxide and Soxhlet Technique Chemistry, pp: 1128-1131 lu nf va an nature, occurrence and dietary burden Journal of the Science of Food and Agriculture, 79 (3), pp 362–372 lm ul 22 Clifford, M N (2003) The analysis and characterization of chlorogenic z at nh oi acids and other cinnamates Methods in Polyphenol Analysis, 14: 314–337 23 Coffee Edited by R J Clarke and R Macrae Volume Chemistry z (1985), pp 306 Volume Technology (1987), pp 321 @ 24 Corse, J., Lundin, R E., Waiss, A C (1965) Identification of several gm l components of isochlorogenic acid Phytochemistry, 4: 527–529 m co 25 D.R Kashyap, P.K Vohra, S Chopa, R Tewari (2001) Applications of 215-227 an Lu pectinases in the commercial sector: a review Bioresource Technology, 77: n va ac th si 64 26 Deniz Bagdasa, Betul Cam Etoz, Zulfiye Gul (2015) In vivo systemic chlorogenic acid therapy under diabetic conditions: Wound healing effects and cytotoxicity/genotoxicity profile Food and Chemical Toxicology pp: 5461 27 Elias Kiassos, Stefania Mylonaki, Dimitris P Makris, Panagiotis Kefalas (2009) Implementation of response surface methodology to optimise extraction of onion (Allium cepa) solid waste phenolics Innovative Food Science & Emerging Technologies, 10(2): 246-252 28 Ewelina Bajko, Monika Kalinowska, Piotr Borowski, Leszek S (2016) lu an 5-O-Caffeoylquinic acid: A spectroscopic study and biological screening for n va antimicrobial activity LWT- Food Science and Technology, 65: 471-479 Farah A., Monteiro M., Donangelo c M., Lafay (2008) Chlorogenic tn to 29 gh acids from green coffee extract are highly bioavailable in humans Journal of p ie Nutrition, 138: 2309-2315 30 Farah A., de Paulis T., Trugo L C., Martin P R (2005) Effect of w oa nl roasting on the formation of chlorogenic acid lactones in coffee Journal of d Agricultural and Food Chemistry, 53(5): 1505-1513 lu Hiroshi Shimoda, Emi Seki, Michio Aitani (2006) Inhibitory effect of nf va an 31 green coffee bean extract on fat accumulation and body weight gain in mice lm ul BMC Complementary and Alternative Medicine, Igho Onakpoya, Rohini Terry, and Edzard Ernst (2011) The Use of z at nh oi 32 Green Coffee Extract as a Weight Loss Supplement: A Systematic Review z and Meta-Analysis of Randomised Clinical Trials Volume 2011, Article ID gm Iwai K., Kishimoto N., Kakino Y., Mochida K., Fujita T (2004) In l 33 @ 382852 m co vitro antioxidative effects and tyrosinase inhibitory activities of seven and Food Chemistry, 52: 4893 -4898 an Lu hydroxycinnamoyl derivatives in green coffee beans Journal of Agricultural n va ac th si 65 34 Jalal, Mahbubul A F., Read, David J., Haslam E (1982) Phenolic composition and its seasonal variation in Calluna vulgaris Phytochemistry 21, p 1397–1401 35 Junghyun Kim, Il-Ha Jeong, Chan-Sik Kim, Yun Mi Le (2011) Chlorogenic acid inhibits the formation of advanced glycation end products and associated protein cross-linking Archives of Pharmacal Research 36 Kazuya Kozuma, Shigemi Tsuchiya, Jun Kohori (2005) Antihypertensive Effect of Green Coffee Bean Extract on Mildly Hypertensive Subjects Hypertension Research lu an 37 Kumar, G.P., Navyaa, K., Ramya, E.M., Venkataramana, M., Anand, n va T., Anilakumar, K.R (2013) DNA damage protecting and free radical tn to scavenging properties of Terminalia arjuna bark in PC-12 cells and plasmid gh DNA Free Rad Antioxid, 3: 35-39 Kweon, Mee-Hyang; Hwang, Han-Joon; Sung, Ha-Chin (2001) p ie 38 Identification and Antioxidant Activity of Novel Chlorogenic Acid w oa nl Derivatives from Bamboo (Phyllostachys edulis) Journal of Agricultural and d Food Chemistry lu R Puupponen Pimia, L Nohynek, C Meier, M.Kahkonen, M nf va an 39 Heinonen, A Hopia (2001) Antimicrobial properties of phenolic compounds lm ul from berries, Journal of Applied Microbiology, 90: 494-507 Rohit Upadhyay, L Jagan Mohan Rao (2013) Critical Reviews in Food z at nh oi 40 Science and Nutrition Medicine, Chemistry Rosana Chirinos, Herve Rogez, David Campos, Romia Pedreschi, z 41 @ Yvan Larondelle (2007) Optimization of extraction conditions of antioxidant gm l phenolic compounds from mashua (Tropaeolum tuberosum Rz & Pavón) m co tubers Separation and Purification Technology, 55(2):217-225 an Lu n va ac th si 66 42 Santana et al (2006) Selectivity in the extraction of 2- quinolone alkaloids with supercritical CO2 Brazilian Journal of Chemical Engineering, 23 (4) 43 Santana-Gálvez, J., Cisneros-Zevallos, L., Jacobo-Velázquez, D A (2017) Chlorogenic acid: Recent Advances on Its Dual Role as a Food Additive and a Nutraceutical against Metabolic Syndrome Molecules, 2: 358379 44 Shela G., Olga M B., Elena K., Antonin L., Milan C., Nuria G M., Ratiporn H., Yong- Seo P., Soon-Teck J., and Simon T (2003) Bioactive lu an compounds and antioxidant potential in fresh and dried Jaffa sweeties, a new n va kind of citrus fruit J Nutri Biolchem., 14: 154- 159 Siti Machmudah, Kiwa Kitada, Mitsuru Sasaki (2008) Caffeine and tn to 45 gh chlorogenic acid separation from raw coffee beans using supercritical CO2 in p ie water 46 S.L.C Ferreira, E.G.P da Silva, H.S Ferreira, R.E Bruns et al (2007) w oa nl Box-Behnken design: An alternative for the optimization of analytical d methods Analytica Chimica Acta, 597(2): 179-186 lu Solange I Mussatto, Ercília M s Machado, Silvia Martins, Jose A nf va an 47 Teixeria (2011) Production, Composition, and Application of Coffee and Its lm ul Industrial Residues Food Bioprocess Technol, 4: 661-672 Speer K., Kolling-Speer I (2006) The lipid fraction of the coffee z at nh oi 48 bean Brazilian Journal of Plant Physiology, 18: 201-216 Takuya Watanabe,Yoichi Arai,Yuki Mitsui (2006) The Blood z 49 @ Pressure-Lowering Effect and Safety of Chlorogenic Acid from Green Coffee gm m Thom, E (2007) The Effect of Chlorogenic Acid Enriched Coffee on an Lu 50 co Hypertension l Bean Extract in Essential Hypertension Clinical and Experimental Glucose Absorption in Healthy Volunteers and Its Effect on Body Mass n va ac th si 67 When Used Long-term in Overweight and Obese People Journal of International Medical Researcher 51 Vogt, T (2010) Phenylpropanoid Biosynthesis Molecular Plant, 3, p 2–20 52 Yang sun (2017) Ionic liquid-based enzyme-assisted extraction of chlorogenic acid from Flos Lonicera Japonicae Bioresources and Bioprocessing, 45 53 Yogesh Khairnar , Vamsi Krishna K , Amol Boraste , Nikhil Gupta , Soham Trivedi et al (2009) Study of pectinase production in submerged lu an fermentation using different strains of Aspergillus Niger International n va Journal of Microbiology Research, 1: 13-17 Zhen Jing, Villani Thomas S., Guo Yue, Qi Yadong, Chin, Kit Pan, tn to 54 gh Min-Hsiung, Ho Chi-Tang, Simon James E., Wu Qingli (2016) p ie Phytochemistry, antioxidant capacity, total phenolic content and anti- inflammatory activity of Hibiscus sabdariffa leaves Food Chemistry, 190: d oa nl w 673–680 nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si