(Luận văn) nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi in vitro ở lợn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÊ THANH QUANG lu an va n NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN p ie gh tn to d oa nl w va an lu ll u nf LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC oi m z at nh z m co l gm @ HÀ NỘI, 12/2015 an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th i Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÊ THANH QUANG lu NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN an n va tn to p ie gh LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC d oa nl w Chuyên ngành: Động vật học Mã số: 60 42 01 03 va an lu ll u nf NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VIỆT LINH oi m z at nh z m co l gm @ HÀ NỘI, 12/2015 an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th i Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Việt Linh, chủ nhiệm đề tài, người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán nghiên cứu Phịng Cơng nghệ Phơi đặc biệt TS Nguyễn Văn Hạnh, Ths Nguyễn Thị Hiệp, Ths Nguyễn Thị Nhung nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ góp ý để tơi lu hồn thành luận văn an n va Luận văn hoàn thành với tài trợ Quỹ Phát triển khoa học tn to công nghệ quốc gia khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng giọt ie gh nỗn bào chất đơn tính lên hoạt hóa trứng phát triển phôi” mã số p 106.12-2012.93 TS Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm w Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện oa nl thủ tục hành để tơi bảo vệ luận văn d Cuối xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, người lu va an ln sát cánh, ủng hộ tơi suốt q trình học tập thực luận văn ll u nf Xin chân thành cảm ơn! m 11 oi Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 z at nh Học viên z l gm @ Lê Thanh Quang m co an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu i – ĐHTN ac th si MỤC LỤC NỘI DUNG Số trang lu an n va i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii PHẦN I MỞ ĐẦU PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học tn to LỜI CẢM ƠN 2.1.1 Buồng trứng trình hình thành nang trứng p ie gh Đặc điểm buồng trứng nl w 2.1.1.1 Quá trình hình thành phát triển nang trứng 2.1.1.3 Sự hình thành phát triển tế bào trứng d oa 2.1.1.2 lu va an u nf 2.1.2 Sự thành thục tế bào trứng ll m 2.1.3 Sự thụ tinh tế bào trứng động vật có vú oi 11 z at nh 2.2Sự thành thục trứng lợn in vitro (In vitro maturation – IVM) 12 z @ 2.3 Thụ tinh ống nghiệm nuôi phôi in vitro (In vitro m co l 2.3.1 Thụ tinh ống nghiệm lợn 14 gm fertilization, In vitro Culutre – IVF, IVC) 14 an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu ii – ĐHTN ac th si 2.3.2 Q trình ni phơi 15 2.4 Q trình ni phơi với tế bào đệm (co culture) 15 PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 NGHIÊN CỨU lu 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 20 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 20 3.3 Nội dung nghiên cứu tiêu theo dõi 20 an n va 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 gh tn to Phương pháp thu nhận chất lượng tế bào trứng p ie Phương pháp phân loại chất lượng trứng w Phương pháp nuôi thành thục tế bào trứng lợn in vitro (In oa nl vitro maturation - IVM) d Phương pháp đo nồng độ GSH nội bào an lu vitro (IVM) ll u nf va Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi thành thục in oi m Phương pháp thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng lợn với z Phương pháp nuôi phôi z at nh tinh trùng đông lạnh, giải đông @ Phương pháp xử lý số liệu m co l gm Phương pháp đánh giá chất lượng phôi nang an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu iii – ĐHTN ac th si PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 Phần I Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục nồng độ oxy khác tới khả 28 thành thục tế bào trứng lợn Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục nồng độ oxy khác tới khả thành thục 28 tế bào trứng lợn lu Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành an n va thục nồng độ oxy khác tới nồng độ Glutahinone 31 tn to (GSH) tế bào trứng lợn gh Phần II Ảnh hưởng việc bổ sung tế bào đệm tới phát ie 34 p triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm w PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 d an lu 5.1 Kết luận oa nl 42 42 ll 43 oi m ẢNH MINH HỌA u nf va 5.2 Đề nghị z at nh TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu iv – ĐHTN ac th si DANH MỤC BẢNG lu an va n Tên bảng Trang tn to gh Bảng Ảnh hưởng nồng độ cysteine lên thành thục in vitro 28 p ie tế bào trứng lợn nồng độ oxy 5% w Bảng Ảnh hưởng nồng độ cysteine lên thành thục in vitro nl 29 d oa tế bào trứng lợn nồng độ oxy 20 % lu va an Bảng Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine tới nồng độ Glutathione tế bào trứng lợn sau nuôi thành thục in vitro ll u nf nồng độ oxy 5% 32 oi m z at nh Bảng Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi 33 tới nồng độ Glutathione trứng nồng độ 20% oxy z @ Bảng Ảnh hưởng việc bổ sung tế bào đệm tới khả phân 35 m co l gm chia trứng lợn thụ tinh ống nghiệm 36 Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới khả phát triển phôi vượt an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu v – ĐHTN ac th si qua giai đoạn 2-16 tế bào Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi lợn thụ 38 tinh ống nghiệm đến giai đoạn phôi nang Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi lợn thụ 40 tinh ống nghiệm đến chất lượng phôi nang lu an DANH MỤC BIỂU ĐỒ n va Trang gh tn to Tên Biểu đồ ie Biểu đồ So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine mức nồng 31 p độ oxy khác tới khả thành thục tế bào trứng lợn w oa nl Biểu đồ So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine mức nồng 34 d độ oxy khác tới nồng độ GSH tế bào trứng lợn an lu va Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới phân chia u nf 37 phát triển phôi tới giai đoạn 2-16 tế bào trứng lợn TTON ll m oi Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới phân chia z at nh 39 hình thành phơi nang trứng lợn TTON z @ Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi gm đến giai đoạn 2-16 tế bào hình thành phơi nang trứng lợn 40 l m co TTON 41 an Lu Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới hình thành http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu vi – ĐHTN ac th si phôi nang chất lượng phôi nang trứng lợn TTON lu an n va to ie gh tn DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT p Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Fetal bovine serum Huyết bào thai bê oa nl FBS w Tiếng Anh FSH Follicle stimulating hormone GSH Glutathione IVC In vitro Culture IVF In vitro fertilization IVM In vitro muaturation LH Luteinsing hormone Hormone thể vàng an lu Fertilization medium gm d Môi trường thụ tinh FM ll u nf va Hormone kích thích nang trứng oi m z at nh Nuôi phôi z Thụ tinh ống nghiệm @ Thành thục ống nghiệm m co l an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu vii – ĐHTN ac th si MI Metaphase I Trung kỳ I MII Metaphase II Trung kỳ II MPN Male pronuclear Tiền nhân đực MEF Mouse embryonic fibroblast Tế bào sợi thai chuột North Carolina State NCSU 23 Môi trường nuôi trứng, phôi University 23 lu North California State an NCSU 37 Môi trường nuôi trứng, phôi n va University 37 to Nhiễm sắc thể gh tn NST Ống dẫn trứng p ie ODT Porcine follicle fluid Dịch nang trứng lợn oa nl w pFF Porcine oviductal d lợn Porcine endometrial epithelial ll PEEC u nf va an cell epithelial Tế bào biểu mô ống dẫn trứng lu POEC Tế bào nội mạc tử cung lợn oi m cell Huyết ngựa chửa @ Môi trường nuôi cấy l gm Tissue Culture Medium serum z TCM gonadotropin mare’s z at nh PMSG Pregnant Thí nghiệm m co TN an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu viii – ĐHTN ac th si Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm đến giai đoạn phôi nang Số lần lu Loại tế bào đệm Số phôi Số phôi nang Tỷ lệ phôi giả định (blastocyst) nang (%) 275 48 (16,8 ± 3,1)b 274 69 (24,6 ± 3,1)ab 280 69 (24,4 ± 2,2)ab 243 66 (28,5 ± 3,5)a lặp lại thí an nghiệm n va gh tn to Đối chứng p ie Tế bào sợi thai chuột d oa lợn nl w Tế bào ống dẫn trứng u nf va cung lợn an lu Tế bào nội mạc tử ll Các chữ khác hàng thể khác biệt có ý nghĩa với P