(Luận văn) đánh giá khả năng sản xuất gonadotropin màng đệm ngựa (ecg, equine chorionic gonadotropin) chuỗi đơn từ dòng tế bào hek 293

68 1 0
(Luận văn) đánh giá khả năng sản xuất gonadotropin màng đệm ngựa (ecg, equine chorionic gonadotropin) chuỗi đơn từ dòng tế bào hek 293

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN NGUYỄN BÁ NGHỊ lu an va n ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT gh tn to GONADOTROPIN MÀNG ĐỆM NGỰA (eCG, Equine p ie Chorionic Gonadotropin) CHUỖI ĐƠN TỪ DÒNG d oa nl w TẾ BÀO HEK 293 nf va an lu z at nh oi lm ul LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM z m co l gm @ Bình Định - Năm 2021 an Lu n va ac th si BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN NGUYỄN BÁ NGHỊ lu an ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT n va Chorionic Gonadotropin) CHUỖI ĐƠN TỪ DÒNG ie gh tn to GONADOTROPIN MÀNG ĐỆM NGỰA (eCG, Equine p TẾ BÀO HEK 293 d oa nl w Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm lu nf va an Mã số: 8420114 z at nh oi lm ul Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp z m co l gm @ an Lu n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tôi, hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung lu luận văn an va Học viên n p ie gh tn to d oa nl w Nguyễn Bá Nghị nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp Trưởng môn Sinh học ứng dụng – Nông nghiệp, khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Quy Nhơn; TS.BS Bùi Khắc Cường tập thể cán nhân viên Trung tâm nghiên cứu động vật thực nghiệm, Học viện Quân Y, tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình thực luận văn lu Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ đổi sáng tạo Vingroup (VINIF) an Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Quang Trung n va tài trợ kinh phí để thực đề tài nghiên cứu gh tn to tạo điều kiện thời gian hỗ trợ kinh phí suốt thời gian p ie Hà Nội để thực hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng oa nl w Đào tạo Sau đại học, khoa Khoa học Tự nhiên, quý Thầy Cô trường Đại học d Quy Nhơn quý Thầy Cô trực tiếp giảng dạy tơi suốt q trình an lu học tập nf va Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, em gái người thân lm ul gia đình ln động viên, hỗ trợ làm hậu phương vững Xin chân thành cảm ơn! z at nh oi trở thành niềm động viên mạnh mẽ giúp thực luận văn Học viên z l gm @ m co Nguyễn Bá Nghị an Lu n va ac th si MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU lu an Lý chọn đề tài n va Mục tiêu nghiên cứu Cấu trúc luận văn gh tn to Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài p ie Những đóng góp đề tài w Chương 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU oa nl 1.1 Tổng quan hormone gonadotropin d 1.1.1 Hormone kích thích nang trứng (Follicle-stimulating hormone, FSH) an lu nf va 1.1.2 Hormone tạo hoàng thể (Luteinizing hormone, LH) z at nh oi lm ul 1.1.3 Gonadotropin màng đệm người (Human chorionic gonadotropin, hCG) 1.2 Tổng quan eCG 1.2.1 Nguồn gốc cấu trúc eCG z 1.2.1.1 Nguồn gốc eCG @ gm 1.2.1.2 Cấu trúc eCG l 1.2.2 Hoạt động sinh học eCG 11 m co 1.2.3 Ứng dụng eCG hỗ trợ sinh sản 12 an Lu 1.3 Tình hình sử dụng eCG hỗ trợ sinh sản động vật 15 1.4 Tế bào HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293) 21 n va ac th si 1.4.1 Nguồn gốc HEK 293 21 1.4.2 Ứng dụng HEK 293 24 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Hóa chất thiết bị 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Nuôi cấy tế bào 28 lu 2.4.2 Theo dõi cấy truyền tế bào 28 an 2.4.4 Phương pháp chuyển nạp gen vào tế bào HEK 293 30 va n 2.4.5 Phương pháp xác định nồng độ cAMP 31 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 32 ie gh tn to 2.4.6 Phương pháp xét nghiệm ELISA “Sandwich” 31 p Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 nl w 3.1 Tỷ lệ sống tế bào HEK sau rã đông từ -196°C 33 d oa 3.2 Khả sản xuất eCG tái tổ hợp tế bào HEK 293 môi trường có bổ sung protein 37 lu nf va an 3.3 Khả sản xuất eCG tái tổ hợp tế bào HEK 293 mơi trường khơng có bổ sung protein 41 z at nh oi lm ul 3.4 Xác định đặc tính sinh học eCG tái tổ hợp thơng qua nồng độ cAMP nội bào 43 3.5 Ảnh hưởng eCG đến tỷ lệ sống tế bào Leydig mLTC-1 q trình ni cấy in vitro 47 z KẾT LUẬN 50 @ gm KẾT LUẬN 50 l KIẾN NGHỊ 51 m co DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 an Lu QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (Bản sao) n va ac th si DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Cyclic adenosine monophosphate CHO: Chinese hamster ovary EMEM: Eagle’s Minimum Essential Medium ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent assay eCG: Equine chorionic gonadotropin FSH: Follicle-stimulating hormone hCG: Human chorionic gonadotropin HEK 293: Human embryonic kidney 293 LH: Luteinzing hormone lu cAMP: an n va ie gh tn to Pregnant mare’s serum gonadotropin p PMSG: Thyroid-stimualting hormone d oa nl w TSH: nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng Trang 3.1 Số lượng tế bào tỷ lệ sống tế bào 37 3.2 Tỷ lệ số tế bào HEK 293 sau 48 chuyển nạp 40 Tỷ lệ phần trăm (%) tế bào mLTC-1 sống theo nồng 3.3 49 độ eCG lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu 1.1 Tên hình Trang Các phân tử gonadotropin Cấu trúc tuyến tính gonadotropin động vật có 1.2 vú cho thấy vị trí gắn carbohydrate Vị trí cấu trúc chuỗi carbohydrate 1.3 10 gonadotropins ngựa lu an n va p ie gh tn to Tế bào HEK 293 24 1.5 Miễn dịch huỳnh quang tế bào HEK 293 25 3.1 Tế bào HEK 293 nuôi cấy sau rã đông 33 3.2 Tế bào HEK 293 sau 48 nuôi cấy 33 3.3 Tế bào HEK 293 bị nhiễm 34 Tế bào HEK 239 sau 72 nuôi cấy 35 1.4 3.4 Tế bào HEK 293 sau tách dung dịch oa nl w 3.5 36 d Trypsin 0,05% (w/v) lu Tế bào HEK 293 sau ngày ni cấy (độ phóng đại an 37 nf va 3.6 100X) lm ul Nồng độ eCG sản xuất từ tế bào HEK 293 môi trường sau ngày nuôi cấy môi z at nh oi 3.7 39 trường có bổ sung FBS z Nồng độ eCG sản xuất từ tế bào HEK 293 @ trường B (bổ sung FBS), môi trường A (bổ sung 42 l 3.8 gm môi trường sau ngày nuôi cấy vào môi an Lu BSA) m co BSA) môi trường C (không bổ sung thêm protein n va ac th si Số hiệu Tên hình Trang Biểu tín hiệu cAMP tác động kích thích eCG sau ủ tế bào mLTC-1 3.9 44-45 nồng độ khác Biểu tín hiệu cAMP tác động kích thích eCG sau ủ tế bào mLTC-1 3.10 47 nồng độ khác Tế bào mLTC-1 sau ủ với eCG 3.11 48 lu kiểm tra khả sống CellTiter-Blue an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 44 màng tế bào dẫn đến trình hình thành cAMP Sau tổng hợp, cAMP tác động đến nhiều hoạt động sinh lý bên tế bào thông qua protein kinase A cAMP đóng vai trị chất truyền thông tin thứ hai cho tác động hormone Trong thí nghiệm này, để xác định hoạt tính sinh học eCG phần thu sau ni cấy D4 có ảnh hưởng đến tổng hợp cAMP hay không Tế bào mLTC-1 nuôi cấy 48 tiếng mơi trường RPMI, sau kích thích tế bào dịch thu D4 với có diện eCG lu nồng độ khác (0,25, 0,5 µl/giếng) Nồng độ cAMP nội bào đo an n va thông qua phát quang oxiluciferin tạo từ trình oxy hóa luciferin động khu vực đường cong (AUC) Kết thể hình 3.9 p ie gh tn to 60 phút, giá trị sau chuyển đổi thành động lực tác d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 45 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu lm ul Hình 3.9 Biểu tín hiệu cAMP tác động kích thích eCG sau z at nh oi ủ tế bào mLTC-1 nồng độ khác cAMP thể thông qua cường độ phát quang oxiluciferin Lượng eCG tra z vào giếng đĩa 96 giếng theo nồng độ 0,25; 0,5; µl/giếng Các thí nghiệm lặp @ gm lại lần cách độc lập, giá trị trung bình ± SE (n = 6) Kết phân tích m co khơng có ý nghĩa thống kê l ANOVA, sau test Dunnett *: khác biệt có ý nghĩa thống kê (* P

Ngày đăng: 18/07/2023, 14:16

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan