Expression of mir 205 in nasopharyngeal carcinoma tissues and its effect on cell proliferation and invasion

Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol，September 2017，Volume 17，Number 328 · 基础研究 · miＲ-205 在鼻咽癌组织中的表达及对细胞 增殖 、侵袭能力的影响 △ 高英 谢丽 ＊ 【摘要】 目的 探讨 miＲ-205 在鼻咽癌组织中的表达及对细胞增殖、侵袭能力的影响。方法 选取 57 例 初治鼻咽癌患者和 40 例对照组，利用实时荧光定量聚合酶链反应（ PCＲ） 技术检测 组组织中的 miＲ-205 表 达。培养人鼻咽癌细胞 CNE-2，根据转染物不同，将细胞分为 miＲ-205 minic 组、minic-对照组、miＲ-205 inhibitor 组和 inhibitor-对照组，利用实时荧光定量 PCＲ 技术检测各转染组细胞中 miＲ-205 表达，四氮唑蓝（ MTT） 比色法 检测各转染组细胞增殖情况，划痕实验检测各转染组细胞迁移能力，Transwell 法检测各转染组细胞侵袭能力。 结果 鼻咽癌组织中 miＲ-205 的相对表达量为 1． 85 ± 0． 17，高于对照组的 1． 14 ± 0． 12，差异有统计学意义（ t = 25． 099，P ＜ 0． 05） 。鼻咽癌组织中 miＲ-205 的相对表达量与临床分期、病理分级和颈淋巴结转移有关 （ P ＜ 0． 05） 。miＲ-205 minic 组细胞中 miＲ-205 的相对表达量为 0． 87 ± 0． 12，显著高于 miＲ-205 inhibitor 组、minic-对 0． 53 ± 0． 11 和 0． 55 ± 0． 12，且 miＲ-205 inhibitor 组低于 minic-对照 照组和 inhibitor-对照组，分别为 0． 34 ± 0． 09、 72 h 和 96 h 的增殖能力显著高于 minic-对照组 组和 inhibitor-对照组（ P ＜ 0． 001） 。miＲ-205 minic 组细胞 48 h、 和 inhibitor-对照组，而 miＲ-205 inhibitor 组则低于 minic-对照组和 inhibitor-对照组（ P ＜ 0． 001） 。miＲ-205 minic 组细胞迁移率和侵袭细胞数均高于 miＲ-205 inhibitor 组、minic-对照组和 inhibitor-对照组，且 miＲ-205 inhibitor 组细胞迁移率和侵袭细胞数均低于 minic-对照组和 inhibitor-对照组（ P ＜ 0． 001） 。结论 miＲ-205 在鼻咽癌组 织中呈高表达，下调 miＲ-205 表达可减少鼻咽癌 CNE-2 细胞增殖、抑制细胞迁移和侵袭能力。（ 中国眼耳鼻喉 2017， 17： 328-332） 科杂志， 【关键词】 鼻咽癌； miＲ-205； 细胞增殖； 侵袭能力 Expression of miＲ-205 in nasopharyngeal carcinoma tissues and its effect on cell proliferation and invasion GAO Ying，XIE Li ＊ ． Department of Otolaryngology，Ji'nan Iron and Steel Group Corporation Hospital in Shandong Province， Ji'nan 250101，China Corresponding author： GAO Ying，Email： 2967939793@ qq． com 【Abstract】 Objective To investigate the expression of miＲ-205 in nasopharyngeal carcinoma （ NPC） tissues and its effect on cell proliferation and invasion． Methods Fifty-seven patients with newly diagnosed NPC and 40 non-NPC patients who had accepted endoscopic surgery （ as the control group） were selected． The expression of miＲ-205 in nasopharyngeal tissues in the two groups were detected by using real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （ PCＲ） ． The human NPC CNE-2 cells were cultured． According to the different transfectants，CNE-2 cells were divided into miＲ-205 minic group，minic-control group，miＲ-205 inhibitor group and inhibitor-control group． The expressions of miＲ-205 in different transfected groups were detected by real-time fluorescence quantitative PCＲ． The cell proliferation was detected by microculture tetrozolium （ MTT） assay． The cell migration ability was detected by scratch test． The invasive ability was detected by Transwell method． Ｒesults The relative expression of miＲ-205 in NPC tissues （ 1． 85 ± 0． 17） was significantly higher than those in the control group （ 1． 14 ± 0． 12） （ t = 25． 099，P ＜ 0． 05） ． The relative expression of miＲ-205 was related to clinical stage，pathological grade and cervical lymph node metastasis （ P ＜ 0． 05） ． The relative expression of miＲ-205 in miＲ-205 minic group （ 0． 87 ± 0． 12） was significantly higher than those in miＲ-205 inhibitor group，minic-control group and inhibitor-control group ［（ 0． 34 ± 0． 09） ，（ 0． 53 ± 0． 11） and （ 0． 55 ± 0． 12） ］，and the relative expression of miＲ-205 in miＲ-205 inhibitor group was lower than those in the minic-control group and inhibitor-control group （ P ＜ 0． 01） ． The cell proliferations at 48 h，72 h and 96 h in the miＲ-205 minic group were higher than in the minic-control group and inhibitor-control group，while those in the miＲ-205 inhibitor group were lower than in the minic-control group and inhibitor-control group （ P ＜ 0． 001） ． The cell migration rate and invasive cell numbers in the miＲ-205 minic group were higher than those in the miＲ-205 inhibitor group，minic-control group and △ 基金项目： 国家自然科学基金（ 81372888） 作者单位： 山东省济南钢铁有限公司总医院耳鼻喉科 通讯作者： 高英（ Email： 2967939793@ qq． com） DOI： 10． 14166 / j． issn． 1671-2420． 2017． 05． 005 济南 250101； ＊ 山东省肿瘤医院耳鼻喉科 济南 250117 中国眼耳鼻喉科杂志 2017 年 月第 17 卷第 期 329 inhibitor-control group，and the cell migration rate and invasive cell numbers in miＲ-205 inhibitor group were lower than those in the minic-control group and inhibitor-control group （ P ＜ 0． 001） ． Conclusions MiＲ-205 was highly expressed in NPC tissues． Down-regulation expression of miＲ-205 could reduce the proliferation，invasion and migration of CNE-2 2017， 17： 328-332） cells． （ Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol， 【Key words】 Nasopharyngeal carcinoma； miＲ-205； Cell proliferation； Invasive ability 鼻咽癌是鼻咽黏膜好发的恶性肿瘤，病因多样且 ［1］ 存在地域差异 。由于其起病隐匿，恶性程度高，多数 ［2］ 患者临床确诊时已处于中晚期，严重影响预后 miＲ-205 模 拟 物 （ miＲ-205 minic ） 、miＲ-205 抑 制 物 （ miＲ-205 inhibitor） 及相应的对照序列均由上海吉玛 。中 制药有限公司设计合成，LipofectamineTM 2000 转染试 晚期鼻咽癌 患 者 初 治 反 应 率 较 低，且 年 生 存 率 ＜ 剂盒购自美国 Invitrogen 公司，四氮唑蓝 （ microculture 60% ［3］ 。目前，鼻咽癌的发病机制尚未完全阐明。 有 ［4］ tetrozolium，MTT） 细胞增殖与细胞毒性试剂盒购自上 指出，鼻咽癌的发病及进展是多因素、多基因、 海碧云天生物技术有限公司，Transwell 小室购自美国 多步 骤 共 同 作 用 的 结 果。 微 小 ＲNA （ micro ＲNA， Corning 公司，紫外分光光度计购自上海仪电分析仪器 miＲNA，miＲ） 是机体广泛存在、高度保守、含 20 个核 有限公司，实时荧光定量 PCＲ 仪购自美国 ABI 公司， 苷酸的小 ＲNA，与多种恶性肿瘤的发生及进展密切相 全自动酶标仪购自美国 Thermo 公司。 研究 ［5］ 关 。miＲ-205 作 为 miＲNA 的 重 要 类 型，在 食 管 ［6］ 癌 ［7］ 、神经胶质瘤 ［8］ 、卵巢癌 等多种恶性肿瘤中发 1． 实时荧光定量 PCＲ 技术检测 miＲ-205 表达 取 鼻咽癌和对照组组织，研磨后加入细胞裂解液进行裂 挥重要作用。本研究对鼻咽癌组织中 miＲ-205 的表达 解。用 Trizol 总 ＲNA 提取试剂盒提取组织中总 ＲNA， 进行检测，并利用转染 miＲ-205 模拟物或抑制物的方 利用紫 外 分 光 光 度 计 对 总 ＲNA 纯 度 进 行 检 测，以 法，探讨其对人鼻咽癌 CNE-2 细胞增殖、侵袭能力的 A260 / A280 ≥1． 80 作为合格样品。利用反转录试剂盒 影响，以期为鼻咽癌的发病机制研究提供基础资料 。 将总 ＲNA 反转录为模板链 cDNA，以 cDNA 为模板，用 1． PCＲ 试剂盒进行 PCＲ 扩增。引物序列： miＲ-205 引物， 资料与方法 临床资料 上 游： 选取 2014 年 月 ～ 2016 年 月在本 5'-CTTGTCCTTCATTCCACCGGA-3'， 下 游： 5'-TGCCGCCTGAACTTCACTCC-3'； U6 引 物，上 游： 科住院治疗的初治鼻咽癌患者 57 例，其中男性 36 例、 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下 游： 5'-AACGCTTCA- 女性 21 例； 年龄 28 ～ 74 岁，平均 （ 43． ± 9． 5） 岁。 所 92 ℃ CGAATTTGCGT-3'。PCＲ 反应条件： 94 ℃ min， 有患者均经病理学检验确诊，均未接受放、化疗。 临床 30 s， 58 ℃ 30 s， 73 ℃ 30 s，进行 40 次循环。每个样品 分期： Ⅰ期 例、Ⅱ期 6、Ⅲ期 31 例、Ⅳ期 16 例； 病理分 均设置 个平行反应复孔。用 级： 未分化癌 23 例、低分化鳞状细胞癌 34 例； 颈淋巴 对照组组织中 miＲ-205 相对表达量。 取各转染 组 细 结转移 32 例。同期选取因其他疾病行鼻内镜手术的 胞，加入细胞裂解液裂解，其余步骤同上。 鼻咽部标本 40 例作为对照组，均排除鼻咽癌，其中男 1． 性 24 例、女 性 16 例，年 龄 27 ～ 73 岁，平 均 （ 44． ± 1640 培养 基 对 CNE-2 细 胞 株 进 行 培 养，置 于 含 5% 10． 2） 岁。2 组研究对象性别、年龄等一般资料差异无 CO2 的 37 ℃ 恒温培养箱中。待细胞稳定传代后，取对 统计学意义。鼻咽癌患者均取治疗前活检标本，对照 数生长细胞，接种于 孔板中，调整细胞密度为 × 组通过鼻内镜取鼻咽黏膜组织，保存于 － 70 ℃ 液氮 10 / 孔，继续培养。待细胞融合度达到 85% 左右时，利 中。研究通过本院伦理委员会批准，所有研究对象均 用 LipofectamineTM 2000 转染试剂盒对细胞进行转染。 知情同意。 根据转染物不同，将细胞分为 组。miＲ-205 minic 组 1． 主要试剂和设备 CNE-2 细胞株由美国 ATCC 细胞培养及分组 － △△Ct 法获得鼻咽癌和 用含 10% 胎牛血清的 ＲPMI- 转 染 miＲ-205 模 拟 序 列： 5'-UCCUUCAUUCCACCGG- 细胞库提供，ＲPMI-1640 培养基、胎牛血清均购自美国 AGUCUG-3'； minic-对 照 组 转 染 minic 对 照 序 列： Hyclone 公 司，Trizol 总 ＲNA 提 取 试 剂 盒 购 自 美 国 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'； miＲ-205 inhibitor Gibco 公 司，反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 （ polymerase chain 组转 染 miＲ-205 抑 制 物 序 列： 5'-CCGGTGGAATGAA- reaction，PCＲ） 试剂盒购自日本 Takara 公司，miＲ-205 GG-3'； inhibitor-对 照 组 转 染 inhibitor 对 照 序 列： 和内参 U6 序 列 均 由 上 海 生 工 生 物 公 司 设 计 合 成， 5'-ACGTCTATACGCCCA-3'。各 组 转 染 后，继 续 在 含 Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol，September 2017，Volume 17，Number 330 表1 5% CO2 的 37 ℃ 恒温培养箱中培养。 1． MTT 比色法检测细胞增殖情况 鼻咽癌组织中 miＲ-205 表达与临床病理特征之间的关系 （ x珔± s） 取各转染组细 胞，接种于 96 孔板，调整细胞密度为 × 10 / 孔。每组 指标 均设置 个复孔，分别于转染后培养 24、48、72、96 h 时，将 g / L 的 MTT 液 20 μL 加入各孔，继续培养 h。 去除 培 养 液，加 入 二 甲 基 亚 砜 （ dimethylsulfoxide， DMSO） 200 μL，充分振荡 12 min，待结晶完全溶解后， 利用全自动酶标仪对 570 nm 处吸光度 A 值进行检测。 1． 划痕实验检测细胞迁移能力 取各转染组转染 后培养 48 h 的细胞，胰酶消化后，用 ＲPMI-1640 培养 液制备单细胞悬液。 调整细胞密度为 × 10 个 / mL， mL / 孔，于恒温培养 接种于背后有划线的 孔板中， 箱中过夜孵育。 待细胞融合度达到 100% 时，用无菌 枪头垂直于背后划横线，每孔连续至少穿过 条。 磷 酸盐缓冲液冲洗 次，去除漂浮细胞。置于含 5% CO2 n miＲ-205 相对 表达量 性别 男性 36 1． 82 ± 0． 14 女性 21 1． 86 ± 0． 18 ＞ 60 30 1． 84 ± 0． 16 ≤60 27 1． 88 ± 0． 18 年龄（ 岁） 浸润范围 T1 ～ T2 23 1． 83 ± 0． 13 T3 ～ T4 34 1． 87 ± 0． 17 临床分期 Ⅰ ～ Ⅱ期 10 1． 48 ± 0． 12 Ⅲ ～ Ⅳ期 47 2． 13 ± 0． 16 病理分级 的 37 ℃ 恒温培养箱中培养。 分别于划痕 h 和 24 h 未分化癌 23 2． 02 ± 0． 17 拍照，利用 Image-Pro Plus 图像分析软件对划痕距离进 低分化鳞状细胞癌 34 1． 55 ± 0． 13 行分析。细胞迁移率 = ［（ W0 h － W24 h ） / W0 h］× 100% （ W 表示宽度） 。 1． Transwell 法检测细胞侵袭能力 Transwell 小室 颈淋巴结转移 是 32 1． 99 ± 0． 18 否 25 1． 58 ± 0． 14 t值 P值 0． 244 0． 404 0． 633 0． 245 1． 192 0． 119 15． 728 ＜ 0． 001 11． 493 ＜ 0． 001 10． 180 ＜ 0． 001 上室铺 Matrigel 胶 50 μL，取各转染组转染后培养 48 h 2． 的细胞，胰酶消化后，用含 1% 胎牛血清的 ＲPMI-1640 minic 组细胞中 miＲ-205 相对表达量为 0． 87 ± 0． 12，显 培养液制备浓度为 × 10 个 / mL 的细胞悬液。取 100 μL 接种于 Transwell 小室上室，将含 10% 胎牛血清的 不 同 转 染 组 细 胞 中 miＲ-205 表 达 miＲ-205 著高于 miＲ-205 inhibitor 组、minic-对照组和 inhibitor对照组，分别为 0． 34 ± 0． 09、0． 53 ± 0． 11 和 0． 55 ± ＲPMI-1640 培 养 液 置 于 小 室 下 室，于 含 5% CO2 的 0． 12，且 miＲ-205 inhibitor 组 低 于 minic-对 照 组 和 37 ℃ 恒温培养箱中培养 24 h。 用棉签轻轻将上室中 inhibitor-对照组，差异均有统计学意义 （ F = 34． 286， 的细胞去除，用结晶紫染色，于高倍镜取 个视野，计 数穿膜细胞数，取平均值。 1． 统计学处理 2． 利用 SPSS 21． 统计分析软件对 数据进行分析，计量资料采用均数 ± 标准差 （ x珋± s） 表 组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方 示， 差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验，以 α = 0． 05 为 检验水准，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。 2． 组 组 织 中 miＲ-205 表 达 鼻咽癌组织中 1． 14 ± 0． 12， P ＜ 0． 05） 。 差异有统计学意义（ t = 25． 099， 鼻咽癌组织中 miＲ-205 表达与临床病理特征之 间的关系 不同转染组细胞增殖能力 miＲ-205 minic 组细 72 h 和 96 h 增殖能力显著高于 minic-对照组 胞 48 h、 和 inhibitor-对 照 组，而 miＲ-205 inhibitor 组 则 低 于 minic-对照组和 inhibitor-对照组，差异均有统计学意义 （ P ＜ 0． 001） （ 表 2） 。 2． 不同转染组细胞迁移能力 miＲ-205 minic 组细 胞迁 移 率 为 （ 61． ± 13． ） % ，显 著 高 于 miＲ-205 结果 miＲ-205 相 对 表 达 量 为 1． 85 ± 0． 17，高 于 对 照 组 的 2． P ＜ 0． 001） 。 鼻咽癌组织中 miＲ-205 相对表达量与性 别、年龄、浸润范围无关（ P ＞ 0． 05） ，而与临床分期、病 理分级和颈淋巴结转移有关（ P ＜ 0． 05） （ 表 1） 。 inhibitor 组、minic-对 照 组 和 inhibitor-对 照 组，分 别 为 （ 31． ± 9． 6） % 、（ 48． ± 10． 7） % 和 （ 50． ± 11． 5） % ， 且 miＲ-205 inhibitor 组细胞迁移率均低于 minic-对照 组和 inhibitor-对 照 组，差 异 均 有 统 计 学 意 义 （ F = 40． 617，P ＜ 0． 001） （ 图 1） 。 2． 不同转染组细胞侵袭能力比较 miＲ-205 minic 组侵袭细胞数为（ 261． ± 23． 5） 个，显著高于 miＲ-205 inhibitor 组 、minic-对照组和 inhibitor-对照组 ，分别为 中国眼耳鼻喉科杂志 2017 年 月第 17 卷第 期 331 表2 不同转染组细胞增殖能力比较（ A 值，x珔± s） 组别 24 h 48 h 72 h 96 h miＲ-205 minic 组 0． 17 ± 0． 06 0． 39 ± 0． 09 0． 58 ± 0． 12 0． 72 ± 0． 14 miＲ-205 inhibitor 组 0． 18 ± 0． 08 0． 26 ± 0． 10 0． 35 ± 0． 09 0． 47 ± 0． 12 图 1． minic-对照组 0． 19 ± 0． 09 0． 32 ± 0． 11 0． 43 ± 0． 10 0． 57 ± 0． 11 inhibitor-对照组 0． 16 ± 0． 07 0． 33 ± 0． 13 0． 45 ± 0． 12 0． 58 ± 0． 10 F值 1． 167 19． 834 30． 472 38． 249 P值 0． 592 ＜ 0． 001 ＜ 0． 001 ＜ 0． 001 划痕实验检测不同转染组细胞迁移能力 A、C、E、G 分别示 h 时 miＲ-205 minic 组、miＲ-205 inhibitor 组、minic-对照组和 inhibitor-对照组； B、 D、F、H 分别示 24 h 时 miＲ-205 minic 组、miＲ-205 inhibitor 组、minic-对照组和 inhibitor-对照组 × 100 （ 131． ± 19． ） 个、（ 208． ± 18． ） 个 和 （ 211． ± 随着诊疗技术的进展，鼻咽癌诊疗水平得到长足发展， 20． 2） 个，且 miＲ-205 inhibitor 组 侵 袭 细 胞 数 均 低 于 但由于肿瘤恶性程度高、侵袭转移能力强，多数患者预 minic-对照组和 inhibitor-对照组，差异均有统计学意义 后较差 （ F = 53． 509，P ＜ 0． 001） （ 图 2） 。 袭、转移的相关基因或因素，对改善患者预后具有重要 ［9］ 。因此，积极探讨影响鼻咽癌发生及肿瘤侵 意义。miＲ-205 是 miＲNA 家族成员之一，其在肿瘤发 ［10］ 生及进展中发挥重要作用，既可发挥癌基因作用 ［11］ 又可作为抑癌基因而抑制肿瘤发生 ， 。 本研究结果 显示，鼻咽癌组织中 miＲ-205 的相对表达量高于对照 组，说明 miＲ-205 可能作为癌基因参与了鼻咽癌的发 ［12］ 生。邓铃等 通过筛选鼻咽癌石蜡标本中 miＲNA 的 表达差异发现，miＲ-205 在鼻咽癌中表达水平升高，可 能参与了鼻咽癌的发生过程，与本研究结论一致。 在 与临床病理特征之间的关系分析中发现，miＲ-205 相 对表达量与临床分期、病理分级和颈淋巴结转移有关， 在临床分期Ⅲ ～ Ⅳ期、未分化癌和发生颈淋巴结转移 图2 Transwell 法检 测不同转染组细胞侵袭能力 A． miＲ-205 minic 组； B． miＲ-205 inhibitor 组； C． minic-对照组； D． inhibitor-对照组 结 晶紫染色 × 100 讨论 鼻咽癌是恶性程度较高的头颈部恶性肿瘤，发生 机制较为复杂，涉及多因素、多基因、多步骤。 近年来， 组中呈高表达，提示 miＲ-205 可能参与了鼻咽癌的进 展及转移过程。 为进一步探讨 miＲ-205 在鼻咽癌增殖、侵袭、转移 中的作用，利用 miＲ-205 模拟物、抑制物及对照序列转 染 CNE-2 细胞。结果显示，miＲ-205 minic 组细胞增殖 能力 显 著 高 于 minic-对 照 组 和 inhibitor-对 照 组，而 miＲ-205 inhibitor 组则低于 minic-对照组和 inhibitor-对 Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol，September 2017，Volume 17，Number 332 照组，说明上调 miＲ-205 可促进 CNE-2 细胞增殖，下调 miＲ-205 则可抑制细胞增殖，提示 miＲ-205 参与了鼻 ［13］ Chin J Cancer，2012，31（ 5） ： 215-222． ［5 ］ Wang J，Chen J，Sen S． MicroＲNA as biomarkers and diagnostics ［J］． J Cell Physiol，2016，231（ 1） ： 25-30． 指出，上调 miＲ-205 可 ［6 ］ Zhao BS，Liu SG，Wang TY，et al． Screening of microＲNA in 通过调控 Cyclin D1、P21 基因而实现对肿瘤细胞增殖 patients with esophageal cancer at same tumor node metastasis stage 咽癌细胞增殖过程。有研究 的调控。划痕实验和 Transwell 小室实验进一步显示， miＲ-205 minic 组细胞迁移率和侵袭细胞数显著高于 miＲ-205 inhibitor 组、minic-对照组和 inhibitor-对照组， 且 miＲ-205 inhibitor 组细胞迁移率均低于 minic-对照 组和 inhibitor-对照组，说明上调 miＲ-205 可提高细胞 迁移和侵袭能力，抑制 miＲ-205 则抑制细胞迁移及侵 袭能力，进一步说明 miＲ-205 基因表达与鼻咽癌细胞 迁移和侵袭能力有关。 with different prognoses［J］． Asian Pac J Cancer Prev，2013，14 （ 1） ： 139-143． ［7 ］ 郑国沛，贾小婷，彭聪，等． miＲ-205 通过靶向调控 TBX18 抑制 神经胶质瘤细胞的侵袭能力［J］． 中国病理生理杂志，2015，31 （ 7） ： 1219-1224． ［8 ］ 周君，刘海玲，陈亦乐，等． VEGF 和 miＲ-205 及靶蛋白 Ezrin 和 Lamin A / C 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